Name: Obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej do pomiaru in vivo zawartości mieliny w szczurzym modelu stwardnienia rozsianego z lizolecytyną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj obrazowanie PET z 11C-PIB do pomiaru zawartości mieliny in vivo w szczurzym modelu stwardnienia rozsianego z lizolecytyną. Ta metoda umożliwia ilościową ocenę demielinizacji i remielinizacji w czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

β-cube equipment (Molecubes NV, Belgia) był wspierany przez São Paulo Research Foundation, FAPESP - Brazylia (#2018/15167-1). LES posiada stypendium doktoranckie od FAPESP - Brazylia (#2019/15654-2).

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Krajowej Rady ds. Kontroli Doświadczeń na Zwierzętach (CONCEA, Brazylia) i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Badań na Zwierzętach Szkoły Medycznej Uniwersytetu w São Paulo (CEUA-FMUSP, Brazylia - numer protokołu: 25/15).
UWAGA: W tym protokole pokazujemy, jak wywołać szczurzy model stwardnienia rozsianego z lizolecytyną oraz jak uzyskać i przeanalizować obrazy PET mieliny.
1. Przygotowanie roztworu lizolecytyny
<ol>
	<li>Zważyć lizolecytynę (L-α-lizofosfatydylocholinę z żółtka jaja) na wadze analitycznej za pomocą stożkowej probówki z tworzywa sztucznego (1,5 ml).</li>
	<li>Dodać sterylną sól fizjologiczną do probówki, aby uzyskać 1% roztwór (na przykład: zważyć 1 mg lizelecytyny i rozpuścić ją w 100 μl soli fizjologicznej) i rozpuścić lizolecytynę, potrząsając probówką (potrząsając z boku na bok i nie obracając się od góry do dołu).</li>
	<li>Przygotuj roztwór tuż przed rozpoczęciem indukcji modelu zwierzęcego (nie przechowuj końcowego gotowego roztworu).</li>
</ol>
2. Model szczura z lizolecytyną - Chirurgia stereotaktyczna
<ol>
	<li>Używaj samców szczurów rasy Wistar o wadze od 220 do 270 g. Podczas wszystkich zabiegów używaj rękawiczek i maski.</li>
	<li>Wywołać znieczulenie 5% izofluranem zmieszanym w 100%O2 (1 l/min) za pomocą pudełka indukcyjnego. Sprawdź, czy zwierzę jest znieczulone, obserwując brak ruchu (należy obserwować tylko oddychanie).</li>
	<li>Umieść zwierzę w aparacie stereotaktycznym na poduszce grzewczej. Przymocuj nos i uszy zwierzęcia do sprzętu. 
	UWAGA: Szczegółowe informacje na temat wykonywania operacji stereotaktycznej można znaleźć w bazie danych JoVE Science Education Database. Neuroscience. Chirurgia stereotaktyczna gryzoni. JoVE, Cambridge, MA, 2021.
	<ol>
		<li>Monitoruj znieczulenie przez cały zabieg (w tym operację i akwizycję obrazu). Aby dostosować stężenie izofluranu, należy obserwować częstość oddechów zwierząt. Szybkie tempo oddychania wymaga wyższego stężenia, a wolne tempo oddychania wymaga niższego stężenia środka znieczulającego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknij środek przeciwbólowy (ketoprofen - 5 mg / kg) podskórnie (rozcieńczyć lek do 1 ml w soli fizjologicznej, pomoże to nawodnić zwierzę).</li>
	<li>Wlej krem pod oczy zwierzęcia, aby chronić go przed odwodnieniem.</li>
	<li>Użyj 0,5% roztworu chlorheksydyny, aby oczyścić obszar nacięcia.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl chlorowodorku lidokainy 2% podskórnie w miejsce nacięcia.</li>
	<li>Ogol obszar czaszki.</li>
	<li>Do tej procedury należy używać sterylnych narzędzi.</li>
	<li>Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie o długości około 2 cm w skórze nad czaszką.</li>
	<li>Odsłoń czaszkę za pomocą zacisków Bulldog.</li>
	<li>Użyj wacika, aby oczyścić obszar czaszki 1% peroksydazą wodorową.</li>
	<li>Zlokalizuj i oznacz bregmę (stereotaktyczny atlas mózgu szczura może pomóc w identyfikacji Bregmy).</li>
	<li>Umieścić strzykawkę Hamiltona (μL strzykawek neuros) na bregmie.</li>
