Name: Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj izolację i transfekcję pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego tęczówki i siatkówki z pięciu gatunków ssaków przy użyciu niewirusowego systemu transposonu SB100X. Ta metoda umożliwia badania terapii genowej w okulistyce z wysoką żywotnością komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania należą się Greggowi Sealy'emu i Alainowi Conti za ich doskonałą pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Komisję Europejską w ramach siódmego programu ramowego, Szwajcarską Narodową Fundację Nauk oraz Fundację Schmieder-Bohrisch. Z.I. otrzymał finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742], a B.M.W. z grantu badawczego Fulbrighta i stypendium rządu szwajcarskiego za doskonałość.

Protokoły, w których zwierzęta były zaangażowane, zostały przeprowadzone przez certyfikowany personel i po autoryzacji kantonalnego Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale z Genewy, Szwajcarii, oraz zgodnie z oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych (zatwierdzenie nr. GE/94/17). Dorosłe, zdrowe szczury rasy brunatnej norweskiej, myszy C57BL/6 i białe króliki nowozelandzkie zostały poddane eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitalu (150 mg / kg) rozcieńczonego w 0,9% NaCl wstrzykniętym dootrzewnowo, a oczy wyłuszczono natychmiast po uśmierceniu. Oczy świń i bydła pozyskiwano z lokalnej rzeźni w ciągu 6 godzin od złożenia ofiary i transportowano do laboratorium na lodzie.
1. Przed przygotowaniem
<ol>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę (DMEM/Ham's F12 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 80 U/ml penicyliny / 80 μg/ml streptomycyny i 2,5 μg/ml amfoterycyny B). Podgrzej pożywkę, 1x PBS i 0,25% trypsyny (jeśli to konieczne) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Włóż sterylną serwetę do okapu, aby przygotować aseptyczne miejsce pracy. Wprowadź wszystkie potrzebne sterylne narzędzia i materiały do wnętrza okapu. 
	UWAGA: Tylko wyłuszczenie oczu i oczyszczenie pozostałej tkanki mięśniowej i skóry to zabiegi wykonywane na zewnątrz okapu, pozostałe czynności należy wykonać wewnątrz kaptura.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek PE szczura/myszy
<ol>
	<li>Użyj zakrzywionych nożyczek i kleszczy Colibri, aby wyłuszczyć oczy po eutanazji zwierzęcia. Oczyść pozostałą tkankę mięśniową i skórę z oczu za pomocą nożyczek i kleszczy (niesterylnych). 
	UWAGA: Rozmiar nożyczek i kleszczy używanych do wyłuszczenia i czyszczenia oczu zależy od gatunku (np. w przypadku szczurów i myszy narzędzia będą mniejsze niż te używane u świń i bydła) (patrz rysunek S1).
	<ol>
		<li>Zebrać oczy w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej niesterylnym PBS i przenieść probówkę do okapu z przepływem laminarnym. Zdezynfekuj oczy, zanurzając je na 2 minuty w roztworze na bazie jodu, a następnie przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną sterylnym PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwarcie żarówki
	<ol>
		<li>Po przeniesieniu oczu na sterylną szalkę Petriego, przytrzymaj je mocno blisko nerwu wzrokowego za pomocą Colibri lub spiczastych kleszczy. Przebić otwór w pobliżu granicy tęczówki (między pars plana a ora serrata) za pomocą igły 18 G. Włóż małe nożyczki do otworu i przetnij wokół tęczówki. Usuń przedni odcinek (rogówkę, soczewkę i tęczówkę) i umieść go na szalce Petriego. Pozostaw bańkę z ciałem szklistym, aż komórki RPE zostaną odizolowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja komórek IPE
	<ol>
		<li>Zdejmij soczewkę i za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie wyciągnij tęczówkę zawierającą komórki IPE. Umieść tęczówkę na szalce Petriego, umyj sterylnym PBS i pozostaw w PBS, aż przygotuje się więcej tęczówki.</li>
		<li>Powtórz kroki od 2.2.1 do 2.3.1, aby przygotować wszystkie oczy tego dnia.</li>
		<li>Dodać 50 μl 0,25% trypsyny na tęczówkę i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Usunąć trypsynę, dodać 150 μl kompletnej pożywki na tęczówkę i delikatnie zeskrobać IPE płaską, polerowaną ogniowo pipetą Pasteura; użyć cienkich kleszczyków do unieruchomienia tkanki. Zebrać zawiesinę komórek i umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml. Użyć 10 μl zawiesiny komórek rozcieńczonej w stosunku 1:3 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera34,35.</li>
		<li>Jeśli nie zostanie natychmiast transfekowany, wysiewaj 200 000 komórek/basenik na 24-dołkowej płytce (100 000 komórek/cm2) w 1 ml kompletnego podłoża (10% FBS) (do wysiewu patrz Tabela 1). Umieścić płytkę w inkubatorze i hodować ją w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 
		UWAGA: Może być konieczne połączenie kilku oczu razem, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do wysiewu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja komórek RPE
	<ol>
		<li>Usuń ciało szkliste i siatkówkę z tylnego segmentu za pomocą cienkich kleszczy. Unikaj uszkodzenia nabłonka barwnikowego siatkówki.</li>
		<li>Przetnij segment na pół skalpelem #10, aby kula ziemska była całkowicie otwarta i umyj sterylnym PBS.</li>
		<li>Dodać 50 μl 0,25% trypsyny na oko i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Usunąć trypsynę i dodać 150 μl kompletnej pożywki na kulę i delikatnie zeskrobać komórki RPE okrągłym skalpelem; użyć cienkich kleszczy do unieruchomienia tkanki. Zebrać zawiesinę komórek i umieścić ją w probówce o pojemności 1,5 ml. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek; rozcieńczyć w stosunku 1:4 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.</li>
		<li>Patrz krok 2.3.4. 
