Name: Zbieranie i identyfikacja pyłku z kolonii pszczół miodnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj metody zbierania i identyfikacji pyłku z kolonii pszczół miodnych przy użyciu pułapek pyłkowych, sortowania kolorystycznego i acetolizy. Techniki te umożliwiają badanie zachowań żerowania zapylaczy i różnorodności roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Gretchen Jones (USDA-ARS, APMRU, College Station, TX) za pomoc w sortowaniu kolorów i analizie acetolizy. Badania te były wspierane przez fundusze badawcze przekazane R.R.S. przez Stowarzyszenie Pszczelarzy Stanu Oregon.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Różne style pułapek pyłkowych mają swoje zalety i konsekwencje. Poniżej omówiono zalety i ograniczenia czterech powszechnie stosowanych typów pułapek: (1) montowanych z przodu, (2) montowanych na dole, (3) z otworem ślimakowym i (4) z górnymi pułapkami. Pułapki montowane z przodu są najbardziej uniwersalnym stylem (rysunek 1B). Instalacja jest szybka i łatwa; Można to zrobić bez podnoszenia skrzynek ula, a te pułapki mogą pasować do każdego stylu wyposażenia ula Langstroth. Ponieważ taca zbiorcza znajduje się przed kolonią, zbiera minimalną ilość zanieczyszczeń z kolonii. Jednak taca zbiorcza jest również bardziej narażona na działanie czynników zewnętrznych - wilgoci z nawadniania pola, deszczowej lub wilgotnej pogody lub rosy może wejść w kontakt z pyłkiem przez tacę zbiorczą, potencjalnie czyniąc pyłek bezużytecznym, jeśli granulki staną się zbyt nasycone, aby je oddzielić. Ryzyko nasycenia pyłkiem można zmniejszyć, unikając pułapek podczas prognozowanych opadów deszczu lub wysokiej wilgotności. Umieszczenie gumowej maty pod pułapką i dodatkowego materiału pokrywającego (np. papy dachowej) na wierzchu łapacza pyłków może również chronić tacę zbierającą przed warunkami atmosferycznymi.
Do zbierania pyłku użyto pułapek montowanych od dołu dla danych w tym artykule (Rysunek 1A). Nie są tak wygodne w instalacji, ponieważ muszą być umieszczone pod gniazdem lęgowym kolonii. Instalacja jest czasochłonna i powoduje, że do pułapki wpada duża ilość zanieczyszczeń z kolonii, takich jak części pszczół i małe kawałki wosku. Podłoga tacki zbiorczej dla większości produkowanych syfonów montowanych od dołu wykonana jest z drobnej siatki, która umożliwia odpowiednią wentylację w celu ochrony zebranego pyłku przed wilgocią. Pułapki pyłkowe z otworem ślimakowym pomagają zminimalizować dezorientację zbieraczy, jeśli używają one głównie otworów świdrowych jako wejść do ula, a nie wejścia wykonanego przez dolną deskę ula (ryc. 1C). Ponieważ taca zbiorcza do osadników pyłków z otworem ślimakowym jest bardzo mała, należy ją często opróżniać, aby uniknąć przepełnienia tacki zbiorczej. Biorąc pod uwagę jej górne umiejscowienie w ulu, pułapka na pyłek montowana od góry jest najłatwiejszym stylem pułapki do zainstalowania i usunięcia, a zebrana próbka pyłku jest wolna od resztek ula. Jednak ten styl pułapki jest szczególnie wrażliwy na uszkodzony sprzęt ula, ponieważ taca zbiorcza byłaby narażona na wilgoć, gdyby pokrywa, wewnętrzna pokrywa i górna skrzynka ula nie były odpowiednio uszczelnione.
Opisane tu protokoły wymagają selekcji kolonii z dużymi populacjami osobników dorosłych i larw (krok 1.2). Ta metoda selekcji ma na celu wytworzenie bardzo dużych ilości uwięzionego pyłku z tych kolonii. Kolonie ze znacznymi populacjami żerującymi mogą doświadczać dużego zatłoczenia przy wejściu po zainstalowaniu pułapki. Wybór dużego wejścia do ula zmniejszy zatory w tunelu. Duże populacje żerujące mogą również zbierać bardzo duże ilości pyłku, które mogą przekraczać granice tacki zbiorczej. Używaj obszernych tac zbiorczych, jak widać w większości typów pułapek montowanych na dole lub od góry, i często opróżniaj tace, aby pomieścić duże ilości uwięzionych pyłków. Jeśli pożądanym celem badawczym jest ocena ilości pyłku zebranego przez rodziny rodzinne w pasiece, należy wybrać reprezentatywne rodziny, zamiast optymalizować populacje dorosłych i larw pod kątem selekcji. Wszystkie style łapaczy pyłku blokują wejście do ula i tworzą nowe wejście, które różni się przestrzennie od oryginalnego wejścia16. Pułapki pyłkowe często nie zbierają pyłku, gdy zbieracze nie są w stanie przeorientować się na nowe wejście pułapki pyłku po instalacji. Zbieracze ci łatwo dryfują do sąsiednich uli, potencjalnie zanieczyszczając krzyżowo inne próbki zbierające pyłek, jeśli dostaną się do innego ula z pułapką na pyłek. W związku z tym zbieracze powinni mieć co najmniej 24 godziny na zaaklimatyzowanie się do nowego wejścia, utrzymując mechanizm pułapki odłączony po instalacji. Wybór kolonii z niewielką liczbą dodatkowych wejść do ula lub bez nich zmniejsza również zamieszanie podczas orientowania się w kierunku nowego wejścia do pułapki na pyłki.
Dodatkowe wejścia do ula (np. i wypaczone pokrywy) powinny być uszczelnione, ale ryzyko dryfowania zbieraczek do sąsiednich uli wzrośnie, gdy wejścia te będą obecne na początku instalacji pułapki. Zbieracze będą również łatwo dryfować do innych wejść do uli, jeśli pułapka na pyłek jest zainstalowana tylko na jednym ulu w skupisku uli na paletach. Zbieracze są mniej skłonni do dryfowania, jeśli wszystkie ule skierowane w tym samym kierunku na palecie mają zainstalowane pułapki. Pułapki pyłkowe montowane od góry mogą stwarzać większe ryzyko dryfowania pszczół ze względu na znaczną odległość między wejściem do pułapki pyłkowej a pierwotnym wejściem do ula. Na potrzeby tego badania pułapki pyłkowe zainstalowano na wielu koloniach pszczół miodnych w każdym miejscu doświadczalnym, aby uwzględnić różnice w ilości pyłku i składzie taksonów między każdą kolonią pszczół miodnych. W związku z tym pułapki pyłkowe powinny być instalowane na wielu koloniach, aby uzyskać solidne zbiory pyłku z krajobrazu, ponieważ zbieranie pyłku może się znacznie różnić między koloniami w zależności od gatunku rośliny i całkowitej zebranej ilości12,13. Każda próbka pyłku miała 7-dniowy okres poboru. W przyszłych badaniach zbieranie pyłku w dwóch lub trzech kolejnych odstępach 72 godzin zwiększy dokładność szacowania paszy pyłkowej40.
Ze względu na wysoki stopień fluktuacji czasowych w zbieraniu pyłku, dokładność szacowania pyłku można zwiększyć, powtarzając proces zbierania pyłku we wczesnych, szczytowych i późnych okresach kwitnienia docelowych systemów uprawy 24,27,39. Pyłek powinien być zbierany z wielu lokalizacji, choć z tego samego systemu uprawy lub typu krajobrazu, ze względu na przewidywane różnice w ilości i typie gatunków roślin między lokalizacjami pasieki 14,27,33,43. Długotrwałe zatrzymywanie pyłku może być szkodliwe dla rodzin pszczelich miodnych. Potencjalne skutki obejmują ograniczenie odchowu czerwiu, skrócenie okresu wzrostu larw oraz kanibalizm jaj i młodych larw w ulach 19,44,45,46. Dłuższe okresy zatrzymywania pyłku, takie jak cały sezon wegetacyjny, mogą pogorszyć szkodliwy wpływ na odchów czerwiu w koloniach. Zatrzymywanie pyłków może również powodować zmniejszenie produkcji miodu i wzrost poziomu wilgotności przechowywanego miodu13. Rotacyjne pułapki pyłkowe między rodzinami w pasiece przy ciągłym monitorowaniu krajobrazu lub systemu upraw mogą złagodzić szkody wyrządzone koloniom wykorzystywanym do zatrzymywania pyłku. Angażowanie pułapek pyłkowych co drugi tydzień zmniejszy szkodliwe skutki, w szczególności straty w produkcji miodu, w przypadku zatrzymywania pyłku na tych samych koloniach przez pewien okres czasu13.
Ponadto pułapki pyłkowe najlepiej umieszczać na silnych koloniach. Czasami pułapki pyłkowe mogą przypadkowo się zatrzasnąć. Można tego uniknąć, blokując mechanizm pułapki pyłku, gdy zbieranie pyłku nie jest pożądane. Pułapki pyłkowe nie usuwają całego pyłku sercowego z zbieraczek pszczół miodnych. Skuteczność odłowu zależy od rodzaju pułapki, wielkości granulek pyłku, wielkości ciała pszczoły, pory dnia i warunków pogodowych. W związku z tym zbieranie pyłku w kształcie guza nie jest spójne w przypadku stosowania pułapek pyłkowych dla różnych gatunków roślin i okresów zbioru25,26. Mniejsze granulki pyłku z roślin takich jak Eucalyptus spp. i Tamarix spp. są mniej podatne na wychwycenie przez pułapki pyłkowe27. Warto zauważyć, że w tym badaniu nie znaleziono pyłku borówki wysokiej (Vaccinium corymbosum L.) z miejsc zbierania borówki wysokiej, co potwierdza wcześniejsze dowody na to, że granulki pyłku borówki wysokiej są zbyt małe do zbierania pułapki na pyłek47. Natomiast pyłek pochodzący z mniszka lekarskiego (Taraxacum officinale F.H. Wigg) znaleziono w każdym systemie upraw w tym badaniu. Granulki pyłku niektórych gatunków roślin mogą być również znacznie większe niż inne, takie jak Taraxacum spp., i mogą być nadreprezentowane w analizie zbiorów pyłku z pułapek pyłkowych27. Chwytanie pojedynczych zbieraczy pyłku i ręczne usuwanie ich pyłku w kształcie nasadki zwiększy dokładność oceny źródła pyłku, ale jest bardzo czasochłonne i zasobochłonne w porównaniu z użyciem pułapek pyłkowych (Tabela 1). Sortowanie granulek pyłku na grupy kolorów jest stosunkowo proste, chociaż jest czasochłonne. O ile nie ma konkretnego celu badawczego, ilość granulek pyłku powinna być ograniczona do 10 g lub mniej (dla danej próbki) w celu sortowania na grupy kolorystyczne. Sortowanie całych próbek, które zawierają większe ilości niż ta ilość, drastycznie wydłuży czas potrzebny do zakończenia analizy. Bardzo ważne jest jednak, aby próbka pyłku była bardzo dobrze wymieszana, zanim zostanie z niej pobrana podpróbka do sortowania kolorów. Niewymieszanie oryginalnej próbki może spowodować, że podpróbka nie będzie reprezentatywna dla całości, czego należy unikać.