	<li>Używając bregmy i atlasu stereotaktycznego jako odniesienia, umieść strzykawkę Hamiltona na następujących współrzędnych: przednio-tylna: -0,30 mm, boczno-boczna: -3,0 mm i brzuszna, aż dotknie kości czaszki, a następnie zaznacz czaszkę i zanotuj orientację współrzędnych na papierze.</li>
	<li>Wywierć czaszkę w zaznaczonej współrzędnej. Zachowaj ostrożność w przypadku opony twardej (uszkodzenie opony twardej może powodować duże krwawienie).</li>
	<li>Napełnij strzykawkę Hamilton 7 μl roztworu lizolecytyny (1% w soli fizjologicznej). Większą objętość można umieścić w strzykawce, ale wstrzyknięte zostanie tylko 7 μl (wyjmij bąbelki ze strzykawki, aby prawidłowo odmierzyć objętość).</li>
	<li>Ustawić strzykawkę Hamiltona na poprzednich współrzędnych, aby rozpocząć wstrzykiwanie leku (łącznie 7 μl w 3 różnych brzusznych współrzędnych stereotaktycznych). Biorąc pod uwagę wcześniej zanotowane współrzędne, opuść strzykawkę Hamiltona do współrzędnej brzusznej -5,0 mm.</li>
	<li>Bardzo powoli wstrzyknąć 2 μl roztworu lizolecytyny (1 μl/10 min). Poczekaj 3 min.</li>
	<li>Weź igłę do następnej brzusznej współrzędnej stereotaktycznej (-4,2 mm) i powoli wstrzyknij 2 μl roztworu lizolecytyny (1 μl / 10 min). Poczekaj 3 min.</li>
	<li>Wstrzyknąć trzecią współrzędną brzuszną -3,0 mm (3 μl roztworu lizolecytyny - 1 μl/ 10 min).</li>
	<li>Odczekaj 5 minut, a następnie wyjmij strzykawkę Hamiltona z mózgu.</li>
	<li>Zszyj skórę.</li>
	<li>Wyjmij zwierzę z aparatu stereotaktycznego i pozwól mu się obudzić.</li>
	<li>Zwróć zwierzę do klatki domowej, trzymaj zwierzę samo i pod nadzorem, aby sprawdzić, czy nie ma oznak dyskomfortu.</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie środek przeciwbólowy (ketoprofen - 5 mg/kg) rozcieńczony w soli fizjologicznej, po 24 h i 48 h po zabiegu.</li>
</ol>
3. Pozyskiwanie PET
<ol>
	<li>Pobrać od 7 do 20 MBq radioaktywności 11C-PIB do strzykawki (1 ml to maksymalna objętość dozwolona do wstrzyknięcia dożylnego u szczurów).</li>
	<li>Znieczulić zwierzę 5% izofluranem zmieszanym ze 100%O2 (1 l/min) za pomocą skrzynki indukcyjnej.</li>
	<li>Wstrzyknąć 11C-PIB (radioaktywność zdefiniowana w punkcie 4.1 powyżej) do żyły prącia lub żyły ogonowej szczura (oba miejsca podania są w porządku, decyzja jest osobistym wyborem. Zalecamy jedynie, aby nie stosować iniekcji zaoczodołowej, ponieważ lokalizacja znajduje się zbyt blisko obszaru zainteresowania (mózgu) i może pogorszyć jakość obrazu. 
	UWAGA: Akwizycja obrazu wyjściowego punktu czasowego jest wykonywana przed wstrzyknięciem stereotaktycznym, a pozostałe 2 punkty czasowe po 1 tygodniu i 4 tygodniach po zabiegu.</li>
	<li>Wyjmij zwierzę ze znieczulenia, aby zwierzę mogło się obudzić (pozostaw zwierzę na ciepłej podkładce, aż całkowicie się obudzi).</li>
	<li>Zwróć zwierzę do klatki domowej.</li>
	<li>Poczekaj 30 minut na następny krok.</li>
	<li>Znieczulić szczury 5% izofluranem zmieszanym ze 100%O2 (1 l/min) za pomocą pudełka indukcyjnego.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie skanera PET.</li>
	<li>Wybierz opcję Scan > Pet Ready (Gotowość do skanowania).</li>
	<li>Uzupełnij dane głównego badacza, identyfikator badania, numer identyfikacyjny serii, identyfikator zwierzęcia, wagę zwierzęcia (g) i dodatkowe uwagi. Wybierz pozycję Next. 
	UWAGA: Użyj kropki (.) dla liczby dziesiętnej w wadze zwierzęcia.</li>
	<li>Edytuj obszar ROI do skanowania (zwykle od 3 do 8). Jest to obszar, który zostanie uwzględniony na obrazie (obszary między numerami 3 i 8 narzuty łóżka pojawią się na końcowym obrazie).</li>
	<li>Umieść znieczulonego szczura na standardowym łóżku szczura skanera PET i włącz znieczulenie (3% izofluranu w 100%O2 to dobry początek, a następnie w razie potrzeby należy dostosować szybkość znieczulenia). Aby dostosować znieczulenie, sprawdź dane monitorowania w oprogramowaniu skanera, aby upewnić się, że zwierzę oddycha w stałym i powolnym rytmie. 
