Name: Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metodę obserwacji rozszczepienia DNA przez endonukleazy restrykcyjne na poziomie pojedynczych cząsteczek. Technika ta pozwala analizować cykle katalityczne setek enzymów jednocześnie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Nagrodę Numer K12GM074869 dla CME od Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych lub Narodowych Instytutów Zdrowia.

<ol><li>Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+restriction+enzymes+became+the+workhorses+of+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5905-5908 (2005).</li>
<li>Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlights+of+the+DNA+cutters%3A+a+short+history+of+the+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 3-19 (2014).</li>
<li>Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REBASE--a+database+for+DNA+restriction+and+modification%3A+enzymes%2C+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">REBASE--a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, Database issue 298-299 (2015).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sliding+and+jumping+of+single+EcoRV+restriction+enzymes+on+non-cognate+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Sliding and jumping of single EcoRV restriction enzymes on non-cognate DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 4118-4127 (2008).</li>
<li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 96 (8), 50-52 (2009).</li>
<li>Blainey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonspecifically+bound+proteins+spin+while+diffusing+along+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).</li>
<li>Huang, C. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+DNA+recognition+by+restriction+endonuclease+EcoRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of DNA recognition by restriction endonuclease EcoRI.</a> Journal of Experimental & Clinical Medicine. 5 (1), 25-29 (2013).</li>
<li>Palma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+biomolecular+nanoarrays+for+parallel+single-molecule+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Selective biomolecular nanoarrays for parallel single-molecule investigations.</a> Journal of American Chemical Society. 133 (20), 7656-7659 (2011).</li>
<li>Reinhard, B. M., Sheikholeslami, S., Mastroianni, A., Alivisatos, A. P., Liphardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+plasmon+coupling+to+reveal+the+dynamics+of+DNA+bending+and+cleavage+by+single+EcoRV+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of plasmon coupling to reveal the dynamics of DNA bending and cleavage by single EcoRV restriction enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2667-2672 (2007).</li>
<li>van den Broek, B., Noom, M. C., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-tension+dependence+of+restriction+enzyme+activity+reveals+mechanochemical+properties+of+the+reaction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA-tension dependence of restriction enzyme activity reveals mechanochemical properties of the reaction pathway.</a> Nucleic Acids Research. 33 (8), 2676-2684 (2005).</li>
<li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li>
<li>Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+kinetic+intermediates+in+single-particle+dwell-time+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions.</a> Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).</li>
<li>Loparo, J. J., van Oijen, A. Single-molecule enzymology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLoparo%2C+JJ+%22Handbook+of+Single-Molecule+Biophysics%22">Handbook of Single-Molecule Biophysics</a>. Hinterdorfer, P., Oijen, A. , Springer. New York, NY. 165-182 (2009).</li>
<li>Taylor, J. D., Badcoe, I. G., Clarke, A. R., Halford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoRV+restriction+endonuclease+binds+all+DNA+sequences+with+equal+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">EcoRV restriction endonuclease binds all DNA sequences with equal affinity.</a> Biochemistry. 30 (36), 8743-8753 (1991).</li>
<li>Pingoud, A., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+type+II+restriction+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structure and function of type II restriction endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 29 (18), 3705-3727 (2001).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1529(2009).</li>
<li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+enzymes+replicating+DNA+using+a+single-molecule+DNA+stretching+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1689(2010).</li>
<li>Baldwin, G. S., Vipond, I. B., Halford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reaction+analysis+of+the+catalytic+cycle+of+the+EcoRV+restriction+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid reaction analysis of the catalytic cycle of the EcoRV restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 34 (2), 705-714 (1995).</li>
<li>Winkler, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal-structure+of+Ecorv+endonuclease+and+of+Its+complexes+with+cognate+and+non-cognate+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The crystal-structure of Ecorv endonuclease and of Its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments.</a> EMBO Journal. 12 (5), 1781-1795 (1993).</li>
<li>Sioss, J. A., Stoermer, R. L., Sha, M. Y., Keating, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-coated%2C+Au%2FAg+striped+nanowires+for+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Silica-coated, Au/Ag striped nanowires for bioanalysis.</a> Langmuir. 23 (22), 11334-11341 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów

Substrat DNA do tego testu jest znakowany kropką kwantową przy użyciu dwuetapowego schematu reakcji z użyciem sulfo-SMCC. Ten dwufunkcyjny środek sieciujący składa się z ugrupowania estrowego NHS, które może reagować z pierwszorzędową aminą, oraz ugrupowania maleimidowego, które może reagować z grupą sulfhydrylową20. Tiolowane oligonukleotydy używane do przygotowania substratu są wysyłane w postaci utlenionej. Ważne jest, aby je zredukować i oczyścić, zgodnie z opisem, przed przystąpieniem do proc...