Jeżeli oryginalny pojemnik na próbkę nie zawiera wystarczającej ilości wolnego miejsca, aby umożliwić dokładne wymieszanie granulek pyłku, umieszczenie całej próbki w dużej plastikowej torbie lub małej papierowej torbie powinno wystarczyć, nawet w przypadku dużych próbek. Sprawdzą się również twarde plastikowe pojemniki z pokrywką. Mieszanie próbki powinno odbywać się delikatnie, tak aby granulki pyłku nie zostały zgniecione lub w inny sposób zniszczone. Niezamierzona stronniczość może podświadomie przekonać kogoś do zgarnięcia "ładnych fioletowych granulek", na przykład podczas usuwania podpróbki z całości. W związku z tym kompozycja kolorystyczna próbki powinna być zasłonięta podczas pobierania podpróbki. W ten sposób uzyskanie podpróby, która jest naprawdę reprezentatywna dla całości, jest bardziej prawdopodobne. Jednak ta metoda podpróbkowania może nie wyselekcjonować granulek pyłku, które są w niskiej obfitości w próbce. W związku z tym, jeśli identyfikacja każdego pojedynczego taksonu roślin reprezentowanego w próbie jest celem badawczym, zebranie podpróby nie będzie właściwe; Cała próbka musi zostać poddana analizie. Dlatego granulki należy sortować na szklanej szalce Petriego. Po zakończeniu sortowania pod naczyniem można umieścić odpowiednie strony przewodnika kolorów Pantone, aby ułatwić dopasowanie kolorów między przewodnikiem a posortowanym pyłkiem. Przykład tego zilustrowano na rysunku 5.
Podczas zatrzymywania pyłku z kolonii pszczół miodnych umieszczonych w uprawach w celu zapylenia, nie należy stosować łącznie więcej niż dziesięciu grup kolorów: dziewięć pojedynczych kolorów i jedną "różną" grupę kolorów składającą się z kolorów mniejszościowych w próbce. Ustalenie rozsądnego limitu na maksymalną liczbę grup kolorów, na które można podzielić próbkę, zapobiega ugrzęźnięciu badacza w niekończącym się rozdzielaniu granulek na stale rosnącą liczbę niezwykle specyficznych grup, które po zakończeniu sortowania mogą indywidualnie nie zawierać wystarczających ilości do acetolizy. W przypadku odłowu z kolonii, które prawdopodobnie żerują na bardzo zróżnicowanym asortymencie gatunków roślin, może być konieczne zwiększenie liczby grup kolorów, a protokoły powinny być zoptymalizowane, aby odzwierciedlić ten wymóg. Niniejsze badanie koncentrowało się na próbkach pyłku pobranych z kolonii pszczół miodnych zapylających uprawy, a wiele taksonów było powszechnie znajdowanych w grupie kolorów, podobnie jak w poprzednich badaniach 29,30,31.
Acetoliza rozpuszcza lipidy, białka i zanieczyszczenia organiczne z powierzchni ziaren pyłku, ujawniając charakterystyczne cechy egzyny, dzięki czemu ziarna można łatwiej zabarwić i zidentyfikować. Jest to stara i powszechna metodologia stosowana w wielu rodzajach badań pyłku37. Ogólne kroki są ustandaryzowane; Różnią się one niewiele w zależności od protokołu. Jednak specyfika szybkości i czasu wirowania, temperatury i czasu trwania inkubacji, objętości odczynników zależnych od ilości pyłku, a nawet metody usuwania supernatantu (dekantacja vs pipetowanie) może wymagać eksperymentalnej optymalizacji zgodnie z celami badawczymi i, do pewnego stopnia, rodzajami pyłku, który można napotkać48. Rzeczywiście, acetoliza może usunąć ważne cechy diagnostyczne pyłku z niektórych taksonów, takich jak Malvaceae i Orchidaceae38. Dlatego nie wszystkie pyłki poddają się standardowym metodom acetolizy. Jak wspomniano powyżej, metody te zostały zoptymalizowane w tym badaniu w celu identyfikacji dominujących źródeł taksonu roślin w pyłku zbieranym przez pszczoły miodne zapylające rośliny. Szczegóły, które należy wziąć pod uwagę, jeśli dokładna kwantyfikacja ziaren pyłku jest częścią badania, nie zostały omówione w tym artykule.
Stosowanie rozpuszczalników i kwasów wymaga starannego planowania, odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE) i odpowiedzialnej utylizacji odpadów (rysunek 6). Bardzo ważne jest, aby naukowcy określili prawidłowy sposób przechowywania odczynników i utylizacji odpadów przed rozpoczęciem jakiejkolwiek części acetolizy. W tym laboratorium rękawice butylowe są używane podczas każdej części procesu, w którym występuje kwas siarkowy, a nawet lodowaty kwas octowy, ponieważ mają znacznie lepsze wskaźniki degradacji i przenikania dla obu kwasów niż rękawice nitrylowe, a jednocześnie nie wpływają negatywnie na zręczność49. Rozsądne byłoby zapoznanie się z wytycznymi bezpieczeństwa danej instytucji w celu uzyskania zaleceń dotyczących odpowiednich rękawic i innych środków ochrony indywidualnej49. Dodanie lodowatego kwasu octowego przed etapem acetolizy pomaga usunąć resztki wilgoci z próbki i przygotowuje ją do ważnej reakcji acetolizy. Lodowata mieszanina kwasu octowego i kwasu siarkowego na etapie acetolizy może gwałtownie reagować z wodą, dlatego ważne jest, aby wszystkie naczynia szklane i materiały eksploatacyjne były całkowicie suche, a cała wilgoć została usunięta z próbki przed acetolizą. Dodatek po acetolizie lodowatego kwasu octowego rozcieńcza i neutralizuje mieszaninę acetolizy.
W szczególności etanol i lodowaty kwas octowy mogą rozpuszczać tusz na etykietach probówek do mikrowirówek, jeśli odczynniki te kapią na zewnątrz probówki, nawet w przypadku pisaków odpornych na rozpuszczalniki. Często sprawdzaj etykiety tubek podczas całego procesu, aby upewnić się, że są nadal czytelne. Jeśli jest to logistycznie wykonalne, rozważ użycie etykiet drukowanych przez LaserJet jako zabezpieczenie przed taką możliwością. Sposób, w jaki supernatanty są dekantowane, będzie miał wpływ na to, czy odczynniki będą spływać po zewnętrznej stronie probówek do mikrowirówek. Ważne jest, aby dekantować supernatant pewną siebie, płynną ręką, co przychodzi z praktyką. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć utraty próbek pyłku z probówki wirówkowej podczas dekantacji. Zbyt szybka dekantacja grozi utratą części lub całości pozostałości pyłku; Zbyt wolna dekantacja może spowodować, że supernatant spłynie w dół probówki. Chociaż powszechnie zalecana jest temperatura inkubacji wynosząca 100 °C, pyłek może łatwo ulec "rozgotowaniu" w tej temperaturze w ilościach użytych w tym badaniu (0,25 g), zwłaszcza jeśli jest inkubowany przez nieco dłuższy czas29. W rzeczywistości nawet w temperaturze 80 °C ziarna pyłku mogą pękać lub w inny sposób ulec uszkodzeniu, jeśli pozostaną zbyt długo w mieszaninie acetolizy. Temperatura i czas trwania inkubacji muszą być dokładnie określone, aby uniknąć zniszczenia ziaren pyłku w próbce.
Barwienie pyłku zwiększa definicję i kontrast cech egzyny, ułatwiając fotografowanie i identyfikację (ryc. 7). Pięć kropli (z plastikowej pipety transferowej) 1% Safraniny O skutecznie zabarwiło 0,25 g pyłku. Jednak różne pyłki barwią się w różny sposób. Jeśli ziarna pyłku są zabarwione zbyt lekko lub zbyt mocno, identyfikacja może być trudna. Tam, gdzie jest to możliwe, objętość roztworu barwienia potrzebna do odpowiedniego zabarwienia gatunków pyłku, które mają zostać znalezione w badaniu, powinna zostać zatwierdzona przed rozpoczęciem przetwarzania próbek doświadczalnych. Niemniej jednak, jeśli jedna z próbek eksperymentalnych nie jest odpowiednio zabarwiona, można ją skorygować. Aby rozjaśnić próbkę pyłku, która jest zbyt mocno zabarwiona, należy spłukać próbkę wodą, a następnie etanolem. Jeśli pyłek nie jest wystarczająco dobrze wybarwiony, aby zobaczyć cechy wyróżniające, można dodać kilka dodatkowych kropel plamy. Plamę tych próbek należy sprawdzić przed dodaniem gliceryny. Podobnie, może być konieczne wykonanie kilku prób i błędów, aby określić idealną objętość gliceryny dla pozostałości pyłku. Piętnaście kropli gliceryny odpowiednio chroniło próbki w tym badaniu przed wysuszeniem, jednocześnie rozcieńczając pozostałości pyłku do stężenia idealnego do dalszej identyfikacji za pomocą mikroskopii świetlnej. Inne ilości pozostałości pyłku mogą wymagać większej lub mniejszej ilości gliceryny, aby zapobiec wysuszeniu i ułatwić montaż.