	UWAGA: Włącz pompę próżniową sprzężoną z filtrem z węglem aktywnym, aby zebrać nadmiar izofluranu (jeśli pompa jest dostępna).</li>
	<li>Nałóż krem pod oczy, aby chronić oczy zwierzęcia.</li>
	<li>Wepchnij legowisko dla zwierząt do skanera PET.</li>
	<li>Pełne szczegóły aktywności, czas kalibracji aktywności, izotop (C-11) i czas trwania skanowania (20 minut). Wybierz opcję Start Scan. 
	UWAGA: Pojawi się komunikat o ruchomym łóżku dla zwierząt, a legowisko dla zwierząt przesunie się do urządzenia i zatrzyma się w poprzednio wybranej pozycji ROI. Rozpocznie się odliczanie czasu akwizycji i pojawi się liczba zliczeń na sekundę (CPS).</li>
	<li>W oprogramowaniu skanera przejdź do zakładki Monitor po lewej stronie ekranu, zaznacz opcję Zmień próg na zmianę parametrów oddechowych (BPM). 
	UWAGA: Pojawi się okno wraz z parametrem progowym (500). Wybierz przycisk OK.</li>
	<li>Przejdź do 0% MOCY, aby zmienić parametry temperatury, aby ogrzać zwierzę podczas skanowania. Pojawi się okno; Uzupełnij parametr (80 - 100). Wybierz pozycję OK. 
	UWAGA: Wybierz od 80 do 100% mocy w zależności od warunków temperatury w pomieszczeniu (im więcej mocy, tym cieplej).</li>
	<li>Wróć do zakładki SKANUJ.</li>
	<li>Przejdź do narzędzia konfiguracyjnego (ikona koła zębatego) i zakończ Czas wtrysku, Pozostała aktywność, Czas kalibracji pozostałej aktywności. Wybierz pozycję Save. 
	UWAGA: Pojawi się okno "Czy na pewno chcesz zmodyfikować metadane protokołu?"> TAK</li>
	<li>Wróć do zakładki Monitor (sprawdź parametry oddechowe zwierzęcia, a w razie potrzeby zwiększ lub zmniejsz stężenie izofluranu - zwykle wystarczy 3% w 100%O2).</li>
	<li>Po zakończeniu akwizycji PET na karcie Skanowanie pojawi się komunikat Pet Ready, sprawdź ikonę strzałki (po lewej stronie narzędzia konfiguracyjnego), aby wysunąć legowisko dla zwierząt.</li>
	<li>Wyjmij zwierzę ze znieczulenia i pozostaw do przebudzenia na ciepłej podkładce.</li>
	<li>Aby zrekonstruować obraz, przejdź do zakładki Rekonstrukcja.</li>
	<li>Zaznacz ikonę plusa w lewym dolnym rogu ekranu i wybierz plik badania, który zostanie zrekonstruowany. Wybierz pozycję Dalej.</li>
	<li>Przejdź do narzędzia Rozdzielczość energii. Pojawi się okno. Skonfiguruj szczyt energetyczny (keV) do parametru urządzenia (w oparciu o miesięczną kontrolę jakości). Wybierz pozycję Zamknij. 
	UWAGA: Szczyt energii może zmieniać się co miesiąc podczas wykonywania comiesięcznej kalibracji sprzętu.</li>
	<li>Zachowaj wszystkie inne parametry jako domyślne (Izometryczny rozmiar woksela: 400 mm; liczba iteracji: 30; Rozdzielczość energetyczna: 30%; Zapisz tylko ostatnią iterację; odznacz Zachowaj dane binarne) .</li>
	<li>Sprawdź Add. 
	UWAGA: Pojawi się okno "Rekonstrukcja została dodana do kolejki i rozpocznie się, gdy inne zakończą". Wybierz przycisk OK. Plik pojawi się na liście rekonstrukcji w zakładce Rekonstrukcja, a jego status będzie wyświetlany jako oczekujący lub % (postęp) lub ukończony.</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
UWAGA: Wykonuj analizę obrazu za pomocą dedykowanego oprogramowania do analizy obrazu. W obecnym protokole demonstracja wykorzystuje określony program, ale jeśli nie jest on dostępny, można użyć innych opcji.
<ol>
	<li>Otwórz PMOD > go połącz.</li>
	<li>Przejdź do zakładki Dopasowanie u góry ekranu.</li>
	<li>Otwórz menu Załaduj wejście w prawej środkowej części ekranu i wybierz Autowykryj pliki, wybierz Plik PET (DICOM, Interfile lub NifTI), dodaj do wybranych, kliknij za pomocą Operacje, Zmień orientację na orientację standardową, kliknij Załaduj i zamknij.</li>
	<li>Sprawdź, czy gatunek zwierzęcia jest poprawny u dołu ekranu (RAT).</li>
	<li>Zaznacz pole Przytnij w prawym dolnym rogu ekranu.</li>
