Name: Przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Naucz się przygotowywać zarodki kurczaków i błonę moczowo-omoczniową jako model in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym oraz badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Nauki Stosowane i Inżynieryjne (TTW) (Vidi-project 17543), część NWO. Autorzy pragną podziękować Robertowi Beurskensowi, Luxi Wei i Rezie Pakdamanowi Zangabadowi z Wydziału Inżynierii Biomedycznej oraz Michielowi Mantenowi i Geertowi Springelingowi z Wydziału Eksperymentalnego Oprzyrządowania Medycznego za pomoc techniczną, wszyscy z Erasmus MC University Medical Center Rotterdam w Holandii.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje trzy metody pozyskiwania i wykorzystywania zarodków kurcząt w wieku od 5 do 8 dni i ich CAM jako modelu in vivo do badania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków. Najbardziej krytyczne kroki przy wyjmowaniu zarodków 5-dniowych (sekcja 1.2) i 6 do 7-dniowych (sekcja 1.3) ze skorupy to: 1) wykonanie małego otworu w górnej części jaja, aby przejść przez całą skorupkę jaja do worka powietrznego przed wyjęciem białka jaja; 2) Utwórz gładkie krawędzie dla dużego otworu w powłoce. W przypadku metody wyjmowania 8-dniowych zarodków ze skorupy (sekcja 1.4) najbardziej krytycznymi krokami są: 1) Wykonaj wystarczającą liczbę wgłębień, aby utworzyć ładne pęknięcie wzdłuż jaja; 2) Trzymaj jajko zanurzone w PBS. Aby zapewnić żywotność zarodka we wszystkich metodach, ważne jest, aby przechowywać komórkę jajową i jej zawartość w temperaturze 37 °C. Ponadto należy unikać wstrzykiwania do tętnicy CAM. Zaleca się wizualne monitorowanie częstości akcji serca zarodka podczas badań w celu zapewnienia żywotności zarodka. Aby potwierdzić dokładny etap rozwoju zarodka, można posłużyć się wskazaniem Hamburger & Hamilton22.
Ważne jest, aby zapobiec uszkodzeniu zarodka, CAM i worka żółtkowego. To uszkodzenie może wpływać na żywotność, przepływ krwi i widoczność zarodka i CAM. Ponadto uszkodzenie worka żółtkowego, a co za tym idzie niska sztywność membrany, uniemożliwia wstrzyknięcie do naczyń CAM. 5-dniowy zarodek ma stosunkowo mały worek powietrzny, więc aby móc zrobić wystarczająco duży otwór w skorupce, przez który można usunąć zawartość jaja, należy pobrać 2 ml białka jaja. W rezultacie powstaje większa przestrzeń między skorupką jaja a zarodkiem. Po wyjęciu białka jaja kawałek taśmy musi zamknąć otwór, w który weszła igła. Jeśli białko jaja nadal wycieka, nałóż kolejny kawałek taśmy. Poza tym nałożenie taśmy na otwór z boku wytwarza podciśnienie wewnątrz jajka, które zapobiega wypadaniu zawartości jajka pod własnym ciężarem, gdy duży otwór zostanie utworzony w kroku 1.2.2.8. Do uszkodzenia zarodka lub CAM może dojść również wtedy, gdy krawędź skorupki jaja była zbyt ostra lub gdy zawartość jaja jest wrzucana do łodzi wagowej zbyt rygorystycznie, dlatego skorupka jaja powinna być trzymana bardzo blisko łodzi do ważenia. Między 5 a 6 dniem rozwoju CAM zaczyna przyczepiać się do membrany powłoki32. To przywiązanie zwiększa ryzyko uszkodzenia zarodka i CAM podczas wyjmowania zawartości jaja ze skorupki jaja. Otwierając jajo po wstrzyknięciu do niego PBS w przypadku jaja inkubowanego przez 6 do 7 dni lub w pojemniku wypełnionym PBS, jak opisano dla jaja inkubowanego przez 8 dni, zmniejsza się ryzyko uszkodzenia. Jeśli chodzi o wstrzyknięcie do żyły CAM: jeśli pierwsze wstrzyknięcie nie powiedzie się, drugie wstrzyknięcie można wykonać dalej w górę tej samej żyły, jeśli uszkodzenie było niewielkie lub w innej żyle CAM. Oddzielenie zarodka i CAM od żółtka sprawia, że naczynia zarodkowe i CAM są optycznie przezroczyste. W konsekwencji zarodek traci swoje główne źródło składników odżywczych33. Ta utrata składników odżywczych może być wyjaśnieniem obserwowanego niższego częstości akcji serca wynoszącego 80 uderzeń na minutę w porównaniu do ~190 dla 6-dniowego zarodka, który nadal ma kontakt z żółtkiem30 i skróconego czasu przeżycia do 2 godzin po tej procedurze separacji. Innym czynnikiem, który może odgrywać rolę w obniżeniu częstości akcji serca i skrócenia czasu przeżycia, jest wyzwanie polegające na utrzymaniu oddzielonego żółtkiem zarodka i naczyń CAM w temperaturze 37 °C. Pomocne może być inkubator ze stopniem mikroskopowym. Oprócz tego oderwanie się CAM od żółtka prawdopodobnie prowadzi do zmian mechanicznych w tkance, ponieważ napięcie błony staje się mniejsze. Niższe napięcie błony może powodować zwiększone tempo ścinania naczyń wewnętrznych, co prowadzi do niższego tętna.
