Name: Obrazowanie wiązki stereocilii z rozdzielczością w nanoskali w żywych słuchowych komórkach rzęsatych ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj technikę HPICM do obrazowania żywych komórek rzęsatych ucha ssaków z rozdzielczością nanometryczną. Ta metoda umożliwia badanie dynamicznych zmian ultrastruktury stereocilii bez kontaktu fizycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Prof. Yuri Korchev (Imperial College, Wielka Brytania) za długoterminowe wsparcie i porady na wszystkich etapach projektu. Dziękujemy również dr. Pavlowi Novakowi i dr. Andrew Shevchukowi (Imperial College, Wielka Brytania) oraz Olegowi Belovowi (Narodowe Centrum Badań Audiologicznych, Rosja) za pomoc w tworzeniu oprogramowania. Badanie było wspierane przez NIDCD/NIH (R01 DC008861 i R01 DC014658 do G.I.F.).

<ol><li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li>
<li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositol-4%2C5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li>
<li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li>
<li>Engström, H., Engström, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li>
<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li>
<li>Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti%2C+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li>
<li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li>
<li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobs%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22">Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology</a>. 55, 547-561 (1990).</li>
<li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li>
<li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li>
<li>Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li>
<li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182(2020).</li>
<li>Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology+JARO%22%5BJournal%5D)">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li>
<li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li>
<li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li>
<li>Dufrêne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li>
<li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li>
<li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li>
<li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030(2017).</li>
<li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li>
<li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scanning+ion-conductance+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li>
<li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li>
<li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+ed+in+English%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li>
<li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li>
<li>Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+scanning+patch-clamp%3A+new+insights+into+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li>
<li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li>
<li>Sánchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li>
<li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li>
<li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li>
<li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Aby uzyskać udane obrazy HPICM, użytkownicy muszą stworzyć system o niskim poziomie hałasu i wibracji oraz wyprodukować odpowiednie pipety. Zdecydowanie zalecamy stosowanie wzorców kalibracyjnych AFM w celu przetestowania stabilności systemu przed próbą wykonania obrazowania żywych komórek. Po przetestowaniu rozdzielczości systemu użytkownicy mogą rozważyć obrazowanie nieruchomego narządu próbek Cortiego, aby zapoznać się z ustawieniami obrazowania przed przystąpieniem do obrazowania żywych komórek.
<p class="jove_co...

