Name: Definiowanie programu translacji mRNA matki podczas dojrzewania in vitro przy użyciu testu reporterowego pojedynczego oocytu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę testu reporterowego pojedynczego oocytu do badania regulacji translacji mRNA podczas dojrzewania in vitro. Technika ta pozwala identyfikować elementy regulacyjne kontrolujące translację w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH R01 GM097165, GM116926 i Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 Marco Conti. Enrico M. Daldello otrzymał stypendium Fundacji Lalor, a Natasja G. J. Costermans otrzymała stypendium Rubicon od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO).

Procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco (protokół AN182026).
1. Przygotowanie mediów
<ol>
	<li>Dodać wszystkie składniki, jak opisano w Tabeli 1, aby uzyskać podstawową pożywkę do pobierania oocytów i pożywkę do dojrzewania oocytów. W przypadku podstawowego podłoża zbiorczego należy ustawić pH na 7,4. Zarówno w przypadku pobierania, jak i pożywki do dojrzewania, w dniu stosowania dodać 3 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1 μM cilostamidu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kodowania mRNA dla Ypet-3' UTR i mCherry
<ol>
	<li>Uzyskaj sekwencje 3′ UTR interesujących mRNA. 
	UWAGA: W tym badaniu sekwencje uzyskano wcześniej z cDNA oocytów myszy.</li>
	<li>Zaprojektuj startery do amplifikacji docelowych 3' UTR z cDNA oocytu i części wektora pcDNA 3.1 zawierającego sekwencję kodującą Ypet, znacznik epitopu V5 i promotor T7.</li>
	<li>Amplifikacja za pomocą zestawu polimerazy DNA o wysokiej wierności. Uruchom produkty reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) na żelu, aby sprawdzić, czy fragmenty mają odpowiedni rozmiar, wyciąć prążki i wyekstrahować DNA z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Połącz fragmenty PCR z wektorem za pomocą zestawu do klonowania PCR. 
	UWAGA: Fragmenty PCR inkubowano na lodzie przez 4 godziny, aby ułatwić bardziej efektywny proces rekombinacji. Jest to sprzeczne z instrukcjami producenta, które zalecają czas inkubacji wynoszący zaledwie 45 minut.</li>
	<li>Transfekcyjna reakcja PCR przekształca się w kompetentne 5-α bakterie Escherichia coli.
	<ol>
		<li>Dodaj mieszaninę i plazmid do bakterii i inkubuj na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Mieszaninę i plazmid poddać szokowi termicznemu, umieszczając mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 45 s i natychmiast schłodzić na lodzie przez 3 minuty.</li>
		<li>Dodać 500 μl bulionu Super Optimal z pożywką do represji katabolicznej (SOC) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wirować z prędkością 7000 × g przez 2 minuty i usunąć większość supernatantu. Zawiesić i umieścić na płytce agarowej Luria Bulion (LB) z odpowiednim doborem antybiotyku. 
		UWAGA: W tym badaniu zastosowano karbenicylinę.</li>
		<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Wyizolować kolonie, lekko naciskając końcówkę pipety na jedną z kolonii i umieszczając ją w 3 ml pożywki LB ze 100 μg/ml karbenicyliny. Inkubować przez 12-24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wyodrębnij DNA plazmidów za pomocą zestawu do izolacji plazmidowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta i potwierdź sekwencje za pomocą sekwencjonowania DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla Ypet/3' UTR:
	<ol>
		<li>Opracowanie liniowej matrycy PCR do transkrypcji in vitro. Użyj startera do przodu przed sekwencją Ypet i startera wstecznego z 20 dodatkowymi pozostałościami tyminy. Patrz Tabela 2 dla sekwencji Ypet/IL-7 3' UTR oraz sekwencji starterów do przodu i do tyłu. 
		UWAGA: Te dodatkowe reszty tyminy dodadzą oligo(A) do liniowego mRNA po transkrypcji in vitro.</li>
		<li>Transkrybować produkt PCR in vitro za pomocą zestawu do transkrypcji T7 zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Oczyść powstały komplementarny RNA (cRNA) za pomocą zestawu do czyszczenia transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Eluować oczyszczone cRNA w wodzie wolnej od RNAzy, mierzyć stężenie i oceniać integralność za pomocą elektroforezy agarozowej. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla mCherry:
	<ol>
		<li>Stwórz liniową matrycę PCR do transkrypcji in vitro przy użyciu enzymu restrykcyjnego o wysokiej wierności; użyj enzymu restrykcyjnego mfEI-HF, jeśli replikujesz ten przykład. Trawić w buforze mineralizacyjnym przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Uruchom żel, aby oczyścić próbkę i wyekstrahować liniowe DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Transkrybować produkt PCR in vitro za pomocą zestawu do transkrypcji T7 zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Poliadenylować cRNA (150-200 nukleotydów) za pomocą zestawu do ogonowania poli(A) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Oczyść powstałe cRNA za pomocą zestawu do czyszczenia transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Eluuj oczyszczone cRNA w wodzie wolnej od RNAzy, zmierz stężenia mRNA i oceń integralność wiadomości za pomocą elektroforezy żelowej. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Procedura eksperymentalna
UWAGA: Schematyczny przegląd mikroiniekcji oocytów i późniejszej mikroskopii poklatkowej znajduje się w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Dootrzewnowo wstrzyknąć 21-dniowym myszom 5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy, aby przyspieszyć wzrost pęcherzyków do stadium antralnego11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3
