Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej
7 lutego 2021
Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.
Dzięki temu protokołowi możemy bezpośrednio obserwować specyficzne dla miejsca rozszczepienie DNA przez endonukleazy restrykcyjne na poziomie pojedynczej cząsteczki. Nasze podejście multipleksowe pozwala nam zmierzyć czas potrzebny setkom pojedynczych REaz na zakończenie cyklu katalitycznego. Multipleksowanie pozwala nam generować dobrze wypełnione rozkłady czasu przebywania do rozszczepienia, które możemy dopasować do rozkładu prawdopodobieństwa gamma, aby uzyskać wgląd w mechanizm rozszczepienia DNA.
Rozpocznij od przygotowania świeżej probówki dla każdego zawieszonego oligonukleotydu o objętości 50 mikrolitrów oligonukleotydu i 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu DTT do każdej probówki, pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie odpipetować całą objętość każdej mieszaniny próbek do przygotowanej kolumny i odwirować w temperaturze 750 G przez dwie minuty. Po odwirowaniu wszelkie próbki, które nie zostaną natychmiast użyte, należy przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby zapobiec utlenianiu grup tiolowych i tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych.
Odpipetować jedną porcję 50 mikrolitrów zapasu kropek kwantowych do urządzenia do dializy dla każdej konstrukcji, która ma być wykonana, uważając, aby nie dotknąć membrany końcówką pipety. Dializować w stosunku do objętości buforu CHES co najmniej 1 000 razy większej od objętości próbki, mieszając przy 100 obr./min przez 15 minut. Za pomocą pipetera ostrożnie pobrać zawieszone kropki kwantowe z urządzenia do dializy i przenieść je do świeżej probówki zawierającej równą objętość świeżo przygotowanego roztworu sulfo-SMCC, pipetując w górę i w dół w celu wymieszania.
Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 1 000 obr./min, aby umożliwić Sulfo-SMCC reakcję z pierwszorzędowymi aminami na kropkach kwantowych. Następnie za pomocą pipetera ostrożnie przenieś każdą próbkę do nowego urządzenia do dializy. W celu usunięcia nadmiaru sulfo-SMCC należy dializować z objętością buforu CHES co najmniej 1 000 razy większą niż objętość zawarta w urządzeniu do dializy, mieszając przez 15 minut.
Należy wymienić bufor dwa razy i przeprowadzić dializę z użyciem nowego buforu CHES łącznie trzy razy, co pozwala na kontynuowanie dializy przez 15 minut po każdej wymianie buforu. Następnie powtórzyć dializę z PBS. Za pomocą pipetera ostrożnie odzyskać roztwór zawierający kropki kwantowe z urządzenia do dializy i przenieść każdą próbkę do świeżej probówki zawierającej równomolową ilość rozszerzonego oligonukleotydu rozcieńczonego w PBS.
Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 1 000 obr./min. Dodaj BSA do każdej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 miligrama na mililitr. Następnie za pomocą pipetera ostrożnie przenieś każdą próbkę do nowego urządzenia do dializy i dializuj w buforze do przechowywania.
Po dializie ostrożnie odzyskaj każdą próbkę i umieść ją w świeżej probówce. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Połącz próbkę oligonukleotydów znakowanych kropkami kwantowymi z dziesięciokrotnym nadmiarem molowym biotynylowanego oligonukleotydu.
Podgrzej mieszaninę w bloku grzewczym do 75 stopni Celsjusza i trzymaj ją w tej temperaturze przez 5 minut. Następnie wyłącz blok grzewczy i pozwól mieszaninie powoli ostygnąć. Przechowuj gotową konstrukcję w temperaturze 4 stopni Celsjusza Za pomocą ręcznego obrotowego narzędzia wielofunkcyjnego wyposażonego w stożkowe wiertło diamentowe wywierć dwa otwory w przeciwległych rogach zjeżdżalni kwarcowej, aby służyły jako wlot i wylot.
Pamiętaj, aby zabezpieczyć suwak na miejscu, smarować wiertło i stale przesuwać się wodą podczas wiercenia. Po każdym eksperymencie odzyskaj przygotowane szkiełko kwarcowe, mocząc używane urządzenie w acetonie w celu rozpuszczenia kleju i żywicy epoksydowej. Odrzuć pozostałe składniki.