Pomimo faktu, że wiązki stereocilii w słuchowych komórkach rzęsatych są wystarczająco duże, aby można je było zobaczyć za pomocą mikroskopii optycznej i odchylić w żywych komórkach w eksperymencie z patch clamp, podstawowe elementy strukturalne maszynerii transdukcyjnej, takie jak połączenia końcówek, mogły być zobrazowane tylko za pomocą mikroskopii elektronowej w martwych komórkach. W słuchowych komórkach rzęsatych ssaków maszyneria transdukcji znajduje się na dolnych końcach ogniw końcówki, tj. na końcach krótszego rzędu stereocilia1 i jest regulowana lokalnie poprzez sygnalizację na końcach stereocilia2,3. Jednak bezznacznikowe obrazowanie struktur powierzchniowych w tym miejscu w żywych komórkach rzęsatych nie jest możliwe ze względu na małe rozmiary stereocilii.
Ślimak ssaków ma dwa rodzaje komórek czuciowych słuchowych: wewnętrzne i zewnętrzne komórki rzęsate. W wewnętrznych komórkach rzęskowych rzęski są dłuższe i grubsze w porównaniu do tych w zewnętrznych komórkach rzęsatych4. Pierwszy i drugi rząd stereocilii mają średnicę 300-500 nm w wewnętrznych komórkach rzęsatych myszy lub szczura. Ze względu na dyfrakcję światła, maksymalna rozdzielczość osiągalna przy użyciu mikroskopii optycznej bez znaczników wynosi około 200 nm. W związku z tym wizualizacja poszczególnych stereocilii w pierwszym i drugim rzędzie wewnętrznego pęczka komórek rzęsatych jest stosunkowo łatwa dzięki mikroskopii optycznej. W przeciwieństwie do tego, stereorzęski krótsze rzędy w wewnętrznych komórkach rzęsatych i wszystkie stereorzęski zewnętrznych komórek rzęsatych mają średnicę około 100-200 nm i nie można ich uwidocznić za pomocą mikroskopii optycznej5. Pomimo niedawnego postępu w obrazowaniu superrozdzielczym, to fundamentalne ograniczenie utrzymuje się w każdym obrazowaniu optycznym bez znaczników. Wszystkie obecnie dostępne na rynku techniki super-rozdzielczości wymagają pewnego rodzaju cząsteczek fluorescencyjnych6, co ogranicza ich zastosowania. Oprócz ograniczeń wynikających z potrzeby specyficznych cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie, wykazano, że ekspozycja na intensywne promieniowanie świetlne indukuje uszkodzenia komórek i może wpływać na procesy komórkowe, co jest wielką wadą podczas badania żywych komórek7.
Nasza obecna wiedza na temat szczegółów ultrastrukturalnych wiązek stereocilia komórek rzęsatych została uzyskana głównie za pomocą różnych technik mikroskopii elektronowej (EM), takich jak skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM), transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), zamrażalno-łamanie EM, a ostatnio dzięki technikom 3D, takim jak seryjne cięcie z skupioną wiązką jonów lub tomografią krio-EM8,9,10, 11,12,13,14,15,16. Niestety, wszystkie te techniki EM wymagają chemicznej lub kriofiksacji próbki. W zależności od skali czasowej zjawisk, wymóg ten sprawia, że badanie procesów dynamicznych na końcach stereocilii jest albo niemożliwe, albo bardzo pracochłonne.
Podjęto ograniczone wysiłki, aby zobrazować wiązki włosów żywych komórek włosowych za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM)17,18. Ponieważ AFM działa w roztworach fizjologicznych, teoretycznie może wizualizować dynamiczne zmiany w wiązkach stereorzęsek żywych komórek rzęsatych w czasie. Problem tkwi w zasadach działania AFM o wysokiej rozdzielczości, co implikuje pewien kontakt fizyczny między sondą AFM a próbką, nawet w najmniej szkodliwym trybie "stukania"19. Kiedy sonda AFM napotyka stereocilium, zwykle rozbija się o nie, uszkadzając strukturę wiązki włosów. W rezultacie, technika ta nie nadaje się do wizualizacji żywych, a nawet stałych, wiązek komórek włosowych17,18. Problem ten można częściowo rozwiązać, stosując dużą sondę AFM w kształcie kuli, która wywiera tylko siły hydrodynamiczne na powierzchnię próbki20. Jednakże, mimo że taka sonda idealnie nadaje się do badania właściwości mechanicznych próbki21, zapewnia tylko rozdzielczość submikrometrową podczas obrazowania narządu Corti22 i nadal przykłada do próbki siłę, która może być znaczna dla bardzo czułych wiązek stereocilia.