	<ol>
		<li>Pobieranie komórek jajowych
		<ol>
			<li>Ofiaruj myszy 44-48 godzin po przygotowaniu, aby zebrać jajniki i umieść je na plastikowej szalce Petriego z podstawową pożywką do pobierania oocytów.</li>
			<li>Ostrożnie otwórz pęcherzyki antralne, wykonując małe nacięcie w ścianie pęcherzyka za pomocą igły 26 G. Wyizoluj nienaruszone oocyty zamknięte w wzgórkach (COC) z kilkoma warstwami komórek wzgórka za pomocą szklanej pipety obsługiwanej przez usta.</li>
			<li>Użyj mniejszej pipety (nieco większej niż średnica oocytu) i mechanicznie usuń COC poprzez wielokrotne pipetowanie. 
			UWAGA: Alternatywnie należy wykonać mikroiniekcję na nienaruszone COC.</li>
			<li>Za pomocą większej pipety odessać ogołocone oocyty i umieścić je na szalce Petriego z pożywką do dojrzewania uzupełnioną 1 μM inhibitora fosfodiesterazy, cylostamidu, aby zapobiec wznowieniu dojrzewania mejotycznego12. Umieść naczynie w inkubatorze na 2 godziny, aby oocyty mogły zregenerować się po stresie wywołanym izolacją oocytów od pęcherzyków.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Mikroiniekcja komórek jajowych
		<ol>
			<li>Przygotować igły do wstrzykiwań, umieszczając rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego o długości 10 cm w mechanicznym ściągaczu. W celu uzyskania optymalnego wstrzyknięcia, należy zegnąć końcówkę igły pod kątem 45° za pomocą podgrzanego filamentu.</li>
			<li>Przygotuj naczynia styropianowe z 20 μl kropelkami podstawowego podłoża do pobierania oocytów i przykryj kropelki lekkim olejem mineralnym.</li>
			<li>Przygotuj mieszankę reporterową, dodając 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR i 12,5 μg/μL mCherry. Przygotować większą objętość i wykonać porcje do przyszłych doświadczeń, aby zapewnić podobne stężenia reporterowe. Przechowywać te podwielokrotności w temperaturze -80 °C. Po rozmrożeniu najpierw odwirować podwielokrotność porcji przez 2 minuty przy 20 000 x g i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki. 
			UWAGA: To wirowanie zapobiegnie zatkaniu igły iniekcyjnej przez potencjalne agregaty w mieszance reporterowej.</li>
			<li>Obciążyć igłę iniekcyjną kapilarnie około 0,5 μl mieszanki reporterowej.</li>
			<li>Umieścić pipetę przytrzymującą i załadowaną igłę do wstrzykiwań w uchwytach i umieścić w kropli pożywki do pobierania oocytów. Odessać część pożywki do pipety podtrzymującej.</li>
			<li>Otworzyć igłę do wstrzykiwań, delikatnie stukając nią o pipetę przytrzymującą.</li>
			<li>Umieścić oocyty w kropli zasadowej pożywki zbiorczej i wstrzyknąć 5-10 ml mieszanki reporterowej.</li>
			<li>Inkubować oocyty w pożywce dojrzewającej z 1 μM cilostamidem przez 16 godzin, aby sygnał mCherry ustabilizował się.</li>
			<li>Przygotować szalkę Petriego, która będzie używana do mikroskopii poklatkowej z co najmniej dwiema kroplami pożywki dojrzewającej o objętości 20 μl na każdy wstrzyknięty reporter: jedną kroplę z 1 μM cilostamidem do kontroli oocytów zatrzymanych w profazie I i jedną kroplę bez cylostamidu dla dojrzewających oocytów. Przykryj kropelki lekkim olejem mineralnym i umieść w inkubatorze.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Mikroskopia poklatkowa
		<ol>
			<li>Po wstępnej inkubacji należy wyjąć wstrzyknięte oocyty z inkubatora i przemyć je czterokrotnie w pożywce do dojrzewania bez cilostamidu. Trzymaj niektóre oocyty w pożywce do dojrzewania z 1 μM cilostamidem jako grupą kontrolną oocytów zatrzymaną w profazie I.</li>
			<li>Przenieś wstrzyknięte oocyty do odpowiednich kropelek na wcześniej przygotowanej czaszy mikroskopu poklatkowego. Zgrupuj oocyty za pomocą zamkniętej szklanej pipety (zamkniętą pipetę można przygotować, trzymając końcówkę w płomieniu przez kilka sekund). 
			UWAGA: Grupowanie oocytów pomaga zapobiegać ich ruchowi podczas nagrywania.</li>
			<li>Umieścić szalkę pod mikroskopem wyposażonym w system oświetlenia diodami elektroluminescencyjnymi i zmotoryzowany stolik wyposażony w komorę środowiskową utrzymywaną w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Aby powtórzyć to badanie, użyj następujących parametrów: zestaw filtrów: lustro dichroiczne YFP/CFP/mCherry 69008BS; Kanał YFP (wzbudzenie (Ex): S500/20 × 49057; Emisja (EM): D535/30 m 47281), mKanał Cherry (np.: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).</li>
			<li>Wprowadź odpowiednie ustawienia dla eksperymentu poklatkowego (patrz Spis materiałów dla oprogramowania użytego w tym badaniu): Kliknij Aplikacje | Akwizycja wielowymiarowa. Wybierz pierwszą zakładkę Main i wybierz timelapse, wiele pozycji stage i wiele długości fal.</li>
			<li>Wybierz zakładkę Zapisywanie, aby wprowadzić lokalizację, w której eksperyment ma zostać zapisany.</li>
			<li>Wybierz zakładkę Timelapse, aby wprowadzić liczbę punktów czasowych, czas trwania i przedział czasu. 
			UWAGA: Czas trwania eksperymentu poklatkowego zależy od badanego gatunku zwierząt, ponieważ czas dojrzewania mejotycznego oocytów różni się w zależności od gatunku. W tym eksperymencie z oocytami myszy oocyty rejestrowano co 15 minut przez 16 godzin.</li>
			<li>Wybierz zakładkę Etap. Włącz jasne pole i zlokalizuj położenie oocytów, otwierając nowe okno, wybierając Acquire | Nabywanie | Pokaż na żywo. Po zlokalizowaniu oocytów przełącz się z powrotem do okna Akwizycja wielowymiarowa i naciśnij +, aby ustawić lokalizację oocytów.</li>