Naczynia ex ovo chicken embryo i CAM mają pewne ograniczenia, podobnie jak model in vivo, w tym tylko krótkie obserwacje czasowe, do obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków. Ze względu na małą objętość krwi wynoszącą 100±23 μl w 5. dniu i 171±23 μl w 6.34. dniu, można wstrzyknąć maksymalną objętość ~5 μl. W późniejszych stadiach rozwoju (7 dzień i starsze) sztywność naczyń wzrasta, a elastyczność żółtka maleje. Może to skomplikować udane wstrzyknięcie w starszych zarodkach. Po wstrzyknięciu mikropęcherzyki krążą przez wiele godzin, ponieważ zarodek kurczaka nie ma na tym etapie w pełni rozwiniętego układu odpornościowego35. W związku z tym mikropęcherzyki nie są usuwane w ciągu ~6 minut, jak u ludzi36,37, co sprawia, że typowe badania ultrasonograficzne obrazowania molekularnego z 5-10-minutowym okresem oczekiwania na usunięcie niezwiązanych docelowych mikropęcherzyków38 są niewykonalne. W celu celowania w mikropęcherzyki należy użyć odpowiednich ligandów zdolnych do wiązania się z komórkami śródbłonka ptaków, takich jak opisane wcześniej dla markera angiogenezy αvβ37. Inne aspekty, które należy wziąć pod uwagę w tym modelu, to zwiększona trudność oddzielenia naczyń zarodkowych i CAM od żółtka u starszych zarodków (> 8 dni) oraz niższy hematokryt o ~20%39 w porównaniu z ludźmi. To ostatnie może wpływać na oscylacje mikropęcherzyków, ponieważ wiadomo, że oscylacje mikropęcherzyków są tłumione w bardziej lepkim środowisku40. Tętnice CAM są mniej natlenione niż żyły CAM41,42. Różnica ta powinna być brana pod uwagę np. przy badaniu fotoakustycznego obrazowania natlenienia krwi.
Opisane tutaj metody pozwalają na pobranie zawartości jaja ze skorupki jaja w dniu obrazowania ultrasonograficznego lub badania dostarczania leku, zwykle w 5 do 8 dniu inkubacji. Różni się to od istniejących metod, w których zawartość jaj jest wyjmowana ze skorupki po 3-dniowej inkubacji i dalej rozwijana jako hodowla ex ovo 18,20,21. Zaletami są wyższy wskaźnik przeżywalności wynoszący 90% dla jaj 5-dniowych, 75% dla 6-dniowych, 50% dla 7-dniowych i 60% dla 8-dniowych jaj inkubowanych w porównaniu do ~50% dla 3-dniowych zarodków wyjętych ze skorupki jaja i dalej inkubowanych ex ovo 1,18, unikanie antybiotyków podczas hodowli18, 20 i duży sterylny inkubator do hodowli Ex ovo. Przeżywalność zarodków w wieku od 6 do 8 dni jest niższa, ponieważ CAM zaczyna przyczepiać się do otoczki21, co sprawia, że błona CAM jest bardziej podatna na pękanie po ekstrakcji. Opisano również oddzielenie zarodka od CAM od żółtka, dzięki czemu zarodek i CAM są optycznie przezroczyste.
Umieszczając zawartość jaj w różnych konfiguracjach, zarodek kurzy i CAM mogą być wykorzystywane do wielu badań obrazowania ultrasonograficznego, takich jak IVUS, fotoakustycznie, bez lub z ultradźwiękowymi środkami kontrastowymi w 2D i 3D. Można skupić się na opracowywaniu nowych schematów pulsacji ultradźwiękowych lub testowaniu nowatorskich przetworników. Poza tym model może być również wykorzystany do badania nowych ultrasonograficznych środków kontrastowych i ich zachowania w naczyniach krwionośnych pod przepływem. Ponieważ mechanizm dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków jest nadal nieznany43, zastosowanie modelu CAM in vivo może pomóc w wyjaśnieniu tego mechanizmu poprzez badanie zachowania mikropęcherzyków w odniesieniu do odpowiedzi komórkowej. Wreszcie, naczynia CAM okazały się odpowiednim systemem do badania przeszczepu guza ksenoprzeszczepu44. Stwarza to możliwość wykorzystania naczynia CAM jako modelu do badania obrazowania guza za pomocą ultradźwięków oraz do badania przepływu krwi wewnątrz guza za pomocą CEUS. Guzy są zwykle przeszczepiane na naczyniach CAM 8 lub 9-dniowych zarodków 1,14,45, w przypadku których zarodek jest wyjmowany ze skorupki jaja w 3 dniu inkubacji i dalej rozwijany ex ovo. Metody opisane w tym protokole mogą być stosowane do hodowli zarodków in ovo do dnia przeszczepu guza.
Autorzy mają nadzieję, że praca ta będzie pomocna dla badaczy, którzy chcą wykorzystać zarodki kurczaka i ich błonę kosmówkowo-omoczniową (CAM) jako model in vivo do zastosowań środków kontrastowych i badań przepływu.

