Wykorzystanie systemu GAL4-UAS do genetyki funkcjonalnej u Anopheles gambiae
15 kwietnia 2021
Dwuczęściowy system GAL4-UAS jest wszechstronnym narzędziem do modyfikacji ekspresji genów w kontrolowany sposób czasoprzestrzenny, co pozwala na funkcjonalną analizę genetyczną w Anopheles gambiae. Opisane procedury korzystania z tego systemu to częściowo ustandaryzowana strategia klonowania, określanie płci i badanie przesiewowe poczwarek pod kątem fluorescencyjnych markerów białkowych i utrwalanie zarodków.
Dwuczęściowy system GAL4-UAS jest wszechstronnym narzędziem do funkcjonalnej analizy genetycznej w Anopheles gambiae poprzez genetyczną modyfikację ekspresji genów w sposób kontrolowany czasowo. System binarny umożliwia elastyczność w podejściach eksperymentalnych do fenotypowej charakterystyki ekspresji transgenu, nawet jeśli indukowane są poważne koszty przystosowania. System ten może być wykorzystany do charakterystyki fenotypowej genów potencjalnie zaangażowanych w oporność na insektycydy, przenoszenie patogenów lub te, które mają zastosowanie w metodach kontroli genetycznej.
Fraser Coleman, technik badawczy, pomoże zademonstrować tę procedurę Zacznij od zebrania poczwarek za pomocą trzymililitrowej plastikowej pipety Pasteura z końcem odciętym na przezroczystym płaskim naczyniu nadającym się do użycia z mikroskopem stereoskopowym. Ostrożnie usuń większość wody wokół poczwarek. Włącz żarówkę fluorescencyjną i pozwól jej się rozgrzać.
Rozważ wzorce czasoprzestrzenne kolorów ekspresji i proporcji różnych fenotypów, które są oczekiwane podczas badań przesiewowych pod kątem markera fluorescencyjnego. Wybierz żądany filtr w stereoskopie fluorescencyjnym i sprawdź, czy widoczna jest kolorowa wiązka światła, która jest skierowana na środek płytki stage. W białym świetle wyśrodkuj poczwarki w polu widzenia i ustaw je na ostrości.
Wyłącz białe światło i użyj precyzyjnej ostrości, aby wyostrzyć obszar poczwarek przenoszących interesujący nas fenotyp z widocznym wzorem fluorescencyjnym. Użyj pędzla do drobnych detali, aby delikatnie obrócić poczwarki i przesunąć łopatki odbytu, aby można było zidentyfikować zewnętrzne narządy płciowe. Oddzielne poczwarki oparte na charakterystycznych zewnętrznych narządach płciowych.
Samce mają długą rurkę, która wystaje z końcowego segmentu grzbietowego około połowy długości wioseł odbytu. Zewnętrzne narządy płciowe poczwarek samic są znacznie krótsze i rozwidlone. Podziel seksowane poczwarki na grupy po 10 lub mniej w przezroczystych 20-mililitrowych probówkach z wodą i uszczelnij probówki kłębkiem waty.
Zassać żądaną liczbę dorosłych samców i samic z probówek do klatki lub małego wiadra, uważając, aby nie uszkodzić dorosłych osobników podczas tego przenoszenia. Utrzymuj krzyż przez pięć do siedmiu dni przed karmieniem krwią. Następnego dnia można pobrać komórki jajowe w celu zbadania rozwoju zarodka.
Zmontuj komorę składania jaj i ostrożnie wprowadź do niej od 10 do 15 samic karmionych krwią. Przykryj komorę do składania jaj i pozostaw na 20 minut. Ostrożnie odłącz 50-mililitrową rurkę polipropylenową od doniczki do składania jaj, uważając, aby nie wypuścić komarów.
Przykryj doniczkę i pozwól jajom dojrzeć do interesującego nas etapu rozwoju. Zbieraj jajka z doniczki za pomocą pędzla do drobnych detali i umieść je na wodzie w wykopanym bloku szklanym o powierzchni 40 milimetrów kwadratowych. Ostrożnie usuń wodę z pustego szkła za pomocą mikropipety i przykryj jajka w 500 mikrolitrach FAA.
Delikatnie oscyluj na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dokładnie opłucz jajka 15 razy wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie ślady roztworu FAA. Używając mikropipety o pojemności 1000 mikrolitrów, dodawaj, a następnie usuwaj po jednym mililitrze wody destylowanej, uważając, aby nie uszkodzić przy tym jaj.
