Name: Wykorzystanie systemu GAL4-UAS do genetyki funkcjonalnej u Anopheles gambiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj system GAL4-UAS do analizy genetycznej u Anopheles gambiae. Metoda umożliwia kontrolowaną ekspresję genów w czasie i przestrzeni, wspierając badania nad odpornością na insektycydy oraz strategiami kontroli wektorów malarii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za finansowanie od LSTM i IVCC (Adriana Adolfi), BBSRC (New Investigator Award (AL), MRC (stypendium doktoranckie dla BCP:MR/P016197/1), Wellcome (stypendium podoktorskie Sir Henry Wellcome dla LG: 215894/Z/19/Z), które uwzględniły analizę Gal4UAS w swoich propozycjach.

<ol><li>Brand, A. H., Perimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+drosophila%3A+A+fly+geneticist%27s+swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> Journal of Genetics and Development. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
<li>Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDow%2C+JA+%22ELS%22">ELS</a>. , John WIley & Sons, Ltd. (2012).</li>
<li>Edi, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP6+P450+Enzymes+and+ACE-1+Duplication+Produce+Extreme+and+Multiple+Insecticide+Resistance+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS Genetics. 10 (3), 1004236(2014).</li>
<li>Daborn, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+melanogaster+to+validate+metabolism-based+insecticide+resistance+from+insect+pests%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila melanogaster to validate metabolism-based insecticide resistance from insect pests.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (12), 918-924 (2012).</li>
<li>Riveron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transcription+and+functional+analyses+reveal+heterogeneous+molecular+mechanisms+driving+pyrethroids+resistance+in+the+major+malaria+vector+Anopheles+funestus+across+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transcription and functional analyses reveal heterogeneous molecular mechanisms driving pyrethroids resistance in the major malaria vector Anopheles funestus across Africa.</a> Genes Genomes Genetics. 7 (6), 1819-1832 (2017).</li>
<li>Riveron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+mutation+in+the+GSTe2+gene+allows+tracking+of+metabolically+based+insecticide+resistance+in+a+major+malaria+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A single mutation in the GSTe2 gene allows tracking of metabolically based insecticide resistance in a major malaria vector.</a> Genome Biology. 15 (2), (2014).</li>
<li>Lynd, A., Lycett, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Bi-Partite+Gal4-UAS+System+in+the+African+Malaria+Mosquito%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of the Bi-Partite Gal4-UAS System in the African Malaria Mosquito, Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 7 (2), 31552(2012).</li>
<li>Lynd, A., Lycett, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+Gal4-UAS+system+in+an+Anopheles+gambiae+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimization of the Gal4-UAS system in an Anopheles gambiae cell line.</a> Insect Molecular Biology. 20 (5), 599-608 (2011).</li>
<li>Adolfi, A., Pondeville, E., Lynd, A., Bourgouin, C., Lycett, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-tissue+GAL4-mediated+gene+expression+in+all+Anopheles+gambiae+life+stages+using+an+endogenous+polyubiquitin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-tissue GAL4-mediated gene expression in all Anopheles gambiae life stages using an endogenous polyubiquitin promoter.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 96, 1-9 (2018).</li>
<li>Kokoza, V. A., Raikhel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+in+the+transgenic+Aedes+aegypti+using+the+binary+Gal4-UAS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression in the transgenic Aedes aegypti using the binary Gal4-UAS system.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 41, 637-644 (2011).</li>
<li>O'Brochta, D. A., Pilitt, K. L., Harrell, R. A., Aluvihare, C., Alford, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gal4-based+Enhancer-Trapping+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gal4-based Enhancer-Trapping in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi.</a> Genes Genomes Genetics. 2, 21305-21315 (2012).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Gut-Specific+Carboxypeptidase%3A+A+Study+Using+the+Binary+Gal4%2FUAS+System+in+the+Mosquito+Aedes+Aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Gut-Specific Carboxypeptidase: A Study Using the Binary Gal4/UAS System in the Mosquito Aedes Aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 54, 1-10 (2014).</li>
<li>Imamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Expression+Using+the+GAL4%2FUAS+System+in+the+Silkworm+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Expression Using the GAL4/UAS System in the Silkworm Bombyx mori.</a> Genetics. 165 (3), 1329-1340 (2003).</li>
<li>Lynd, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+functional+genetic+tool+for+Anopheles+gambiae+oenocyte+characterisation%3A+application+to+cuticular+hydrocarbon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Development of a functional genetic tool for Anopheles gambiae oenocyte characterisation: application to cuticular hydrocarbon synthesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Pondeville, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocyte-targeted+gene+expression+in+the+female+malaria+mosquito+using+the+hemolectin+promoter+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hemocyte-targeted gene expression in the female malaria mosquito using the hemolectin promoter from Drosophila.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103339(2020).</li>
<li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+validation+of+key+genes+conferring+insecticide+resistance+in+the+major+African+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).</li>
<li>Pondeville, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+integrase-mediated+site-specific+germline+transformation+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient integrase-mediated site-specific germline transformation of Anopheles gambiae.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1698-1712 (2014).</li>
<li>Horn, C., Schmid, B. G. M., Pogoda, F. S., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+transformation+markers+for+insect+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent transformation markers for insect transgenesis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 32, 1221-1235 (2002).</li>
<li>Clements, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClements%2C+A+%22A.+Biology+of+Mosquitoes%2C+Volume+1%3A+Development%2C+Nutrition+and+Reproduction%22">A. Biology of Mosquitoes, Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction</a>. 1, CABI Publishing. (1992).</li>