Zachodnia pszczoła miodna (Apis mellifera L.) jest ważnym zapylaczem wielu upraw rolnych, które zależą od zapylania przez pszczoły1. Przez ponad dekadę odnotowano znaczne straty w koloniach pszczół miodnych2,3,4,5,6,7,8,9. Kilka czynników, w tym pasożyty i choroby, złe odżywianie i pestycydy, jest związanych z tym spadkiem liczby kolonii10. Złe odżywianie można przypisać intensyfikacji rolnictwa i utracie siedlisk żerowania11. Konieczne jest zrozumienie zasobów kwiatowych wykorzystywanych przez pszczoły w różnych krajobrazach w celu poprawy odżywiania pszczół i pomocy w wysiłkach na rzecz ochrony pszczół. Pyłek jest głównym źródłem białka, lipidów, witamin i minerałów dla pszczół i był wykorzystywany w wielu badaniach rolniczych i ekologicznych w celu zrozumienia preferencji pszczół miodnych w zakresie żerowania na poziomie kolonii, oceny wpływu zatrzymywania pyłku na kolonie pszczół miodnych i określenia narażenia pszczół na pestycydy12,13,14.
Pszczoły miodne zbierają pyłek z kwiatów, pakują pyłek w granulki na swoim corbicula - koszyczku pyłkowym piszczelowym na tylnej nodze - i wracają do kolonii w celu przechowywania. Pyłek sercowy można usunąć z zbieraczek, chwytając je przy wejściu do ula lub na kwiatach, krótko schładzając w celu unieruchomienia, a następnie usuwając granulki pyłku z tylnych nóg za pomocą kleszczy. Pracochłonny proces ręcznego zbierania pyłku korboidalnego od indywidualnie schwytanych zbieraczy jest powolny i nieefektywny, jeśli wymaga się znacznej ilości pyłku. Prostszą i bardziej wydajną metodą zbierania dużych ilości pyłku jest zatrzymywanie granulek pyłku z pszczół miodnych przy wejściach do ula. Pułapki pyłkowe są zaprojektowane tak, aby usuwać pyłek z nóg powracających zbieraczy pyłku, gdy wchodzą one do ula15. Zbieracze muszą przeciskać się przez otwory w siatce, które są tak małe, aby umożliwić przejście ciała robotnicy pszczoły miodnej.
Gdy pszczoła miodna przechodzi przez jedną z tych, większe granulki pyłku są zeskrobywane z jej nóg i wpadają do tacki na zbieranie16. Badania wykazały, że zatrzymywanie pyłku stymuluje zbieraczy do zbierania większej ilości pyłku, zwiększając w ten sposób efektywność zapylania okolicznych upraw i roślinności17,18,19,20. Metodologie zbierania pyłku mogą być również wykorzystane do zrozumienia paszy wykorzystywanej przez pszczoły miodne w krajobrazie jako pierwszy krok do określenia ilości, jakości i taksonów gatunków roślin kwitnących. Skuteczne metodologie wychwytywania pyłku ułatwiają zatem zarówno badania nad zapylaniem, jak i żywieniem pszczół miodnych. Porównanie tych metod zbierania pyłku przedstawiono w tabeli 1. Zachowanie związane z żerowaniem pyłku zmieni się w zależności od zapotrzebowania kolonii na przechowywany pyłek w stosunku do poziomu populacji jaj i larw21,22. Ponieważ zmiany te obejmują różną intensywność zbierania, często oczekuje się dużych różnic w ilości pyłku między koloniami w tym samym miejscu i między różnymi lokalizacjami tego samego systemu upraw lub krajobrazu type23,24. Zwiększenie liczby kolonii i miejsc do zatrzymywania pyłku pomoże dostosować się do tej różnorodności.
Pułapki pyłkowe różnią się skutecznością25,26. Wielkość granulek pyłku zbieranych przez pszczoły miodne różni się w zależności od gatunku rośliny i może się zmieniać w zależności od poziomu zapasów pyłku w kolonii27,28. Stwarza to możliwość, że mniejsze granulki pyłku mogą być niedostatecznie reprezentowane, a większe granulki mogą być nadreprezentowane w próbkach pobranych za pomocą pułapek pyłkowych. Dorosłe pszczoły różnią się wielkością ciała, co może również wpływać na reprezentację pyłku zebranego w pułapkach. Istnieją również gatunki roślin, które głównie wytwarzają nektar, który nie zostanie wykryty, jeśli tylko oceni zebrany pyłek w niektórych krajobrazach. Na skuteczność odłowu wpływa również dryf i dezorientacja zbieracza, na którą wpływ ma rodzaj pułapki na pyłki i stan wyposażenia ula. Problem ten można złagodzić, stosując techniki opisane w tym artykule. Badacze mogą rozważyć dodatkowe techniki badawcze, takie jak liczenie wizyt kwiatów przez zbieraczy, w celu uzupełnienia wyników preferencji żywieniowych na poziomie kolonii. Przydatną metodą oceny różnorodności pyłku jest sortowanie pyłku sercowego według koloru. Chociaż pszczoły miodne są ogólnymi zbieraczami, wykazują również wierność kwiatom, gdy zbierają pyłek z tych samych gatunków roślin w tym samym miejscu podczas każdej podróży zbiorczej. Opierając się na tym zachowaniu żerowania, zakłada się, że każda osadka pyłku jądrowego jest głównie reprezentowana przez pojedynczy gatunek rośliny 27,29,30,31. W związku z tym naukowcy mogą opisać różnorodność pyłku, sortując pyłek sercowy według koloru granulek i podając całkowitą liczbę wykrytych kolorów lub proporcję całkowitej liczby reprezentowanej przez każdą grupę kolorów12,32,33,34. Można to osiągnąć, mierząc masę lub liczbę granulek w każdej grupie kolorów. Pomiar liczby osadów w każdej grupie kolorystycznej jest sugerowany, jeśli znane lub podejrzewa się systematyczne różnice w masie granulek pochodzących od różnych taksonów. Różnice systematyczne mogą być spowodowane wielkością granulek lub ilością nektaru, który zbieracze dodają do pyłku podczas formowania osadu.
Sortowanie kolorów jest szybkim i prostym procesem, ale może nie mieć akceptowalnej dokładności dla niektórych badań nad zapylaniem, ponieważ różne taksony roślin mogą mieć podobne kolory granulek pyłku35,36. Dodatkowo istnieje logistyczne ograniczenie liczby różnych grup kolorystycznych, na które można podzielić granulki pyłku. W związku z tym rozdzielenie każdego pojedynczego pyłku taksonu roślin na jego własną, odrębną grupę kolorów granulek może nie zawsze być możliwe w badaniach zapylania. Charakterystyka morfologiczna ziaren pyłku za pomocą mikroskopii świetlnej często uzupełnia separację kolorów granulek poprzez rozróżnienie pyłku dwóch lub więcej taksonów w granulkach o tej samej grupie kolorystycznej. Chociaż często zdarza się, że ziarna pyłku wielu taksonów znajdują się w danej grupie kolorów granulek pyłku, pojedyncze granulki pyłku zebrane przez pszczołę miodną na ogół stanowią jeden dominujący takson, ewentualnie z innymi taksonami w niewielkich ilościach. W związku z tym często zakłada się wierność taksonomiczną w granulkach pyłku sercowego pszczół miodnych. Granulki pyłku innych zapylaczy, które nie wykazują zachowania wierności kwiatom, takich jak trzmiele, często zawierają wiele gatunków roślin i mogą nie posiadać dominującego taksonu. W przypadkach, w których pożądane jest ilościowe oszacowanie proporcji taksonów w wielokwiatowych granulkach pyłku, do prawidłowej analizy wymagane są dodatkowo metody mikroskopowe, które obejmują acetolizę.
Ocena cech morfologicznych acetolizowanych ziaren pyłku jest najczęstszą metodą identyfikacji taksonomicznej16. Procedura acetolizy usuwa protoplazmę ziarna pyłku, aby uwidocznić cechy diagnostyczne, które można zaobserwować pod mikroskopem świetlnym37,38. Korzystając z tej metody, badacze mogą raportować różne taksony, częstotliwość występowania taksonów w określonych systemach upraw oraz dominujące taksony o kolorach granulek33,36. Acetoliza jest najlepszą techniką analityczną pozwalającą na ujawnienie morfologii pyłku28. Jednak niektóre acetolizowane ziarna pyłku, takie jak wiele typów Rosaceae, nie mogą być zidentyfikowane na poziomie rodzaju lub gatunku za pomocą samej acetolizy i mikroskopii świetlnej. Naukowcy rozważają skaningową mikroskopię elektronową lub metabarcoding jako alternatywne metody identyfikacji na poziomie rodzaju lub gatunku. Te alternatywne metody zapewniają jednak jedynie jakościową identyfikację taksonów i nie pozwalają oszacować proporcji różnych taksonów ziaren pyłku w granulkach pyłku wielokwiatowego36,39. Ponadto koszt i niezbędna wiedza specjalistyczna są znacznie wyższe w przypadku tych metod. Porównanie tych metod identyfikacji przedstawiono w tabeli 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metody</td>
			<td>Godzina</td>
			<td>wydatek</td>
			<td>rezolucja</td>
			<td>ekspertyza</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolekcja pyłków</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wychwytywanie pyłków</td>
			<td>niski</td>
			<td>umiarkowany</td>
			<td>zmienna</td>
			<td>umiarkowany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zbieranie pyłku</td>
			<td>wysoki</td>
			<td>umiarkowany</td>
			<td>wysoki</td>
			<td>niski</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Identyfikacja pyłku</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizualny (tylko sortowanie kolorów)</td>
			<td>umiarkowany</td>
			<td>niski</td>
			<td>niski</td>
			<td>niski</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetoliza</td>
			<td>umiarkowany</td>
			<td>umiarkowany</td>
			<td>umiarkowany</td>
			<td>umiarkowany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skaningowa mikroskopia elektronowa</td>
			<td>wysoki</td>
			<td>wysoki</td>
			<td>wysoki</td>
			<td>wysoki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metabarcoding (metabarcody)</td>
			<td>zmienna</td>
			<td>wysoki</td>
			<td>wysoki</td>
			<td>wysoki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Tabela 1: Porównanie różnych metod zbierania i identyfikacji pyłku w oparciu o czas, koszty, rozdzielczość i wiedzę. Metody wizualne (tylko sortowanie kolorów) podają całkowitą liczbę wykrytych kolorów lub proporcję sumy reprezentowaną przez każdą grupę kolorów jako metrykę do określania źródeł pyłku, ale nie zapewniają identyfikacji taksonów.
Dostępne informacje na temat wychwytywania i sortowania pyłków oraz acetolizowania ziaren pyłku są zróżnicowane i często rozproszone w wielu źródłach, różne dla badaczy z różnych dziedzin. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat różnych rodzajów pułapek pyłkowych, które mogą być wykorzystywane zarówno przez badaczy, jak i pszczelarzy do skutecznego zbierania dużych ilości pyłku cielesnego. Podano również protokoły przygotowania próbek pyłku - poprzez acetolizę, barwienie i montaż szkiełkowy - w celu identyfikacji taksonów roślin. Przedstawione tu metodologie są wszechstronne i służą jako unikalne źródło informacji na temat dominujących gatunków roślin, na których żerują pszczoły miodne w danym krajobrazie, w szczególności w systemach upraw. Zaprezentowano wyniki oparte na tych metodach z poprzedniego badania, które dokumentują różnorodność kolorów granulek pyłku i taksonów roślin z pyłku sercowego zebranego przez pszczoły miodne w pięciu systemach uprawy14.