			<li>Wybierz zakładkę Długości fal i ustaw 3 różne długości fal dla jasnego pola (ekspozycja 15 ms), YFP (ekspozycja 150 ms dla Ypet/IL7 3' UTR) i mCherry (ekspozycja 75 ms dla Ypet/IL7 3' UTR). 
			UWAGA: Dostosuj ekspozycję dla każdego reportera Ypet/3' UTR w oparciu o poziom akumulacji reportera i wstrzykniętą objętość. Upewnij się, że sygnał YFP znajduje się w środku zakresu detekcji na początku eksperymentu, aby zapobiec niedoszacowaniu lub nasyceniu w przypadku aktywacji translacji. W przypadku mCherry dostosuj ekspozycję dla każdej partii mCherry, ponieważ sygnał zależy od liczby nukleotydów adeninowych, które zostały dodane podczas procedury poliadenylacji. Ze względu na różnice w skuteczności poliadenylacji, użyj tej samej partii mCherry w różnych eksperymentach, aby uzyskać lepsze porównanie między eksperymentami.</li>
			<li>Rozpocznij eksperyment poklatkowy, klikając przycisk Pobierz. Zobacz Rysunek 2 i Plik uzupełniający dla przykładu nagrania poklatkowego w pojedynczym oocycie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Analiza translacji Ypet-3' UTR
		<ol>
			<li>W celu przeprowadzenia tej analizy (patrz Tabela materiałów dla oprogramowania użytego w tym badaniu) wykonaj dwa pomiary regionu dla każdego oocytu: samego oocytu - kliknij obszar elipsy i otocz oocyt - oraz mały obszar blisko oocytu, który ma być użyty do odejmowania tła - kliknij na obszar prostokątny. 
UWAGA: Upewnij się, że oocyty nie wychodzą poza wybrany region podczas nagrywania poklatkowego. Zwróć szczególną uwagę na umiejscowienie obszaru pomiaru wokół wytłoczenia ciała polarnego, ponieważ powoduje to ruch w oocycie i może zniekształcić zapis.</li>
			<li>Wyeksportuj dane pomiarowe regionu do arkusza kalkulacyjnego, klikając najpierw Otwórz dziennik, a następnie Dane dziennika, aby wyeksportować oprogramowanie do analizy danych.</li>
			<li>Dla każdego pojedynczego oocytu i dla wszystkich zmierzonych punktów czasowych odejmij pomiar regionu tła od pomiaru regionu oocytu. Zrób to osobno dla długości fal YFP i mCherry.</li>
			<li>Zapisz czas rozpadu pęcherzyków rozrodczych (GVBD) i wytłaczania ciał polarnych (PBE) do późniejszego wykorzystania. 
			UWAGA: Wyklucz dojrzewające oocyty myszy, gdy GVBD przekracza 2 godziny.</li>
			<li>Wykreśl ekspresję YFP i mCherry w czasie dla każdego oocytu, aby sprawdzić, czy nie ma wartości odstających. 
			UWAGA: Powinna to być gładka krzywa, jeśli tak nie jest, może to oznaczać, że oocyt poruszył się podczas nagrania.</li>
			<li>Dla każdego pojedynczego oocytu oblicz średnią ekspresję mCherry dla ostatnich dziesięciu punktów czasowych zapisu. Dla każdego punktu czasowego podziel ekspresję YFP przez uśrednioną ekspresję mCherry, aby skorygować objętość wstrzykniętej wiśni, aby uzyskać stosunek YFP/mCherry w każdym punkcie czasowym dla każdego pojedynczego oocytu.</li>
			<li>Obliczanie szybkości translacji dla określonego przedziału czasu poprzez dopasowanie nachylenia krzywej za pomocą regresji liniowej. Oceń różnice w szybkości tłumaczeń za pomocą wnioskowania statystycznego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li>
<li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portrait+of+an+oocyte%3A+our+obscure+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li>
<li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConti%2C+M+%22Posttranscriptional+Mechanisms+in+Endocrine+Regulation%22">Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation</a>. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).</li>
<li>Dai, X. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinational+code+for+mRNA+3%27UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li>
<li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li>
<li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399(2020).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+%28Dazl%29+at+the+oocyte-to-zygote+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li>
<li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li>
<li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li>
<li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li>
<li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+growth%3A+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li>
<li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li>
<li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li>
<li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333(2018).</li>
<li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development%3A+A+model+for+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li>
<li>Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li>
<li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302(2013).</li>
<li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+mRNAs+with+distinct+3%27+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).</li>
<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive%2C+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li>
<li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+3%27+uridylation+and+poly%28A%29+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li>
<li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiona metoda opisuje strategię badania aktywacji i represji translacji docelowego mRNA przy różnych przejściach podczas dojrzewania mejotycznego oocytów in vitro. Do opisania tej metody wybrano IL-7, cytokinę uwalnianą przez oocyt, która może brać udział w komunikacji między komórką oocytowąa wzgórkiem 8,13. Wiadomo, że IL-7 ulega coraz większej translacji podczas dojrzewania oocytów8 i pozwala na dobrą wizualizację aktywa...