<li>Trpiš, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+bleaching+and+decalcifying+method+for+general+use+in+zoology%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology.</a> Canadian Journal of Zoology. 48, 892-893 (1970).</li>
<li>Kaiser, M. L., Duncan, F. D., Brooke, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Development+and+Rates+of+Metabolic+Activity+in+Early+and+Late+Hatching+Eggs+of+the+Major+Malaria+Vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Embryonic Development and Rates of Metabolic Activity in Early and Late Hatching Eggs of the Major Malaria Vector Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 9 (12), 114381(2014).</li>
<li>Grigoraki, L., Grau-Bové, X., Yates, H. C., Lycett, G. J., Ranson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transcriptomic+analysis+of+Anopheles+gambiae+oenocytes+enables+the+delineation+of+hydrocarbon+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Isolation and transcriptomic analysis of Anopheles gambiae oenocytes enables the delineation of hydrocarbon biosynthesis.</a> eLife. 9, 58019(2020).</li>
<li>Xiao, Y. -H., Yin, M. -H., Hou, L., Pei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+amplification+of+intron-containing+hairpin+RNA+construct+from+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Direct amplification of intron-containing hairpin RNA construct from genomic DNA.</a> BioTechniques. 41 (5), 548-552 (2006).</li>
<li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+Mapping+of+a+Sequence+on+the+Drosophila+melanogaster+X+and+Y+Chromosomes+That+Is+Transcribed+during+Spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Organization and Mapping of a Sequence on the Drosophila melanogaster X and Y Chromosomes That Is Transcribed during Spermatogenesis.</a> Genetics. 107 (4), 611-634 (1984).</li>
<li>MR4, CDC, NEI & beiResources. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+MR4+Methods+in+Anopheles+Research+Laboratory+Manual.+5th+Edition%22">The MR4 Methods in Anopheles Research Laboratory Manual. 5th Edition</a>. , (2015).</li>
<li>Sik Lee, Y., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+better+RNAi+vector+for+Drosophila%3A+use+of+intron+spacers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Making a better RNAi vector for Drosophila: use of intron spacers.</a> Methods. 30 (4), 322-329 (2003).</li>
<li>Cha-aim, K., Hoshida, H., Fukunaga, T., Akada, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCha-aim%2C+K+%22Gene+Synthesis%3A+Methods+and+Protocols%22">Gene Synthesis: Methods and Protocols</a>. Peccoud, J. , Humana Press. 97-110 (2012).</li>
<li>Cavener, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+consensus+sequence+flanking+translational+start+sites+in+Drosophila+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of the consensus sequence flanking translational start sites in Drosophila and vertebrates.</a> Nucleic Acids Research. 15 (4), 1353-1361 (1987).</li>
<li>Wang, Y., Wang, F., Wang, R., Zhao, P., Xia, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2A+self-cleaving+peptide-based+multi-gene+expression+system+in+the+silkworm+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>Galizi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+sex+ratio+distortion+system+for+the+control+of+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito.</a> Nature Communications. 5, 3977(2014).</li>
<li>Kondo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemical+organisation+of+the+Drosophila+Brain+Visualised+by+Endogenously+Tagged+Neurotransmitter+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neurochemical organisation of the Drosophila Brain Visualised by Endogenously Tagged Neurotransmitter Receptors.</a> Cell Reports. 30 (1), 284-297 (2020).</li>
<li>Lee, P. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-specific+T2A-GAL4+library+for+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila.</a> eLife. 7, 35574(2018).</li>
<li>Marois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sorting+of+mosquito+larvae+for+laboratory+studies+and+for+future+vector+control+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">High-throughput sorting of mosquito larvae for laboratory studies and for future vector control interventions.</a> Malaria Journal. 11, 302(2012).</li>
<li>Crawford, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+male+Wolbachia-infected+Aedes+aegypti+mosquitoes+enables+large-scale+suppression+of+wild+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient production of male Wolbachia-infected Aedes aegypti mosquitoes enables large-scale suppression of wild populations.</a> Nature Biotechnology. 38 (4), 482-492 (2020).</li>
<li>Goltsev, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Developmental Biology. 330 (2), 462-470 (2009).</li>
<li>Rezende, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+desiccation+resistance+in+Aedes+aegypti%3A+presumptive+role+of+the+chitinized+Serosal+Cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized Serosal Cuticle.</a> BMC Developmental Biology. 8 (1), 82(2008).</li>
<li>Vargas, H. C. M., Farnesi, L. C., Martins, A. J., Valle, D., Rezende, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serosal+cuticle+formation+and+distinct+degrees+of+desiccation+resistance+in+embryos+of+the+mosquito+vectors+Aedes+aegypti%2C+Anopheles+aquasalis+and+Culex+quinquefasciatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Serosal cuticle formation and distinct degrees of desiccation resistance in embryos of the mosquito vectors Aedes aegypti, Anopheles aquasalis and Culex quinquefasciatus.</a> Journal of Insect Physiology. 62, 54-60 (2014).</li>
<li>Chang, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+non-canonical+Notch+signaling+is+essential+for+the+control+of+fertility+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">The non-canonical Notch signaling is essential for the control of fertility in Aedes aegypti.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 12 (3), 0006307(2018).</li>
<li>Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+Analysis+of+Protein+Expression+during+Aedes+aegypti+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical Analysis of Protein Expression during Aedes aegypti Development.</a> Spring Harbor Protocols. 10, 1-4 (2010).</li>
<li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+in+situ+of+Salivary+Glands%2C+Ovaries+and+Embryos+of+Vector+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries and Embryos of Vector Mosquitoes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e3709(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zrozumienie funkcji genów komarów ma zasadnicze znaczenie dla opracowania nowych podejść do zwalczania Anopheles i wpływania na przenoszenie malarii. Opisany system GAL4-UAS jest wszechstronnym i wydajnym systemem do funkcjonalnej analizy genów kandydujących i do tej pory używaliśmy go do badania genetycznych podstaw odporności na insektycydy 17 i produkcji węglowodorów kutykularnych 15,23, a także do fluorescencyjnego znakowania różnych populacji komórek komarów 8...