Połączyć 25 mikrolitrów roztworu streptawidyny z 80 mikrolitrami PBS i 20 mikrolitrami buforu blokującego. Pokryj szkiełko nakrywkowe nasączone PEG tą mieszaniną i inkubuj w wilgotnym środowisku przez 30 minut. Podczas inkubacji szkiełka nakrywkowego należy przygotować przekładkę obrazową, aby utworzyć kanał przepływowy.
Wytnij kwadratowy kawałek materiału dystansowego o średnicy 1 cala, a następnie zaznacz kanał o szerokości 2 milimetrów wyrównany z końcami otworów wywierconych w szkiełku kwarcowym. Wytnij kanał z materiału dystansowego za pomocą skalpela. Dokładnie wyczyść szkiełko kwarcowe acetonem, aby usunąć wszelkie pozostałości kleju z poprzednich eksperymentów.
Oderwij jedną stronę podkładu od przekładki obrazu i ostrożnie umieść ją na szkiełku kwarcowym, uważając, aby nie zakryć otworów wlotowych i wylotowych. Umyj szkiełko nakrywkowe wodą i osusz sprężonym powietrzem. Usuń drugą stronę nośnika z przekładki obrazowej i umieść ją między szkiełkiem kwarcowym a funkcjonalnym szkiełkiem nakrywkowym pokrytym streptawidyną za pomocą plastikowej pęsety, aby docisnąć zespół do siebie i usunąć pęcherzyki powietrza z kleju.
Przyciąć koniec rurki pod kątem, aby zapewnić swobodny przepływ roztworu. Następnie włóż rurkę polietylenową o długości 30 centymetrów do każdego otworu w zjeżdżalni kwarcowej. Przytrzymaj rurki na miejscu za pomocą stojaka na tuby, a następnie użyj żywicy epoksydowej, aby uszczelnić rurki na miejscu i krawędzie zmontowanego urządzenia.
Po związaniu żywicy epoksydowej włóż igłę na pustej strzykawce do rurki wylotowej urządzenia i zanurz koniec rurki wlotowej w pojemniku wypełnionym buforem blokującym. Odciągnąć tłok strzykawki, aby napełnić urządzenie buforem blokującym. Następnie pozostaw urządzenie do inkubacji na co najmniej 30 minut przed użyciem.
Przymocuj urządzenie mikroprzepływowe do płytki stolika mikroskopu za pomocą taśmy. Zetknij obiektyw z dolną częścią urządzenia i ustaw obiektyw tak, aby pole widzenia znajdowało się w kanale mikroprzepływowym. Po podłączeniu rurki wylotowej do pompy strzykawkowej, przepłukać kanał mikroprzepływowy świeżym buforem blokującym, odciągając tłok strzykawki.
Sprawdź, czy w rurce lub w kanale nie ma pęcherzyków uwięzionych. Rozcieńczyć 1 mikrolitr przygotowanego substratu DNA w 1 mililitrze buforu blokującego. Umieścić rurkę wlotową w rozcieńczonym podłożu DNA i przepuścić 800 mikrolitrów roztworu substratu przez kanał z szybkością 200 mikrolitrów na minutę.
Pozostawić roztwór DNA do inkubacji w kanale przez 15 minut po ustaniu przepływu. Po inkubacji przepuść co najmniej 800 mikrolitrów buforu blokującego przez kanał z szybkością 200 mikrolitrów na minutę, aby wypłukać niezwiązane DNA z kanału. Dostosuj ostrość mikroskopu tak, aby kropki kwantowe na uwięzi powierzchniowej były wyraźnie widoczne.
Przepłukać urządzenie mikroprzepływowe 800 mikrolitrami eksperymentalnego buforu bez magnezu z natężeniem przepływu 200 mikrolitrów na minutę. Dodać REazę do podwielokrotności buforu doświadczalnego bez magnezu i delikatnie wymieszać pipetując. Przepływ 800 mikrolitrów po 400 jednostek na mililitr EcoRV przez kanał przy natężeniu przepływu 200 mikrolitrów na minutę.
Rozpocznij eksperyment od przelania eksperymentalnego buforu zawierającego magnez i fluoresceinę z prędkością przepływu 200 mikrolitrów na minutę. Rejestrowanie danych należy rozpocząć natychmiast po uruchomieniu pompy strzykawkowej. Zatrzymaj akwizycję danych po przepłynięciu 800 mikrolitrów bufora.