	<li>Dostosuj rozmiar żółtego pola na obrazie PET, aby objąć cały mózg.</li>
	<li>Kliknij przycisk Sztywny po prawej stronie ekranu. W oknie potwierdzenia kliknij przycisk Tak.</li>
	<li>Kliknij narzędzie mózgu w prawej środkowej części ekranu, aby otworzyć atlas referencyjny. Wybierz Px Rat (W.Schiffer) - T2.</li>
	<li>Wybierz opcję Dopasuj wyniki z prawej górnej zakładki (zakładka Wybierz etap przetwarzania).</li>
	<li>Kliknij Podział danych (4. zakładkaw prawym górnym menu).</li>
	<li>Wyrównaj obraz PET z szablonem referencyjnym za pomocą narzędzia do obracania (biała ikona na środku obrazu PET). Sprawdź wyrównanie dla 3 płaszczyzn anatomicznych.</li>
	<li>Zapisz plik wspólnej rejestracji (menu po prawej stronie ekranu).</li>
	<li>Wybierz format wyjściowy (DICOMlub NifTI), katalog i prefiks pliku. Kliknij Zapisz. 
	UWAGA: Jeśli współzarejestrowane dane wyjściowe zostaną zapisane jako NifTi, informacje o obrazie nagłówka zostaną utracone.</li>
	<li>Kliknij menu VOI u dołu ekranu.</li>
	<li>Przejdź do Szablonu > Atlasu u dołu ekranu (poniżej okna VOI).</li>
	<li>Wybierz Px Rat(W.Schiffer) z menu rozwijanego. 
	UWAGA: Jeśli chcesz przeanalizować tylko określone VOI, możesz wybrać tylko obszary zainteresowania mózgu. Jeśli chcesz mieć wszystkie obszary mózgu w atlasie mózgu, nie jest potrzebne żadne działanie.</li>
	<li>Kliknij Konspekt u dołu ekranu. 
	UWAGA: VOI obszarów mózgu pojawią się w oknie VOI.</li>
	<li>Ręcznie narysuj VOI w miejscu zmiany chorobowej i obszarze przeciwległej półkuli mózgu (odpowiednio 11C-PIB obszar niskiego wychwytu i przeciwległa półkula mózgu).</li>
	<li>Kliknij w obszarze obrazu PET z niskim poborem 11C-PIB.</li>
	<li>Wybierz pozycję Nowe VOI > OK. 
	UWAGA: Pojawi się arkusz kalkulacyjny</li>
	<li>Przejdź do ikony SPHERE w środkowej części ekranu (po lewej stronie okna VOI) 
	UWAGA: Pojawi się arkusz kalkulacyjny.</li>
	<li>Wybierz nazwę VOI: lesion i wybierz Apply. 
	UWAGA: Na współzarejestrowanym obrazie pojawi się kula.</li>
	<li>Wyrównaj kulę w obszarze zmiany i dostosuj VOI dla wszystkich płaszczyzn anatomicznych.</li>
	<li>Kliknij Zamknij (w dolnej części arkusza kalkulacyjnego).</li>
	<li>Wybierz VOI zmiany chorobowej (z listy VOI).</li>
	<li>Przejdź do ikony operacji dublowania VOI (w prawym górnym rogu okna VOI) i wybierz opcję Klonuj i odbij lustrzanie w lewo/w prawo.</li>
	<li>Przejdź do opcji Oblicz wybrane statystyki VOI w górnej części okna listy VOI. Przejdź do ikony Wybierz statystyki do obliczenia, aby wybrać dane wyjściowe (po prawej stronie ikony statystyk VOI). Zwykle pod kątem zawartości mieliny sprawdź statystyki dla grupy VOI, średnia, SD, Min, Max). 
	UWAGA: Pojawi się arkusz kalkulacyjny. Domyślnym ustawieniem Jednostka danych jest kBq/cc. W lewej górnej części arkusza kalkulacyjnego (Statystyki VOI) możesz sprawdzić jednostkę danych jako SUV (Standardized Uptake Value). Jeśli poprawnie wykonałeś administrację radioznacznikiem i szczegóły akwizycji obrazu w oprogramowaniu skanera, jak opisano wcześniej, dane SUV zostaną obliczone automatycznie przez oprogramowanie PMOD, jeśli nie, możesz edytować szczegóły.</li>
	<li>Przejdź do opcji Kopiuj przy użyciu formatu numerów ustawień regionalnych systemu. 
	UWAGA: Sprawdź, czy wszystkie statystyki są wybrane do skopiowania jako dane wyjściowe (ikona wyboru w prawym górnym rogu ekranu). Dane, które zostaną skopiowane, zależą od wybranej jednostki danych.</li>
	<li>Wklej dane wyjściowe do notatnika lub arkusza kalkulacyjnego. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność przy ustawieniach oprogramowania dla symboli kropek i przecinków między liczbami. Może się to różnić w zależności od konfiguracji języka.</li>
	<li>Zapisz plik z nazwą i szczegółami badania.</li>
</ol>