W pełni rozwinięty oocyt ssaka przechodzi gwałtowne zmiany w przygotowaniu do zapłodnienia i nabycia totipotencji. Zmiany te są niezbędne do podtrzymania rozwoju embrionalnego po zapłodnieniu. Chociaż zdarzenia związane z dojrzewaniem jądrowym są stosunkowo dobrze opisane, znacznie mniej wiadomo o procesach molekularnych i szlakach w cytoplazmie oocytów. Podczas końcowych etapów dojrzewania oocytów oocyty są wyciszone transkrypcyjnie, a ekspresja genów jest całkowicie zależna od translacji i degradacji mRNA1,2. Synteza białek krytycznych dla kompetencji rozwojowych opiera się zatem na programie czasowej translacji długożyciowych mRNA, które zostały zsyntetyzowane wcześniej podczas wzrostu oocytów1,3. W ramach skupienia się na zdefiniowaniu tego programu translacji mRNA matki wykonywanej podczas dojrzewania mejotycznego i podczas przejścia oocytu do zygoty, w artykule przedstawiono strategię badania aktywacji i represji translacji docelowych matczynych mRNA w pojedynczych oocytach podczas dojrzewania mejotycznego in vitro.
W tej metodzie, otwarta ramka odczytu YPet jest klonowana przed 3' UTR interesującej nas transkrypcji. Następnie mRNA kodujące ten reporter są mikrowstrzykiwane do oocytów wraz z poliadenylowanymi mRNA kodującymi mCherry w celu kontroli wstrzykniętej objętości. Akumulacja reporterowa jest mierzona podczas dojrzewania mejotycznego oocytów in vitro za pomocą mikroskopii poklatkowej. Akumulacja białka żółtej fluorescencji (YFP) i mCherry jest rejestrowana w poszczególnych oocytach, a sygnały YFP są korygowane przez plateau poziomu współwstrzykiwanego mCherry. Po pozyskaniu danych oblicza się współczynniki translacji dla różnych przedziałów czasowych podczas dojrzewania mejotycznego oocytów in vitro, obliczając nachylenie krzywej uzyskane przez dopasowanie krzywej.
To podejście dostarcza narzędzia do eksperymentalnego potwierdzania zmian w translacji wybranych endogennych mRNA. Ponadto metoda ta ułatwia charakterystykę elementów regulatorowych, które kontrolują translację podczas dojrzewania mejotycznego oocytów poprzez manipulowanie elementami cis-regulatorowymi 3' UTR docelowych mRNAs4,5,6. Manipulacja długością ogona poli(A) pozwala również na wgląd w aktywność adenylazy/deadenylazy w oocytach5. Mutageneza elementów działających cis lub immunoprecypitacja RNA może być wykorzystana do badania interakcji z pokrewnymi białkami wiążącymi RNA6,7. Dodatkowo, metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji istotnych komponentów programu translacji, które są krytyczne dla kompetencji rozwojowych oocytów, mierząc docelową translację 3' UTR w modelach związanych z obniżoną jakością oocytów 8,9,10. W artykule przedstawiono reprezentatywny eksperyment, w którym ogołoconym oocytom 21-dniowych myszy C57 / BL6 wstrzyknięto mikro reporter Ypet połączony z 3' UTR IL-7. Opisano konfigurację i protokół wstrzykiwania komórek jajowych, nagrywania poklatkowego i analizy danych.