Po wprowadzeniu substratu DNA do komórki przepływowej i zmyciu nadmiaru DNA i kropek kwantowych, w polu widzenia znajdują się zazwyczaj tysiące pojedynczych kropek kwantowych. Są stabilnie przymocowane do powierzchni szkła i nie ulegają zauważalnemu przyciemnieniu ani znacznemu bieleniu przez cały czas trwania eksperymentu. Gdy REaza przepłynęła przez kanał pod nieobecność magnezu, co najmniej 95% kropek kwantowych obecnych na początku eksperymentu można nadal zobaczyć pod koniec okresu obserwacji.
Jednakże, gdy bufor zawierający magnez przepływa bezpośrednio po REazie, do połowy kropek kwantowych znika pod koniec okresu obserwacji, podobnie jak obserwuje się, gdy REaza i magnez przepływają razem przez kanał. Zanikanie kropek kwantowych następuje szybko i powoduje gwałtowny spadek trajektorii intensywności, co stanowi wyraźne wskazanie czasu, w którym dana cząsteczka DNA jest rozszczepiana. Eksperyment ten przeprowadzono z dobrze przebadanym typem II P REase EcoRV.
Do wyodrębnienia wartości n i beta z danych wykorzystano zarówno nieliniowe dopasowanie krzywej najmniejszych kwadratów, jak i oszacowanie parametru maksymalnego prawdopodobieństwa. Obie metody szacowania parametrów były zgodne. Stosując nieliniowe dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów, n wynosił 3,52, a beta 5,78 sekundy.
Korzystając z oszacowania maksymalnego prawdopodobieństwa, n wynosił 3,41, a beta 6,06 sekundy. Test ten może dostarczyć dowodów na obecność etapów pośrednich wzdłuż szlaku rozszczepienia. Przeprowadzenie tego testu w zmieniających się warunkach reakcji może pomóc w ustaleniu charakteru produktów pośrednich reakcji, których nie można bezpośrednio zaobserwować.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu zastosowano podejście multipleksowe w celu obserwacji specyficznego dla miejsca cięcia DNA przez endonukleazy restrykcyjne na poziomie pojedynczych cząsteczek. Wykorzystując DNA znakowane kropkami kwantowymi oraz fluorescencyjną mikroskopię z całkowitym wewnętrznym odbiciem, badanie analizuje cykl katalityczny poszczególnych REaz.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia molekularna
- Techniki pojedynczych cząsteczek
Wprowadzenie
- Endonukleazy restrykcyjne to enzymy, które przecinają DNA w specyficznych miejscach.
- Zrozumienie mechanizmów ich reakcji jest kluczowe dla różnorodnych zastosowań w genetyce i biologii molekularnej.
- Techniki pojedynczych cząsteczek dostarczają informacji, które mogą zostać pominięte w analizach populacyjnych.
- Multipleksowanie umożliwia jednoczesną obserwację wielu interakcji.
Cel badania
- Bezpośrednia obserwacja cykli katalitycznych endonukleaz restrykcyjnych.
- Wygenerowanie dobrze zdefiniowanych rozkładów czasu przebywania dla zdarzeń cięcia DNA.
- Zrozumienie mechanizmów cięcia DNA.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów oligonukleotydów z dodatkiem DTT w celu zapobiegania utlenianiu.
- Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem do obserwacji.
- Multipleksowy pomiar aktywności poszczególnych REaz.
- Dopasowanie danych do rozkładu prawdopodobieństwa gamma w celu przeprowadzenia analizy.
Główne wyniki
- Skuteczna obserwacja specyficznego dla miejsca cięcia DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek.
- Wygenerowanie szczegółowych rozkładów czasu przebywania dla setek endonukleaz restrykcyjnych (REases).
- Wgląd w mechanizmy katalityczne endonukleaz restrykcyjnych.
- Demonstracja skuteczności multipleksowania w badaniach pojedynczych cząsteczek.
Wnioski
- Badanie przedstawia nowatorskie podejście do analizy endonukleaz restrykcyjnych.
- Wyniki przyczyniają się do głębszego zrozumienia mechanizmów cięcia DNA.