		UWAGA: Może być konieczne połączenie kilku oczu razem, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do wysiewu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja komórek PE królika
<ol>
	<li>Przeprowadzić czyszczenie i dezynfekcję zgodnie z opisem w krokach od 2.1 do 2.1.1.</li>
	<li>Połóż jedno oko na sterylnym kompresie z gazy i trzymaj je mocno blisko nerwu wzrokowego. Otwórz oko skalpelem #11 i nożyczkami około 2 mm pod rąbkiem. Usuń przedni odcinek (rogówkę, soczewkę i tęczówkę) i umieść go na szalce Petriego. Pozostaw bańkę z ciałem szklistym, aż komórki RPE zostaną odizolowane.</li>
	<li>Izolacja komórek IPE
	<ol>
		<li>Wykonaj krok 2.3.1. Usuń ciało rzęskowe z tęczówki, przecinając skalpelem #10.</li>
		<li>Po przygotowaniu 2 tęczówek inkubować z 1 ml 0,25 % trypsyny w temperaturze 37 °C przez 10 minut; w tym czasie można wyizolować komórki RPE (patrz krok 3.4). Usuń trypsynę i dodaj 1 ml kompletnej pożywki do tęczówki i odizoluj komórki, ostrożnie drapiąc płaską, polerowaną ogniowo pipetą Pasteura. Ostrożnie zawiesić komórki przez pipetowanie i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć w stosunku 1:3 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.</li>
		<li>Patrz krok 2.3.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja komórek RPE
	<ol>
		<li>Wykonaj krok 2.4.1.</li>
		<li>Umieść sterylną gazę na płytce 12-dołkowej i umieść bańkę na gazie.</li>
		<li>Umyć PBS i wykonać krok 2.4.3. 
		UWAGA: Użyj zakrzywionej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura.</li>
		<li>Odwirować komórki 10 minut przy 120 x g.</li>
		<li>Patrz krok 2.3.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Izolacja komórek PE świni
<ol>
	<li>Wykonaj czyszczenie zgodnie z opisem w kroku 2.1. Przemyć PBS i zdezynfekować oczy, zanurzając na 2 minuty w roztworze na bazie jodu, spłukać PBS. Przejdź do kroku 3.2.</li>
	<li>Izolacja komórek IPE
	<ol>
		<li>Wykonaj krok 3.3.1. Po przygotowaniu 2 tęczówek dodaj 1 ml kompletnej pożywki i wyizoluj komórki, ostrożnie drapiąc płaską, wypolerowaną ogniowo pipetą Pasteura. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć w stosunku 1:4 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.</li>
		<li>Patrz krok 2.3.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja komórek RPE
	<ol>
		<li>Wykonaj krok 2.4.1. Umieść bańkę na szalce Petriego i umyj PBS. Napełnij bańkę 1 ml kompletnego podłoża.</li>
		<li>Za pomocą zakrzywionej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura ostrożnie usuń komórki RPE. Upewnij się, że zeskrobywasz od dołu do góry, aby uniknąć ześlizgiwania się kompleksu błonowego naczyniówki-Brucha. Zebrać zawiesinę komórek w bańce za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml w celu ponownego zamieszania. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć w stosunku 1:8 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.</li>
		<li>Patrz krok 2.3.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Izolacja bydlęcych komórek PE
<ol>
	<li>Wykonaj czyszczenie zgodnie z opisem w kroku 2.1. Przemyć PBS i zdezynfekować oczy, zanurzając na 2 minuty w roztworze na bazie jodu, spłukać PBS. Przejdź do kroku 3.2.</li>
	<li>Izolacja komórek IPE
	<ol>
		<li>Wykonaj krok 3.3.1. Po przygotowaniu dwóch tęczówek inkubować z 2 ml 0,25% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 10 minut. W tym czasie można wyizolować komórki RPE (patrz krok 5.3).</li>