Endonukleazy restrykcyjne (REazy) to enzymy wywołujące swoiste dla sekwencji pęknięcia obu nici DNA. Odkrycie REaz w latach 70. XX wieku doprowadziło do rozwoju technologii rekombinowanego DNA, a enzymy te są obecnie niezastąpionymi narzędziami laboratoryjnymi służącymi do modyfikacji i manipulacji genetycznych1. Endonukleazy restrykcyjne typu II są najszerzej stosowanymi enzymami z tej klasy, ponieważ przecinają one DNA w stałym miejscu, w obrębie lub w pobliżu ich sekwencji rozpoznawania. Istnieje jednak znaczna zmienność wśród REaz typu II i są one podzielone na kilka podtypów w oparciu o konkretne właściwości enzymatyczne, a nie klasyfikowane według pokrewieństwa ewolucyjnego. W obrębie każdego podtypu często występują wyjątki od schematu klasyfikacji, a wiele enzymów należy do kilku podtypów jednocześnie2. Zidentyfikowano tysiące REaz typu II, z czego setki są dostępne komercyjnie.
Pomimo jednak różnorodności wśród REaz typu II, bardzo niewielu REaz przebadano szczegółowo. Według REBASE, bazy danych enzymów restrykcyjnych założonej przez Sir Richarda Robertsa w 1975 roku3, opublikowane dane kinetyczne są dostępne dla mniej niż 20 z tych enzymów. Co więcej, choć niektóre REazy były bezpośrednio obserwowane na poziomie pojedynczych cząsteczek podczas dyfuzji wzdłuż DNA przed napotkaniem i związaniem sekwencji rozpoznawczej4,5,6,7, istnieje bardzo mało badań kinetyki ich reakcji cięcia na poziomie pojedynczych cząsteczek. Istniejące badania albo nie raportują wystarczających statystyk, aby przeprowadzić szczegółową analizę zmienności czasów, w których następują pojedyncze zdarzenia cięcia8,9,10, albo nie są w stanie uchwycić pełnego rozkładu czasów cięcia11. Tego typu analiza może ujawnić obecność stosunkowo długo żyjących produktów pośrednich kinetycznie i mogłaby prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów cięcia DNA katalizowanego przez REazy.
Na poziomie pojedynczych cząsteczek procesy biochemiczne mają charakter stochastyczny – czas oczekiwania na wystąpienie pojedynczego zdarzenia w procesie, τ, jest zmienny. Można się jednak spodziewać, że wiele pomiarów τ będzie zgodnych z rozkładem prawdopodobieństwa, p(τ), który wskazuje na rodzaj zachodzącego procesu. Na przykład proces jednowykroczny, taki jak uwalnianie cząsteczki produktu z enzymu, będzie zgodny ze statystyką Poissona, a p(τ) będzie przyjmować formę ujemnego rozkładu wykładniczego:
<img alt="Równanie funkcji gęstości prawdopodobieństwa dla rozkładu wykładniczego; wzór: p(τ)=(1/β)e^(-τ/β)." src="/files/ftp_upload/62112/62112eq1v3.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">
gdzie β jest średnim czasem oczekiwania. Należy zauważyć, że szybkość procesu, k, będzie równa 1/β, czyli odwrotności średniego czasu oczekiwania. W przypadku procesów wymagających więcej niż jednego kroku, p(τ) będzie splotem rozkładów pojedynczych wykładniczych dla każdego z poszczególnych kroków. Ogólnym rozwiązaniem splotu N funkcji pojedynczego rozpadu wykładniczego o identycznych średnich czasach oczekiwania, β, jest rozkład prawdopodobieństwa gamma:
<img alt="Rozkład prawdopodobieństwa gamma; równanie do modelowania statystycznego; p(τ)=1/Γ(N)βⁿτⁿ⁻¹e⁻ᵗ/ᵦ." src="/files/ftp_upload/62112/62112eq2v3.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">
gdzie Γ(N) jest funkcją gamma, która opisuje interpolację silni N-1 dla wartości N niebędących liczbami całkowitymi. Chociaż to ogólne rozwiązanie może być stosowane jako przybliżenie, gdy średnie czasy oczekiwania poszczególnych etapów są podobne, należy przyjąć, że obecność etapów stosunkowo szybkich zostanie zamaskowana przez etapy o znacznie dłuższych czasach oczekiwania. Innymi słowy, wartość N reprezentuje dolną granicę liczby etapów12. Przy odpowiedniej liczbie pomiarów czasu oczekiwania parametry β i N można oszacować poprzez binning zdarzeń i dopasowanie rozkładu gamma do otrzymanego histogramu lub stosując metodę największej wiarygodności. Tego rodzaju analiza może zatem ujawnić obecność etapów kinetycznych, których nie można łatwo rozdzielić w testach populacyjnych i która wymaga dużej liczby obserwacji w celu dokładnego oszacowania parametrów12,13.
