Definiowanie programu translacji mRNA matki podczas dojrzewania in vitro przy użyciu testu reporterowego pojedynczego oocytu

Metoda ta może być stosowana do identyfikacji i charakterystyki elementów regulatorowych, które kontrolują translację podczas dojrzewania oocytów. Zastosowaliśmy mikroskopię poklatkową, aby ocenić akumulację reportera podczas dojrzewania oocytów in vitro. To dokładnie określa czas, w którym aktywacja translacyjna lub represja ma miejsce podczas dojrzewania oocytów.

Na początek ostrożnie otwórz pęcherzyki antralne, wykonując małe nacięcie w ścianie mieszków włosowych za pomocą igły o rozmiarze 26. Odizoluj nienaruszone COC za pomocą kilku warstw komórek wzgórka za pomocą szklanej pipety obsługiwanej przez usta. Użyj mniejszej pipety i mechanicznie usuń COC przez wielokrotne pipetowanie.

Odessać ogołocone oocyty i umieścić je na szalce Petriego z pożywką do dojrzewania uzupełnioną jednym mikromolem cylostamidu. Umieść naczynie w inkubatorze na dwie godziny, aby oocyty mogły dojść do siebie po stresie wywołanym ich izolacją od pęcherzyków. Umieść rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego o długości 10 centymetrów w mechanicznym ściągaczu, aby przygotować igły iniekcyjne.

Zegnij końcówkę igły pod kątem 45 stopni za pomocą podgrzanego filamentu, aby uzyskać optymalne wstrzyknięcie. Umieść 20 mikrolitrowych kropelek podstawowej pożywki do pobierania oocytów w naczyniu styropianowym i przykryj kropelki lekkim olejem mineralnym. Przygotuj większą objętość mieszanki reporterowej, dodając 12,5 mikrograma na mikrolitr Ypet UTR i mCherry każdy.

Ich porcje należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu odwirować podwielokrotność przez dwie minuty w temperaturze 20 000 razy G, a następnie przenieść ją do nowej probówki do mikrowirówki. Na igłę iniekcyjną należy wlać około 0,5 mikrolitra mieszanki reporterowej.

Umieścić pipetę przytrzymującą i igłę do wstrzykiwań w uchwytach i umieścić je w kropli pożywki do pobierania oocytów. Otworzyć igłę do wstrzykiwań, delikatnie stukając nią o pipetę przytrzymującą. Umieść oocyty w kropli zasadowej pożywki zbiorczej i wstrzyknij od pięciu do 10 pikolitrów mieszanki reporterowej.

Inkubować oocyty i pożywkę dojrzewalniczą z jednym mikromolowym cilostamidem przez 16 godzin, aby sygnał mCherry ustabilizował się. Do mikroskopii poklatkowej należy przygotować szalkę Petriego z dwiema 20-mikrolitrowymi kropelkami pożywki dojrzewającej dla każdego wstrzykniętego reportera, jedną kroplą z jednym mikromolowym cylostamidem do kontroli oocytów zatrzymanych w profazie I i jedną kroplą bez cylostamidu dla dojrzewających oocytów. Przykryj kropelki lekkim olejem mineralnym i umieść je w inkubatorze.

Po wstępnej inkubacji należy wyjąć wstrzyknięte oocyty z inkubatora i przemyć je czterokrotnie w pożywce do dojrzewania bez cylostamidu. Przechowywać niektóre oocyty w pożywce do dojrzewania z jednym mikromolowym cilostamidem jako grupą kontrolną oocytów profazy I. Przenieś wstrzyknięte oocyty do odpowiednich kropelek na wcześniej przygotowanej czaszy mikroskopu poklatkowego.

Zgrupuj oocyty za pomocą zamkniętej szklanej pipety, aby zapobiec ich ruchowi podczas zapisu. Umieść czaszę pod mikroskopem wyposażonym w system eliminacji diod elektroluminescencyjnych i zmotoryzowany stolik wyposażony w komorę środowiskową utrzymywaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, stosując parametry wymienione w rękopisie tekstu. Wprowadź odpowiednie ustawienia eksperymentu poklatkowego, klikając Aplikacje, a następnie Akwizycja wielowymiarowa.

Wybierz pierwszą zakładkę Główna, a następnie wybierz tryb poklatkowy, wiele pozycji stage i wiele długości fal. Wybierz zakładkę Zapisywanie, aby wprowadzić lokalizację, w której eksperyment ma zostać zapisany. Następnie wybierz zakładkę Time-Lapse, aby wprowadzić liczbę punktów czasowych, czas trwania i przedział czasowy.

Wybierz zakładkę Etap, włącz jasne pole i zlokalizuj położenie oocytów, otwierając nowe okno i wybierając Nabierz, Zdobądź i Pokaż na żywo. Po zlokalizowaniu oocytów przełącz się z powrotem do okna akwizycji wielowymiarowej i naciśnij plus, aby ustawić lokalizację oocytów. Wybierz zakładkę Długości fal i ustaw trzy różne długości fal dla jasnego pola, YFP i mCherry.

Dostosuj ekspozycję dla Ypet i mCherry, a następnie rozpocznij eksperyment poklatkowy, klikając Acquire. W celu analizy translacji Ypet three prime UTR, wykonaj dwa pomiary regionu dla każdego oocytu, samego oocytu, klikając region elipsy, oraz mały obszar otaczający oocyt, który ma być użyty do odejmowania tła, klikając obszar prostokątny. Wyeksportuj dane pomiaru regionu do arkusza kalkulacyjnego, klikając Otwórz dziennik, a następnie Rejestruj dane.

Dla każdego pojedynczego oocytu i dla wszystkich zmierzonych punktów czasowych odejmij pomiar regionu tła od pomiaru regionu oocytu osobno dla długości fal YFP i mCherry. Ekspresję mCherry i YFP w profazie I i dojrzewających oocytach odnotowano w 39 oocytach, z których 30 było dojrzałych, a dziewięć zatrzymano w profazie I jako kontrolę ujemną. Indywidualne proporcje YFP do mCherry dla sygnałów oocytów zatrzymanych profazą I i dojrzewających skorygowano o objętość wstrzykniętej przez podzielenie sygnału YFP przez średni sygnał mCherry z ostatnich 10 punktów czasowych dla oocytów zatrzymanych profazą I i dojrzewających.

Szybkość translacji reporterowego YFP mierzono za pomocą krzywej dopasowania stosunku YFP do mCherry w profazie I i w dojrzewających oocytach w ciągu pierwszych 0 do dwóch godzin lub 8 do 10 godzin po uwolnieniu cylostamidu przy użyciu regresji liniowej. Akumulacja reportera nie przebiega zgodnie ze wzorcem liniowym, na co wskazuje znacząca różnica w szybkości translacji między zerem a dwiema godzinami i ośmioma do 10 godzinami po uwolnieniu cylostamidu, co wskazuje na aktywację translacji interleukiny 7 podczas dojrzewania mięśniowego oocytów. Próbując skorzystać z tego protokołu, upewnij się, że czas ekspozycji jest odpowiedni na początku nagrywania.

Należy pamiętać, że sygnał może się nasycić w ciągu czasu, jeśli translacja zostanie aktywowana podczas wznowienia mejozy oocytów. Stabilność MRMA można potwierdzić za pomocą PCR, przy użyciu starterów do YFP. Aby potwierdzić zmiany w translacji, możesz użyć Western blotting z przeciwciałem przeciwko technologii V5.