		<li>Usuń trypsynę i dodaj 2 ml kompletnej pożywki do tęczówki i wyizoluj komórki, ostrożnie drapiąc płaską, polerowaną ogniowo pipetą Pasteura. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki 10 minut przy 120 x g. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć w stosunku 1:4 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.</li>
		<li>Jeśli nie zostanie natychmiast przetransfekowany, wysiew 320 000 komórek/basenik na płytce 6-dołkowej w 3 ml kompletnego podłoża (10% FBS) (do wysiewu patrz Tabela 1). Umieścić płytkę w inkubatorze i hodować ją w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja komórek RPE
	<ol>
		<li>Wykonaj krok 2.4.1. Umieść bańkę na szalce Petriego i umyj PBS. Po przygotowaniu 2 oczek napełnić bańkę w około 3/4 trypsyną i inkubować przez 25 minut w temperaturze 37 °C z pokrywką szalki Petriego na wierzchu bańki.</li>
		<li>Usuń trypsynę i dodaj 1 ml kompletnej pożywki. Wykonaj krok 4.3.2. Odwirować komórki 10 minut przy 120 x g.</li>
		<li>Patrz krok 5.2.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Uprawa - średnia zmiana
<ol>
	<li>Hodować komórki w F12 DMEM/Ham, uzupełnionym 10% FBS, 80 U/ml penicyliny / 80 μg/ml streptomycyny i 2,5 μg/ml amfoterycyny B, w temperaturze 37°C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze. Po 3-4 dniach pipetuj w górę iw dół, aby zebrać nieprzylegające komórki i umieść połowę objętości w innym dołku. Napełnij do 1 ml kompletnym podłożem. 
	UWAGA: Pozwala to na uzyskanie wystarczająco dużej powierzchni, aby wszystkie odizolowane komórki mogły się przyłączyć i zmaksymalizować moc wyjściową.</li>
	<li>Po kolejnych 3-4 dniach powtórz pobieranie komórek, ale tym razem łącząc nieprzylegające komórki z dwóch studzienek do jednego dołka (np. A1 + B1 w C1). Dodaj pożywkę do wszystkich studzienek. Obserwuj komórki i zmieniaj pożywkę 2 razy w tygodniu (w przypadku płytek 6- i 24-dołkowych należy użyć odpowiednio 3 i 1 ml / dołek). Gdy komórki osiągną konfluencję, przełącz się na kompletną pożywkę z 1% FBS lub użyj komórek do eksperymentów (np. transfekcji). 
	UWAGA: Komórki RPE i IPE zlewają się odpowiednio po 3-4 i 4-5 tygodniach od izolacji. Czystość hodowli komórkowej została potwierdzona, sprawdzając morfologię komórek (komórki pigmentowane) i specyficzne markery, jak opisali Johnen i współpracownicy36.</li>
</ol>
7. Elektroporacja pierwotnych ogniw PE
<ol>
	<li>Wykonaj elektroporację zgodnie z wcześniejszym opisem1,37.</li>
	<li>W zależności od liczby transfekowanych komórek należy użyć płytek 6-, 24- lub 48-dołkowych (patrz Tabela 2) do wysiewu komórek w pożywce bez antybiotyków lub środków przeciwgrzybiczych. Przez następne 2 tygodnie dodawaj krople z pożywką zawierającą penicylinę (80 j./ml), streptomycynę (80 μg/ml) i amfoterycynę B (2,5 μg/ml) dwa razy w tygodniu. Całkowicie wymień pożywkę 2 tygodnie po transfekcji.</li>
	<li>Aby określić wzrost komórek, wydajność transfekcji i wydzielanie białka, monitoruj komórki co tydzień za pomocą mikroskopii i analizuj supernatant kultury komórkowej za pomocą western blot. Przed zakończeniem hodowli należy pobrać 24-godzinny supernatant z hodowli komórkowej w celu ilościowego określenia wydzielania białka metodą ELISA, policzyć komórki, zmierzyć fluorescencję za pomocą cytometrii obrazowej (w przypadku komórek transfekowanych przez Wenus) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów) i zebrać osad komórkowy do analizy ekspresji genów opartej na RT-qPCR. 