Niniejsza praca opisuje metodę wykorzystującą DNA znakowane kropkami kwantowymi oraz mikroskopię fluorescencyjną z całkownym wewnętrznym odbiciem (TIRF) do równoległej obserwacji setek pojedynczych zdarzeń cięcia DNA katalizowanego przez nukleazy restrykcyjne (REaza). Projekt tego testu umożliwia agregowanie wyników z wielu eksperymentów, co pozwala na stworzenie rozkładów czasu przebywania obejmujących tysiące zdarzeń. Wysoka fotostabilność i jasność kropek kwantowych pozwalają na uzyskanie rozdzielczości czasowej 10 Hz bez utraty zdolności do obserwacji zdarzeń cięcia występujących nawet wiele minut po rozpoczęciu eksperymentu. Dobra rozdzielczość czasowa i szeroki zakres dynamiczny, w połączeniu z możliwością zgromadzenia dużego zestawu danych, pozwalają na dokładną charakterystykę rozkładów czasu przebywania w celu wykrycia obecności wielu etapów kinetycznych w szlakach cięcia REaz, których szybkość obrotu mieści się w zakresie 1 min-1. W przypadku EcoRV możliwe jest rozróżnienie trzech etapów kinetycznych, z których każdy został zidentyfikowany za pomocą innych metod, co potwierdza, że test jest czuły na obecność takich etapów.
Substraty dwuniciowego DNA zawierające interesującą sekwencję rozpoznawczą są wytwarzane poprzez hybrydyzację biotynilowanego oligonukleotydu z nicią komplementarną znakowaną pojedynczą, kowalencyjnie przyłączoną kropką kwantową z nanokryształu półprzewodnika. Substraty te wprowadza się do kanału przepływowego zbudowanego na szkiełku podstawowym z warstwą cząsteczek wysokocząsteczkowego glikolu polietylenowego (PEG) kowalencyjnie przyłączonych do jego powierzchni. Substraty DNA są wychwytywane poprzez powiązanie biotyna-streptawidyna-biotyna przez frakcję cząsteczek PEG posiadających biotynę na wolnym końcu. W mikroskopii TIRF oświetlenie zapewnia fala ewanescentna, której amplituda zanika wykładniczo wraz z odległością od interfejsu szkło-ciecz; głębokość penetracji jest rzędu długości fali użytego światła. W tych warunkach wzbudzone zostaną tylko kropki kwantowe przytwierdzone do powierzchni za pomocą cząsteczki DNA wychwyconej na funkcjonalizowanej powierzchni szkła. Kropki kwantowe swobodne w roztworze nie będą ograniczone do obszaru oświetlonego, a zatem nie będą luminescować. Jeśli DNA przytwierdzające kropkę kwantową do powierzchni zostanie przecięte, kropka kwantowa ta będzie mogła swobodnie dyfundować w kierunku oddalenia od powierzchni i zniknie z obrazu fluorescencyjnego.
Choć wiadomo, że wiele REaz typu II wiąże DNA w obecności magnezu14, wszystkie one wymagają magnezu do przeprowadzenia cięcia DNA15. REazy te mogą wiązać DNA unieruchomione na powierzchni w warunkach braku magnezu. Gdy przez kanał z REazą uprzednio związaną z DNA przepływa bufor zawierający magnez, cięcie rozpoczyna się natychmiast, co objawia się znikaniem kropek kwantowych. Synchronizacja osiągnięta poprzez uprzednie związanie cząsteczek REazy, a następnie zainicjowanie cięcia DNA poprzez wprowadzenie magnezu, ułatwia pomiar czasu opóźnienia do momentu zakończenia cięcia DNA niezależnie dla każdej cząsteczki w populacji enzymów obserwowanych w eksperymencie. Jako barwnik śledzący w buforze zawierającym magnez zastosowano fluoresceinę, aby wskazać moment dotarcia magnezu do pola widzenia. Ponieważ w buforze z magnezem nie znajduje się enzym, czas opóźnienia od momentu dotarcia bufora z magnezem do zniknięcia każdej kropki kwantowej wskazuje czas potrzebny REazie, która jest już związana z DNA, na przecięcie DNA i uwolnienie kropki kwantowej z powierzchni szkła. Zniknięcie kropki kwantowej następuje szybko i skutkuje gwałtownym spadkiem trajektorii intensywności, co daje jasną wskazówkę co do czasu, w którym dana cząsteczka DNA została przecięta. Wyznaczenie czasu zdarzeń odbywa się poprzez matematyczną analizę trajektorii intensywności, a typowy eksperyment dostarcza setek identyfikowalnych zdarzeń cięcia. Wyniki z wielu eksperymentów można połączyć, aby uzyskać odpowiednią statystykę pozwalającą na oszacowanie parametrów N i β za pomocą nieliniowej metody najmniejszych kwadratów lub analizy maksymalnej wiarygodności.