Bipartyjny system GAL4-UAS jest podstawowym narzędziem funkcjonalnej charakterystyki genów w organizmie modelowym owadów Drosophila melanogaster1,2,3. Aby wykorzystać system GAL4-UAS, transgeniczne linie sterujące (driver lines), wykazujące ekspresję drożdżowego czynnika transkrypcyjnego GAL4 pod kontrolą sekwencji regulacyjnej, krzyżuje się z liniami odpowiadającymi (responder lines) niosącymi interesujący gen lub konstrukt interferencji RNA (RNAi) kontrolowany przez sekwencję aktywacyjną Upstream Activation Sequence (UAS) rozpoznawaną przez GAL4. Potomstwo tego krzyżowania wykazuje ekspresję interesującego transgenu w wzorcu czasoprzestrzennym dyktowanym przez promotor kontrolujący ekspresję GAL4 (Rycina 1). Fenotypy wykazane przez potomstwo krzyżówek linii sterujących i odpowiadających mogą być oceniane w celu wyjaśnienia funkcji genów kandydackich. Chociaż D. melanogaster była wykorzystywana do badania genów z innych organizmów4,5,6,7, system GAL4-UAS został obecnie dostosowany do zastosowania u owadów o znaczeniu medycznym i rolniczym, aby umożliwić bezpośrednią analizę w gatunkach będących przedmiotem zainteresowania 8,9,10,11,12,13,14.
W przypadku afrykańskiego komara przenoszącego malarię, Anopheles gambiae, system GAL4-UAS został po raz pierwszy przetestowany poprzez kotransfekcję linii komórkowych9. Przebadano wydajność wielu konstruktów w różnych kombinacjach parzystych, ustalając, że 14 tandemowo powtórzonych sekwencji UAS uzupełnionych o mały sztuczny intron (UAS-14i) wykazywało najszerszy zakres potencjału aktywacji przy zastosowaniu panelu driverów GAL4. Aby wykazać funkcjonalność in vivo, konstrukty te wykorzystano następnie do stworzenia dwóch osobnych transgenicznych linii An. gambiae za pomocą transformacji PiggyBac8: linii drivera niosącej GAL4 sterowany przez promotor specyficzny dla jelita środkowego oraz linii respondera zawierającej geny lucyferazy i wzmocnionego żółtego białka fluorescencyjnego (eYFP) pod regulacją sekwencji UAS. Aktywność lucyferazy specyficzna dla jelita oraz fluorescencja w potomstwie wykazały, że system ten jest wydajny u Anopheles. Od tego czasu stworzono linie drivera wykazujące ekspresję transgenów w innych tkankach istotnych dla potencjału wektorowego i oporności na insektycydy, w tym w oenocytach15 i hemocytach16, a także w wzorcu bliskim powszechnemu10. Wygenerowano również liczne linie UAS w celu zbadania genów uważanych za zaangażowane w metabolizm i oporność na insektycydy zapośredniczoną przez sekwestrację, syntezę węglowodorów kutykularnych oraz w celu fluorescencyjnego znakowania różnych typów komórek i tkanek (Tabela 1). W przypadku linii respondera celowana integracja transgenu jest obecnie przeprowadzana za pomocą wymiany kasety rekombinacyjnej katalizowanej przez ΦC3117,18, aby ustalić kontekst genomowy genów regulowanych przez UAS. W ten sposób ekspresja transgenu jest normalizowana pod kątem miejsca insercji w genomie, co pozwala na dokładniejsze porównanie efektów fenotypowych różnych genów kandydackich.
Linie responderów stworzone do tej pory zostały zaprojektowane w celu ekspresji transgenu na podwyższonym poziomie lub w celu redukcji ekspresji genu poprzez interferencję RNA (RNAi). Zazwyczaj klony cDNA są łączone z sekwencją UAS w celu wytworzenia odpowiednich plazmidów ekspresyjnych, jednak możliwe jest również wykorzystanie pełnych sekwencji genomicznych, pod warunkiem, że nie są one zbyt duże do klonowania. W celu wytworzenia konstruktów wyciszających zastosowaliśmy trzy różne metody uzyskania odpowiednich tandemowych sekwencji odwróconych, które tworzą dwuniciowe RNA (dsRNA) w formie spinki stymulujące RNAi. Metody te obejmowały PCR fuzyjny, asymetryczny PCR oraz komercyjną syntezę konstruktów typu spinka. Wspólną cechą każdej z tych metod jest wprowadzenie sekwencji intronu pomiędzy sekwencje odwrócone w celu zapewnienia stabilności klonowania. Opracowano plazmidy responderów, do których można wstawić gen zainteresowania lub konstrukt RNAi15. Plazmidy te zawierają również wymagane miejsca ΦC31 attB dla RMCE (opisane w towarzyszącym artykule JoVE autorstwa Adolfiego, który szczegółowo opisuje technikę RCME). W niniejszym manuskrypcie zawarto protokoły obejmujące kluczowe kroki niezbędne przy wyborze sekwencji do wstawienia do jednego z tych plazmidów w celu nadekspresji. Dodatkowo opisano i zilustrowano dwa protokoły tworzenia konstruktów RNAi w formie spinki.