Ex ovo zarodki kurcząt i bogata w naczynia krwionośne błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) okazały się odpowiednim modelem do badania różnych procesów biologicznych i biomedycznych, takich jak embriogeneza, onkologia i dostarczanie leków1,2,3,4. Ultradźwięki zostały wykorzystane do obrazowania rozwoju embrionalnego serca 4,5 oraz do aktywacji jąder kawitacji po wstrzyknięciu, takich jak mikropęcherzyki, do dostarczania leków naczyniowych6,7. Zarodki kurczaków są niedrogie, wymagają mniej infrastruktury i sprzętu oraz mają mniej rygorystyczne przepisy w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi8. Naczynia z zarodkiem kurzym i CAM są łatwo dostępne po otwarciu jaja, podczas gdy w przypadku zarodków i naczyń ssaków okazuje się to znacznie trudniejsze. Poza tym zarodek kurczaka i naczynia CAM zapewniają bicie serca i pulsujący przepływ krwi. CAM wykazuje podobieństwa w anatomii statków ze ssakami i może być używany do badań przesiewowych leków8,9,10. Ze względu na te cechy, naczynia CAM okazały się również odpowiednim modelem do badania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem (CEUS)11,12,13,14,15,16. Ponadto model może być wykorzystany do optycznego zbadania zachowania ultrasonograficznych środków kontrastowych w polu ultrasonograficznym za pomocą ultraszybkiej kamery oraz wpływu siły promieniowania akustycznego na napęd, wiązanie i wynaczynienie leków7,17,18,19. Chociaż zarodek kurzy i CAM są mniej odpowiednie do długoterminowych eksperymentów, mogą być korzystne dla krótkoterminowych eksperymentów in vivo.
Aby zwiększyć widoczność i kontrolę nad zarodkiem kurczaka i CAM podczas eksperymentów, ważne jest, aby pobrać zawartość jaja zawierającą zarodek i CAM ze skorupki jajka18. W poprzednich badaniach na zarodkach kurcząt z użyciem ultrasonograficznych środków kontrastowych stosowano zarodki w wieku od 5 do 6 dni7,11,12,17,19 i 14 do 18-dniowe zarodki13,14,15,16. Szczegółowo opisano wiele podejść do usuwania zawartości jaj ze skorupy18,20,21. Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, poprzednio opublikowane podejścia koncentrują się na wyjęciu zawartości jaja ze skorupki jaja po 3 dniach inkubacji (tj. Hamburger & Hamilton (HH) etap 19-2022) i kontynuowaniu hodowli ex ovo. To podejście do hodowli ex ovo ma wiele wad, w tym zwiększone ryzyko zgonów podczas hodowli (~50%)1,18, stosowanie antybiotyków18,20 oraz zmniejszona całkowita długość naczynia w porównaniu do in ovo growth23. Ponieważ hodowla zarodka w skorupce jaja zapewnia najbardziej naturalne środowisko, najłatwiej jest inkubować zarodek w skorupce jaja do dnia eksperymentu. Z tego powodu podejście, w którym zawartość jaja jest pobierana ze skorupki jaja po 5 do 8 dniach inkubacji, byłoby korzystne zwłaszcza w przypadku eksperymentów na zarodkach w wieku od 5 do 8 dni.
W tym protokole opisujemy trzy metody pobierania zawartości jaja ze skorupki jaja, gdy zarodek jest w 5 do 8 dniu rozwoju (HH 26-3522), pozwalając zarodkowi rozwijać się w skorupce jaja aż do dnia eksperymentu. Rozmiar naczynia CAM waha się od 10-15 μm średnicy, w mniejszych naczyniach włosowatych 8-dniowego zarodka24, do 115-136 μm średnicy w większym naczyniu 6 i 8-dniowych zarodków24,25. Trzy opisane metody wymagają jedynie podstawowych narzędzi laboratoryjnych i zmniejszają ryzyko powikłań przed rozpoczęciem eksperymentu, redukując w ten sposób niepotrzebne koszty i pracę. Szczegółowo opisujemy również metodę oddzielania błony zawierającej zarodek i CAM od worka z żółtkiem, dzięki czemu CAM jest optycznie przezroczysty do badań mikroskopowych. Ponieważ błona zawierająca zarodek i CAM może być przytwierdzona na przykład do uchwytu z membraną akustyczną, konfiguracja może być również akustycznie przezroczysta26, co pozwala na połączenie badań mikroskopowych i ultrasonograficznych, gdy żółtko będzie miało wpływ na ścieżkę światła. Na koniec opisujemy kilka innych konfiguracji ultrasonograficznych, które można wykorzystać do obrazowania ultrasonograficznego lub CEUS.