<table><tbody><tr><td>3-aminopropylotrietoksysilan (APTS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140-100ML</td><td>Przechowywać w pudełku eksykatora</td></tr><tr><td>5 Minute Epoxy</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td>służy do uszczelniania urządzenia mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>aceton</td><td>Pharmco</td><td>329000ACS</td><td>służy do czyszczenia szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>sonikator do kąpieli</td><td>Fisher Scientific</td><td>CPXH Model 2800</td><td>numer katalogowy 15-337-410</td></tr><tr><td>Zlewka, szklana, 100 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td>stołowa</tr><tr><td>Biotyna-PEG-Walerianian sukcynimidylu (MW 5,000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-SVA-5K</td><td>Walerianian sukcynimidylu ma dłuższy okres półtrwania niż węglan sukcynimidylu</td></tr><tr><td>Biotynylowany oligonukleotyd</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td> niestandardowe <td>- patrz protokół, aby zapoznać się z rozważaniami projektowymi</td><td>Poproś o modyfikację 5' Biotyny i Oczyszczanie HPLC</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>VWR</td><td>0903-5G</td><td>przygotować roztwór o stężeniu 10 mg/ml (woda) i podgrzać do 95 & stopni; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Centri-Spin-10 Wykluczenie rozmiaru Kolumny wirowe</td><td>Princeton Separacje</td><td>CS-100 lub CS-101</td><td>służy do oczyszczania tiolowanych oligonukleotydów po redukcji wiązania dwusiarczkowego</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 1,5. ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, 1-calowe kwadratowe szklane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>uchwyty</td><td></td><td></td><td></td>na szkiełka nakrywkowe</tr><tr><td>diamentowe koło punktowe</td><td>Dremel</td><td>7134</td><td>zastosowanie do wiercenia otworów w kwarcowej nakładce na komory przepływowe</td></tr><tr><td>ditiotreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td>No-Weigh Format, 7,7 mg/fiolkę</td></tr><tr><td>wiertarka obrotowa narzędzie Stacja robocza Stojak</td><td>Dremel</td><td>220-01</td><td>ułatwia wiercenie kwarcowe</td></tr><tr><td>EcoRV (REase używane do generowania przykładowych danych)</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195T lub R0195M</td><td>Użyj 100 000 jednostek/ml, aby uniknąć dodawania nadmiaru glicerolu Sprawdź REBASE dla dostawców innych REaz</td></tr><tr><td>etanolu</td>, <td>różnych</td><td>CAS 64-17-5</td><td>denaturowanych lub 95% są dopuszczalne, używaj do czyszczenia szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>BioUltra, bezwodny, przechowywać w pudełku eksykatora</td></tr><tr><td>Pchły Micro Spinbar</td><td>Fisherbrand</td><td>14-513-65</td><td>Rozmiar 3 mm x 10 mm pasujący pod stojakiem na szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>fluoresceina</td><td>Acros Organics</td><td>17324</td><td>służy do produkcji eksperymentalnych</td></tr><tr><td>grawitacyjnych pieca konwekcyjnego</td><td>Binder</td><td>9010-0131</td><td></td></tr><tr><td>ręczne obrotowe narzędzie wielofunkcyjne</td><td>Dremel</td><td>8220</td><td>służy do wiercenia otworów w kwarcowej komorze przepływowym</td></tr><tr><td>Topper ImagEM X2 EM-CCD Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-23B</td><td>chłodzenie powietrzem jest odpowiednie do tego eksperymentu, użyj oprogramowania HCImage lub podobnego do sterowania</td></tr><tr><td>Dystans obrazowania, dwustronny, samoprzylepny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Słoik, szkło z zakrętką, (około 50 mm średnicy i 50 mm wysokości)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP214-500</td><td>służy do tworzenia eksperymentalnego bufora z magnezem</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td> <td>MATLAB</td><td>Metalowa</td></tr><tr><td>pęseta</td> do analizy danych <td>Fisher Brand</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>metoksy-PEG-Sukcynimidyl Walerianian (MW 5,000)</td><td>Laysan Bio</td><td>M-SVA-5K</td><td>Oba PEG-i powinny mieć ten sam ester NHS, aby szybkość reakcji była spójna</td></tr><tr><td>mikrowirówka</td> Wielopozycyjne mieszadło magnetyczne <td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>12621-022</td><td></td></tr><tr><td>Kwas N-cykloheksylo-2-aminoetanosulfonowy (CHES)</td><td>Acros Organics</td><td>AC20818</td><td>CAS 103-47-9, służy do produkcji bufora CHES</td></tr><tr><td>wytrząsarka orbitalna i grzałka do probówek do mikrowirówek</td><td>Q Instruments</td><td>1808-0506</td><td>z adapterem 1808-1061 do probówek 24 x 2,0 ml lub 15 x 0,5 ml</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE60 Rurka polietylenowa (średnica wewnętrzna 0,76 mm, średnica zewnętrzna 1,22 mm)</td><td>Intramedic</td><td>6258917</td><td>igły 22 G dobrze pasują do tego rozmiaru rurki</td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanami (PBS) 10x</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7059</td><td>Stosować przy sile</td></tr><tr><td>1x wodorotlenek potasu</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH9262</td><td>użyć 1 M roztworu do czyszczenia szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko kwarcowe, 1 cal kwadratowy, grubość 1 mm</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72250-10</td><td>W rogach należy wywiercić otwory do wprowadzania rurek doprowadzających i wylotowych</td></tr><tr><td>wzmocniona pęseta z tworzywa sztucznego</td><td>Rubis</td><td>K35a</td><td>służy do przenoszenia szkiełek nakrywkowych i budowy urządzenia mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>Arkusze samoprzylepne SecureSeal</td><td>Grace Biolabs</td><td>SA-S-1L</td><td>przycięte w celu utworzenia przekładki do urządzenia mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>Jednokanałowa pompa strzykawkowa do mikrofluidyki</td><td>Systemy</td> <td>pompowe nowej eryNE-1002X-US</td><td>wyposażony w strzykawkę o pojemności 50 ml i igłę 22 G</td></tr><tr><td>Slide-a-Lyzer MINI urządzenia do dializy, 10 kDa MWCO, 0,1 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>69570 lub 69572</td><td>używane do wymiany buforu podczas sprzęgania kropek kwantowych z</td></tr><tr><td>wodorowęglanem sodu</td><td>DNA EMD Millipore</td><td>SX0320</td><td>służy do tworzenia buforu do funkcjonalizacji powierzchni; 100 mM, pH 8</td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Macron</td><td>7581-12</td><td>używać do wytwarzania eksperymentalnych</td></tr><tr><td>Dwuzasadowy roztwór fosforanu sodu (BioUltra, 0,5 M w wodzie)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94046</td><td>służy do wytwarzania 100 mM buforu fosforanu sodu</td></tr><tr><td>Monozasadowy roztwór fosforanu sodu (BioUltra, 5M w wodzie)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74092</td><td>służy do regulacji pH 100 mM buforu fosforanu sodu</td></tr><tr><td>Streptawidyna z Streptomyces avidinii</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4762</td><td>rozpuścić w stężeniu 1 mg/ml i przechowywać 25 ml roztworu w temperaturze -20 ?</td></tr><tr><td>Sulfosuccinimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan (sulfo-SMCC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39268</td><td>No-Weigh Format, 2 mg / fiolkę</td></tr><tr><td>Strzykawka wyposażona w igłę</td><td></td><td></td><td></td>21 G</tr><tr><td>Pompka</td><td></td><td></td><td></td>strzykawkowa</tr><tr><td>Tiolowany oligonukleotyd</td><td>Zintegrowane technologie DNA niestandardowe</td><td>- zobacz protokół, aby zapoznać się z rozważaniami projektowymi</td><td>Poproś o 5-calowy modyfikator tiolu C6 S-S i system obrazowania HPLC purificaiton</td></tr><tr><td>TIRF z oświetleniem laserowym 488 nm,</td><td>różnymi</td><td></td><td>niestandardowymi konstrukcjami</td></tr><tr><td>Tris -HCl</td><td>Research Products International</td><td>T60050</td><td>do tworzenia eksperymentalnych</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>JT Baker</td><td>4101</td><td>służy do tworzenia eksperymentalnych</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>służy do blokowania bufor</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td></td> wody <td></td> ultraczystej VWR 10153-842 <td></td></tr><tr><td>Wash-N-Dry Coverslip Rack Mikroskopia</td><td>elektronowa Sciences</td><td>70366-16</td><td>służy do funkcjonalizacji powierzchni szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia dna za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