Podczas tworzenia nowych linii kluczowa jest identyfikacja rzadkich osobników transgenicznych, które posłużą do rozrodu w celu ustanowienia i utrzymania kolonii transgenicznych. Co najważniejsze dla systemu GAL4-UAS, konieczne jest rozróżnienie linii responderów i driverów, aby móc przeprowadzać krzyżówki i identyfikować poszczególne potomstwo niosące oba transgeny. Osiąga się to poprzez zastosowanie różnych dominujących genów markerów selekcyjnych powiązanych z kasetami drivera i respondera. Najczęściej są to fluorescencyjne geny markerowe, które można wyraźnie odróżnić za pomocą filtrów optycznych (np. eYFP, eCFP, dsRed). Ważne jest, aby markery były ekspresjonowane w znanym i wiarygodnym wzorcu czasowo-przestrzennym, co ułatwia identyfikację anomalii oraz kontaminacji. Ekspresja fluorescencyjnych genów markerowych jest rutynowo regulowana przez syntetyczny promotor 3xP3, który powoduje specyficzną ekspresję w oczach i zwojach brzusznych na wszystkich etapach rozwoju An. gambiae19. Markery fluorescencyjne kontrolowane przez 3xP3 są zawarte we wszystkich plazmidach transformacyjnych opisanych w niniejszym artykule. Poniżej zamieszczono protokół szczegółowo opisujący powszechne metody stosowane do przesiewania fluorescencyjnych linii GAL4-UAS u poczwarek An. gambiae.
Jednym z kluczowych elementów systemu GAL4-UAS jest konieczność krzyżowania różnie oznakowanych linii sterujących (driver) i odpowiadających (responder). Aby to osiągnąć, samce i samice z każdej linii muszą zostać rozdzielone przed kopulacją. Osobniki dorosłe są łatwo rozróżnialne wizualnie, jednak w celu ustanowienia krzyżówek genetycznych zasadne jest rozdzielenie płci przed wyjściem imago, aby mieć pewność, że kopulacja nie miała miejsca. Ogólna różnica w wielkości między poczwarkami samców i samic An. gambiae jest zbyt zmienna, aby stanowiła wydajną i niezawodną metodę określania płci20. Zamiast tego, wyraźne różnice morfologiczne w budowie zewnętrznych narządów płciowych stanowią wiarygodną podstawę do określania płci u An. gambiae. W niniejszym artykule opisujemy niezawodną metodę określania płci poczwarek An. gambiae w celu przygotowania odpowiednich krzyżówek.
<img alt="Schemat procesu edycji genów z wykorzystaniem spinek RNAi, klonowania, krzyżowania oraz analizy fenotypowej w modelu owadziego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62131/62131fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1 - Schematyczny przedstawienie procesu wykorzystania dwuczęściowego systemu GAL4-UAS u Anopheles gambiae. (A) Przedstawiono główne komponenty przykładowego wektora (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]), szczegółowo opisując dostępne miejsca restrykcyjne (EcoRI, NheI, XhoI oraz NcoI) w obrębie wielomiejscowych stron klonowania, które nadają się do wstawienia konstruktu spinki lub sekwencji kodującej interesujący gen. Przedstawiono również strukturę linii dokującej. (B) Zilustrowano etap krzyżowania, wskazując na użycie samców z linii sterującej (niosących sterownik GAL4 pod kontrolą promotora interesującego genu oraz eCFP sterowanego przez promotor 3xP3) i samic z linii odpowiadającej (niosących interesujący gen lub konstrukt spinki pod kontrolą promotora UAS oraz marker eYFP sterowany przez promotor 3xP3). (C) Schematyczne przedstawienie sterowania ekspresją interesującego genu przez GAL4 w potomstwie z krzyżowania opisanego w punkcie B oraz lista niektórych typowych fenotypów poddawanych ocenie. Skróty: Multiple Cloning Site (MCS) – wielomiejscowa strona klonowania, Recombinase mediated cassette exchange (RMCE) – wymiana kasety oparta na rekombinazie, Upstream Activator Sequence (UAS) – sekwencja aktywatora upstream, enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) – ulepszone żółte białko fluorescencyjne, enhanced cyan fluorescent protein (eCFP) – ulepszone cyjanowe białko fluorescencyjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62131/62131fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
To właśnie wykorzystanie krzyżówek nadaje systemowi GAL4-UAS jego dwuczęściowy charakter, co zapewnia wyraźne zalety w porównaniu do podejść bardziej liniowych. Przykładowo, można ocenić znacznie więcej kombinacji linii driver i responder, niż byłoby to możliwe, gdyby dla każdej kombinacji promotora i genu należało wygenerować i utrzymywać nową linię transgeniczną. Co ważniejsze, pozwala to na analizę genów, których zaburzona ekspresja prowadzi do fenotypów letalnych lub sterylnych, co jest trudne do osiągnięcia i utrzymania w systemie liniowym. Takie fenotypy letalne mogą objawiać się na wszystkich etapach rozwoju, w zależności od funkcji genu i ekspresji spatiotemporalnej, lecz najczęściej obserwuje się je podczas rozwoju embrionalnego. Wizualizacja rozwoju embrionów komara wymaga usunięcia nieprzezroczystego chorionu pokrywającego jaja. Opierając się na metodach opisanych przez Trpiša (1970)21 oraz Kaisera i wsp. (2014)22, opisujemy stosowane przez nas protokoły utrwalania embrionów z zachowaniem ich integralności strukturalnej oraz wybielania w celu usunięcia endochorionu, co umożliwia wizualizację mikroskopową i obrazowanie.

