Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu
2 lutego 2021
Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.
Oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej jest kluczową miarą wyników w badaniach nad chorobą Parkinsona. Protokół ten znacznie skraca obciążenie wymagane do oszacowania liczby neuronów. Metoda ta zapewnia efektywny czasowo i dokładny proces wykrywania zmian w liczbie neuronów dopaminergicznych i nadaje się do określania wpływu interwencji na przeżycie komórek.
Metodę tę można łatwo zaadaptować, aby zapewnić dokładne zliczanie neuronów w różnych regionach mózgu, przy jednoczesnym zachowaniu przewagi kosztowej i czasowej w porównaniu z tradycyjnymi metodami stereologicznymi. Aby uchwycić obrazy IHC, użyj oprogramowania sprzężonego z mikroskopem konfokalnym o 10-krotnym powiększeniu. Otwórz otwór na szpilkę na 1,5 jednostki obszaru, aby uchwycić szeroką płaszczyznę o łącznej długości 1,5 mikrometra i ustaw ostrość na wstrzykniętą stronę mózgu.
Na karcie akwizycji zaznacz opcję obrazowania skanowania kafelków i ustaw wymiary na 10 na cztery. W panelu trybu akwizycji ustaw powiększenie na 1,1, aby uniknąć jakichkolwiek śladów łączenia obrazów skanowanych kafelków. Ustaw rozmiar klatki na 1024 na 1024 piksele, a uśrednienie na dwa, aby zapewnić wysoką jakość pozyskiwania obrazu.
W panelu kanałów ustaw ścieżkę pierwszą na Alexa 488 i ścieżkę drugą na Alexa 555. Załaduj szkiełko na scenę i wybierz sekcję z silnym zabarwieniem TH. Kliknij na żywo w panelu akwizycji.
W panelu kanałów ustaw siłę i wzmocnienie lasera na poziomy, które maksymalizują sygnał i ograniczają szumy tła. Użyj wskaźnika zasięgu, aby upewnić się, że sygnały nie są prześwietlone. Powtórz to z wieloma slajdami.
Na karcie akwizycji zaznacz pole pozycji. Aby rozpocząć obrazowanie, użyj okularu i wybierz pierwszą sekcję pokazującą dodatnie barwienie TH. Następnie ustaw fokus w punkcie zainteresowania i przesuń scenę do linii środkowej sekcji.
Spowoduje to zapisanie pozycji w osiach X, Y i Z i wyświetli obraz skanu kafelka obejmującego cały przekrój. Powtórzyć tę czynność dla wszystkich innych preparatów, w tym dla miejsca, w którym nie wykonano iniekcji. Oddziel pliki obrazów za pomocą odpowiedniego oprogramowania i zaimportuj je do oprogramowania do automatycznej analizy obrazu.
Zdefiniuj obszar zainteresowania, wybierając narzędzie adnotacji pióra, aby narysować adnotację wokół istoty czarnej pars compacta. Przejdź do karty analizy i wybierz dostrajanie w czasie rzeczywistym z rozwijanego menu analizy. Spowoduje to otwarcie osobnego okna na obrazie przekroju, co pozwala na modyfikację parametrów analizy w czasie rzeczywistym.
W sekcji powiększenia analizy wybierz odpowiednie powiększenie obrazu. W sekcji wykrywania komórek wybierz barwnik jądrowy jako barwnik używany do barwienia TH. Dostosuj próg kontrastu jądrowego, minimalną intensywność jądrową, agresywność segmentacji jądrowej i ustawienia rozmiaru jądra, uważnie obserwując okno dostrajania czasu.
Powtórz ten proces z wieloma próbkami. Po pobraniu odpowiedniej liczby obrazów i odpowiednim dostosowaniu dostrajania w czasie rzeczywistym zapisz ustawienia analizy w menu rozwijanym akcji ustawień. Wybierz wszystkie obrazy do analizy i kliknij analizuj.
Wybierz ustawienie analizy, które zostało właśnie zapisane i w oknie regionu analizy zaznacz pole Warstwy adnotacji, a następnie zaznacz warstwę pierwszą i kliknij Analizuj. Po zakończeniu wyeksportuj dane analizy podsumowującej dla wszystkich sekcji, wybierając opcję eksportu danych analizy obiektowej. Ten zestaw danych może być wykorzystany do zbadania zmian wielkości komórek w odpowiedzi na toksynę lub terapię.