UWAGA: Metody te nie zostały uwzględnione w niniejszej pracy, ponieważ nie jest celem szczegółowego wyjaśnienia analizy komórek, ale raczej ich izolacji. Gęstość wysiewu komórek jest taka sama dla wszystkich gatunków (100 000 komórek/cm2), ale ponieważ liczba izolowanych komórek jest różna, użyto różnych płytek. Ponadto w przypadku myszy, szczurów i królików może być konieczne zebranie 2-3 oczu, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do wysiewu.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>gatunek</td>
			<td>Leczenie trypsyną</td>
			<td>Liczba ogniw IPE</td>
			<td>Liczba ogniw RPE</td>
			<td>Talerz do wysiewu (100 000 komórek/cm2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mysz/szczur</td>
			<td>tak</td>
			<td>~50,000</td>
			<td>~150 000</td>
			<td>Płytki 24-dołkowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>królik</td>
			<td>tak</td>
			<td>~350 000</td>
			<td>~2 500 000</td>
			<td>Płytki 24-dołkowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>świnia</td>
			<td>Nie</td>
			<td>~1 000 000</td>
			<td>~3 000 000</td>
			<td>Płytki 24-dołkowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wołowy</td>
			<td>tak</td>
			<td>~1 700 000</td> osób
			<td>~5 000 000</td>
			<td>Płytki 6-dołkowe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Liczba pierwotnych komórek PE wyizolowanych z oczu różnych gatunków.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>nazwa</td>
			<td>obszar</td>
			<td>Nośnik objętościowy</td>
			<td>trypsyna</td>
			<td>Objętość medium do zatrzymania działania trypsyny</td>
			<td>Gęstość wysiewu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płytka 6-dołkowa</td>
			<td>9,6 cm²</td>
			<td>3,0 ml</td>
			<td>0,5 ml</td>
			<td>1,0 ml</td>
			<td>Wymiary: 3x105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płytka 24-dołkowa</td>
			<td>2,0 cm²</td>
			<td>1,0 ml</td>
			<td>0,2 ml</td>
			<td>0,8 ml</td>
			<td>Dawka 5x104</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Płytka 48-dołkowa</td>
			<td>1,1 cm²</td>
			<td>0,5 ml</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td>0,4 ml</td>
			<td>0,5-1x104</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Objętości kultur komórkowych i gęstości wysiewu.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Posiadanie ustandaryzowanych metod izolacji i hodowli komórek PE ma zasadnicze znaczenie dla opracowania nowych podejść do leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Dzięki przedstawionym tutaj protokołom komórki PE mogą być z powodzeniem izolowane od różnych gatunków i hodowane przez długie okresy (do tej pory najdłuższa hodowla była utrzymywana przez 2 lata 1,38); Zaobserwowano typową morfologię, pigmentację i funkcję komórek PE (ryc. 1</s...

Nasza grupa skupia się na rozwoju metod regeneracyjnych do leczenia zwyrodnień neurosiatkówkowych, tj. AMD, za pomocą niewirusowej terapii genowej opartej na RPE i IPE. Przedkliniczne opracowanie takich terapii wymaga modeli in vitro, które można przenieść na ludzi. W związku z tym celem przedstawionego tutaj badania jest dostarczenie protokołów izolacji, hodowli i inżynierii genetycznej pierwotnych komórek RPE i IPE. Uzasadnieniem dla ustanowienia izolacji komórek PE od wielu gatunków jest solidne potwierdzenie bezpieczeństwa i skuteczności tego podejścia oraz zwiększenie jego odtwarzalności i możliwości przenoszenia. Dostępna ludzka linia komórkowa RPE ARPE-19 różni się od komórek pierwotnych (np. są mniej pigmentowane) i dlatego ma ograniczoną wartość dla analiz przedklinicznych1. Dodatkowo komórki ssaków innych niż ludzkie można kupić za niższą cenę i w większych ilościach; Tkanki ludzkiego dawcy można pozyskać z różnych banków oczu, ale ich dostępność jest ograniczona i kosztowna. Wreszcie, nowe produkty lecznicze terapii zaawansowanej (ATMP, tj. produkt leczniczy terapii komórkowej, tkankowej lub genowej) muszą być stosowane u co najmniej dwóch różnych gatunków przed przetestowaniem na pacjentach, a te badania in vivo wymagają przygotowania allogenicznych przeszczepów komórek.