<table><tbody><tr><td>Zacisk Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>(zacisk Kocher)</td><td></td><td></td><td></td></tr>Uchwyt <tr><td>na folię</td><td></td><td></td><td></td>spożywczą</tr><tr><td>z membraną akustyczną (CLINIcell 25 cm2)</td><td>MABIO, Tourcoing, Francja</td><td>CLINIcell25-50-T FER 00106</td><td></td></tr><tr><td>Demi water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe plastikowe pipety Pasteura</td><td>VWR</td><td>612-1747</td><td></td></tr><tr><td>Jaja</td><td>Drost Pluimveebedrijf Loenen BV, Holandia</td><td>Świeżo zapłodniona</td><td></td></tr><tr><td>lodówka 15 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igły kapilarne szklane</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Średnica wewnętrzna: 0,0413 cala</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza 37 & deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator nawilżany 37 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szpilki</td><td></td><td></td><td></td>do próbek owadów</tr><tr><td>Metalowy uchwyt</td><td></td><td></td> na jajka <td>Wykonany na zamówienie przez Eksperymentalne Oprzyrządowanie Medyczne w Erasmus MC. Patrz rysunek 1 A,B</td></tr><tr><td>Metalowy uchwyt</td><td></td><td></td> do ważenia <td>łodzi wykonany na zamówienie przez Eksperymentalne Oprzyrządowanie Medyczne w Erasmus MC. Zobacz rysunek 1 C,D</td></tr><tr><td>System mikroiniekcji</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Igła, 19 G</td><td>VWR (TERUMO)</td><td>613-5392</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS), 1x</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego, 1 L</td><td></td><td></td><td>Szklana</td></tr><tr><td>szalka Petriego, średnica 90 mm</td><td>VWR</td><td>391-0559</td><td></td></tr><tr><td>Przedkliniczny aparat ultrasonograficzny dla zwierząt (Vevo 2100)</td><td>Sonda FUJIFILM VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(MS250)</td><td>Sonda FUJIFILM VisualSonics</td><td></td><td>30 MHz nadawania i odbioru 15 MHz</td></tr><tr><td>(MS550s)</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td></td><td>częstotliwość transmisji 40 MHz</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>VWR (SWANN-MORTON)</td><td>233-5363</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki, małe</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, 5 mL</td><td>VWR (TERUMO)</td><td>613-0973</td><td></td></tr><tr><td>Taśma na łyżkę</td><td></td><td></td><td></td>stołową</tr><tr><td>(Scotch Magic tape)</td><td>Taśma klejąca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bibułka</td><td>klejąca</td> Pęseta Tork <td></td><td></td></tr><tr><td>duża&nbsp;</td><td>Akcje VWR (USBECK Laborger&auml; te)</td><td>232-0107</td><td>Zobacz rysunek 1E</td></tr><tr><td>Pęseta mała</td><td>DUMONT Medical, Szwajcaria</td><td>0103-5/45</td><td>Zobacz rysunek 1F</td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy środek kontrastowy (custum wykonany typu F)</td><td></td><td></td><td>Wyprodukowany zgodnie z opisem przez: Daeichin, V. i wsp. Skład mikropęcherzyków i przygotowanie do obrazowania: ocena in vitro i in vivo. TRANSAKCJE IEEE NA ULTRASONICS. art. 64 ust. 3, art. 555&ndash; 567 (2017).</td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy środek kontrastowy (MicroMarker)</td><td>FUJIFILM VisualSonics, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy środek kontrastowy (Definity)</td><td>Obrazowanie medyczne Lantheus, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żel do ultradźwięków</td><td>Aquasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waxi film (Parafilm)</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łodzie do ważenia (85 &x; 85&24 mm)</td><td>VWR</td><td>611-0094</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków

The Preparation of Chicken Ex Ovo Embryos and Chorioallantoic Membrane Vessels as In Vivo Model for Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging and Microbubble-Mediated Drug Delivery Studies

Zarodek kurczaka i bogata w naczynia krwionośne błona kosmówkowo-omoczna (CAM) to cenny model in vivo do badania procesów biomedycznych, nowych schematów pulsacji ultradźwiękowych lub nowatorskich przetworników do obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków. Powodem takiego stanu rzeczy jest dostępność sieci zarodków i naczyń krwionośnych CAM, a także niskie koszty modelu. Ważnym krokiem do uzyskania dostępu do naczyń zarodka i CAM jest pobranie zawartości jaja ze skorupki jaja. W protokole tym opisano trzy metody pobierania zawartości ze skorupki jaja między 5. a 8. dniem inkubacji, co pozwala zarodkom rozwijać się w skorupce jaja aż do tych dni. Opisane metody wymagają jedynie prostych narzędzi i sprzętu i dają wyższy wskaźnik przeżycia wynoszący 90% dla jaj 5-dniowych, 75% dla 6-dniowych, 50% dla 7-dniowych i 60% dla 8-dniowych jaj inkubowanych w porównaniu z zarodkami hodowanymi ex ovo (~50%). Protokół opisuje również, jak wstrzykiwać jądra kawitacyjne, takie jak mikropęcherzyki, do układu naczyniowego CAM, jak oddzielić błonę zawierającą zarodek i CAM od reszty zawartości jaja w celu przeprowadzenia optycznie przezroczystych badań oraz jak wykorzystać zarodek kurczaka i CAM w różnych krótkoterminowych eksperymentach ultrasonograficznych. Model in vivo zarodka kurczaka i CAM jest niezwykle istotny dla badania nowych protokołów obrazowania, ultrasonograficznych środków kontrastowych i schematów pulsacji ultradźwiękowych do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym, a także do rozwikłania mechanizmów dostarczania leków za pośrednictwem ultradźwięków.

Ten protokół opisuje trzy metody pozyskiwania i wykorzystywania zarodków kurczaków w wieku od 5 do 8 dni oraz ich błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jako modelu in vivo do badania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków.

Przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków

The chicken embryo and the blood-vessel rich chorioallantoic membrane (CAM) is a valuable in vivo model to investigate biomedical processes, new ...