<table><tbody><tr><td>Plastikowa szalka Petriego 100 x 15 mm</td><td>SLS</td><td>2175546</td><td>opakowanie 10 sztuk</td></tr><tr><td>1000 &mikro; L Pipeta Gilson</td><td>Probówka uniwersalna Gilson</td><td>F144059P</td><td></td></tr><tr><td>20/25 ml</td><td>Starlab</td><td>E1412-3020</td><td>Zestaw 400</td></tr><tr><td>pipet Pasteura 3 ml</td><td>SLS</td><td>G612398</td><td>Pipeta Pasteura 3 ml sterylna, pakowana pojedynczo</td></tr><tr><td>50 ml probówki Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>11512303</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>SLS</td><td>45726-1L-F</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Klatki</td><td>SLS</td><td>E6099</td><td>30x30x30 z portem ekranu</td></tr><tr><td>Drobne pędzle malarskie</td><td>Amazon</td><td>UKDPB66</td><td>KOLAMOON 9 sztuk Zestaw pędzli do malowania detali Miniture Pędzle do akwareli, malarstwa akrylowego, obrazu olejnego (czerwone wino)</td></tr><tr><td>Pokarm dla ryb</td><td>Amazonka</td><td></td><td>Tetra Min Fish Food, Kompletny pokarm dla wszystkich ryb tropikalnych dla zdrowia, koloru i witalności, 10 l&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator do ust</td><td>John Hock</td><td>612</td><td></td></tr><tr><td>Sól stawowa</td><td>Amazon</td><td></td><td>Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, dla zdrowia ryb, jakości wody, ogólnego toniku, buforu pH, 9,08 kg, smakołyki 9,092 l&nbsp;</td></tr><tr><td>Doniczki z poczwarkami</td><td>Cater4you</td><td>SP8OZ</td><td>250 doniczek z pokrywkami</td></tr><tr><td>Małe plastikowe wiadra</td><td>Amazon</td><td></td><td>2,5 l białe plastikowe wiadro w komplecie z białą pokrywką (opakowanie 10 sztuk)&nbsp;</td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25552</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie systemu gal4-uas do genetyki funkcjonalnej u anopheles gambiae