Skaningowa mikroskopia konduktancyjna jonowa (SICM) to wersja mikroskopii z sondą skanującą, która wykorzystuje szklaną sondę pipetową wypełnioną roztworem przewodzącym23. SICM wykrywa powierzchnię, gdy pipeta zbliża się do celi, a prąd elektryczny przepływający przez pipetę zmniejsza się. Ponieważ dzieje się to na długo przed dotknięciem komórki, SICM idealnie nadaje się do bezkontaktowego obrazowania żywych komórek w roztworze fizjologicznym24. Najlepsza rozdzielczość SICM jest rzędu pojedynczych nanometrów, co pozwala na rozdzielenie pojedynczych kompleksów białkowych na błonie plazmatycznej żywej komórki25. Jednak, podobnie jak w przypadku innych technik sond skanujących, SICM jest w stanie obrazować tylko stosunkowo płaskie powierzchnie. Pokonaliśmy to ograniczenie, wynajdując mikroskop konduktancyjny jonów z sondą skaczącą (HPICM)26, w którym nanopipeta zbliża się do próbki w każdym punkcie obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Korzystając z HPICM, byliśmy w stanie zobrazować wiązki stereocilii w żywych słuchowych komórkach rzęsatych z rozdzielczością nanoskali27.
Kolejną fundamentalną zaletą tej techniki jest to, że HPICM to nie tylko narzędzie do obrazowania. W przeciwieństwie do innych technik sond skanujących, sonda HPICM/SICM jest elektrodą szeroko stosowaną w fizjologii komórki do zapisów elektrycznych i lokalnego dostarczania różnych bodźców. Aktywność kanałów jonowych zwykle nie zakłóca obrazowania HPICM, ponieważ całkowity prąd przepływający przez sondę HPICM jest o kilka rzędów wielkości większy niż prąd zewnątrzkomórkowy generowany przez największe kanały jonowe25. Jednak HPICM umożliwia precyzyjne pozycjonowanie nanopipety nad strukturą będącą przedmiotem zainteresowania, a następnie jednokanałowy zapis patch-clamp z tej struktury28. W ten sposób uzyskaliśmy pierwsze wstępne zapisy aktywności pojedynczego kanału na końcach zewnętrznej komórki rzęsatej stereocilia29. Warto wspomnieć, że nawet duży prąd przepływający przez nanopipetę nie jest w stanie spowodować znaczących zmian potencjału w poprzek błony plazmatycznej ze względu na ogromny bocznik elektryczny ośrodka zewnątrzkomórkowego. Jednak poszczególne kanały jonowe mogą być aktywowane mechanicznie przez przepływ cieczy przez nanopipetę30 lub chemicznie przez miejscowe zastosowanie agonisty31.
W HPICM obraz jest generowany, gdy nanopipeta sekwencyjnie zbliża się do próbki w jednym punkcie, cofa się, a następnie przesuwa w kierunku bocznym, aby powtórzyć podejście (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Wzmacniacz z zaciskiem krosowym stale przykłada napięcie do przewodu AgCl w pipecie (<klasa silna="xfig">Rysunek 1B), aby wytworzyć prąd o wartości ~1 nA w roztworze kąpieli. Wartość tego prądu, gdy pipeta znajduje się z dala od powierzchni celi, jest określana jako prąd odniesienia (I ref, <silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Następnie pipeta przesuwa się w osi Z, aby zbliżyć się do próbki, aż prąd zostanie zmniejszony o wartość zdefiniowaną przez użytkownika (wartość zadana), zwykle 0,2%-1% wartości I ref (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C, górny ślad). Następnie system zapisuje wartość Z w tym momencie jako wysokość próbki wraz ze współrzędnymi X i Y tego punktu obrazowania. Następnie pipeta jest odsuwana od powierzchni (rysunek 1C, dolna ścieżka) z prędkością określoną przez użytkownika, zwykle 700-900 nm/ms. Po wycofaniu pipeta (lub, w naszym przypadku, próbka - patrz Rysunek 1B) jest przesuwana poprzecznie