<table><tbody><tr><td>Przygotowanie pożywki</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Surowica bydlęca Albumina w proszku Bioxtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL-A3311</td><td></td></tr><tr><td>Cilostamid</td><td>EMD Millipore</td><td>231085</td><td></td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2645</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna 100x Roztwór, sterylny filtrowany</td><td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td><td>25-512</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu&nbsp;</td><td>JT-Baker</td><td>3506-1</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda destylowana</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Przygotowanie mRNA kodującego YFP/3' UTR i mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex Biomedical&nbsp;</td><td>20-102QD</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa karbenicyliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania ciuchci</td><td>McLab</td><td>CCK-20</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204</td><td></td></tr> barwnik <tr><td>ładujący DNA (6x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Solution</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb drabinka DNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>LB Płytki agarowe ze 100 i mikro; g/ml karbenicyliny, Teknova&nbsp;</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium (kapsułki)</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002-021</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Zestaw do czyszczenia transkrypcji Life</td><td>Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny MfeI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3589</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Zestaw do transkrypcji</td><td>Invitrogen</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA polimeraza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Zestaw do usuwania odpadów</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>bufor TAE&nbsp;</td><td>Apex Biomedyczny&nbsp;</td><td>20-193</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Oocyte collection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw probówek aspiratora do kalibrowanych mikropipet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Kalibrowane mikropipety</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSG- 5000</td><td>Mybiosource</td><td>MBS142665</td><td></td></tr><tr><td>Igła PrecisionGlide 26 G x 1/2</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Oocyte mikroiniekcja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Naczynie | Szkiełko nakrywkowe nr 0 | Średnica szkła 20 mm | Niepowlekany</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-20-C</td><td>Do mikroskopii poklatkowej</td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe z żarnikiem</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Olej do hodowli zarodków</td><td>Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td></td><td>Falcon 351006</td><td>do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Do inkubacji oocytów</td></tr><tr><td>VacuTip Holding Kapilara</td><td>Eppendorf</td><td>5195000036</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>BioRender</td><td></td><td>Przygotowanie Figure 1S</td></tr><tr><td>MetaMorph, wersja 7.8.13.0&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td>&nbsp; Do mikroskopii poklatkowej, analiza translacji 3' UTR&nbsp;</td></tr></tbody></table>

