Aparat do niwelowania snu: wysoce skuteczna metoda pozbawiania snu Drosophila

Homeostaza snu, czyli wydłużenie snu po utracie snu, jest cechą definiującą sen. Deprywacja snu i ograniczenie snu są zatem potężnymi narzędziami do badania regulacji i funkcji snu. Protokół ten skutecznie pozbawia snu i ogranicza sen much, jednocześnie minimalizując potencjalne zakłócenia.

SNAP pozbawia muszki ponad 95% snu nawet u much z wysokim popędem snu. Co ważne, pobudzenie much za pomocą SNAP nie szkodzi muchom i wywołuje odbicie porównywalne do tego uzyskanego przy deprywacji rąk, co jest standardem dla minimalnie zakłócającej deprywacji snu. Wizualizacja, w jaki sposób SNAP utrzymuje muchy w stanie czuwania, pomoże badaczom wykorzystać i zoptymalizować ten protokół.

Zacznij od zebrania much do fiolek, oddzielając samce i samice. Trzymaj muchy w grupach mniejszych niż 20 sztuk i trzymaj je przez trzy do pięciu dni w jasnym i wilgotnym środowisku. Przygotuj odpowiednią liczbę probówek z pokarmem na muchy na jednym końcu i uszczelnij koniec woskiem.

Pojedynczo umieść obudzone muchy w rurkach za pomocą aspiratora i zatkaj rurki piankowym korkiem. Załaduj rurki do monitorów aktywności, aby monitorować sen, upewniając się, że rurki są umieszczone we właściwej orientacji. Koniec tubki z jedzeniem powinien znajdować się w górnej części SNAP, aby zapewnić, że muchy nie zostaną wepchnięte do jedzenia.

Umieść monitory aktywności w komorze rejestracyjnej i monitoruj sen przez co najmniej dwa pełne dni, aby oszacować sen bazowy. Zapisuj liczniki aktywności lokomotorycznej much w jednominutowych pojemnikach od czasu zapalenia się świateł w danym dniu do świateł w dniu poprzednim za pomocą oprogramowania do rejestrowania aktywności. Oszacuj sen na podstawie danych dotyczących aktywności lokomotorycznej za pomocą niestandardowych makr, używając pięciu minut bezczynności jako progu napadu snu.

Jeśli sen jest stabilny w ciągu dwóch dni wyjściowych, umieść monitory aktywności w SNAP na wypadek nocnego braku snu trzeciego dnia. Upewnij się, że monitory aktywności są zabezpieczone za pomocą kołków uchwytu monitora. Przewody monitora są podłączone, a monitory są prawidłowo ustawione.

Gdy światła zapalą się po nocnym braku snu, odłącz monitory aktywności i natychmiast wyjmij je z SNAP. Umieść muchy w komorze rejestracyjnej, w której będą niepokojone przez dwa dni, aby monitorować sen regeneracyjny. Dla każdej muchy oblicz różnicę godzinową między snem uzyskanym podczas braku snu a odpowiadającą mu godziną podczas linii bazowej, a następnie zsumuj różnice godzinowe, aby obliczyć całkowitą ilość utraconego snu.

Następnie oblicz różnicę godzinową między snem uzyskanym podczas regeneracji a odpowiadającą mu godziną podczas linii bazowej, a następnie zsumuj różnice godzinowe, aby obliczyć całkowity uzyskany sen. Oblicz średni procent snu odzyskanego w ciągu 12, 24 i 48 godzin okresu rekonwalescencji dla każdego genotypu. Na koniec oblicz średnią i maksymalną długość snu w ciągu dnia w dniach wyjściowych i regeneracyjnych dla każdego genotypu.

Muchy były pozbawione snu w SNAP i odzyskiwały sen w ciągu dnia. Skuteczność SNAP w utrzymywaniu much w stanie czuwania wykazano na podstawie wysokiej aktywności wykazywanej przez muchy podczas braku snu. Aby ilościowo oszacować skuteczność deprywacji snu i regeneracji, dla każdej muszki obliczono sen utracony podczas deprywacji, a następnie odzyskany w dniach rekonwalescencji.

Co ważne, nie zaobserwowano znaczącej zmiany w wyjściowym śnie między dniem deprywacji a dniem wyjściowym, co wskazuje, że sen u tych much jest stabilny. SNAP skutecznie pozbawił muchy ponad 98% ich nocnego snu. Muchy odzyskały około 20% snu w ciągu pierwszych 12 godzin i nie odzyskały dodatkowego snu w nocy.

Zaczęli odzyskiwać sen następnego dnia i odzyskali 36% snu w ciągu 48 godzin. Homeostaza snu charakteryzuje się zarówno wydłużonym czasem trwania snu, jak i zwiększoną głębokością snu w okresie rekonwalescencji. Konsolidacja snu w ciągu dnia jest powszechnie używana jako odczyt głębokości snu.

Konsolidację snu można ocenić jako średni czas trwania snu w ciągu całego dnia. Jednak gdy ciśnienie snu jest rozpraszane podczas regeneracji, średni czas trwania snu ulega skróceniu. Zmiany w maksymalnym czasie trwania snu mogą zapewnić bardziej czułą metrykę.

Procedurę tę można łatwo zmodyfikować, aby zminimalizować utratę snu, a tym samym kontrolować niespecyficzne efekty bodźca. SNAP można skonfigurować tak, aby ograniczał sen, naśladując w ten sposób przewlekłą utratę snu u ludzi. Może być również używany do pomiaru progów pobudzenia.

Deprywacja snu za pomocą SNAP przyniosła ważne informacje na temat funkcji snu dzięki badaniom badającym negatywne konsekwencje utraty snu. Identyfikując manipulacje, które zakłócają ekspresję snu z odbicia, deprywacja snu za pomocą SNAP pomogła również wyjaśnić mechanizmy homeostatyczne, które regulują sen.