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

Dwuczęściowy system GAL4-UAS jest wszechstronnym i potężnym narzędziem do funkcjonalnej analizy genetycznej. Istotą systemu jest krzyżowanie transgenicznych linii "sterowników", które wyrażają czynnik transkrypcyjny GAL4 drożdży w sposób specyficzny dla tkanki, z transgenicznymi liniami "odpowiadającymi" przenoszącymi konstrukt interferencyjny genu kandydującego / RNA, którego ekspresja jest kontrolowana przez sekwencje aktywacyjne (UAS), które wiążą GAL4. W powstałym potomstwie gen lub konstrukt wyciszający ulega zatem ekspresji w określony sposób czasoprzestrzenny, co umożliwia oznaczenie wynikowych fenotypów i wywnioskowanie funkcji genu. System binarny umożliwia elastyczność w eksperymentalnych podejściach do badań przesiewowych fenotypów generowanych przez ekspresję transgenu w wielu wzorcach specyficznych dla tkanki, nawet jeśli wiąże się to z poważnymi kosztami przystosowania. Dostosowaliśmy ten system do Anopheles gambiae, głównego wektora malarii w Afryce.
W tym artykule przedstawiamy niektóre z typowych procedur używanych podczas analizy GAL4-UAS. Opisujemy już wygenerowane linie GAL4-UAS An. gambiae, a także klonowanie nowych konstruktów reagujących w celu regulacji w górę i knockdownu RNAi. Określamy przewodnik krok po kroku dotyczący określania płci poczwarek komarów w celu ustalenia krzyżówek genetycznych, który obejmuje również badanie przesiewowe potomstwa w celu śledzenia dziedziczenia fluorescencyjnych markerów genowych, które oznaczają insercje sterownika i osoby reagującej. Przedstawiamy również protokół oczyszczania zarodków An. gambiae w celu zbadania rozwoju embrionalnego. Na koniec wprowadzamy potencjalne adaptacje metody do generowania linii sterujących poprzez insercję CRISPR / Cas9 GAL4 za genami docelowymi.

3xP3 ekspresja eYFP, dsRed i eCFP zapewnia niezawodną i łatwo rozróżnialną identyfikację osobników posiadających geny markerowe wykazujące ekspresję w oczach i zwojach brzusznych poczek An. gambiae (Rysunek 3). Różnice morfologiczne zaobserwowane w zewnętrznych narządach płciowych samców i samic wykorzystywane do określania płci oraz przykład poczwej nieidentyfikowalnej przedstawiono na Rysunku 4. Usunięcie całej wody z poczew utrudnia określan...

Dwuczęściowy system GAL4-UAS jest wszechstronnym narzędziem do modyfikacji ekspresji genów w kontrolowany sposób czasoprzestrzenny, co pozwala na funkcjonalną analizę genetyczną w Anopheles gambiae. Opisane procedury korzystania z tego systemu to częściowo ustandaryzowana strategia klonowania, określanie płci i badanie przesiewowe poczwarek pod kątem fluorescencyjnych markerów białkowych i utrwalanie zarodków.