Przykryj utrwalone jaja jednym mililitrem roztworu Trpis i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Na jajach zaczną pojawiać się blade plamy po pięciu minutach inkubacji, ostatecznie osiągając mlecznobiały kolor po oczyszczeniu. Jajka dokładnie opłucz 15 razy wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie ślady roztworu Trpis.
Ekspresję markerów fluorescencyjnych napędzanych przez promotor 3xP3 obserwuje się w oczach i zwojach brzusznych poczwarek Anopheles gambiae. Użycie różnokolorowych markerów fluorescencyjnych pozwala na selekcję i badania przesiewowe zmodyfikowanych osobników noszących różne komponenty GAL4 i UAS. Podczas pracy z dwuczęściowym systemem GAL4-UAS konieczne jest krzyżowanie samców i samic z różnych szczepów w celu uzyskania potomstwa noszącego zarówno komponenty GAL4, jak i UAS.
Do określania płci wykorzystuje się zróżnicowaną morfologię obserwowaną w zewnętrznych narządach płciowych samców i samic poczwarek. Przykład niezidentyfikowanej poczwarki jest tutaj podkreślony. Usunięcie całej wody z poczwarek, jak pokazano po prawej stronie, zwiększa trudność w określaniu płci, ponieważ wiosła analne zasłaniają wizualizację genitaliów.
Dwuczęściowy system GAL4-UAS pozwala na modyfikację ekspresji genów w kontrolowany sposób czasoprzestrzenny. Można to zobrazować, krzyżując enocyty i wszechobecne cztery linie sterujące GAL4 z linią odpowiadającą UAS-mCherry. Kluczową zaletą stosowania dwuczęściowego systemu GAL4-UAS jest łatwość badania letalnych fenotypów nawet na etapie embrionalnym.
Aby to zrobić, konieczne jest uwidocznienie wewnętrznej morfologii zarodków. Normalne cechy morfologiczne obserwowane na różnych etapach rozwoju zarodka po 12, 24 i 36 godzinach od zniesienia można zobaczyć po zakończeniu protokołu oczyszczania zarodków. Podczas tej procedury ważne jest, aby poczwarki i jaja nie mogły wyschnąć.
Dlatego ważne jest, aby pracować szybko podczas usuwania płynów. Metoda GAL4-UAS pozwoliła nam na funkcjonalne scharakteryzowanie genów zaangażowanych w oporność na insektycydy oraz tych, które mają potencjalne zastosowanie w metodach kontroli napędu genowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje zastosowanie dwuczęściowego systemu GAL4-UAS do funkcjonalnej analizy genetycznej u Anopheles gambiae, głównego wektora malarii w Afryce. Protokół ten umożliwia precyzyjną, czasowo-przestrzenną kontrolę ekspresji genów, co ułatwia charakterystykę fenotypową genów, w tym tych zaangażowanych w odporność na insektycydy oraz strategie kontroli genetycznej. Przedstawiono procedury krok po kroku dotyczące krzyżówek genetycznych, wyznaczania płci poczwarek, przesiewania markerów fluorescencyjnych oraz klarowania embrionów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Biologia molekularna
- Biologia wektorów
Wstęp
- System GAL4-UAS to binarna metoda genetyczna, pierwotnie opracowana u drożdży i zaadaptowana do stosowania w różnych organizmach modelowych.
- Umożliwia ona tkankowo specyficzną i czasową kontrolę ekspresji genów poprzez krzyżowanie linii sterujących (driver) i linii odpowiednich (responder).
- U An. gambiae system ten pozwala na badanie funkcji genów istotnych dla biologii wektorów i transmisji chorób.
- Markery fluorescencyjne ułatwiają identyfikację osobników transgenicznych.
Cel badania
- W celu adaptacji i zademonstrowania systemu GAL4-UAS u An. gambiae.
- W celu przedstawienia protokołów generowania i przesiewania linii transgenicznych.
- W celu umożliwienia funkcjonalnej analizy genów, w tym tych o fenotypach letalnych.
Zastosowane metody
- Zbieranie i wyznaczanie płci poczwarek komarów przy użyciu markerów morfologicznych pod stereomikroskopem.
- Krzyżowanie linii driver i responder w celu uzyskania potomstwa posiadającego oba komponenty GAL4 oraz UAS.
- Przesiewanie potomstwa przy użyciu markerów fluorescencyjnych sterowanych przez promotor 3xP3.
- Zbieranie, utrwalanie i przejrzystowanie zarodków przy użyciu roztworów FAA i Trpis na potrzeby analizy rozwoju.