do następnego punktu obrazowania, uzyskuje się nową wartość prądu referencyjnego, a pipeta ponownie zbliża się do próbki, powtarzając proces. Ruch X-Y pipety jest preferowany w ustawieniu mikroskopu pionowego, który jest zwykle używany do rejestrowania prądów mechanotransdukcji komórek rzęsatych. W tym ustawieniu sonda HPICM zbliża się do wiązek komórek rzęsatych nie od góry, ale pod kątem32. Jednak najlepszą rozdzielczość obrazowania HPICM uzyskuje się w konfiguracji mikroskopu odwróconego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B), w której ruch próbki w kierunkach X-Y jest oddzielony od ruchu Z nanopipety, eliminując w ten sposób potencjalne artefakty mechaniczne.
Korzystając z HPICM, uzyskaliśmy obrazy topograficzne wewnętrznych i zewnętrznych wiązek stereocilii komórek rzęsastych myszy i szczura, a nawet zwizualizowaliśmy powiązania między stereociliami o średnicy około 5 nm26,27. Powodzenie obrazowania pęczka komórek rzęsatych za pomocą tej techniki zależy od kilku czynników. Po pierwsze, szum (wariancja) prądu nanopipety powinien być jak najmniejszy, aby umożliwić najniższą możliwą wartość zadaną dla obrazowania HPICM. Niska wartość zadana pozwala sondzie HPICM "wyczuć" powierzchnię stereorzęsek w większej odległości i pod dowolnym kątem do zbliżenia sondy i, co zaskakujące, poprawia rozdzielczość X-Y obrazowania HPICM (patrz Dyskusja). Po drugie, drgania i dryfty w systemie powinny zostać zmniejszone do mniej niż 10 nm, ponieważ mają one bezpośredni wpływ na artefakty obrazowania. Wreszcie, mimo że sonda HPICM i stolik na próbkę są poruszane w osiach Z i X-Y przez skalibrowane siłowniki piezoelektryczne sterowane sprzężeniem zwrotnym, które mają dokładność jednego nanometra lub lepszą, średnica końcówki nanopipety określa rozpiętość prądu (objętość wykrywania), a tym samym rozdzielczość (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Dlatego przed obrazowaniem żywych komórek rzęsatych ważne jest, aby pobrać odpowiednie pipety, osiągnąć pożądaną rozdzielczość za pomocą próbek kalibracyjnych i osiągnąć niski poziom szumów w systemie rejestracji.
Przez co najmniej kilka dekad, technika SICM nie była dostępna komercyjnie i rozwija się tylko przez kilka laboratoriów na świecie z wiodącym laboratorium prof. Korcheva w Imperial College (Wielka Brytania). Ostatnio na rynku pojawiło się kilka systemów SICM (patrz tabela materiałów), z których wszystkie są oparte na oryginalnych zasadach HPICM. Jednak obrazowanie wiązek stereocilia w komórkach rzęsatych wymaga kilku niestandardowych modyfikacji, które są technicznie trudne (lub nawet niemożliwe) w zamkniętych systemach "gotowych do użycia". W związku z tym potrzebna jest pewna integracja komponentów. Ponieważ konfiguracja HPICM reprezentuje zestaw do zacisków krosowych z bardziej rygorystycznymi wymaganiami dotyczącymi wibracji i dryfu oraz napędzany piezoruchem sondy HPICM i próbki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D), ta integracja jest stosunkowo łatwa dla każdego badacza, który jest biegły w zaciskaniu łat. Jednak naukowiec bez odpowiedniego zaplecza z pewnością musiałby najpierw przeszkolić się w zakresie elektrofizjologii. Pomimo pozostałych wyzwań, takich jak zwiększenie szybkości obrazowania (patrz Dyskusja), byliśmy w stanie zobrazować wiązki stereocilii w żywych komórkach rzęsatych z rozdzielczością nanoskalową bez ich uszkadzania. 
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół do przeprowadzenia udanego obrazowania HPICM żywych pakietów słuchowych komórek rzęsatych u młodych pourodzeniowych szczurów lub myszy explantat przy użyciu naszego niestandardowego systemu. Zintegrowane komponenty są wymienione w tabeli materiałów. W dokumencie opisano również typowe problemy, które można napotkać, oraz sposoby ich rozwiązywania.