Sześć tygodni po wstrzyknięciach wirusa związanego z adeno lub AAV, stereotaktyczne wstrzyknięcie AAV eksprymującego zmutowaną alfa synukleinę A53T do istoty czarnej w mózgu szczura spowodowało znaczne zmniejszenie gęstości neuronów dopaminergicznych. Średnia liczba neuronów TH dodatnich na milimetr kwadratowy w istocie czarnej szczurów, którym wstrzyknięto AAV-A35T, była znacznie zmniejszona w porównaniu z szczurami, którym wstrzyknięto pusty wektor AAV. Podobne obserwacje poczyniono przy użyciu bezstronnej stereologii.
Próbując użyć tego protokołu, należy pamiętać, że oprogramowanie jest tylko tak użyteczne, jak zostało przeszkolone. Dlatego należy poświęcić czas i ostrożność, aby upewnić się, że pojedyncza komórka jest identyfikowana jako pojedyncza komórka. Oprogramowanie można dostosować do pomiaru intensywności fluorescencji innych białek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak alfa-synukleina, w celu określenia, czy leczenie może modulować poziom białka.
Technika ta pozwoliła na uzyskanie większej wydajności podczas testowania wpływu wielu potencjalnych terapii na gęstość neuronów dopaminergicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca prezentuje zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych w pachim ciemnym istoty czarnej szczura. Protokół ten znacznie zmniejsza nakład pracy i zwiększa dokładność szacowania liczby neuronów, co jest kluczowe w badaniach nad chorobą Parkinsona.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Psychiatria
- Biologia komórkowa
Wprowadzenie
- Oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych jest kluczowe dla badań nad chorobą Parkinsona.
- Tradycyjne metody mogą być czasochłonne i mniej dokładne.
- Metody zautomatyzowane mogą zapewnić oszczędność czasu i korzyści finansowe.
- Zmiany ilościowe w liczbie neuronów mogą oceniać efekty terapeutyczne.
Cel badania
- Przedstawienie metody efektywnego i dokładnego wykrywania liczby neuronów dopaminergicznych.
- Umożliwienie badaczom analizy zmian w liczbie neuronów w wyniku różnych interwencji.
- Uproszczenie procesu obrazowania i analizy danych dla neuronów dopaminergicznych.
Wykorzystane metody
- Zautomatyzowana metoda obrazowania z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.
- Skupienie się na pachim ciemnym istoty czarnej u szczura.
- Protokół obejmuje wykonywanie obrazów IHC przy powiększeniu 10X z określonymi ustawieniami obrazowania.
- W czasie rzeczywistym strojenie i analiza obrazów neuronalnych za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania.
- Zawiera analizę danych dotyczących zmian w gęstości neuronów po interwencji.
Główne wyniki
- Metoda ta wykazała znaczące zmniejszenie gęstości neuronów pozytywnych na TH po wstrzyknięciach AAV wyrażających mutantowy alfa-synuklein A53T.
- Wyniki wskazały na zmniejszenie liczby neuronów dopaminergicznych w porównaniu z grupami kontrolnymi.
- Wykorzystano niezachowawczą stereologię w celu potwierdzenia wyników.
- Umożliwia wykrywanie zmian morfologicznych w odpowiedzi na interwencje terapeutyczne.
Wnioski
- Badanie potwierdza wydajną metodę kwantyfikacji neuronów dopaminergicznych.
- Technika ta zwiększa zrozumienie utraty neuronów w modelach choroby Parkinsona.
- Prezentowane metody mogą ułatwić badanie wpływu terapeutycznego na gęstość neuronów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of dopaminergic neuron density in the substantia nigra is critical for preclinical Parkinson's disease research and therapeutic evaluation. Automated image analysis offers a scalable, time-efficient alternative to traditional stereology, enabling rapid assessment of neuroprotective interventions. This approach supports robust target validation and accelerates decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of neuronal loss or protection in disease-relevant models.
- Supports functional validation of therapeutic targets by measuring intervention effects on cell survival.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing objective, reproducible neuron counts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain region assays for compound screening workflows.
- Standardizes neuron quantification, improving reproducibility and assay comparability.
- Delivers quantitative outputs suitable for high-throughput evaluation of multiple interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical readouts with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust neuronal survival data.
- Supports biomarker development by quantifying protein expression changes alongside neuron counts.
Pipeline & Workflow Integration
This automated quantification method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging target validation, screening, and translational research phases.
- Discovery Biology: Provides objective neuron density measurements for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Offers reproducible, scalable quantification for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Generates exportable datasets for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity of disease-relevant endpoints across the pipeline.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other brain regions and protein markers, supporting broad R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and more efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on robust quantitative data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and image analysis parameter optimization.
- Needs access to compatible microscopy and automated analysis software infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptable across different brain regions and protein targets with appropriate validation.
- Accuracy depends on rigorous training and tuning of analysis software for single-cell identification.