Wykorzystanie systemu GAL4-UAS do genetyki funkcjonalnej u Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

Dwuczęściowy system GAL4-UAS jest wszechstronnym narzędziem do funkcjonalnej analizy genetycznej w Anopheles gambiae poprzez genetyczną modyfikację ekspresji genów w sposób kontrolowany czasowo. System binarny umożliwia elastyczność w podejściach eksperymentalnych do fenotypowej charakterystyki ekspresji transgenu, nawet jeśli indukowane są poważne koszty przystosowania. System ten może być wykorzystany do charakterystyki fenotypowej genów potencjalnie zaangażowanych w oporność na insektycydy, przenoszenie patogenów lub te, które mają zastosowanie w metodach kontroli genetycznej.Fraser Coleman, technik badawczy, pomoże zademonstrować tę procedurę Zacznij od zebrania poczwarek za pomocą trzymililitrowej plastikowej pipety Pasteura z końcem odciętym na przezroczystym płaskim naczyniu nadającym się do użycia z mikroskopem stereoskopowym. Ostrożnie usuń większość wody wokół poczwarek. Włącz żarówkę fluorescencyjną i pozwól jej się rozgrzać.Rozważ wzorce czasoprzestrzenne kolorów ekspresji i proporcji różnych fenotypów, które są oczekiwane podczas badań przesiewowych pod kątem markera fluorescencyjnego. Wybierz żądany filtr w stereoskopie fluorescencyjnym i sprawdź, czy widoczna jest kolorowa wiązka światła, która jest skierowana na środek płytki stage. W białym świetle wyśrodkuj poczwarki w polu widzenia i ustaw je na ostrości.Wyłącz białe światło i użyj precyzyjnej ostrości, aby wyostrzyć obszar poczwarek przenoszących interesujący nas fenotyp z widocznym wzorem fluorescencyjnym. Użyj pędzla do drobnych detali, aby delikatnie obrócić poczwarki i przesunąć łopatki odbytu, aby można było zidentyfikować zewnętrzne narządy płciowe. Oddzielne poczwarki oparte na charakterystycznych zewnętrznych narządach płciowych.Samce mają długą rurkę, która wystaje z końcowego segmentu grzbietowego około połowy długości wioseł odbytu. Zewnętrzne narządy płciowe poczwarek samic są znacznie krótsze i rozwidlone. Podziel seksowane poczwarki na grupy po 10 lub mniej w przezroczystych 20-mililitrowych probówkach z wodą i uszczelnij probówki kłębkiem waty.Zassać żądaną liczbę dorosłych samców i samic z probówek do klatki lub małego wiadra, uważając, aby nie uszkodzić dorosłych osobników podczas tego przenoszenia. Utrzymuj krzyż przez pięć do siedmiu dni przed karmieniem krwią. Następnego dnia można pobrać komórki jajowe w celu zbadania rozwoju zarodka.Zmontuj komorę składania jaj i ostrożnie wprowadź do niej od 10 do 15 samic karmionych krwią. Przykryj komorę do składania jaj i pozostaw na 20 minut. Ostrożnie odłącz 50-mililitrową rurkę polipropylenową od doniczki do składania jaj, uważając, aby nie wypuścić komarów.Przykryj doniczkę i pozwól jajom dojrzeć do interesującego nas etapu rozwoju. Zbieraj jajka z doniczki za pomocą pędzla do drobnych detali i umieść je na wodzie w wykopanym bloku szklanym o powierzchni 40 milimetrów kwadratowych. Ostrożnie usuń wodę z pustego szkła za pomocą mikropipety i przykryj jajka w 500 mikrolitrach FAA.Delikatnie oscyluj na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dokładnie opłucz jajka 15 razy wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie ślady roztworu FAA. Używając mikropipety o pojemności 1000 mikrolitrów, dodawaj, a następnie usuwaj po jednym mililitrze wody destylowanej, uważając, aby nie uszkodzić przy tym jaj.Przykryj utrwalone jaja jednym mililitrem roztworu Trpis i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Na jajach zaczną pojawiać się blade plamy po pięciu minutach inkubacji, ostatecznie osiągając mlecznobiały kolor po oczyszczeniu. Jajka dokładnie opłucz 15 razy wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie ślady roztworu Trpis.Ekspresję markerów fluorescencyjnych napędzanych przez promotor 3xP3 obserwuje się w oczach i zwojach brzusznych poczwarek Anopheles gambiae. Użycie różnokolorowych markerów fluorescencyjnych pozwala na selekcję i badania przesiewowe zmodyfikowanych osobników noszących różne komponenty GAL4 i UAS. Podczas pracy z dwuczęściowym systemem GAL4-UAS konieczne jest krzyżowanie samców i samic z różnych szczepów w celu uzyskania potomstwa noszącego zarówno komponenty GAL4, jak i UAS.Do określania płci wykorzystuje się zróżnicowaną morfologię obserwowaną w zewnętrznych narządach płciowych samców i samic poczwarek. Przykład niezidentyfikowanej poczwarki jest tutaj podkreślony. Usunięcie całej wody z poczwarek, jak pokazano po prawej stronie, zwiększa trudność w określaniu płci, ponieważ wiosła analne zasłaniają wizualizację genitaliów.Dwuczęściowy system GAL4-UAS pozwala na modyfikację ekspresji genów w kontrolowany sposób czasoprzestrzenny. Można to zobrazować, krzyżując enocyty i wszechobecne cztery linie sterujące GAL4 z linią odpowiadającą UAS-mCherry. Kluczową zaletą stosowania dwuczęściowego systemu GAL4-UAS jest łatwość badania letalnych fenotypów nawet na etapie embrionalnym.Aby to zrobić, konieczne jest uwidocznienie wewnętrznej morfologii zarodków. Normalne cechy morfologiczne obserwowane na różnych etapach rozwoju zarodka po 12, 24 i 36 godzinach od zniesienia można zobaczyć po zakończeniu protokołu oczyszczania zarodków. Podczas tej procedury ważne jest, aby poczwarki i jaja nie mogły wyschnąć.Dlatego ważne jest, aby pracować szybko podczas usuwania płynów. Metoda GAL4-UAS pozwoliła nam na funkcjonalne scharakteryzowanie genów zaangażowanych w oporność na insektycydy oraz tych, które mają potencjalne zastosowanie w metodach kontroli napędu genowego.