Protokół ten opisuje przygotowanie i wykorzystanie zarodków kurzych między piątym a ósmym dniem inkubacji do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków Trzy metody usuwania zawartości ze skorupki jaja w piątym do ósmym dniu umożliwiają jej rozwój w skorupce i wymagają jedynie podstawowych narzędzi laboratoryjnych. Model ten nadaje się do badania różnych aspektów badań ultrasonograficznych i naczyniowych, takich jak obrazowanie przepływu krwi, dostarczanie leków oraz nowe ultradźwiękowe środki kontrastowe i przetworniki. Aby przygotować pięciodniowy zarodek, umieść pięciodniowe zapłodnione jajo w pięciodniowym inkubowanym jajku we wstępnie podgrzanym pojemniku na jaja tak, aby jajo znajdowało się w tej samej orientacji, co w inkubatorze i użyj spiczastego końca końcówki pęsety, aby zrobić małe wgłębienie na samej górze jaja.Użyj pęsety, aby zrobić drugie wgłębienie z boku jajka około 2/3 długości jajka i użyj większej pęsety, aby usunąć mały kawałek skorupki jajka z wgłębionego obszaru na górze jajka, uważając, aby worek powietrzny stykał się z otaczającym powietrzem, nie wnikając zbyt głęboko w skorupę. Za pomocą pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 19 przebij otoczkę przez drugie wgłębienie z igłą skierowaną w dół i usuń około dwóch mililitrów albuminy. Po zebraniu albuminy należy użyć taśmy, aby uszczelnić nakłucie i dozować albuminę do łodzi wagowej.Użyj dużej pęsety, aby powiększyć mały otwór na górze komórki jajowej, aż zarodek i błona kosmówkowo-omoczniowa będą w pełni widoczne, bez usuwania skorupki poniżej błony kosmówkowo-omoczniowej lub penetrowania błony wewnętrznej. Po utworzeniu wystarczającego otworu obróć jajko o 180 stopni w uchwycie, tak aby otwór w górnej części jajka był teraz skierowany w dół. Po jednej do dwóch minut zarodek unosi się w górę, stając się niewidoczny od dołu.Gdy cały zarodek i błona kosmówkowo-omoczniowa znikną z pola widzenia i widoczne jest tylko żółtko, usuń taśmę z bocznego otworu. Wnętrze jajka powinno wybrzuszać się z otworu. Trzymając dno jajka blisko łódki do ważenia w metalowym uchwycie na wagę , użyj ostrych końcówek małej pęsety, aby delikatnie, ale szybko wykonać poziome zadrapanie w membranie na całej szerokości otworu i delikatnie wrzuć zawartość jajka do łódki do ważenia.Sprawdź, czy bicie serca jest nadal obecne, aby potwierdzić, że zarodek jest nadal żywy, naczynia błony kosmówkowo-omoczniowej są nienaruszone i nie ma wycieku krwi ani żółtka. Umieść żywotny zarodek w temperaturze 37 stopni Celsjusza, regularnie podając 30-mikrolitrowe krople PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza do zarodka i błony omoczniowej. Aby zebrać sześcio- lub siedmiodniowy zarodek i błonę kosmówkowo-omocznikową, przygotuj jajo, jak pokazano dla pięciodniowego zarodka i użyj nowej pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 19, aby przebić skorupę przez drugie wgłębienie z igłą skierowaną w dół, aby pobrać od pięciu do sześciu mililitrów albuminy podczas jednej penetracji.Po zebraniu albuminy włóż igłę 10-mililitrowej strzykawki zawierającej około jednego mililitra PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza, więcej niż pobrana objętość, w bok otoczki z igłą skierowaną w dół, aby zastąpić pobraną albuminę. Następnie szybko ponownie uszczelnij szczelinę kawałkiem taśmy i zakończ przetwarzanie jajka, jak pokazano. Aby pobrać zarodek i błonę kosmówkowo-omoczniową z ośmiodniowego zapłodnionego jaja, trzymaj jajo poziomo, użyj tylnego końca dużej pęsety i wykonaj małe wgłębienie mniej więcej w połowie długości jaja.Wykonaj małe wgłębienia we wzorze pierścienia 360 stopni wokół przestrzeni skorupki jajka w odległości około 10 milimetrów od siebie. Kiedy wszystkie wgłębienia zostaną utworzone, użyj spiczastego końca pęsety, aby rozbić skorupkę między dwoma wgłębieniami i całkowicie zanurz jajko w PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Pod koniec inkubacji przesuń jajko nad łódką wagową w PBS i umieść oba kciuki w dużym otworze, aby delikatnie otworzyć jajko, które powinno pęknąć wzdłuż małych wgłębień.Gdy wokół skorupki jajka utworzy się pęknięcie, delikatnie