<ol><li>Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+clinical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: clinical aspects.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (6), 752-759 (2018).</li>
<li>Sand, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification%2C+diagnosis%2C+and+differential+diagnosis+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Classification, diagnosis, and differential diagnosis of multiple sclerosis.</a> Current Opinion in Neurology. 28 (3), 193-205 (2015).</li>
<li>Thompson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+multiple+sclerosis%3A+2017+revisions+of+the+McDonald+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria.</a> Lancet Neurology. 17 (2), 162-173 (2018).</li>
<li>Veronese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+C-11+PIB+PET+for+imaging+myelin+in+the+human+brain%3A+a+test-retest+reproducibility+study+in+high-resolution+research+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Quantification of C-11 PIB PET for imaging myelin in the human brain: a test-retest reproducibility study in high-resolution research tomography.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 35 (11), 1771-1782 (2015).</li>
<li>Carvalho, R. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-11+PIB+PET+imaging+can+detect+white+and+grey+matter+demyelination+in+a+non-human+primate+model+of+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">C-11 PIB PET imaging can detect white and grey matter demyelination in a non-human primate model of progressive multiple sclerosis.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 35, 108-115 (2019).</li>
<li>Stankoff, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+central+nervous+system+myelin+by+positron+emission+tomography+in+multiple+sclerosis+using+%5Bmethyl-%281%29%281%29C%5D-2-%284%27-methylaminophenyl%29-+6-hydroxybenzothiazole%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Imaging central nervous system myelin by positron emission tomography in multiple sclerosis using [methyl-(1)(1)C]-2-(4'-methylaminophenyl)- 6-hydroxybenzothiazole.</a> Annals of Neurology. 69 (4), 673-680 (2011).</li>
<li>Faria, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+positron+emission+tomography+%28PET%29+imaging+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Myelin positron emission tomography (PET) imaging in multiple sclerosis.</a> Neural Regeneration Research. 15 (10), 1842-1843 (2020).</li>
<li>Pietroboni, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+PET+as+a+marker+of+normal-appearing+white+matter+early+damage+in+multiple+sclerosis%3A+correlation+with+CSF+-amyloid+levels+and+brain+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Amyloid PET as a marker of normal-appearing white matter early damage in multiple sclerosis: correlation with CSF -amyloid levels and brain volumes.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46 (2), 280-287 (2019).</li>
<li>Pytel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+PET+findings+in+multiple+sclerosis+are+associated+with+cognitive+decline+at+18+months%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Amyloid PET findings in multiple sclerosis are associated with cognitive decline at 18 months.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 39, (2020).</li>
<li>Faria, D. dP., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+glucose+metabolism%2C+neuroinflammation+and+demyelination+in+the+lysolecithin+rat+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+Journal%22%5BJournal%5D)">PET imaging of glucose metabolism, neuroinflammation and demyelination in the lysolecithin rat model for multiple sclerosis.</a> Multiple Sclerosis Journal. 20 (11), 1443-1452 (2014).</li>
<li>Rinaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+circumvents+lysolecithin-induced+demyelination+through+the+modulation+of+microglial+polarization%2Fphagocytosis+and+oligodendroglial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 circumvents lysolecithin-induced demyelination through the modulation of microglial polarization/phagocytosis and oligodendroglial differentiation.</a> Neurobiology of Disease. 96, 127-143 (2016).</li>
<li>Faria, D. dP., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+focal+demyelination+and+remyelination+in+a+rat+model+of+multiple+sclerosis+comparison+of+%5BC-11%5DMeDAS%2C+%5BC-11%5DCIC+and+%5BC-11%5DPIB%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis comparison of [C-11]MeDAS, [C-11]CIC and [C-11]PIB.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).</li>
<li>Faria, D. dP., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+focal+demyelination+and+remyelination+in+a+rat+model+of+multiple+sclerosis%3A+comparison+of+%5B11C%5DMeDAS%2C+%5B11C%5DCIC+and+%5B11C%5DPIB%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis: comparison of [11C]MeDAS, [11C]CIC and [11C]PIB.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).</li>
<li>vander Star, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+and+In+Vivo+Models+of+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+%26+Neurological+Disorders-Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">In Vitro and In Vivo Models of Multiple Sclerosis.</a> CNS & Neurological Disorders-Drug Targets. 11 (5), 570-588 (2012).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-based+modulation+of+endogenous+stem+cells+promotes+functional+remyelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo.</a> Nature. 522 (7555), 216(2015).</li>
</ol>