definiowanie programu translacji mrna matki podczas dojrzewania in vitro przy użyciu testu reporterowego pojedynczego oocytu

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Zdarzenia związane z dojrzewaniem jądra oocytu zostały dobrze opisane. Jednak znacznie mniej wiadomo o szlakach i procesach molekularnych, które zachodzą w cytoplazmie w ramach przygotowań do zapłodnienia i nabycia totipotencji. Podczas dojrzewania oocytów zmiany w ekspresji genów zależą wyłącznie od translacji i degradacji matczynych informacyjnych RNA (mRNA), a nie od transkrypcji. Realizacja programu translacyjnego odgrywa zatem kluczową rolę w ustaleniu kompetencji rozwojowej oocytów w celu podtrzymania rozwoju zarodka. Niniejszy artykuł jest częścią badań nad zdefiniowaniem programu translacji mRNA w organizmie matki, która zachodzi podczas dojrzewania mejotycznego i przejścia oocytu do zygoty. W niniejszej pracy przedstawiono strategię badania regulacji translacji docelowych mRNA podczas dojrzewania oocytów in vitro. W tym przypadku reporter Ypet jest łączony z nieulegającym translacji regionem 3' (UTR) genu będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie mikrowstrzykiwany do oocytów wraz z poliadenylowanym mRNA kodującym mCherry w celu kontrolowania wstrzykniętej objętości. Wykorzystując mikroskopię poklatkową do pomiaru akumulacji reportera, oblicza się szybkości translacji przy różnych przejściach podczas dojrzewania mejotycznego oocytów. W tym miejscu opisano protokoły izolacji i iniekcji oocytów, rejestracji poklatkowej i analizy danych, na przykładzie reportera UTR Ypet/interleukina-7 (IL-7)-3'.

Ogołocone oocyty myszy C57/BL6 w wieku 21 dni, zatrzymane w profazie I, wstrzyknięto mieszanką reporterową zawierającą mRNA kodujące reporter Ypet połączony z 3' UTR IL-7 oraz mRNA kodujące mCherry. Ekspresję YFP i mCherry zarejestrowano w 39 oocytach, z czego 30 poddano dojrzewaniu, a 9 pozostawiono w profazie I jako kontrolę negatywną. Trzy dojrzewające oocyty wykluczono z analizy z powodu opóźnionego GVBD (N=2) lub przemieszczania się w naczyniu podczas rejestracji (N=1). Rysunek 3 przeds...

Ten protokół opisuje test reporterowy do badania regulacji translacji mRNA w pojedynczych oocytach podczas dojrzewania in vitro.

Definiowanie programu translacji mRNA matki podczas dojrzewania in vitro przy użyciu testu reporterowego pojedynczego oocytu