Choroby neurodegeneracyjne siatkówki są główną przyczyną ślepoty w krajach uprzemysłowionych, obejmując powszechne choroby, takie jak AMD, a także rzadkie choroby, takie jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, w którym śmierć komórek siatkówki ostatecznie prowadzi do ślepoty. Uszkodzenia komórek RPE, fotoreceptorów i komórek zwojowych siatkówki (RGC) mogą być w niektórych przypadkach spowolnione, ale obecnie nie ma dostępnych terapii leczniczych. Produkty lecznicze terapii zaawansowanych (ATMPs) oferują potencjał do korygowania wad genów, integracji genów terapeutycznych lub zastępowania zdegenerowanych komórek, umożliwiając w ten sposób rozwój terapii regeneracyjnych i leczniczych chorób takich jak AMD; 13 terapii genowych zostało już dopuszczonych do obrotu, w tym terapia w leczeniu zwyrodnienia siatkówki związanego z mutacją RPE652,3. Wśród osób starszych (>60 lat) ~30 milionów ludzi na całym świecie jest dotkniętych neowaskularnym (nvAMD) lub jałowym (aAMD) AMD4. Obie formy są indukowane przez czynniki związane z wiekiem, w tym uszkodzenia oksydacyjne, upośledzenie funkcji i utratę komórek RPE, a następnie degradację fotoreceptorów, między innymi (np. allele ryzyka genetycznego, palenie tytoniu, nadciśnienie)5,6. W nvAMD patogeneza jest pogarszana przez brak równowagi czynników angiogennych i antyangiogennych na korzyść angiogennego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), który indukuje neowaskularyzację naczyniówki (CNV). Do tej pory tylko nvAMD można leczyć poprzez comiesięczne wstrzyknięcia doszklistkowe inhibitorów białka VEGF w celu zahamowania CNV; Nie jest jeszcze dostępna skuteczna metoda leczenia aAMD6,7.
Kilka badań oceniało terapie komórkowe zastępujące terapię anty-VEGF: badania przeprowadzone przez Binder et al., w których świeżo pobrane autologiczne komórki RPE zostały przeszczepione pacjentom z nAMD8,9,10, wykazały umiarkowaną poprawę widzenia, ale tylko niewielka grupa pacjentów osiągnęła końcową ostrość widzenia wystarczająco wysoką, aby umożliwić czytanie. Niedawno, w badaniu klinicznym fazy I, w którym wykorzystano plaster RPE pochodzący z embrionalnych komórek macierzystych w leczeniu AMD, uzyskując obiecujące wyniki; tj. skuteczność, stabilność i bezpieczeństwo plastra RPE przez okres do 12 miesięcy u 2 z 10 leczonych pacjentów11. Ponadto kilka grup opublikowało badania, w których autologiczne plamy błonowo-naczyniówkowe RPE-Brucha zostały pobrane z siatkówki obwodowej i przeszczepione do plamki żółtej12,13,14; oraz wygenerowano plastry RPE pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do przeszczepu15. W przypadku aAMD przeciwciała skierowane na szlak dopełniacza zostały przetestowane w badaniach klinicznych6,16 i zakończono badanie fazy I z zastosowaniem pojedynczego wstrzyknięcia do ciała szklistego wektora wirusowego związanego z adenowirusem (AAV) kodującego gen czynnika CD59 (AAVCAGsCD59) u pacjentów z atrofią geograficzną (GA)17; Niedawno rozpoczęło się badanie fazy II, którego celem jest rekrutacja 132 pacjentów z zaawansowanym AMD i ocena wyników po 2 latach od interwencji18. Wreszcie, grupa badawcza FocuS rozpoczęła wieloośrodkowe badanie kliniczne fazy I/II oceniające bezpieczeństwo, odpowiedź na dawkę i skuteczność rekombinowanego, niereplikującego wektora AAV kodującego ludzki czynnik dopełniacza19.