<table><tbody><tr><td>Oscyloskop analogowy</td><td>B& K Precision</td><td>2160C</td><td>Oscyloskop analogowy do monitorowania w czasie rzeczywistym prądu nanopipet i podejścia do osi Z,</td></tr><tr><td>wzorce kalibracji AFM</td>, <td>TED PELLA Inc</td>, <td>HS-100MG; HS-20MG</td><td>Te wzorce kalibracyjne 100 i 20 nm są używane do testowania działania systemu HPICM</td></tr><tr><td>Laboratoryjny izolator drgań</td><td>AMETEK/TMC</td><td>Everstill K-400</td><td>Aktywna izolacja</td></tr><tr><td>drgań Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>1B100F-4</td><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego do nanopipet</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Do dodania do roztworu do kąpieli w celu regulacji osmolarności</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>National Instruments Corporation</td><td>PCI-6221</td><td>Wielokanałowy digitizer wejść/wyjść</td></tr><tr><td>Szybki analogowy regulator proporcjonalno-całkująco-pochodną (PID) dla ruchu Z</td><td>Standford Research Systems</td><td>SIM900, SIM960, SIM980</td><td>Moduły oprzyrządowania zintegrowane z zewnętrznym regulatorem PID dla ruchu Z. Wymaga szybkiej reakcji, która zwykle nie jest zaimplementowana w komercyjnych wzmacniaczach piezoelektrycznych.</td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>AMETEK/TMC</td><td>Typ II</td><td>Wymagany do ekranowania zakłóceń elektromagnetycznych</td></tr><tr><td>Szklana podstawka</td> Instrumenty <td>precyzyjne World Precision Instruments (WPI)</td><td>FD5040-100</td><td>Używany jako naczynie do komory na tkankę</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy (do kąpieli)</td></tr><tr><td>Wzmacniacz oprzyrządowania</td><td>Brownlee Wzmacniacz</td> oprzyrządowania Precision <td>Model 440</td><td>zapewnia wymagane przesunięcia, filtrowanie i wtórne powiększenie lub tłumienie</td></tr><tr><td>Laserowy ściągacz do mikropipet</td> Ściągacz do mikropipet <td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>do wytwarzania nanopipet. Laser jest potrzebny do ostrych pipet kwarcowych.</td></tr><tr><td>Lebovitz's L-15, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy (kąpielowy)</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td>Służy do "kursowego" pozycjonowania siłownika piezoelektrycznego</td></tr><tr><td>Z Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Odwrócony mikroskop optyczny</td></tr><tr><td>Wzmacniacz krosowy</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Axopatch 200B</td><td>Wzmacniacz patch clamp mierzy prąd przez nanopipetę</td></tr><tr><td>Wzmacniacz piezoelektryczny (osie XY)</td> <td>Physik Instrumente (PI)</td> <td>E-500.00, E-505.00, E-509. C2A</td><td>Wzmocnienie i regulacja PID dla stopnia translacji piezoelektrycznej XY</td></tr><tr><td>Wzmacniacz piezoelektryczny (oś Z)</td><td>Piezosystem jena</td><td>ENT 400 & 800</td><td>Niestandardowy wzmacniacz składający się z zasilacza ENT 400 i dwóch wzmacniaczy ENT 800 równolegle w celu uzyskania maksymalnego prądu 1,6 nA</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe z tworzywa sztucznego</td><td>TED PELLA Inc</td><td>26028</td><td>Używane do produkcji komór na tkanki&nbsp;</td></tr><tr><td>Kontroler i oprogramowanie SICM*</td><td>Ionscope, Wielka Brytania (ionscope.com)Nie</td> <td>dotyczy</td><td>Niestandardowy kontroler oparty na płytce SBC6711 cyfrowego przetwarzania sygnału firmy Innovative Integration Ltd</td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy (Sylgard)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYLG184</td><td>Służy do mocowania elastycznych włókien szklanych do komory na tkankę</td></tr><tr><td>Klej silikonowy</td><td>The Dow Chemical Company</td><td>734</td><td>Służy do klejenia różnych części komory na tkankę</td></tr><tr><td>Pręt wolframowy</td><td>A-M Systems</td><td>717500</td><td>Służy do przytrzymywania pasm nici dentystycznej w komorze na tkankę</td></tr><tr><td>Nanopozycjoner piezoelektryczny XY</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>P-733.2DD</td><td>Stolik translacyjny XY z czujnikami pojemnościowymi</td></tr><tr><td>Z nanopozycjoner piezoelektryczny</td><td>Piezosystem jena</td><td>RA 12/24 SG</td><td>Pierścieniowy siłownik piezoelektryczny z czujnikiem tensometrycznym</td></tr><tr><td>*Ionscope nie sprzedaje już oddzielnych kontrolerów SICM. Istnieje kilka innych komercyjnych systemów:&nbsp; NX12-Bio oraz NX10 SICM,&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Park Systems, Korea i moduły SICM firmy ICAPPIC Limited, Wielka Brytania (icappic.com). Wszystkie te systemy bazują na oryginale&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zasady HPICM. Jednak obrazowanie wiązek stereocilia w komórkach rzęsatych wymaga kilku niestandardowych modyfikacji, które są technicznie&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>trudne (lub wręcz niemożliwe) w zamkniętym " Gotowy do pracy" systemy takie jak Ionscope lub NX12-Bio/NX10. Obecnie jest tylko jeden&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>system modułowy (ICAPPIC), który jest elastyczny i pasuje do każdego eksperymentu SICM/HPICM, ale wymaga pewnej integracji komponentów.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie wiązki stereocilii z rozdzielczością w nanoskali w żywych słuchowych komórkach rzęsatych ssaków