Największą zaletą stosowania modelu lizolecytyny do badania stwardnienia rozsianego jest szybki czas wystąpienia demielinizacji (około 1 tygodnia) i remielinizacji (około 4 tygodni)14. Model ten można również indukować u myszy15, jednak indukcja u szczurów jest bardziej korzystna w przypadku obrazowania PET in vivo ze względu na większy rozmiar mózgu szczura w porównaniu z myszami.
Pierwszym krokiem modelu indukcyjnego jest zachowanie sz...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62094">Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis</a>. The citation&#160;was updated.
The citation was updated from:
de Paula Faria, D., Cristiano Real, C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).
to:
de Paula Faria, D., Real, C.C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62094">Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis</a>. The citation&#160;was updated.

Erratum: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis

Stwardnienie rozsiane (MS) jest chorobą neurozapalną, która wpływa na ośrodkowy układ nerwowy, charakteryzującą się stanem zapalnym, demielinizacją i utratą aksonów1. Rokowanie w przypadku tej choroby jest zmienne nawet przy postępach w leczeniu i jest to jedna z najczęstszych przyczyn deficytów neurologicznych u młodych ludzi1. Rozpoznanie stwardnienia rozsianego opiera się na kryteriach manifestacji klinicznej i wizualizacji charakterystycznych zmian za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI)2,3.
Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) może być użytecznym narzędziem do monitorowania in vivo progresji SM i efektów terapeutycznych. Radioznacznik związku B z Pittsburgha (PIB) znakowany węglem-11 (11C-PIB) jest szeroko stosowany do ilościowego oznaczania blaszek β-amyloidowych; Jednak w ciągu ostatniej dekady badano ją w celu ilościowego określenia zawartości mieliny i wykazania dynamicznej demielinizacji i remielinizacji4,5,6.
Różne znaczniki PET amyloidu (11C-PIB, 18F-florbetaben, 18F-florbetamel, 18F-flutemetamol) mogą być używane do ilościowego oznaczania mieliny i dostarczania ważnych informacji o postępie choroby i odpowiedzi terapeutycznej, umożliwiając identyfikację procesów demielinizacji i remielinizacji, bez ingerencji zapalenia nerwów, które może wystąpić w przypadku konwencjonalnych obrazów rezonansu magnetycznego (MRI)7. Obrazowanie PET amyloidu wykazało zmniejszony wychwyt znacznika u aktywnych pacjentów ze stwardnieniem rozsianym w porównaniu z pacjentami nieaktywnymi, co można wytłumaczyć wczesnym uszkodzeniem istoty białej u aktywnych pacjentów8. Niższy wychwyt znacznika amyloidu był również związany ze spadkiem funkcji poznawczych w badaniu kontrolnym, co pokazuje, że technika ta jest cennym narzędziem do badania patofizjologii choroby i wyników klinicznych9.
Model szczurzy lizolecytyny (LPC) jest chemicznie indukowanym modelem stwardnienia rozsianego, gdzie wstrzyknięta toksyna, LPC, wywołuje wysoką reakcję makrofagów, co skutkuje zwiększonym stanem zapalnym, a w konsekwencji demielinizacją10,11. Demielinizacja ulega szybkiemu odwróceniu, w ciągu około 4 tygodni, co sprawia, że jest to dobry model do oceny procesów demielinizacji i remielinizacji u gryzoni. Model ten został już oceniony za pomocą obrazowania PET, z dobrymi wynikami i korelacją z esejami pośmiertnymi 12.
Tutaj prezentujemy protokół obrazowania mieliny PET z 11C-PIB w szczurzym modelu lizolecytyny, pokazując, że ta technika obrazowania jest użytecznym narzędziem do pomiaru in vivo zawartości mieliny.

<table><tbody><tr><td>Waga analityczna</td><td>Marte</td><td>AUWZZOD</td><td>max: 220 g- min: 1 mg</td></tr><tr><td>Waporyzator anestezyjny</td><td>Nanitech</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>Beta-cube</td><td>Molecubes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zacisk Bulldog</td><td>Stoelting</td><td>5212043P</td><td></td></tr><tr><td>kloreksydyna</td><td>Rioquimica</td><td></td><td>0,5%/100 ml</td></tr><tr><td>Waciki bawełniane</td><td>johnson e johnson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalibrator dawki</td><td>Capintech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Kinzo elektronarzędzia</td><td>352901</td><td>Model Q0M-DC3C</td></tr><tr><td>Rurka Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>30125150</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Smar do oczu</td><td>ADVFARMA</td><td>30049099</td><td>&nbsp; wazelina 15 g (czystość farmaceutyczna)</td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste</td><td>Stoelting</td><td>52102-38P</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice</td><td>Descarpack</td><td>212101</td><td>&nbsp; Rozmiar 6,5</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Softhear</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka iniekcyjna</td><td>Hamilton</td><td>80314</td><td>10&micro;, 32ga, model 701</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>BD</td><td>328328</td><td>1 mL strzykawki insulinowe z igłą</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Crist&aacute; lia</td><td>410525</td><td>100 ml , stężenie 1 ml / 1 ml</td></tr><tr><td>Ketoprofen lub inny środek przeciwbólowy</td><td>Sanofi</td><td></td><td>100 mg / 2 ml</td></tr><tr><td>lidokaina</td><td>Hipolabor</td><td>1.1343.0102.001-5</td><td>2%/20 ml</td></tr><tr><td>L-&alfa;-lizofosfatydylocholina z żółtka jaja</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L-4129</td><td>25 mg - &ge; 99%, Typ I, proszek</td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę</td><td>Stoelting</td><td>5212290P</td><td></td></tr><tr><td>Tlen</td><td>Biały Martins</td><td>7782-44-7</td><td>Sprężony gaz</td></tr><tr><td>Oprogramowanie PMOD</td><td>Technologie PMOD</td><td>Wersja 4.1</td><td>moduł bezpiecznik</td></tr><tr><td>Maska anestezjologiczna dla szczurów</td><td>KOPF</td><td>Model 906</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Farmace</td><td>0543325/ 14-8</td><td>0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań, 10 ml</td></tr><tr><td>Ostrza Scapel</td><td>Stoelting</td><td>52173-10</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty Scapel</td><td>Stoelting</td><td>52171P</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Stoelting</td><td>52136-50P</td><td></td></tr><tr><td>Waga półanalityczna</td><td>Quimis</td><td>BK-3000</td><td>max:3,100 g; min:0,2 g</td></tr><tr><td>Mega profesjonalna</td><td></td><td>golarka</td><td>AT200 model</td></tr><tr><td>Aparat stereotaktyczny</td><td>KOPF</td><td>Nodel 900</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt uniwersalny z podparciem igły</td><td>KOPF</td><td>Model 1772-F1</td><td>Wspornik Hamilton dla 5 i 10 i mikro; L</td></tr></tbody></table>

obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej do pomiaru in vivo zawartości mieliny w szczurzym modelu stwardnienia rozsianego z lizolecytyną

Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis

Stwardnienie rozsiane (MS) jest chorobą neurozapalną z rozszerzającą się degeneracją aksonów i neuronów oraz demielinizacją w ośrodkowym układzie nerwowym, prowadzącą do dysfunkcji motorycznych, niepełnosprawności psychicznej i upośledzenia funkcji poznawczych podczas progresji SM. Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) to technika obrazowania umożliwiająca ilościowe określenie zmian komórkowych i molekularnych in vivo.
Radioznaczniki o powinowactwie do nienaruszonej mieliny mogą być używane do obrazowania in vivo zmian zawartości mieliny w czasie. Możliwe jest wykrycie wzrostu lub spadku zawartości mieliny, co oznacza, że ta technika obrazowania może wykryć procesy demielinizacji i remielinizacji ośrodkowego układu nerwowego. W tym protokole pokazujemy, jak wykorzystać obrazowanie PET do wykrywania zmian mieliny w szczurzym modelu lizolecytyny, który jest modelem ogniskowej zmiany demielinizacyjnej (indukowanej przez wstrzyknięcie stereotaktyczne) (tj. Model choroby stwardnienia rozsianego). 11Obrazowanie C-PIB PET wykonano na początku badania oraz 1 tydzień i 4 tygodnie po stereotaktycznym wstrzyknięciu lizolecytyny 1% w prawe prążkowie (4 μl) i ciało modzelowate (3 μl) mózgu szczura, umożliwiając ilościowe określenie ogniskowej demielinizacji (miejsce wstrzyknięcia po 1 tygodniu) i procesu remielinizacji (miejsce wstrzyknięcia po 4 tygodniach).
Obrazowanie PET mieliny jest interesującym narzędziem do monitorowania in vivo zmian w zawartości mieliny, które może być przydatne do monitorowania postępu choroby demielinizacyjnej i odpowiedzi terapeutycznej.

Rysunek 1 przedstawia ilustracyjne obrazy PET z użyciem 11C-PIB, ukazujące zmiany mieliny w czasie. Na skanie wyjściowym nie widać różnic w zawartości mieliny (tj. nie występuje demielinizacja). Na obrazie z punktu czasowego 1 tydzień można dostrzec ogniskową zmianę demielinizacyjną (w prawej półkuli), wskazaną białą strzałką. Obrazy przedstawiono w trzech płaszczyznach anatomicznych (czołowej, osiowej i strzałkowej) i w każdej z nich można zidentyfikować zmianę demielinizacyjną. ...

Ten protokół ma na celu monitorowanie in vivo zmian mielinowych (demielinizacja i remielinizacja) za pomocą obrazowania metodą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) w zwierzęcym modelu stwardnienia rozsianego.

Obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej do pomiaru in vivo zawartości mieliny w szczurzym modelu stwardnienia rozsianego z lizolecytyną

Multiple sclerosis (MS) is a neuroinflammatory disease with expanding axonal and neuronal degeneration and demyelination in the central nervous system, ...