Przede wszystkim, celem regeneracyjnej terapii AMD jest przeszczepienie funkcjonalnych komórek RPE, które zostały uszkodzone lub utracone. Jednak komórki IPE i RPE mają wiele podobieństw funkcjonalnych i genetycznych (np. fagocytoza i metabolizm retinolu), a ponieważ komórki IPE są bardziej wykonalne, zaproponowano je jako substytut RPE20. Mimo że wcześniej wykazano, że przeszczep komórek IPE opóźnia degenerację fotoreceptorów w modelach zwierzęcych21,22 i stabilizuje funkcje wzrokowe u pacjentów ze schyłkowym stadium nvAMD, nie zaobserwowano znaczącej poprawy u tych pacjentów23. Brak skuteczności może być spowodowany małą liczbą przeszczepionych komórek i (lub) brakiem równowagi neuroprotekcyjnych czynników siatkówki. Alternatywnym podejściem byłoby przeszczepienie transfekowanych komórek nabłonka barwnikowego, które nadmiernie eksprymują czynniki neuroprotekcyjne w celu przywrócenia homeostazy siatkówki, utrzymania pozostałych komórek RPE oraz ochrony fotoreceptorów i RGC przed degeneracją. W związku z tym proponujemy nową terapię, która polega na przeszczepieniu funkcjonalnych komórek RPE lub IPE, które zostały poddane inżynierii genetycznej w celu wydzielania białek neuroprotekcyjnych i antyangiogennych, takich jak PEDF, GM-CSF lub insulinopodobne czynniki wzrostu (IGF). Zaletą opracowania i przeanalizowania tego podejścia na kilku gatunkach zamiast przy użyciu linii komórkowej, tylko jednego gatunku lub tkanki ludzkiej jest: 1) zwiększona odtwarzalność i przenośność wyników, jak wykazano w licznych badaniach przeprowadzonych w niezależnych laboratoriach i różnych gatunkach1,24,25; 2) komórki świńskie lub bydlęce są praktycznie do utylizacji bez poświęcania dodatkowych zwierząt; 3) Dostępność komórek pochodzących w szczególności od świń i bydła pozwala na uzyskanie wiarygodnych wyników w dużych seriach testowych; 4) wiedza na temat izolacji, hodowli i modyfikacji genetycznej komórek z najczęściej używanych modeli umożliwia analizy in vivo u wielu gatunków24,25,26, a tym samym oferuje lepszy stosunek ryzyka do korzyści dla pierwszych leczonych pacjentów; 5) Elastyczność przedstawionego protokołu pozwala na jego zastosowanie w różnych modelach i układach eksperymentalnych oraz we wszystkich terapiach opartych na komórkach oka z inżynierią genetyczną i bez niej. Natomiast techniki alternatywne, takie jak linie komórkowe lub tkanki ludzkie, mają jedynie ograniczoną zdolność przenoszenia i/lub ograniczoną jednorazowość. Linie komórkowe, takie jak ARPE-19, są idealne do wstępnych eksperymentów; Jednak niska pigmentacja i wysoka proliferacja różnią się znacznie od komórek pierwotnych<klasa SUP="xref">1. Komórki RPE i IPE, które są izolowane z ludzkich tkanek dawcy, stanowią cenne źródło dla przenośnych eksperymentów in vitro; jednak pozyskujemy ludzką tkankę z amerykańsko-amerykańskiego banku oczu, co oznacza, że tkanka ma co najmniej dwa dni (po enukleacji) i wymaga długiego i kosztownego transportu, ale lokalna tkanka dawcy nie jest dostępna w wystarczających ilościach do produktywnych badań. Zaleta zastosowania komórek pierwotnych jest potwierdzona wieloma badaniami z innych grup27,28.
Za opracowanie komórkowej niewirusowej terapii genowej z wykorzystaniem systemu transpozonów SB100X do transfekcji pierwotnych komórek RPE i IPE z genami kodującymi dla PEDF i/lub GM-CSF w celu leczenia odpowiednio nvAMD i aAMD29,30,31,32, najpierw ustaliliśmy transfekcję komórek ARPE-191. Następnie ustalono protokoły izolacji i transfekcji w łatwo dostępnych komórkach pierwotnych bydła i świń. Teraz ustalono izolację i transfekcję pierwotnych komórek RPE i IPE od pięciu różnych gatunków, od małych (jak myszy) do dużych ssaków (jako bydło). Zostało to potwierdzone w pierwotnych komórkach RPE i IPE pochodzących z ludzkich oczu dawcy30. Produkcja ATMP zgodna z Dobrymi Praktykami Wytwarzania (GMP) została również zwalidowana przy użyciu ludzkiej tkanki dawcy33. Na koniec oceniono zarówno bezpieczeństwo, jak i skuteczność tego podejścia in vivo na trzech różnych gatunkach, do których dostosowano protokół: myszy, szczura i królika. W warunkach klinicznych od pacjenta zostanie pobrana biopsja tęczówki, a komórki IPE zostaną wyizolowane i przetransfekowane w pomieszczeniu czystym, zanim komórki zostaną przeszczepione podsiatkówkowo z powrotem do tego samego pacjenta. Cały proces odbędzie się podczas jednej sesji chirurgicznej, która trwa około 60 minut. Opracowanie podejścia do leczenia i ocena jego skuteczności wymagały doskonałych modeli in vitro i ex vivo w celu wdrożenia solidnych i skutecznych metod dostarczania genów, analizy efektywności dostarczania genów, produkcji białek terapeutycznych i efektów neuroprotekcyjnych oraz produkcji przeszczepów komórek w celu przetestowania podejścia in vivo1,24,25,29,30. Warto wspomnieć, że terapia posiada etyczną zgodę na badanie kliniczne fazy Ib/IIa wydaną przez komisję etyczną ds. badań kantonu Genewa (nr 2019-00250) i obecnie ostatnie dane przedkliniczne wymagane do autoryzacji przez szwajcarskie organy regulacyjne są zbierane przy użyciu przedstawionego protokołu. W związku z tym dane przedkliniczne in vivo wykazały znaczne zmniejszenie CNV i doskonałe bezpieczeństwo24,25,31.