<table><tbody><tr><td>#8 ściereczka</td><td></td><td></td> sprzętowa <td>apertura 2,7</td></tr><tr><td>mm cylinder</td><td></td><td></td><td></td>z podziałką</tr><tr><td>1000 ml końcówki</td><td></td><td></td><td></td>do mikropipet</tr><tr><td>1000 ml końcówki</td><td></td><td></td><td></td>do mikropipet z filtrem 1250 ml</tr><tr><td>szkiełka</td><td></td><td></td> podstawowe 15 x 75 mm <td>Grubość: 0,93 mm - 1,05 mm</td></tr><tr><td>Probówki</td><td></td><td></td><td></td> do mikrowirówek 2 ml</tr><tr><td>Zlewki ze szkła borokrzemianowego z podziałką 250 ml (x3)</td><td>VWR</td><td>10754-952</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki ze szkła borokrzemianowego z podziałką 50 ml (x6)</td><td>VWR</td><td>10754-946</td><td></td></tr><tr><td>95% EtOH Pharmco</td><td>AAPER</td><td>111000200DM55</td><td>ACS/USP/koszerne</td></tr><tr><td>rękawice</td><td></td><td></td><td></td>butylowo-winylowe</tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td>Maksymalna prędkość 1060 x g; preferowany obrót poziomy</td></tr><tr><td>Okulary</td><td></td><td></td><td></td>ochronne</tr><tr><td>Przewodnik po kolorach</td><td>Pantone</td><td>SKU: GP1601A</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe z solidną powłoką 1 lub 1,5</td><td></td><td></td><td>Grubość: 0,13 mm - 0,19 mm</td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wyciąg</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lodowcowy kwas octowy</td><td>BDH Chemikalia</td><td>BDH3092</td><td>Klasa ACS</td></tr><tr><td>Lejek</td><td></td><td></td><td></td>szklany</tr><tr><td>Gliceryna</td><td>Humco</td><td>103196001_1</td><td>Klasa USP, 99,5%, bezwodna</td></tr><tr><td>Pojemniki na odpady niebezpieczne Narzędzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>ula</td></tr><tr><td>Gorący blok</td><td></td><td></td><td>Musi osiągnąć 80 stopni C</td></tr><tr><td>Fartuch laboratoryjny z długimi rękawami</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lateks lub pianka</td><td></td><td></td><td></td>poliuretanowa</tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci, przezroczysty</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawice</td><td></td><td></td><td></td>nitrylowe</tr><tr><td>Pipeta P1000</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalka</td><td></td><td></td><td></td>Petriego</tr><tr><td>Łyżka</td><td></td><td></td><td></td>plastikowa</tr><tr><td>Safranin</td><td>Ward's Science</td><td>470302-322</td><td>Wędzarnia</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> klasy laboratoryjnej <td>Do instalacji pułapki na pyłki</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0320</td><td>Klasa ACS,</td></tr><tr><td>proszek Butelki do spryskiwania (x2)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kwas siarkowy</td><td>EMD Millipore</td><td>SX1244</td><td>Klasa ACS</td></tr><tr><td>Sundance Pułapka na pyłki do montażu na dole</td><td>Betterbee Pszczelarstwo Zaopatrzenie</td><td>Taśma</td> PTRAPB <td></td></tr><tr><td>Drewniane patyczki</td><td></td><td></td><td></td>do mieszania</tr><tr><td>Drewniane wykałaczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zbieranie i identyfikacja pyłku z kolonii pszczół miodnych