Protokół ten nosi nazwę monitorowania łańcuchów mielinowych in vivo za pomocą obrazowania PET z PIB znakowanym karbonylem w szczurzym modelu lizolecytyny stwardnienia rozsianego. Ta technika obrazowania umożliwia obrazowanie in vivo pozycji w różnych punktach. Uzyskanie punktowego kontaktu z danymi łańcuchów wydobywczych w czasie.W tym filmie pokazujemy, jak indukować model zwierzęcy za pomocą iniekcji stereotaktycznej oraz jak akwizycji i analizy. Obrazy górnictwa. Wyjmij potrzebny materiał do przygotowania roztworu lizolecytyny, weź roztwór lizolecytyny, odważnik na wadze elektronicznej za pomocą szklanej rurki, wyjmij szklaną rurkę z wagi elektrycznej, otwórz linię komórkową i pobierz odpowiednią objętość do przygotowania 1% roztworu lizolecytyny.Umieść linię komórkową w plastikowej tubce, zamknij plastikową rurkę i potrząśnij nią palcami. Przygotuj się do zabiegu ze zwierzęciem we właściwej pozycji, wstrzyknij, nałóż krem pod oczy, oczy zwierzęcia chronią przed nawodnieniem. Użyj 5% roztworu tlenu CODoxygen do oczyszczenia obszaru nacięcia operacji, wstrzyknij lidokainę w miejscu, w którym zostanie wykonane nacięcie.Ogolić włosy w głowach czaszki, wykonać nacięcie o długości ok

positron-emission-tomography-imaging-for-vivo-measuring-myelin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Źródło: Schmitz, K., et al., Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy. J. Vis. Exp. (2017).Ten film pokazuje metodę wizualizacji i monitorowania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego lub zapalenia nerwu wzrokowego wywołanego EAE za pomocą obrazowanie bioluminescencyjne. Obejmuje to pozycjonowanie myszy, wstrzykiwanie odczynnika i przechwytywanie sekwencyjnych...

Obrazowanie bioluminescencyjne w modelu myszy EAE

Nowy preparat ex vivo do obrazowania rdzenia kręgowego myszy. Protokół ten pozwala na obrazowanie dwufotonowe żywych interakcji komórkowych w całym rdzeniu kręgowym.

Dwufotonowe obrazowanie dynamiki komórkowej w rdzeniu kręgowym myszy

Choroby demielinizacyjne mogą być modelowane u zwierząt poprzez ogniskowe zastosowanie lizolecytyny do OUN. Pojedyncze wstrzyknięcie lizolecytyny do rdzenia kręgowego myszy powoduje zmianę, która spontanicznie naprawia się w czasie. Celem jest zbadanie czynników zaangażowanych w de- i remielinizację oraz przetestowanie środków usprawniających naprawę.

Eksperymentalna demienizacja i remielinizacja mysiego rdzenia kręgowego przez ogniskowe wstrzyknięcie lizolecytyny

Ogniskowa demienizacja jest indukowana w nerwie wzrokowym za pomocą mikroiniekcji lizolecytyny. Wzrokowe potencjały wywołane są rejestrowane za pomocą elektrod czaszkowych wszczepionych w korę wzrokową w celu zbadania przewodzenia sygnału wzdłuż szlaku wzrokowego in vivo. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury chirurgiczne leżące u podstaw implantacji elektrod i mikroiniekcji nerwu wzrokowego.

Wizualny zapis potencjału wywołanego w szczurzym modelu eksperymentalnej demielinizacji nerwu wzrokowego

Pokazujemy technikę obrazowania in vivo na żywo bioluminescencji i bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w eksperymentalnym modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) dla stwardnienia rozsianego u myszy SJL/J.

Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy

Tutaj używamy obrazowania bioluminescencyjnego, rentgenowskiego i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej, aby zbadać, jak hamowanie aktywności mTOR wpływa na guzy szpiczaka kostnego przeszczepionego szpiczakiem kostnym w modelu ksenoprzeszczepu. Pozwala to na fizjologicznie istotne, nieinwazyjne i multimodalne analizy działania przeciwszpiczaka mózgu terapii ukierunkowanych na guzy szpiczaka kostnego przeszczepione szpiczakiem kostnym in vivo.

Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Opisujemy przedkliniczną eksperymentalną metodę oceny neuromodulacji metabolicznej wywołanej przez ostrą głęboką stymulację mózgu za pomocą in vivo FDG-PET. Manuskrypt ten obejmuje wszystkie etapy eksperymentalne, od chirurgii stereotaktycznej po zastosowanie leczenia stymulacją oraz pozyskiwanie, przetwarzanie i analizę obrazów PET.

In vivo (in vivo) Pozytonowa tomografia emisyjna w celu ujawnienia wzorców aktywności wywołanych głęboką stymulacją mózgu u szczurów

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię znakowania radioaktywnego przeciwciała monoklonalnego anty-CD19 specyficznego dla człowieka i jak go używać do ilościowego oznaczania limfocytów B w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych mysiego modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu obrazowania in vivo PET, zliczania gamma ex vivo i metod autoradiograficznych.

Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Poznaj obrazowanie PET z 11C-PIB do pomiaru zawartości mieliny in vivo w szczurzym modelu stwardnienia rozsianego z lizolecytyną. Ta metoda umożliwia ilościową ocenę demielinizacji i remielinizacji w czasie.

Obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej do pomiaru in vivo zawartości mieliny w szczurzym modelu stwardnienia rozsianego z lizolecytyną (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej do pomiaru in vivo zawartości mieliny w szczurzym modelu stwardnienia rozsianego z lizolecytyną

Przeglądaj więcej filmów