rozsuń obie strony, delikatnie przesuwając kawałki do przodu iz powrotem, aż zawartość jajka zostanie oddzielona od skorupki i wrzuć zawartość do łodzi wagowej. Powoli podnieś łódkę ważącą zawierającą zawartość jaj z PBS, lekko przechylając łódź, aby usunąć nadmiar PBS. Następnie umieść łódkę ważącą w metalowym uchwycie na łódkę ważącą.Na tym etapie w zarodku można zobaczyć bijące serce. Aby przygotować próbkę błony zarodkowej i kosmówkowo-omoczniowej do obrazowania mikroskopowego, umieść uchwyt z membraną akustyczną z agarozą na dnie jednomiotowej szalki Petriego zawierającej około 500 mililitrów PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza z warstwą agarozy skierowaną do góry. Użyj małych nożyczek, aby szybko przeciąć błonę witellusa w sześciu do siedmiu nacięciach wokół całej błony kosmówkowo-omoczniowej, obracając łódź wagową, aby uzyskać lepszą precyzję i szybkość.Za pomocą łyżki stołowej nabrać wyciętą błonę zawierającą zarodek i błonę kosmówkowo-omocznikową i powoli podnosić łyżkę, aby umożliwić wzrokowe sprawdzenie, czy wycięta błona zawierająca zarodek i błonę kosmówkowo-omocznikową jest nadal przyczepiona do pozostałej części błony woreczka żółtkowego. Lekko przechyl łyżkę, aby pozbyć się jak największej ilości żółtka bez wysuszania tkanki i zanurz wyciętą błonę w PBS w litrowej szalce Petriego. Za pomocą małej pęsety chwyć i delikatnie zakręć jedną krawędzią membrany, aby usunąć wszelkie żółtka, które jest nadal przyczepione, zanim przesuniesz membranę nad uchwytem z membraną akustyczną.Użyj szpilki do próbki owadów, aby przymocować membranę do przeciwległych rogów uchwytu i unikaj przebijania naczyń błony kosmówkowo-omoczniowej. Gdy oba rogi zostaną zabezpieczone, podnieś i lekko przechyl uchwyt, aby wyrzucić większość PBS i użyj małej pęsety, aby rozciągnąć i równomiernie rozprowadzić membranę na uchwycie, aby umożliwić przypięcie reszty membrany płasko do uchwytu. Po zabezpieczeniu zarodka należy umieścić uchwyt w mikroskopie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i umieścić akustycznie i optycznie przezroczystą membranę na obszarze zainteresowania próbki, aby umożliwić optyczną wizualizację naczyń.W tej reprezentatywnej analizie usunięto pięcio-, sześcio-, siedmio- i ośmiodniowe zarodki oraz błony kosmówkowo-omoczniowe, jak wykazano. Nie obserwuje się krwawienia ani uszkodzenia zarodków lub błon kosmówkowo-omoczniowych, co wskazuje, że metody te można stosować do bezpiecznego zbierania zawartości jaj bez uszkadzania zarodka lub naczyń błony moczowo-omoczniowej. Podczas ekstrakcji może wystąpić wiele komplikacji, dlatego ważne jest, aby dokładnie przestrzegać protokołu i wyrzucić wszelkie uszkodzone próbki tkanek.Jak wykazano, do zarodka można wstrzykiwać na przykład ultradźwiękowe środki kontrastowe, takie jak mikropęcherzyki. Po podaniu można zaobserwować, że mikropęcherzyki krążą w świetle wstrzykniętego naczynia krwionośnego i krążą we krwi obwodowej przez kilka godzin. Przed wstrzyknięciem mikropęcherzyków można już zaobserwować kontrast wewnątrz serca embrionalnego w trybie B, ale nie w ultrasonograficznym obrazowaniu subharmonicznym o wysokiej częstotliwości.Dodanie mikropęcherzyków zwiększa kontrast i widoczność zarodka w obu typach obrazów. Obrazy subharmoniczne 3D o wysokiej częstotliwości można również uzyskać po wstrzyknięciu środka kontrastowego w celu wizualizacji sieci naczyń w obrębie zarodka i błony kosmówkowo-omoczniowej. Zarodek kurczaka i naczynia błony kosmówkowo-omoczniowej można również wykorzystać do zbadania dostarczania leków za pośrednictwem ultradźwięków.Podejmując się tej procedury, najważniejsze jest, aby zawsze utrzymywać zarodek i CAM w temperaturze 37 stopni Celsjusza i nie dopuścić do ich wyschnięcia. Po tej procedurze zarodek kurczaka można umieścić w różnych konfiguracjach, takich jak zbiornik na wodę lub mikroskop w celu wykonania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem lub badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków. Ta metoda i preparat nadaje się do badań ultrasonograficznych środków kontrastowych, a także może być stosowana do badań nad rakiem i wirusami.