Ten nowatorski test oparty na mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem umożliwia jednoczesny pomiar długości cyklu katalitycznego dla setek pojedynczych cząsteczek endonukleazy restrykcyjnej (REazy) w jednym eksperymencie. Test ten nie wymaga znakowania białek i można go przeprowadzić za pomocą jednego kanału obrazowania. Ponadto wyniki wielu indywidualnych eksperymentów można łączyć w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania. Analiza uzyskanych rozkładów czasu przebywania może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmu rozszczepienia DNA, ujawniając obecność kroków kinetycznych, których nie można bezpośrednio zaobserwować. Przykładowe dane zebrane za pomocą tego testu z dobrze zbadaną REazą, EcoRV - dimeryczną endonukleazą restrykcyjną typu IIP, która rozszczepia sekwencję palindromiczną GAT↓ATC (gdzie ↓ jest miejscem cięcia) - są zgodne z wcześniejszymi badaniami. Wyniki te sugerują, że istnieją co najmniej trzy etapy na ścieżce do rozszczepienia DNA, która jest inicjowana przez wprowadzenie magnezu po tym, jak EcoRV wiąże DNA pod jego nieobecność, ze średnią szybkością 0,17 s-1 dla każdego etapu.

Komora przepływowa jest bezpośrednio sprzężona z obiektywem imersyjnym olejowym o wysokiej aperturze numerycznej i powiększeniu 60x w mikroskopie odwróconym, wyposażonym w oświetlenie laserowe do obrazowania TIRF przez obiektyw (Rycina 5A). Po wprowadzeniu substratu DNA i wypłukaniu nadmiaru DNA oraz kropek kwantowych, w polu widzenia znajduje się zazwyczaj tysiące pojedynczych kropek kwantowych (Rycina 5B). Kropki kwantowe te są stabilnie przytwierdzone do szkl...

Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.

Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Dzięki temu protokołowi możemy bezpośrednio obserwować specyficzne dla miejsca rozszczepienie DNA przez endonukleazy restrykcyjne na poziomie pojedynczej cząsteczki. Nasze podejście multipleksowe pozwala nam zmierzyć czas potrzebny setkom pojedynczych REaz na zakończenie cyklu katalitycznego. Multipleksowanie pozwala nam generować dobrze wypełnione rozkłady czasu przebywania do rozszczepienia, które możemy dopasować do rozkładu prawdopodobieństwa gamma, aby uzyskać wgląd w mechanizm rozszczepienia DNA.Rozpocznij od przygotowania świeżej probówki dla każdego zawieszonego oligonukleotydu o objętości 50 mikrolitrów oligonukleotydu i 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu DTT do każdej probówki, pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie odpipetować całą objętość każdej mieszaniny próbek do przygotowanej kolumny i odwirować w temperaturze 750 G przez dwie minuty. Po odwirowaniu wszelkie próbki, które nie zostaną natychmiast użyte, należy przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby zapobiec utlenianiu grup tiolowych i tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych.Odpipetować jedną porcję 50 mikrolitrów zapasu kropek kwantowych do urządzenia do dializy dla każdej konstrukcji, która ma być wykonana, uważając, aby nie dotknąć membrany końcówką pipety. Dializować w stosunku do objętości buforu CHES co najmniej 1 000 razy większej od objętości próbki, mieszając przy 100 obr./min przez 15 minut. Za pomocą pipetera ostrożnie pobrać zawieszone kropki kwantowe z urządzenia do dializy i przenieść je do świeżej probówki zawierającej równą objętość świeżo przygotowanego roztworu sulfo-SMCC, pipetując w górę i w dół w celu wymieszania.Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 1 000 obr./min, aby umożliwić Sulfo-SMCC reakcję z pierwszorzędowymi aminami na kropkach kwantowych. Następnie za pomocą pipetera ostrożnie przenieś każdą próbkę do nowego urządzenia do dializy. W celu usunięcia nadmiaru sulfo-SMCC należy dializować z objętością buforu CHES co najmniej 1 000 razy większą niż objętość zawarta w urządzeniu do dializy, mieszając przez 15 minut.Należy wymienić bufor dwa razy i przeprowadzić dializę z użyciem nowego buforu CHES łącznie trzy razy, co pozwala na kontynuowanie dializy przez 15 minut po każdej wymianie buforu. Następnie powtórzyć dializę z PBS. Za pomocą pipetera ostrożnie odzyskać roztwór zawierający kropki kwantowe z urządzenia do dializy i przenieść każdą próbkę do świeżej probówki zawierającej równomolową ilość rozszerzonego oligonukleotydu rozcieńczonego w PBS.Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 1 000 obr./min. Dodaj BSA do każdej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 miligrama na mililitr. Następnie za pomocą pipetera ostrożnie przenieś każdą próbkę do nowego urządzenia do dializy i dializuj w buforze do przechowywania.Po dializie ostrożnie odzyskaj każdą próbkę i umieść ją w świeżej probówce. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Połącz próbkę oligonukleotydów znakowanych kropkami kwantowymi z dziesięciokrotnym nadmiarem molowym biotynylowanego oligonukleotydu.Podgrzej mieszaninę w bloku grzewczym do 75 stopni Celsjusza i trzymaj ją w tej temperaturze przez 5 minut. Następnie wyłącz blok grzewczy i pozwól mieszaninie powoli ostygnąć. Przechowuj gotową konstrukcję w temperaturze 4 stopni Celsjusza Za pomocą ręcznego obrotowego narzędzia wielofunkcyjnego wyposażonego w stożkowe wiertło diamentowe wywierć dwa otwory w przeciwległych rogach zjeżdżalni kwarcowej, aby służyły jako wlot i wylot.Pamiętaj, aby zabezpieczyć suwak na miejscu, smarować wiertło i stale przesuwać się wodą podczas wiercenia. Po każdym eksperymencie odzyskaj przygotowane szkiełko kwarcowe, mocząc używane urządzenie w acetonie w celu rozpuszczenia kleju i żywicy epoksydowej. Odrzuć pozostałe składniki.Połączyć 25 mikrolitrów roztworu streptawidyny z 80 mikrolitrami PBS i 20 mikrolitrami buforu blokującego. Pokryj szkiełko nakrywkowe nasączone PEG tą mieszaniną i inkubuj w wilgotnym środowisku przez 30 minut. Podczas inkubacji szkiełka nakrywkowego należy przygotować przekładkę obrazową, aby utworzyć kanał przepływowy.Wytnij kwadratowy kawałek materiału dystansowego o średnicy 1 cala, a następnie zaznacz kanał o szerokości 2 milimetrów wyrównany z końcami otworów wywierconych w szkiełku kwarcowym. Wytnij kanał z materiału dystansowego za pomocą skalpela. Dokładnie wyczyść szkiełko