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Komórki rzęsate ucha wewnętrznego wykrywają przemieszczenia wywołane dźwiękiem i przekształcają te bodźce w sygnały elektryczne w wiązce włosów, która składa się ze stereocilii, które są ułożone w rzędy o rosnącej wysokości. Kiedy stereorzęski są odchylone, ciągną za maleńkie (~5 nm średnicy) zewnątrzkomórkowe ogniwa końcówek łączące stereorzęski, które przenoszą siły do mechanowrażliwych kanałów transdukcji. Chociaż mechanotransdukcja jest badana w żywych komórkach rzęsatych od dziesięcioleci, funkcjonalnie ważne szczegóły ultrastrukturalne maszynerii mechanotransdukcji na końcach stereorzęsek (takie jak dynamika połączenia końcówki lub zależna od transdukcji przebudowa stereorzęsek) mogą być nadal badane tylko w martwych komórkach za pomocą mikroskopii elektronowej. Teoretycznie techniki sond skanujących, takie jak mikroskopia sił atomowych, mają wystarczającą rozdzielczość, aby uwidocznić powierzchnię stereocilii. Jednak niezależnie od trybu obrazowania, nawet najmniejszy kontakt sondy mikroskopowej sił atomowych z wiązką stereocilii zwykle uszkadza wiązkę. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania w mikroskopii konduktancyjnej jonów z sondą skaczącą (HPICM) żywych słuchowych komórek rzęsatych gryzoni. Ta bezkontaktowa technika sondy skanującej umożliwia obrazowanie poklatkowe powierzchni żywych komórek o złożonej topografii, takich jak komórki rzęsate, z rozdzielczością pojedynczych nanometrów i bez fizycznego kontaktu z próbką. HPICM wykorzystuje prąd elektryczny przepływający przez szklaną nanopipetę do wykrywania powierzchni komórki w bliskim sąsiedztwie pipety, podczas gdy system piezoelektryczny z pozycjonowaniem 3D skanuje powierzchnię i generuje jej obraz. Dzięki HPICM byliśmy w stanie obrazować wiązki stereocilii i ogniwa łączące stereocilia w żywych słuchowych komórkach rzęsatych przez kilka godzin bez zauważalnych uszkodzeń. Przewidujemy, że zastosowanie HPICM pozwoli na bezpośrednią eksplorację zmian ultrastrukturalnych w stereorzęskach żywych komórek rzęsatych w celu lepszego zrozumienia ich funkcji.