the-preparation-chicken-ex-ovo-embryos-chorioallantoic-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Błona chorioallantoiczna (CAM) zarodka kurczaka stanowi unikalne, naturalnie immunodeficyjne środowisko hodowlane do badania angiogenezy i tumorigenzy. Niniejszy artykuł wideo prezentuje poszczególne etapy hodowli kurczaka ex ovo, aplikację substancji potencjalnie angiogennych oraz skuteczną inokulację komórek i tkanek nowotworowych na powierzchni CAM.

Hodowla kurcząt ex ovo oraz test CAM ex ovo: jak to naprawdę działa

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodologię umożliwiającą długotrwałą hodowlę embrionów ptaków ex-ovo. Technika ta jest idealna do eksperymentów podłużnych, które wymagają pełnej dostępności optycznej i/lub sterylnego transportu embrionów ptaków.

System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

W tym filmie opisujemy technikę otwierania skorupki zapłodnionego jaja kurzego w celu odsłonięcia jego błony kosmówkowo-omoczniowej lub CAM niosącego sieć rozgałęzionych naczyń krwionośnych. Odsłonięty CAM może być stosowany do modelowania guza w ovo.

Okienkowanie jaj: metoda otwierania zapłodnionej skorupki jaja kurzego w celu odsłonięcia naczyń naczyniowych błony moczowo-omoczniowej

Ten film demonstruje procedurę wstrzykiwania mikropęcherzykowych środków kontrastowych do izolowanego zarodka myszy w późnym stadium ciąży. Obrazowanie ultrasonograficzne oparte na mikropęcherzykowym środku kontrastowym pomaga uwidocznić i scharakteryzować środowisko naczyniowe zarodka.

Wstrzykiwanie mikropęcherzyków do izolowanych zarodków myszy: technika dostarczania mikropęcherzykowych środków kontrastowych do naczyń krwionośnych żywych zarodków myszy

Oglądanie i dostęp do zarodka kurczaka podczas rozwoju może być wyzwaniem. Opracowaliśmy metodę ex ovo, która jest prosta, opłacalna i może być łatwo stosowana w klasie lub w środowisku badawczym. Metoda ta zapewnia dostęp do zarodka w późnych stadiach rozwoju zarodkowego (HH 40).

Zoptymalizowana hodowla ex-ovo zarodków piskląt do zaawansowanych etapów rozwoju

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania ultradźwiękowych mikropęcherzykowych środków kontrastowych do żywych, izolowanych mysich zarodków w późnym stadium ciąży. Metoda ta umożliwia badanie parametrów perfuzji i naczyniowych markerów molekularnych w obrębie zarodka za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości ze wzmocnieniem kontrastowym.

Obrazowanie kontrastowe w zarodkach myszy za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości

Tutaj prezentujemy nową technikę hodowli zarodków piskląt ex ovo do obrazowania poklatkowego przy użyciu światła przechodzącego i mikroskopii fluorescencyjnej. Kanapka z zanurzoną bibułą filtracyjną jest wariantem dobrze znanej techniki nośnika bibuły filtracyjnej1, która pozwala na hodowlę zarodków piskląt całkowicie zanurzonych w płynnej pożywce hodowlanej.

Zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej do długoterminowego obrazowania poklatkowego ex ovo wczesnych zarodków piskląt

Prezentujemy model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka jako alternatywny, nadający się do przeszczepu, model in vivo do wszczepiania ginekologicznych i urologicznych linii komórkowych raka oraz guzów pochodzących od pacjentów.

Wykorzystanie błony chorio-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) ptasiego zarodka jest bardzo użytecznym i przydatnym narzędziem w różnych dziedzinach badań. Specjalny model ex ovo przepiórki japońskiej CAM nadaje się do badań nad leczeniem fotodynamicznym.

Przepiórcza błona chorioallantoiczna - narzędzie do diagnostyki i terapii fotodynamicznej

Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Naucz się przygotowywać zarodki kurczaków i błonę moczowo-omoczniową jako model in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym oraz badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków.

Przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków

Przeglądaj więcej filmów