Tutaj opisana jest izolacja i hodowla komórek RPE/IPE od bydła, świni, królika, szczura i myszy oraz zastosowanie integracyjnego systemu transpozonów SB100X w połączeniu z elektroporacją jako efektywną metodą dostarczania genów. W szczególności pierwotne komórki PE zostały transfekowane w celu nadekspresji PEDF i GM-CSF. Zbiór tych protokołów umożliwia prowadzenie badań in vitro i in vivo we wszystkich fazach przedklinicznych rozwoju ATMP. Co więcej, układ ten ma potencjał do adaptacji do innych genów i chorób, które są przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>Płytki 12-dołkowe</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe Płytki 48-dołkowe</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td></td> Płytki<td>6-dołkowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td> 150687 <td></td></tr><tr><td>Mikrokleszczyki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> płaskie Greiner 7657160 <td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr> Bonn <tr><td>Kleszcze Colibri (sterylne)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Test cytotoksyczności CytoTox-Glo</td><td>Promega</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Serweta (sterylna)</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>800530</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do elektroporacji 3P.14</td><td>3P Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Brunschwig</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze (różne rozmiary) (sterylne)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kompres z gazy</td><td>PROMEDICAL AG</td><td>25403</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (0,9%)</td><td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td><td>1000090</td><td></td></tr><tr><td>Igła (18G)&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>TER-NN1838R</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do transfekcji neonowej 10 i mikro; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>Komora Neubauera</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura (fire-polish)</td><td>Witeg</td><td>4100150</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td><td>Ospedalia AG</td><td>31408025</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-PEDF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-SB100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-Venus</td><td></td><td></td><td>Pastor i wsp., 2018. Dzięki uprzejmości prof. Schermana i prof. Marie</td></tr><tr><td>pSB100X (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td><td>M&aacute; t&eaostry; S i wsp., 2009. Dostarczone przez prof. Izsvak</td></tr><tr><td>pT2-CAGGS-Venus</td><td></td><td></td><td>Johnen et al., 2012</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF-His plazmidowe DNA (250 ng/&mikro; L)</td><td></td><td></td> <td>Sklonowany w naszym laboratorium</td></tr><tr><td>pT2-CMV-PEDF-His plazmidowe DNA (250 ng /&mikro; L)</td><td></td><td></td> <td>Pastor i wsp., 2018</td></tr><tr><td>scarpel nr 10</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>scarpel nr 11</td><td>Swann-Morton</td><td>503</td><td></td></tr><tr><td>Ostro-ostra końcówka zakrzywione Extra Fine Bonn Nożyczki (sterylne)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostra-ostra końcówka prosta Bardzo cienkie nożyczki Bonn (sterylne)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr obrazowy Tali</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10796</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25%&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25050014</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas zakrzywione (sterylne)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest najczęstszą przyczyną ślepoty u pacjentów w wieku >60 lat, dotykając ~30 milionów ludzi na całym świecie. AMD jest chorobą wieloczynnikową, na którą wpływają czynniki środowiskowe i genetyczne, które prowadzą do upośledzenia funkcji siatkówki z powodu zwyrodnienia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), a następnie degradacji fotoreceptorów. Idealne leczenie obejmowałoby przeszczepienie zdrowych