Protokół przedstawiony w niniejszej pracy może być wykorzystany do wizualizacji dowolnych żywych komórek o złożonej topografii. Postępując zgodnie z tymi krokami, rutynowo uzyskujemy obrazy żywych wiązek komórek rzęsatych ucha szczura (Rysunek 6B,D). Pomimo niższej rozdzielczości w płaszczyźnie X-Y w porównaniu z obrazami SEM, nasze obrazy HPICM pozwalają pomyślnie rozdzielić poszczególne rzędy stereocilii, kształt ich wierzchołków, a nawet niewielkie połączenia (o średnicy ...

Tutaj prezentujemy protokół dla Mikroskopii Konduktancji Jonów Sondy Skaczącej (HPICM), techniki bezkontaktowej sondy skanującej, która umożliwia nanoskalowe obrazowanie wiązek stereorzęsek w żywych słuchowych komórkach rzęsatych.

Obrazowanie wiązki stereocilii z rozdzielczością w nanoskali w żywych słuchowych komórkach rzęsatych ssaków

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

To praktyczne może nam pomóc w badaniu dynamicznych zmian nanostrukturalnych elementów mechanicznej elektrycznej maszynerii transdukcyjnej na powierzchni wiązek stereocilii komórek rzęsatych. Główną zaletą tej techniki jest obrazowanie poklatkowe powierzchni żywych komórek o złożonej topografii w rozdzielczości pojedynczego nanometra i bez fizycznego kontaktu z próbką. Technikę tę można zastosować do prawie każdej żywej komórki.Wcześniej dopasowaliśmy powierzchnię linii komórkowych nabłonka płuc zakażonych wirusami, komórek mięśniowych, w My Image Bacteria Soon. Przetestuj nanopipety na początku każdej sesji obrazowania. Po wyprodukowaniu nanopipety sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza, usuń wszelkie pęcherzyki, jeśli są obecne, i zamontuj nanopipetę na uchwycie pipety mikroskopu konduktancji jonowej z sondą przeskakującą.Na cztery mililitry roztworu kąpieli do komory i umieścić komorę na stoliku HPICM. Wprowadzić elektrodę masową do roztworu kąpieli i upewnić się, że napięcie podawane do pipety przez wzmacniacz patch clamp wynosi zero. Po ustawieniu mikromanipulatora w pozycji pionowej przesuń pipetę w pozycji Z, aż dotknie cieczy i ustaw przesunięcie wzmacniacza na zero, a następnie dodaj plus 100 miliwoltów, aby sprawdzić prąd pipety.Użyj kleju silikonowego, aby przymocować wzorzec kalibracyjny AFM do komory i przykryj próbkę czterema mililitrami HBSS. Użyj taśmy dwustronnej, aby przymocować komorę do stopnia XY konfiguracji HPICM i załaduj nową nanopipetę na uchwyt, jak pokazano. Po przetestowaniu rezystancji i średnicy nanopipety ustaw prąd na jeden nanoamper.Użyj manipulatora z gruboziarnistym zaciskiem krosowym, aby ustawić nanopipetę w przybliżeniu powyżej środka wzorca kalibracyjnego i zwiększyć wartość zadaną, jednocześnie monitorując sygnał z czujnika siłownika piezoelektrycznego Z na oscyloskopie w czasie rzeczywistym. Po ustaleniu stabilnego, powtarzalnego cyklu podejścia Z, zmniejsz wartość zadaną do wartości tuż powyżej punktu niestabilności i przesuwaj pipetę w dół z prędkością około pięciu mikronów na sekundę, aż dotrze do próbki. Dolny poziom sygnału pozycjonowania Z w czasie rzeczywistym wzrośnie, co oznacza, że nanopipeta została wycofana z powodu wykrycia powierzchni próbki.Ze względu na nierównomierne mocowanie na standardzie AFM, najwyższy punkt obszaru zainteresowania może być nieznany. Dlatego należy ustawić amplitudę wciągania pipety na co najmniej 200 do 500 nanometrów. Uważając, aby nie przekroczyć górnej granicy ruchu siłownika piezoelektrycznego Z, rozpocznij obrazowanie w niskiej rozdzielczości.Po zidentyfikowaniu najwyższego punktu próbki w obszarze obrazowania zmniejsz amplitudę przeskoku i cofnij pipetę o około 200 mikronów wzdłuż osi Z, aby zapobiec niepożądanej kolizji z próbką przed przeniesieniem jej do nowego miejsca XY. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania rozpocznij obrazowanie w wyższej rozdzielczości. W przypadku obrazowania słuchowych komórek rzęsatych należy mocno przymocować świeżo wyizolowany narząd Cortiego do komory za pomocą nici dentystycznej lub elastycznych szklanych pipet.Użyj taśmy dwustronnej, aby mocno przymocować komorę do stolika piezoelektrycznego XY i załaduj nową nanopipetę na uchwyt, jak pokazano. Po sprawdzeniu rezystancji nanopipet, użyj mikromanipulatora z zaciskiem krosowym, aby umieścić nanopipetę nad obszarem komórek rzęsatych, obserwując narząd rośliny Corti X w odwróconym mikroskopie. Zapisz prąd w czasie rzeczywistym i sygnał pozycjonowania Z na oscyloskopie, aby sprawdzić, czy system jest stabilny z wartością zadaną 0,5% 6 lub niższą, a następnie określ optymalną wartość zadaną i zbliż się do próbki, jak pokazano.Wykonać obrazowanie próbki w niskiej rozdzielczości, jak pokazano, przy amplitudzie chmielu co najmniej sześciu do ośmiu mikronów. Jeśli nanopipeta musi zostać przeniesiona w nowe miejsce XY, należy cofnąć pipetę na około 500 nanometrów, aby uniknąć kolizji z jakimikolwiek wysokimi elementami w tkance i powtórzyć obrazowanie HPICM o niskiej rozdzielczości aż do obszaru zainteresowania, w którym znajdują się komórki rzęsate. Następnie zobrazuj obszar zainteresowania w wyższej rozdzielczości w ciągu 15 minut lub krócej.Protokół HPICM może być używany do wizualizacji dowolnych żywych komórek o złożonej topografii, takich jak wiązki słuchowych komórek rzęsatych żywych szczurów. Pomimo wykazywania niższej rozdzielczości XY w porównaniu z obrazami ze skaningowej mikroskopii elektronowej, obrazy HPICM mogą z powodzeniem rozpoznać różne rzędy stereocilii. Kształt końcówek stereocilii, a nawet małe pięcionanometrowe ogniwa łączące sąsiednie stereocilia.Biorąc pod uwagę bezkontaktowy charakter obrazowania HPICM, ciągłe obrazowanie poklatkowe tego samego pęczka komórek rzęsatych może być wykonywane przez kilka godzin bez uszkodzenia spójności pęczka His. Należy pamiętać, że przy bardzo niskiej wartości zadanej system może interpretować niewielkie wahania prądu jako napotkanie powierzchni komórki, co prowadzi do szumu białej kropki na obrazie. Podobnie, duże amplitudy przeskoku mogą zwiększać rezonans boczny pipety, co również powoduje wytwarzanie hałaśliwych pikseli.Z drugiej strony, jeśli amplituda chmielu jest zbyt mała lub wartość zadana jest zbyt wysoka, nanopipeta może zderzyć się z próbką, powodując artefakty obrazowania lub uszkodzenie pęczka włosów. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest poświęcenie mniej niż 15 minut na pęczek komórek rzęsatych podczas pracy z żywymi komórkami. Po uzyskaniu obrazu wiązki włosów, można próbować uzyskać jednokanałowe nagrania z określonych miejsc na powierzchni stereocilii, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące właściwości kanału mechanotransdukcji.

stereocilia-bundle-imaging-with-nanoscale-resolution-live-mammalian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracje metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell z dendrytów włókien nerwu słuchowego w obrębie synaps wstążkowych komórek rzęskowych wewnętrznych w ślimaku ssaków.