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Badacze często zbierają i analizują pyłek od pszczół miodnych, aby zidentyfikować źródła roślin, na których zbierają pyłek lub oszacować narażenie pszczół na pestycydy za pomocą pyłku. Opisana w niniejszym dokumencie jest skuteczna metoda zatrzymywania pyłku do zbierania pyłku sercowego od pszczół miodnych powracających do uli. Ta metoda zbierania powoduje uzyskanie dużych ilości pyłku sercowego, który można wykorzystać do celów badawczych. Pszczoły miodne zbierają pyłek z wielu gatunków roślin, ale zazwyczaj odwiedzają jeden gatunek podczas każdej podróży zbiorczej. Dlatego każda granulka pyłku sercowego reprezentuje głównie jeden gatunek rośliny, a każdą pastylkę pyłku można opisać kolorem. Pozwala to na sortowanie próbek pyłku sercowego według koloru w celu segregacji źródeł roślinnych. Naukowcy mogą dalej klasyfikować pyłek korbomienny, analizując morfologię acetolizowanych ziaren pyłku w celu identyfikacji taksonomicznej. Metody te są powszechnie stosowane w badaniach związanych z zapylaczami, takich jak wydajność zapylania, dynamika żerowania zapylaczy, jakość diety i różnorodność. Przedstawiono szczegółowe metodologie zbierania pyłku sercowego za pomocą pułapek pyłkowych, sortowania pyłku według koloru i acetolizowania ziaren pyłku. Zaprezentowano również wyniki dotyczące częstości występowania kolorów granulek i taksonów pyłku guzowatego zbieranego od pszczół miodnych w pięciu różnych systemach upraw.