kwarcowe acetonem, aby usunąć wszelkie pozostałości kleju z poprzednich eksperymentów.Oderwij jedną stronę podkładu od przekładki obrazu i ostrożnie umieść ją na szkiełku kwarcowym, uważając, aby nie zakryć otworów wlotowych i wylotowych. Umyj szkiełko nakrywkowe wodą i osusz sprężonym powietrzem. Usuń drugą stronę nośnika z przekładki obrazowej i umieść ją między szkiełkiem kwarcowym a funkcjonalnym szkiełkiem nakrywkowym pokrytym streptawidyną za pomocą plastikowej pęsety, aby docisnąć zespół do siebie i usunąć pęcherzyki powietrza z kleju.Przyciąć koniec rurki pod kątem, aby zapewnić swobodny przepływ roztworu. Następnie włóż rurkę polietylenową o długości 30 centymetrów do każdego otworu w zjeżdżalni kwarcowej. Przytrzymaj rurki na miejscu za pomocą stojaka na tuby, a następnie użyj żywicy epoksydowej, aby uszczelnić rurki na miejscu i krawędzie zmontowanego urządzenia.Po związaniu żywicy epoksydowej włóż igłę na pustej strzykawce do rurki wylotowej urządzenia i zanurz koniec rurki wlotowej w pojemniku wypełnionym buforem blokującym. Odciągnąć tłok strzykawki, aby napełnić urządzenie buforem blokującym. Następnie pozostaw urządzenie do inkubacji na co najmniej 30 minut przed użyciem.Przymocuj urządzenie mikroprzepływowe do płytki stolika mikroskopu za pomocą taśmy. Zetknij obiektyw z dolną częścią urządzenia i ustaw obiektyw tak, aby pole widzenia znajdowało się w kanale mikroprzepływowym. Po podłączeniu rurki wylotowej do pompy strzykawkowej, przepłukać kanał mikroprzepływowy świeżym buforem blokującym, odciągając tłok strzykawki.Sprawdź, czy w rurce lub w kanale nie ma pęcherzyków uwięzionych. Rozcieńczyć 1 mikrolitr przygotowanego substratu DNA w 1 mililitrze buforu blokującego. Umieścić rurkę wlotową w rozcieńczonym podłożu DNA i przepuścić 800 mikrolitrów roztworu substratu przez kanał z szybkością 200 mikrolitrów na minutę.Pozostawić roztwór DNA do inkubacji w kanale przez 15 minut po ustaniu przepływu. Po inkubacji przepuść co najmniej 800 mikrolitrów buforu blokującego przez kanał z szybkością 200 mikrolitrów na minutę, aby wypłukać niezwiązane DNA z kanału. Dostosuj ostrość mikroskopu tak, aby kropki kwantowe na uwięzi powierzchniowej były wyraźnie widoczne.Przepłukać urządzenie mikroprzepływowe 800 mikrolitrami eksperymentalnego buforu bez magnezu z natężeniem przepływu 200 mikrolitrów na minutę. Dodać REazę do podwielokrotności buforu doświadczalnego bez magnezu i delikatnie wymieszać pipetując. Przepływ 800 mikrolitrów po 400 jednostek na mililitr EcoRV przez kanał przy natężeniu przepływu 200 mikrolitrów na minutę.Rozpocznij eksperyment od przelania eksperymentalnego buforu zawierającego magnez i fluoresceinę z prędkością przepływu 200 mikrolitrów na minutę. Rejestrowanie danych należy rozpocząć natychmiast po uruchomieniu pompy strzykawkowej. Zatrzymaj akwizycję danych po przepłynięciu 800 mikrolitrów bufora.Po wprowadzeniu substratu DNA do komórki przepływowej i zmyciu nadmiaru DNA i kropek kwantowych, w polu widzenia znajdują się zazwyczaj tysiące pojedynczych kropek kwantowych. Są stabilnie przymocowane do powierzchni szkła i nie ulegają zauważalnemu przyciemnieniu ani znacznemu bieleniu przez cały czas trwania eksperymentu. Gdy REaza przepłynęła przez kanał pod nieobecność magnezu, co najmniej 95% kropek kwantowych obecnych na początku eksperymentu można nadal zobaczyć pod koniec okresu obserwacji.Jednakże, gdy bufor zawierający magnez przepływa bezpośrednio po REazie, do połowy kropek kwantowych znika pod koniec okresu obserwacji, podobnie jak obserwuje się, gdy REaza i magnez przepływają razem przez kanał. Zanikanie kropek kwantowych następuje szybko i powoduje gwałtowny spadek trajektorii intensywności, co stanowi wyraźne wskazanie czasu, w którym dana cząsteczka DNA jest rozszczepiana. Eksperyment ten przeprowadzono z dobrze przebadanym typem II P REase EcoRV.Do wyodrębnienia wartości n i beta z danych wykorzystano zarówno nieliniowe dopasowanie krzywej najmniejszych kwadratów, jak i oszacowanie parametru maksymalnego prawdopodobieństwa. Obie metody szacowania parametrów były zgodne. Stosując nieliniowe dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów, n wynosił 3,52, a beta 5,78 sekundy.Korzystając z oszacowania maksymalnego prawdopodobieństwa, n wynosił 3,41, a beta 6,06 sekundy. Test ten może dostarczyć dowodów na obecność etapów pośrednich wzdłuż szlaku rozszczepienia. Przeprowadzenie tego testu w zmieniających się warunkach reakcji może pomóc w ustaleniu charakteru produktów pośrednich reakcji, których nie można bezpośrednio zaobserwować.