Rejestracje postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęskowymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstążkowej

Opisano wiarygodną metodę badania odpowiedzi ruchowych zewnętrznych komórek rzęskowych (OHC), obejmującą elektromotywność, motywność powolną oraz zginanie. Motywność OHC jest wywoływana poprzez stymulację zewnętrznym przemiennym polem elektrycznym, a metoda wykorzystuje szybką rejestrację obrazu, oświetlenie LED oraz najnowszej generacji oprogramowanie do analizy obrazu.

Badanie ruchliwości zewnętrznych komórek rzęskowych przy użyciu kombinacji zewnętrznej stymulacji zmiennym polem elektrycznym oraz wysokoprzepustowej analizy obrazu

Źródło: Łukasz, D., et al. Obrazowanie in vivo wapnia komórek rzęsatych linii bocznej u larw danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje obrazowanie na żywo napływu wapnia do komórek rzęsatych linii bocznej sparaliżowanej transgenicznej larwy danio pręgowanego przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Mechaniczna stymulacja wiązek włosów za pomocą impulsów płynu indukuje wnikanie wapnia przez kanały mechanotransdukcji i kanały bramkowane napięciem, co jest wizualizowane w czasie...

Obrazowanie dynamiki wapnia w komórkach rzęsatych linii bocznej larw danio pręgowanego

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Woreczek amerykańskiej żaby (Rana catesbeiana) pozwala na bezpośrednie badanie fizjologii komórek rzęsatych. Opisano tutaj sekcję i przygotowanie worka żaby do badań biofizycznych. Pokazujemy reprezentatywne eksperymenty z tymi komórkami rzęsa, w tym obliczenie relacji siła-przemieszczenie wiązki i pomiar jej niewymuszonego ruchu.

Fizjologiczne przygotowanie komórek rzęsatych z worka żaba białopłetwego (Rana catesbeiana)

Ten protokół opisuje metody rejestrowania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u pourodzonych szczurzych szczeniąt. Aby zbadać rozwój funkcjonalny zewnętrznych komórek rzęsatych, opisano krok po kroku eksperymentalną procedurę rejestracji klamry krosowej całej komórki w izolowanych zewnętrznych komórkach rzęsatych.

Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

Danio pręgowany to modelowy system, który posiada wiele cennych cech, w tym przejrzystość optyczną, szybki rozwój zewnętrzny oraz, co szczególnie ważne dla dziedziny słuchu i równowagi, zewnętrznie zlokalizowane czuciowe komórki rzęsate. W tym artykule opisano, w jaki sposób transgeniczny danio pręgowany może być używany do oznaczania zarówno mechanosensacji komórek rzęsatych, jak i funkcji presynaptycznych in toto.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek rzęsatych w linii bocznej u larw danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji wychwytu 3 kDa Texas Red-labeled dextranu w słuchowych komórkach rzęsatych z funkcjonalnymi kanałami mechanotransdukcji. Ponadto dektrans o stężeniu 3–10 kDa może być stosowany do badania endocytozy we włosach i komórkach podporowych narządu Cortiego.

Znakowanie i wychwyt dekstranu w żywych i funkcjonalnych mysich komórkach rzęsatych ślimaka

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od myszy. Początkowo narząd Cortiego został wypreparowany z noworodków (w wieku 3-5 dni) mysich ślimaków pod mikroskopem. Następnie komórki trawiono enzymatycznie do zawiesiny jednokomórkowej i identyfikowano za pomocą immunofluorescencji po kilku dniach w hodowli.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od nowonarodzonych myszy

Poznaj technikę HPICM do obrazowania żywych komórek rzęsatych ucha ssaków z rozdzielczością nanometryczną. Ta metoda umożliwia badanie dynamicznych zmian ultrastruktury stereocilii bez kontaktu fizycznego.

Obrazowanie wiązki stereocilii z rozdzielczością w nanoskali w żywych słuchowych komórkach rzęsatych ssaków

Przeglądaj więcej filmów