W poprzednim badaniu przedstawiono ocenę różnorodności pyłku zbieranego przez pszczoły miodne z następujących upraw rolniczych: migdałowca, wiśni, borówki wysokiej, marchwi hybrydowej oraz pianki łąkowej14. Z zastosowaniem opisanych metod zebrano pyłek z koszyczków, posortowano go według koloru, a następnie zidentyfikowano roślinne źródła każdej grupy kolorystycznej granul, aby ocenić różnorodność pyłku. Pułapki pyłkowe montowane od dołu zainstalowano w rodzinach pszczelich w wielu lokalizacjach dla każdej uprawy (Rycina 1A). Ilość pyłku zebranego z każdej lokalizacji była wystarczająca, aby spełnić wymagania dotyczące masy próbek dla metod sortowania kolorystycznego i analizy acetolizy. Każda próbka zebranego pyłku zawierała kilka rozróżnialnych grup kolorystycznych (Rycina 2 oraz Rycina 3). W niektórych próbkach grupy kolorystyczne pyłku zawierały zaledwie 4-5 granul; jednak większość grup posiadała znacznie więcej, przez co stanowiły one osobną, oznakowaną grupę kolorystyczną do acetolizy (Rycina 4 oraz Rycina 5). Po przeprowadzeniu acetolizy (Rycina 6) zastosowano mikroskopię świetlną w polu jasnym, aby skutecznie zidentyfikować każdą grupę kolorystyczną do najniższego możliwego stopnia taksonomicznego, potwierdzając cechy morfologiczne z okazami referencyjnymi zebranymi z obszaru wokół każdego miejsca badania (Rycina 7). 
<img alt="Porównanie konfiguracji uli; schemat systemów wentylacyjnych A, B, C; badanie zachowania kolonii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Pułapki pyłkowe zainstalowane w rodzinie pszczelarskiej w celu zbierania pyłku z koszyczków. (APułapki montowane od dołu, umieszczone nad dnem ula i bezpośrednio nad najniższym korpusem ula. Inne rodzaje pułapek na pyłek obejmują (B) montaż przedni i (Cpułapki z wejściem w postaci otworu świdrowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Pszczoły oddziałujące na siatce drucianej w badaniu zachowania pszczół, koncentrującym się na komunikacji i dynamice ula." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Mechanizm przechwytujący i taca zbiorcza pułapki pyłkowej. Powracające pszczoły zbieraczki pyłku muszą przecisnąć się przez siatkowy mechanizm przechwytujący, zanim dotrą do swojego ula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Konfiguracja pułapki na pyłek pszczeli; metoda zbierania z ula; eksperyment pszczelarski; zrównoważone pszczelarstwo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Tacka zbiorcza pułapki na pyłek. Pyłek korbikularny jest zgarniany z nóg powracających pszczół zbieraczek przez pułapkę na pyłek i wpada do tacki zbiorczej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment porównawczy kolorów; wzornik Pantone i nasiona w szalce Petriego, zestaw do precyzyjnych pomiarów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Sortowanie próbki pyłku korbिकुलरnego na grupy kolorystyczne. Pyłek korbिकुलरny można wysuszyć i zważyć po posortowaniu na grupy kolorystyczne, aby określić proporcje zebranych granulek różnych kolorów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment analizy kolorystycznej z czterema próbkami na paskach Pantone w szalkach Petriego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Cztery grupy peletek pyłku posortowane według koloru przy użyciu przewodnika kolorów Pantone. Grupy kolorystyczne zostały oznaczone jako (A) szary, Pantone 5855C, (B) brązowy, Pantone 7557C, (C) żółty, Pantone 458C oraz (D) jasnobrązowy, Pantone 3547C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig05large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Ustawienie stanowiska laboratoryjnego z pipetami, kolbami i butelkami do eksperymentów i analiz chemicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Konfiguracja sprzętu do acetolizy wewnątrz dygestorium. Blok grzejny, odczynniki, pojemniki na odpady rozpuszczalnikowe i kwasowe, opisane zlewki, pipeta, końcówki do pipety, mieszadełka i probówki do mikrocentryfug znajdujące się wewnątrz dygestorium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obserwacja krwinek czerwonych, obraz mikroskopowy; biologia komórki, badanie hematologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Mikrografia barwionych, acetolizowanych ziaren pyłku. Wiele ścianek acetolizowanych ziaren pyłku gorczycy (Brassicaceae) przy powiększeniu 40x. Pasek skali = 50,398 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Pyłek zebrany z obszarów upraw migdałowca charakteryzował się stosunkowo niższą różnorodnością niż pyłek z innych upraw, ze średnią wynoszącą 3,0 ± 0,5 kolorów granulek oraz 3,2 ± 1,2 taksonów roślin na stanowisko (Tabela 2)14. Pozostałe cztery systemy upraw wykazywały wyższe poziomy różnorodności pyłku, ze średnią 6,0 ± 2,0 kolorów granulek i 8,0 ± 1,5 taksonów roślin na stanowisko w przypadku wiśni, 8,8 ± 1,4 kolorów granulek i 13,5 ± 2,0 taksonów roślin na stanowisko w przypadku borówki wysokiej, 7,0 ± 1,0 kolorów granulek i 11,0 ± 0,0 taksonów roślin na stanowisko w przypadku marchwi hybrydowej oraz 10,0 ± 0,0 kolorów granulek i 13,0 ± 1,5 taksonów roślin na stanowisko w przypadku pianki łąkowej14.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kadrowanie</td>
			<td>Średnia liczba kolorów granulek pyłku na stanowisko (SE)</td>
			<td>Średnia liczba taksonów roślin na stanowisko (SE)</td>
			<td colspan="3">Całkowita liczba zidentyfikowanych taksonów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Rodzina</td>
			<td>Rodzaj</td>
			<td>Gatunki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Migdał</td>
			<td>3.0 (0.5)</td>
			<td>3.2 (1.2)</td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borówka amerykańska</td>
			<td>8.8 (1.4)</td>
			<td>13.5 (2.0)</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marchew</td>
			<td>7.0 (1.0)</td>
			<td>11.0 (0.0)</td>
			<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wiśnia</td>
			<td>6.0 (2.0)</td>
			<td>8.0 (1.5)</td>
			<td>4</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>limnanorys</td>
			<td>10.0 (0.0)</td>
			<td>13.0 (1.5)</td>
			<td>5</td>
			<td>4</td>
			<td>14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Tabela 2: Różnorodność pyłku w koszyczkach zebranych od pszczół miodnych w pięciu systemach upraw. Metryki różnorodności obejmują średnią liczbę kolorów grudek pyłku (± SE), średnią liczbę taksonów roślin (± SE) oraz całkowitą liczbę zidentyfikowanych taksonów. Tabela została zmodyfikowana na podstawie źródła14. Skrót: SE = błąd standardowy.