using-the-gal4-uas-system-for-functional-genetics-in-anopheles-gambiae

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisujemy metodę Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR), która pozwala wykorzystać tkankowo specyficzną FLP do określania wzorców ekspresji Gal80. W każdym miejscu, w którym Gal4 i FLP nakładają się na siebie, ekspresja Gal4 zostaje włączona (Gal80 zostaje usunięte – „flipped out”) lub wyłączona (Gal80 zostaje wstawione – „flipped in”). Metoda FINGR jest wszechstronnym narzędziem do analizy klonalnej i mapowania obwodów neuronalnych.

Mapowanie i zastosowanie ekspresji flippazy w pułapkach enhancerów w OUN larw i dorosłych osobników Drosophila

Zespoły genomowe oparte na technologiach masowego równoległego sekwencjonowania DNA są zazwyczaj silnie pofragmentowane. Opracowanie fizycznych map chromosomowych może potencjalnie usprawnić składanie genomów. W niniejszej pracy prezentujemy innowacyjne podejścia do przygotowania chromosomów, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz obrazowania, które znacząco zwiększają wydajność tworzenia map fizycznych.

Wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów z wykorzystaniem zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ

W tym filmie pokazujemy dostarczanie konstruktu napędu genowego do zarodka komara Anopheles gambiae za pomocą techniki mikroiniekcji zarodka. Procedura ta pozwala na integrację dostarczonego konstruktu DNA, poprzez rekombinację homologiczną, z komórkami linii rozrodczej w celu wytworzenia przekształconej populacji komarów.

Mikroiniekcja zarodka komara: technika dostarczania egzogennego DNA do żółtka zarodka Anopheles Gambiae w celu wytworzenia mutacji linii zarodkowej

Ten protokół opisuje metodę mutagenezy insercyjnej pułapki genowej przy użyciu Gal4-VP16 jako głównego reportera i GFP/RFP jako wtórnego reportera u danio pręgowanego. Około jedna na dziesięć ryb o wysokiej ekspresji F0 daje potomstwo pułapki genowej koeksprymujące GFP i RFP. Procedurę przesiewową można łatwo przeskalować, aby dostosować ją do wielkości laboratorium wykonującego badanie przesiewowe mutagenezy insercyjnej.

Pułapkowanie genów za pomocą Gal4 u danio pręgowanego

W tym artykule wideo opisujemy zautomatyzowany test do pomiaru wpływu głodu lub sytości na zależne od węchu zachowanie związane z poszukiwaniem pokarmu u dorosłej muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Celem tego protokołu jest przedstawienie projektu i wydajności eksperymentów in vivo na Drosophila melanogaster w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji rzadkich wariantów genów związanych z chorobami ludzkimi.

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Techniki mikroiniekcji są niezbędne do wprowadzenia egzogennych genów do genomów komarów. Protokół ten wyjaśnia metodę stosowaną przez laboratorium Jamesa do mikrowstrzykiwania konstruktów DNA do embrionów Anopheles gambiae w celu wygenerowania przekształconych komarów.

Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Poznaj system GAL4-UAS do analizy genetycznej u Anopheles gambiae. Metoda umożliwia kontrolowaną ekspresję genów w czasie i przestrzeni, wspierając badania nad odpornością na insektycydy oraz strategiami kontroli wektorów malarii.

Wykorzystanie systemu GAL4-UAS do genetyki funkcjonalnej u Anopheles gambiae

Przeglądaj więcej filmów