single-molecule-dwell-time-analysis-restriction-endonuclease-mediated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Kursy czasowe aktywności glikozylazy DNA 8-oksoguaniny są dwufazowe, wykazując gwałtowne tworzenie produktu i liniową fazę stanu ustalonego. Wykorzystując techniki przepływu gaszącego, można zmierzyć szybkość rozerwania i stanu ustalonego, które odpowiadają odpowiednio wycięciu 8-oksoguaniny i uwolnieniu glikozylazy z DNA produktu.

Pomiar kinetyczny w stanie ustalonym, przed stanem ustalonym i pojedynczym obrotem dla aktywności glikozylazy DNA

Egzonukleazy odgrywają kluczową rolę w zapewnieniu stabilności genomu. Utrata funkcji egzonukleazy WRN powoduje przedwczesne starzenie się. Badanie substratów i innych wymagań nukleazy in vitro może pomóc w wyjaśnieniu jej roli in vivo. Tutaj demonstrujemy szybki i powtarzalny test oparty na fluorescencji do pomiaru jego aktywności nukleazy.

Test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania DmWRNexo, ortologu ludzkiej egzonukleazy progeroidalnej WRN i jej zastosowania do innych nukleaz

Opracowano systemy obserwacji w czasie rzeczywistym oparte na transferze energii rezonansu fluorescencji reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51. Korzystając z przedstawionych tutaj protokołów, jesteśmy w stanie wykryć powstawanie produktów pośrednich reakcji i ich przekształcanie w produkty, jednocześnie analizując kinetykę enzymatyczną reakcji.

Obserwacja w czasie rzeczywistym reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51

Prezentowany tutaj jest protokół do wykonywania transferu energii rezonansu Förstera dla pojedynczej cząsteczki w celu zbadania rozdzielczości HJ. Dwukolorowe wzbudzenie przemienne służy do wyznaczania stałych dysocjacji. Jednokolorowy smFRET poklatkowy jest następnie stosowany w testach rozszczepienia w czasie rzeczywistym w celu uzyskania rozkładu czasu przebywania przed rozdzielczością HJ.

Metody transferu energii rezonansu Förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza Hollidaya przez GEN1

Opisano wysoce równoległą metodę pomiaru specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Protokół ten demonstruje technikę przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej NdeI. Metodę można łatwo zmodyfikować w celu zbadania dowolnego procesu, który prowadzi do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA.

Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

W pracy przedstawiono prosty, przyjazny dla użytkownika ratiometryczny test FRET do wykrywania i ilościowej oceny aktywności DNazy oraz wykazano jego zastosowanie w analizie słabej nukleazy.

Ocena aktywności DNazy za pomocą ratiometrycznego transferu energii rezonansu fluorescencji

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Poznaj metodę obserwacji rozszczepienia DNA przez endonukleazy restrykcyjne na poziomie pojedynczych cząsteczek. Technika ta pozwala analizować cykle katalityczne setek enzymów jednocześnie.

Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

Przeglądaj więcej filmów