Opisujemy metody zbierania pyłku sercowego od pszczół miodnych, a także protokoły sortowania kolorów, acetolizy i preparatu mikroskopowego pyłku do identyfikacji taksonomicznej. Ponadto prezentujemy barwę granulek i różnorodność taksonomiczną pyłku guzowatego zebranego z pięciu systemów upraw z wykorzystaniem pułapek pyłkowych.

Zbieranie i identyfikacja pyłku z kolonii pszczół miodnych

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

W niniejszym protokole opisano trzy metody: zbieranie pyłku sercowego za pomocą pułapek pyłkowych, sortowanie pyłku według koloru i acetolizę. Metody te są powszechnie stosowane w badaniach związanych z zapylaczami, takimi jak wydajność zapylania, dynamika żerowania zapylaczy oraz jakość i różnorodność diety. Zatrzymywanie pyłku to łatwy sposób na zbieranie dużych ilości pyłku z kolonii pszczół miodnych.Sortowanie granulek pyłku według koloru jest niedrogą metodą klasyfikacji pyłku, która wymaga niskiej wiedzy specjalistycznej, a acetoliza pozwala zidentyfikować takson roślin związany z każdym kolorem granulek. Procedurę zademonstrują Ellen Topitzhofer, asystentka naukowa wydziału, oraz Emily Carson, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Na początek określ, kiedy należy zatrzymać pyłek z żądanej lokalizacji pasieki i wybierz optymalne rodziny pszczół miodnych do zatrzymywania pyłku.Oceń siłę kolonii, licząc zbieraczki powracające do wejścia do kolonii przez dwie minuty, a następnie wybierz kolonie o największej łącznej liczbie powracających zbieraczek. Wybierz ule z drewnianymi naczyniami, które są w dobrym stanie, najlepiej bez dodatkowych wejść i wypaczonych pokryw. Używaj kolonii z mniejszą liczbą alternatywnych wejść, ponieważ pszczoły zbieraczki powracające do takich kolonii są bardziej skłonne do zmiany orientacji do wejścia do pułapki.Jeśli to możliwe, wybieraj wejścia do ula od strony południowej. Jeśli ule są paletyzowane, zainstaluj pułapki na pyłki na każdej kolonii skierowanej w tym samym kierunku na danej palecie, aby uniknąć dryfu zbieraczy do sąsiednich wejść do ula. W razie potrzeby oceń gniazdo lęgowe kolonii, sprawdzając ramki pod kątem obecności larw i wybierz kolonie ze stosunkowo dużą ilością larw.Następnie zainstaluj pułapki pyłkowe na wybranych rodzinach pszczół miodnych. W przypadku pułapek montowanych z przodu przymocuj pułapkę przed wejściem za pomocą zszywek, i taśmy lub podłącz pułapkę do linek bungee owiniętych wokół ula. Uszczelnij wszystkie inne możliwe wejścia do kolonii nieprzylepnym i nadającym się do formowania materiałem, takim jak lateks lub pianka poliuretanowa lub tkanina sprzętowa numer osiem do otworów świdra.Użyj taśmy klejącej do małych pęknięć. Jeśli używasz syfonów montowanych z przodu, które znajdują się w ulach na poziomie gruntu, umieść barierę, taką jak gumowa mata, między koszem zbiorczym a trawą, aby uniknąć uszkodzenia przez wilgoć spowodowaną rosą. Włączyć mechanizm wychwytywania łapacza pyłku 24 godziny po zainstalowaniu i przed rozpoczęciem dziennego lotu w poszukiwaniu żerowania.Zbierz konkretny pyłek sercowy z tacki zbiorczej i umieść go w plastikowych torebkach lub probówkach wirówkowych, a następnie przechowuj w lodówce z lodem. Użyj szufelki lub dużej łyżki, aby zgarnąć 10 gramów pyłku jako reprezentatywną podpróbkę. Usuń wszystkie części pszczół i zanieczyszczenia z podpróbki, a następnie posortuj każdą granulkę pyłku z 10-gramowej podpróbki na grupę kolorów, używając zarówno koloru pyłku, jak i tekstury, aby rozróżnić grupy.Aby zapewnić co najmniej 0,25 grama każdej grupy kolorów dla dalszych etapów, umieść wszelkie granulki, które nie są wystarczająco obfite, aby utworzyć grupę kolorów o wadze co najmniej 0,25 grama, w różnej grupie. Nazwij każdą pojedynczą grupę kolorów, korzystając z wzornika kolorów Pantone. Odważ 0,25 grama granulek pyłku z każdej grupy kolorów.Załóż odpowiednie środki ochrony osobistej. Następnie powoli dodaj 500 mikrolitrów lodowatego kwasu kwaśnego do każdej probówki mikrowirówki zawierającej 0,25 grama pyłku z grupy kolorów. Podczas oględzin rurki mieszaj pyłek czystą wykałaczką przez 10 do 15 sekund.Odwirować próbkę przez trzy minuty w temperaturze 1,100 razy G, a następnie zdekantować supernatant do zlewki na odpady kwasu. Aby przygotować mieszaninę acetolizy, dodaj 10,8 mililitra lodowatego kwasu kwaśnego do zlewki oznaczonej mieszaniną acetolizy. Następnie powoli dodawać 1 200 mikrolitrów stężonego kwasu siarkowego z roztworu podstawowego.Powoli dodaj 1 000 mikrolitrów mieszaniny acetolizy do każdej probówki i mieszaj czystą wykałaczką przez 10 do 15 sekund. Umieść próbki na bloku grzewczym podgrzanym do 80 stopni Celsjusza. Inkubuj probówki przez pięć minut, dokładnie mieszając każdą probówkę czystą wykałaczką w połowie inkubacji.Po inkubacji powoli dodaj 500 mikrolitrów lodowatego kwasu octowego do każdej probówki i mieszaj czystą wykałaczką przez 10 do 15 sekund. Odwirować próbki, a następnie zdekantować supernatant z każdej probówki do zlewki na odpady kwasowe. Przepłucz każdą próbkę trzykrotnie wodą, dodając 1 000 mikrolitrów wody destylowanej do każdej probówki i mieszając czystą wykałaczką.Odwirować próbki i zdekantować supernatant z probówek do zlewki z wodorowęglanem sodu. Następnie powtórz płukanie wodą jeszcze dwa razy. Dodaj 1 000 mikrolitrów 95% etanolu ze zlewki etanolu do każdej probówki i wymieszaj czystą wykałaczką.Następnie odwirować próbki i zdekantować supernatant z probówek do zlewki na odpady etanolu. Wymieszaj roztwór podstawowy safraniny-O i dodaj od 5 do 10 kropli do każdej probówki. Mieszaj wykałaczką przez 10 do 15 sekund i pozostaw wykałaczkę w tubce.Dodaj 1 000 mikrolitrów 95% etanolu ze zlewki etanolu do każdej probówki i wymieszaj. Po odwirowaniu próbek zdekantować supernatant do zlewki na odpady etanolu. Dodaj 10 do 15 kropli gliceryny do każdej probówki i mieszaj zawartość przez 10 do 15 sekund.Pozostaw rurki otwarte w dygestorium, aby odparować etanol przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej otoczenia. Etykietowanie szkiełek mikroskopowych do identyfikacji pyłków. Usuń jedną kroplę pozostałości pyłku z probówki i umieść ją na środku oznakowanego szkiełka mikroskopowego, pozwalając, aby kropla lekko się rozprzestrzeniła.Umieść czyste szkiełko nakrywkowe na kropli na szkiełku podstawowym i uszczelnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka przezroczystym lakierem do paznokci. Za pomocą opisanych metod zebrano pyłek sercowy, posortowano go według koloru i zidentyfikowano źródła roślinne każdej grupy kolorów granulek w celu oceny różnorodności pyłku. Każda próbka zebranego pyłku miała wiele rozróżnialnych grup kolorów.W niektórych próbkach grupy barwne pyłku zawierały zaledwie cztery do pięciu granulek. Jednak większość grup miała ich znacznie więcej i służyła jako osobna grupa kolorów oznaczonych do acetolizy. Po acetolizie wykorzystano mikroskopię światła jasnego pola, aby skutecznie zidentyfikować każdą grupę kolorów do jej najniższej możliwej rangi taksonomicznej poprzez potwierdzenie cech morfologicznych z cechami próbek kuponów pobranych z obszaru otaczającego każde miejsce badania.Pyłek zebrany z lokalizacji upraw migdałów miał stosunkowo niższą różnorodność pyłku niż pyłek zebrany z innych upraw, ze średnio trzema kolorami granulek w 3,2 taksonach roślin na miejsce Posortowany pyłek można przetestować pod kątem pestycydów w celu wyjaśnienia agrochemikaliów znajdujących się na roślinach pastewnych pszczół miodnych lub przeanalizować pod kątem składu chemicznego w celu określenia jego wartości odżywczej dla pszczół miodnych. Wyniki tych badań dostarczyły cennych informacji na temat różnorodności gatunkowej obserwowanej w pyłku zbieranym przez kolonie, podkreślając znacznie niską różnorodność pyłku zbieranego w systemach uprawy migdałów.