Główne wyniki
- Pomyślna identyfikacja i oddzielenie poczwarek męskich i żeńskich na podstawie narządów płciowych zewnętrznych.
- Efektywny przesiew potomstwa transgenicznego z wykorzystaniem odrębnych markerów fluorescencyjnych.
- Wizualizacja wzorców ekspresji genów w embrionach i poczwarkach.
- Wykazanie użyteczności systemu w badaniu fenotypów letalnych i rozwoju embrionalnego.
Wnioski
- System GAL4-UAS jest niezawodnym narzędziem do kontrolowanej ekspresji genów u An. gambiae.
- Umożliwia on funkcjonalne badania genetyczne, w tym te ukierunkowane na geny o silnym wpływie na kondycję organizmu.
- Podejście to wspiera badania nad kontrolą wektorów oraz genetycznymi podstawami istotnych cech.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
System GAL4-UAS u Anopheles gambiae umożliwia precyzyjną, spatiotemporalną manipulację genetyczną, wspierając walidację funkcjonalną genów zaangażowanych w biologię wektorów i mechanizmy oporności. Możliwość ta ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka związanego z celami terapeutycznymi oraz dostarczania informacji niezbędnych do podejmowania wczesnych decyzji portfelowych w zakresie strategii kontroli wektorów i interwencji genetycznych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w badaniach nad funkcją genów, bezpośrednio wpływając na procesy badawcze w obszarze translacyjnym dotyczącym zwalczania wektorów chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji genów w sposób specyficzny dla tkanki i stadium rozwoju w celu mechanistycznej oceny ryzyka.
- Wspiera walidację funkcjonalną genów kandydackich zaangażowanych w oporność na insektycydy oraz przenoszenie patogenów.
- Ułatwia szybką selekcję celów genetycznych wywołujących silne efekty w zakresie dostosowania biologicznego poprzez kontrolowaną ekspresję.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane linie transgeniczne do późniejszych procesów przesiewania fenotypowego.
- Standaryzuje analizy przesiewowe z wykorzystaniem markerów fluorescencyjnych w celu niezawodnej identyfikacji konstruktów genetycznych.
- Umożliwia przeprowadzanie skalowalnych i powtarzalnych testów w celu korelacji funkcji genów z fenotypem.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodność badań nad funkcjami genów z biologią wektorów istotną dla chorób w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wsparcie dla dostosowanego do ryzyka wdrażania strategii kontroli genetycznej ukierunkowanej na populacje wektorów.
- Zapewnienie wglądu w mechanizmy, które służą do opracowywania modeli przedklinicznych dla interwencji w chorobach przenoszonych przez wektory.
Integracja potoków i przepływów pracy
System GAL4-UAS obejmuje cały proces – od wczesnych odkryć, przez identyfikację wiodących związków, aż po badania translacyjne w zakresie biologii wektorów i kontroli genetycznej.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków dla genów wpływających na kompetencję wektora i odporność.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki fenotypowe z wykorzystaniem selekcji opartej na markerach fluorescencyjnych.
- Analityka: Zapewnia mierzalne odczyty do porównywania efektów ekspresji genów w różnych stadiach rozwojowych i tkankach.
- Badania translacyjne: Łączy genetykę funkcjonalną z przedkliniczną walidacją strategii kontroli wektorów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnych badań nad funkcją genów i opracowywania narzędzi genetycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów przesiewowych w badaniach genetycznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka związanych z celami genetycznymi.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w przypadku kandydatów do kontroli wektorów i interwencji genetycznych.
Rozważania dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu genetyki komarów oraz utrzymania linii transgenicznych.
- Niezbędny jest dostęp do mikroskopii fluorescencyjnej oraz infrastruktury do klonowania molekularnego.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie krzyżówek genetycznych i protokołów przesiewania fenotypowego.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla różnych szczepów komarów lub genów docelowych.
- Niezbędna jest ostrożna obsługa w celu zapobiegania wysychaniu i zapewnienia żywotności podczas procedur.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:49
Collection of Pupae for Microscopic Characterization and Identification of Fluorescent Markers
1:45
Sexing Pupae
2:25
Setting Up GAL4-UAS (Upstream Activation Sequences) System Crosses and Inducing Egg Laying
3:20
Embryo Fixation and Bleaching
4:15
Results: Analysis of Anopheles gambiae Pupae Expressing Fluorescent Markers Driven by 3xP3 Promoter, Tissue-specific Expression Visualization, and Embryo Clearing
5:53
Conclusion