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Metoda ta może być stosowana do identyfikacji i charakterystyki elementów regulatorowych, które kontrolują translację podczas dojrzewania oocytów. Zastosowaliśmy mikroskopię poklatkową, aby ocenić akumulację reportera podczas dojrzewania oocytów in vitro. To dokładnie określa czas, w którym aktywacja translacyjna lub represja ma miejsce podczas dojrzewania oocytów.Na początek ostrożnie otwórz pęcherzyki antralne, wykonując małe nacięcie w ścianie mieszków włosowych za pomocą igły o rozmiarze 26. Odizoluj nienaruszone COC za pomocą kilku warstw komórek wzgórka za pomocą szklanej pipety obsługiwanej przez usta. Użyj mniejszej pipety i mechanicznie usuń COC przez wielokrotne pipetowanie.Odessać ogołocone oocyty i umieścić je na szalce Petriego z pożywką do dojrzewania uzupełnioną jednym mikromolem cylostamidu. Umieść naczynie w inkubatorze na dwie godziny, aby oocyty mogły dojść do siebie po stresie wywołanym ich izolacją od pęcherzyków. Umieść rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego o długości 10 centymetrów w mechanicznym ściągaczu, aby przygotować igły iniekcyjne.Zegnij końcówkę igły pod kątem 45 stopni za pomocą podgrzanego filamentu, aby uzyskać optymalne wstrzyknięcie. Umieść 20 mikrolitrowych kropelek podstawowej pożywki do pobierania oocytów w naczyniu styropianowym i przykryj kropelki lekkim olejem mineralnym. Przygotuj większą objętość mieszanki reporterowej, dodając 12,5 mikrograma na mikrolitr Ypet UTR i mCherry każdy.Ich porcje należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu odwirować podwielokrotność przez dwie minuty w temperaturze 20 000 razy G, a następnie przenieść ją do nowej probówki do mikrowirówki. Na igłę iniekcyjną należy wlać około 0,5 mikrolitra mieszanki reporterowej.Umieścić pipetę przytrzymującą i igłę do wstrzykiwań w uchwytach i umieścić je w kropli pożywki do pobierania oocytów. Otworzyć igłę do wstrzykiwań, delikatnie stukając nią o pipetę przytrzymującą. Umieść oocyty w kropli zasadowej pożywki zbiorczej i wstrzyknij od pięciu do 10 pikolitrów mieszanki reporterowej.Inkubować oocyty i pożywkę dojrzewalniczą z jednym mikromolowym cilostamidem przez 16 godzin, aby sygnał mCherry ustabilizował się. Do mikroskopii poklatkowej należy przygotować szalkę Petriego z dwiema 20-mikrolitrowymi kropelkami pożywki dojrzewającej dla każdego wstrzykniętego reportera, jedną kroplą z jednym mikromolowym cylostamidem do kontroli oocytów zatrzymanych w profazie I i jedną kroplą bez cylostamidu dla dojrzewających oocytów. Przykryj kropelki lekkim olejem mineralnym i umieść je w inkubatorze.Po wstępnej inkubacji należy wyjąć wstrzyknięte oocyty z inkubatora i przemyć je czterokrotnie w pożywce do dojrzewania bez cylostamidu. Przechowywać niektóre oocyty w pożywce do dojrzewania z jednym mikromolowym cilostamidem jako grupą kontrolną oocytów profazy I. Przenieś wstrzyknięte oocyty do odpowiednich kropelek na wcześniej przygotowanej czaszy mikroskopu poklatkowego.Zgrupuj oocyty za pomocą zamkniętej szklanej pipety, aby zapobiec ich ruchowi podczas zapisu. Umieść czaszę pod mikroskopem wyposażonym w system eliminacji diod elektroluminescencyjnych i zmotoryzowany stolik wyposażony w komorę środowiskową utrzymywaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, stosując parametry wymienione w rękopisie tekstu. Wprowadź odpowiednie ustawienia eksperymentu poklatkowego, klikając Aplikacje, a następnie Akwizycja wielowymiarowa.Wybierz pierwszą zakładkę Główna, a następnie wybierz tryb poklatkowy, wiele pozycji stage i wiele długości fal. Wybierz zakładkę Zapisywanie, aby wprowadzić lokalizację, w której eksperyment ma zostać zapisany. Następnie wybierz zakładkę Time-Lapse, aby wprowadzić liczbę punktów czasowych, czas trwania i przedział czasowy.Wybierz zakładkę Etap, włącz jasne pole i zlokalizuj położenie oocytów, otwierając nowe okno i wybierając Nabierz, Zdobądź i Pokaż na żywo. Po zlokalizowaniu oocytów przełącz się z powrotem do okna akwizycji wielowymiarowej i naciśnij plus, aby ustawić lokalizację oocytów. Wybierz zakładkę Długości fal i ustaw trzy różne długości fal dla jasnego pola, YFP i mCherry.Dostosuj ekspozycję dla Ypet i mCherry, a następnie rozpocznij eksperyment poklatkowy, klikając Acquire. W celu analizy translacji Ypet three prime UTR, wykonaj dwa pomiary regionu dla każdego oocytu, samego oocytu, klikając region elipsy, oraz mały obszar otaczający oocyt, który ma być użyty do odejmowania tła, klikając obszar prostokątny. Wyeksportuj dane pomiaru regionu do arkusza kalkulacyjnego, klikając Otwórz dziennik, a następnie Rejestruj dane.Dla każdego pojedynczego oocytu i dla wszystkich zmierzonych punktów czasowych odejmij pomiar regionu tła od pomiaru regionu oocytu osobno dla długości fal YFP i mCherry. Ekspresję mCherry i YFP w profazie I i dojrzewających oocytach odnotowano w 39 oocytach, z których 30 było dojrzałych, a dziewięć zatrzymano w profazie I jako kontrolę ujemną. Indywidualne proporcje YFP do mCherry dla sygnałów oocytów zatrzymanych profazą I i dojrzewających skorygowano o objętość wstrzykniętej przez podzielenie sygnału YFP przez średni sygnał mCherry z ostatnich 10 punktów czasowych dla oocytów zatrzymanych profazą I i dojrzewających.Szybkość translacji reporterowego YFP mierzono za pomocą krzywej dopasowania stosunku YFP do mCherry w profazie I i w dojrzewających oocytach w ciągu pierwszych 0 do dwóch godzin lub 8 do 10 godzin po uwolnieniu cylostamidu przy użyciu regresji liniowej. Akumulacja reportera nie przebiega zgodnie ze wzorcem liniowym, na co wskazuje znacząca różnica w szybkości translacji między zerem a dwiema godzinami i ośmioma do 10 godzinami po uwolnieniu cylostamidu, co wskazuje na aktywację translacji interleukiny 7 podczas dojrzewania mięśniowego oocytów. Próbując skorzystać z tego protokołu, upewnij się, że czas ekspozycji jest odpowiedni na początku nagrywania.Należy pamiętać, że sygnał może się nasycić w ciągu czasu, jeśli translacja zostanie aktywowana podczas wznowienia mejozy oocytów. Stabilność MRMA można potwierdzić za pomocą PCR, przy użyciu starterów do YFP. Aby potwierdzić zmiany w translacji, możesz użyć Western blotting z przeciwciałem przeciwko technologii V5.