collection-and-identification-of-pollen-from-honey-bee-colonies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym protokole pokazujemy, jak kondycjonować zaprzęgnięte pszczoły miodne do bodźców dotykowych i wprowadzamy technikę przechwytywania ruchu 2D do analizy kinematyki wzorca próbkowania anteny na małą skalę.

Kondycjonowanie dotykowe i analiza ruchu w strategiach pobierania próbek czułków u pszczół miodnych (Apis mellifera L.)

U robotnic pszczół miodnych starzenie się zależy od zachowań społecznych, a nie od wieku chronologicznego. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób można uzyskać i przeanalizować typy pracowników o bardzo różnych wzorcach starzenia się pod kątem starzenia się komórek.

Uzyskiwanie próbek ze spowolnionym, przyspieszonym i odwróconym starzeniem w modelu pszczoły miodnej

Oto metody ilościowego określania składników odżywczych w pyłku przed i po jego przemianie w pierzgę przez dwa podgatunki pszczół miodnych. Opisujemy techniki pomiaru spożycia pierzgi pszczelej i wynikających z niej mian białek w obu podgatunkach.

Metody porównywania składników odżywczych w pierzgach wytwarzanych przez zafrykanizowane i europejskie pszczoły miodne oraz wpływ na miana białek hemolimfy

Tutaj opisujemy nasz szczegółowy protokół przygotowania jednokohortowych kolonii pszczół miodnych - użyteczne narzędzie do analizy fizjologii pracowników związanych z rolą. Opisujemy również szczegółowe protokoły leczenia pracowników hormonem juwenilnym i ekdyzonem, aby ocenić udział tych hormonów w regulacji zachowania i/lub fizjologii pracowników.

Przygotowanie kolonii jednokohortowych i leczenie hormonalne robotnic pszczół miodnych w celu analizy fizjologii związanej z rolą i/lub układem hormonalnym

Konsorcja mikrobiologiczne w ulach trzmieli wzbogacają i zachowują pyłek dla larw pszczół. Wykorzystując sekwencjonowanie nowej generacji, wraz z eksperymentami laboratoryjnymi i terenowymi, manuskrypt ten opisuje protokoły stosowane do testowania hipotezy, że pozostałości fungicydów zmieniają mikrobiom pyłku i demografię kolonii, ostatecznie prowadząc do utraty kolonii.

Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół

Subletalne dawki pestycydów mogą wpływać na kolonie w sposób, który jest trudny do wykrycia przy użyciu tylko metod okresowych lub wizualnych. Podano metody pomiaru całkowitej masy dorosłych pszczół, czerwiu i zasobów pokarmowych poprzez ważenie uli i części ula, fotografowanie ramek i instalowanie czujników. Poruszana jest również kwestia analizy danych.

Monitorowanie wpływu narażenia na subletalne pestycydy na pszczoły miodne na poziomie kolonii

Spraye fungicydowe na kwitnące rośliny mogą narażać samotne pszczoły na wysokie stężenia pozostałości fungicydów przenoszonych przez pyłki. Wykorzystując eksperymenty laboratoryjne z udziałem larw pszczół hodowanych in vitro, badanie to bada interaktywne efekty spożywania pyłku poddanego działaniu fungicydów pochodzącego z roślin żywicielskich i niebędących żywicielami.

In vitro Hodowla pszczół samotnic: narzędzie do oceny czynników ryzyka larw

Prezentujemy nieśmiercionośny i zautomatyzowany mechanizm zbierania pyłku od robotnic trzmieli (Bombus) powracających do ula. W zestawie znajduje się instrukcja produkcji, przygotowania, instalacji i użytkowania urządzeń. Dzięki wykorzystaniu obiektów wydrukowanych w 3D, modyfikacja projektu była terminowa, wydajna i pozwoliła na szybki czas na testy.

Wydrukowana w 3D pułapka na pyłki dla wejść do ula Bumble Bee (Bombus)

Tutaj opisujemy dwa protokoły: pierwszy do rozmnażania, ekstrakcji, oczyszczania i ilościowego oznaczania dużych ilości bezotoczkowych cząsteczek wirusa pszczoły miodnej, w tym metoda usuwania poczwarek pszczół miodnych, a drugi do testowania skutków infekcji wirusowej za pomocą wysoce powtarzalnego, wysokoprzepustowego testu biologicznego w klatce.

Przygotowanie inokulum wzbogaconego wirusem do doustnego zakażenia pszczół miodnych (Apis mellifera)

Ulepszona metoda pomiaru profili nawodnienia pyłku u Arabidopsis thaliana jest opisana tutaj. Nowa metoda oferuje wyższą rozdzielczość, jest nieinwazyjna i wysoce odtwarzalna. Protokół stanowi nowe narzędzie do dokładniejszej analizy procesów regulujących wczesne etapy zapylania.

Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana

Pokazujemy sprawdzoną metodę bezpiecznego obchodzenia się z pszczołami zebranymi na polu. Metoda ta umożliwia szybką manipulację, identyfikację, pobieranie próbek genetycznych i potwierdzanie interakcji między roślinami a owadami za pomocą pyłku pobranego podczas pobierania próbek. Podejście to, łatwe do adaptacji, oferuje opłacalny, nieśmiercionośny sposób badania rzadkich grup owadów.

Szybka metoda ograniczania i bezpiecznego obchodzenia się z pszczołami w terenie

Poznaj metody zbierania i identyfikacji pyłku z kolonii pszczół miodnych przy użyciu pułapek pyłkowych, sortowania kolorystycznego i acetolizy. Techniki te umożliwiają badanie zachowań żerowania zapylaczy i różnorodności roślin.

Zbieranie i identyfikacja pyłku z kolonii pszczół miodnych

Przeglądaj więcej filmów