- Multipleksowanie zwiększa możliwość jednoczesnej analizy wielu interakcji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta analiza czasu przebywania pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację cykli katalitycznych endonukleaz restrykcyjnych, dostarczając wglądu w mechanizmy cięcia DNA, które są niewidoczne w analizach zbiorczych. Poprzez kwantyfikację etapów pośrednich w ścieżce cięcia, test ten wspiera walidację celu i identyfikację związków wiodących dzięki zwiększonej pewności predykcyjnej w zakresie minimalizacji ryzyka mechanizmu enzymatycznego. Format multipleksowy pozwala na wysokoprzepustowe generowanie rozkładów czasu przebywania, co ułatwia skalowalny screening oraz rozwój testów dla terapeutyków celujących w kwasy nukleinowe.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ujawnienie etapów kinetycznych w mechanizmach rozcięcia DNA, których nie można bezpośrednio zaobserwować w pomiarach zbiorczych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez ilościową analizę czasu przebywania pojedynczych cząsteczek endonukleaz restrykcyjnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio, dostarczając danych mechanistycznych służących do ograniczania ryzyka w przypadku enzymów modyfikujących kwasy nukleinowe.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez generowanie dobrze obsadzonych rozkładów czasu przebywania na podstawie setek zdarzeń pojedynczych cząsteczek.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki pomiarom multipleksowym oraz dopasowaniu rozkładu gamma do kinetyki cięcia.
- Skalowalność: Wskazuje na gotowość do screeningu i możliwość ponownego wykorzystania platformy, umożliwiając analizę zbiorczą z wielu eksperymentów w celu zwiększenia mocy statystycznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez ustalenie zmian w produktach pośrednich ścieżki cięcia zależnych od dawki i warunków.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Skupia się na wartości prognostycznej poprzez identyfikację etapów ograniczających szybkość reakcji oraz produktów pośrednich cięcia DNA w zmiennych warunkach reakcji.
- Dopasowanie biomarkerów: Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych, gdy są one powiązane z wynikami funkcjonalnymi w systemach istotnych dla danej choroby.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywania leków – od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po badania przedkliniczne – dostarczając ilościowych danych dotyczących cykli katalitycznych enzymów z rozdzielczością mechanistyczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez rozdzielenie poszczególnych etapów katalitycznych w cięciu DNA za pomocą endonukleaz restrykcyjnych.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu do zastosowania dzięki multipleksowemu pomiarowi pojedynczych cząsteczek i ilościowym wynikom czasu przebywania (dwell-time), odpowiednim do walidacji trafień.
- Analityka: Wyróżnia pomiary i wyniki statystyczne (dopasowanie rozkładu gamma, parametry n i beta), które umożliwiają porównanie aktywności enzymu w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną poprzez ustalenie, w jaki sposób produkty pośrednie reakcji zmieniają się w zależności od stężenia magnezu lub mutantów enzymu.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako reużywalne narzędzie do charakteryzacji enzymów przetwarzających kwasy nukleinowe w odniesieniu do wielu celów i kampanii badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w mechanizmach enzymów kwasów nukleotydowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki multipleksowemu obrazowaniu pojedynczych cząsteczek i analizie zbiorczego czasu przebywania.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania prac, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wczesnemu ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja dostosowana do ryzyka oraz decyzje o dalszym rozwoju oparte na ilościowej architekturze ścieżek cięcia.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek oraz przygotowania urządzeń mikrofluidycznych.
- Wymaga aparatury do obrazowania fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem oraz systemu sterowania przepływem za pomocą pompy strzykawkowej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w protokołach przygotowywania koniugatów kropka kwantowa-DNA oraz pasywacji powierzchni.
- Wymaga rozważenia adaptacji dla różnych endonukleaz restrykcyjnych lub substratów kwasów nukleinowych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak fotoblaknięcie kropek kwantowych oraz wydajność przytwierdzania do powierzchni wpływająca na okna obserwacyjne.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:31
Preparation of Quantum-Dot-Labeled DNA Substrate Materials
3:38
Microfluidic Device Construction
5:58
Surface Tethering of Quantum-Dot-Labeled DNA Substrate
7:07
REase-Mediated DNA Cleavage
7:51
Results: Single-Molecule TIRF Experiment for Parallelized Observations of DNA Cleavage Events
9:32
Conclusion