defining-program-maternal-mrna-translation-during-vitro-maturation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie pokazujemy, że w obecności inhibitora fosfodiestru, cykl komórkowy oocytów zostaje zatrzymany w profazie-I, podczas której transkrybowane mRNA są przechowywane w przypadku braku translacji. Po uwolnieniu inhibitora dojrzewanie oocytów zostaje wznowione, a komórki wchodzą w metafazę. Sygnał reporterowego mRNA połączonego z docelowym genem w metafazie-I wskazuje na aktywację maszynerii translacyjnej i ekspresji białka.

Test reporterowy pojedynczej komórki jajowej in vitro: technika badania docelowej regulacji translacji mRNA podczas dojrzewania oocytów in vitro

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Kontrola syntezy białek występuje głównie na etapie inicjacji translacji, której niedobory są związane z różnymi zaburzeniami. Aby lepiej zrozumieć ich etiologię, opisaliśmy tutaj protokół z wykorzystaniem oocytów Xenopus laevis oceniający translację transkryptu mos w obecności mutanta czynnika inicjacji translacji eIF4G1.

Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego zubożenia mRNA za pośrednictwem siRNA, a następnie analizę immunofluorescencyjną w celu oceny montażu i organizacji wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Protokół ten jest odpowiedni do in vitro zubożenia transkryptów i oceny funkcjonalnej różnych czynników wrzecionowych i/lub MTOC w oocytach.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

Zoptymalizowany protokół dojrzewania in vitro oocytów danio pręgowanego, używany do manipulacji produktami genów matki, jest prezentowany tutaj.

Funkcjonalna manipulacja matczynymi produktami genowymi z wykorzystaniem dojrzewania oocytów in vitro u danio pręgowanego

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Aby w sposób powtarzalny zliczyć liczbę mRNA w poszczególnych oocytach, zoptymalizowano jednocząsteczkową fluorescencję RNA in situ (RNA-FISH) dla komórek nieprzylegających. Oocyty zebrano, zhybrydyzowano z sondami specyficznymi dla transkryptu i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji obrazu.

Zastosowanie jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (SM-FISH) do ilościowego oznaczania i lokalizacji mRNA w mysich oocytach

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Ten protokół opisuje procedury dotyczące in vitro dojrzewania oocytów mysich, in vitro zapłodnienia i późniejszej kultury embrionów do etapu blastocysty.

Dojrzewanie in vitro komórek jajowych myszy, zapłodnienie i hodowlą zarodków przedimplantacyjnych

Poznaj metodę testu reporterowego pojedynczego oocytu do badania regulacji translacji mRNA podczas dojrzewania in vitro. Technika ta pozwala identyfikować elementy regulacyjne kontrolujące translację w czasie rzeczywistym.

Definiowanie programu translacji mRNA matki podczas dojrzewania in vitro przy użyciu testu reporterowego pojedynczego oocytu

Przeglądaj więcej filmów