komórek RPE wydzielających czynniki neuroprotekcyjne, aby zapobiec śmierci komórek RPE i zwyrodnieniu fotoreceptorów. Ze względu na podobieństwa funkcjonalne i genetyczne oraz możliwość mniej inwazyjnej biopsji, zaproponowano przeszczepienie komórek nabłonka barwnikowego tęczówki (IPE) jako substytut zdegenerowanego RPE. Wydzielanie czynników neuroprotekcyjnych przez małą liczbę komórek przeszczepionych podsiatkówkowo można osiągnąć za pomocą transfekcji >za pośrednictwem transpozonów Sleeping Beauty (SB100X) z genami kodującymi czynnik pochodzenia nabłonka barwnikowego (PEDF) i/lub czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF). Ustaliliśmy izolację, hodowlę i transfekcję za pośrednictwem SB100X komórek RPE i IPE różnych gatunków, w tym gryzoni, świń i bydła. Kule są eksplantowane, a rogówka i soczewka są usuwane, aby uzyskać dostęp do tęczówki i siatkówki. Za pomocą specjalnie wykonanej szpatułki komórki IPE są usuwane z izolowanej tęczówki. Aby zebrać komórki RPE, może być wymagana inkubacja trypsyny, w zależności od gatunku. Następnie, za pomocą szpatułki dostosowanej do RPE, komórki są zawieszane w podłożu. Po wysianiu komórki są monitorowane dwa razy w tygodniu, a po osiągnięciu konfluencji transfekowane za pomocą elektroporacji. Integracja, ekspresja, wydzielanie i funkcja genów zostały potwierdzone za pomocą qPCR, WB, ELISA, immunofluorescencji i testów funkcjonalnych. W zależności od gatunku można wyizolować 30 000-5 milionów (RPE) i 10 000-1,5 miliona (IPE) komórek na oko. Genetycznie zmodyfikowane komórki wykazują znaczną nadekspresję PEDF/GM-CSF ze zdolnością do zmniejszania stresu oksydacyjnego i oferują elastyczny system do analiz ex vivo i badań in vivo, który można przenieść na ludzi w celu opracowania metod terapii genowej oczu.

Izolacja PE z różnych gatunków ssaków 
Z zastosowaniem wyżej opisanych protokołów pomyślnie wyizolowano i hodowano komórki IPE i RPE z pięciu różnych gatunków. Liczba komórek uzyskanych w każdej procedurze zależy od gatunku i wielkości oka (Tabela 1). Jak pokazano na Rysunku 1, komórki wykazują typową morfologię i pigmentację komórek PE (z wyjątkiem przedstawionych komórek królika, pochodzących od albinotycznych królików nowozelandzkich białych (NZW)). W ...

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Protokół jest istotny, ponieważ pokazuje izolację i transfekcję komórek nabłonka barwnikowego od pięciu ssaków jako optymalny system do badania terapii genowej oka w różnych konfiguracjach. Główną zaletą tej metody jest jej elastyczność, przenośność, wysoka wydajność komórek, żywotność i szybkość transfekcji dzięki zastosowanym pięciu gatunkom i niewirusowemu systemowi transpozonów SB100X. Techniki te zostały opracowane w celu zbadania podejść terapii genowej ukierunkowanych na komórki nabłonka barwnikowego siatkówki i tęczówki, które są izolowane i transfekowane w niniejszym protokole, ale mogą być wykorzystywane do wszelkich badań ocznych.Procedurę zademonstruje Gregg Sealy, technik z laboratorium. Po eutanazji zwierzęcia użyj zakrzywionych nożyczek i kleszczy Colibri, aby wyłuszczyć oczy, a następnie oczyść pozostałą tkankę mięśniową i skórę z oczu. Zbierz oczy do 50-mililitrowej probówki wypełnionej niesterylnym PBS i przenieś probówkę do okapu z przepływem laminarnym.Zdezynfekuj je, zanurzając je w roztworze na bazie jodu na dwie minuty, a następnie przenieś oczy do 50-mililitrowej probówki wypełnionej sterylnym PBS. Połóż jedno oko na sterylnym kompresie z gazy i mocno trzymaj oko blisko nerwu wzrokowego. Następnie przetnij w pobliżu granicy tęczówki skalpelem numer 11.Za pomocą nożyczek przetnij wokół tęczówki i usuń przedni odcinek i umieść go na szalce Petriego, pozostawiając bańkę z ciałem szklistym, aż do wyizolowania nabłonka barwnikowego siatkówki lub komórek RPE. Aby wyizolować nabłonek barwnikowy tęczówki lub komórki IPE, usuń soczewkę cienkimi kleszczami i delikatnie wyciągnij tęczówkę zawierającą komórki IPE. Umieść tęczówkę na szalce Petriego i umyj ją sterylnym PBS.Dodaj 500 mikrolitrów 0,25% trypsyny i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń trypsynę, dodaj 500 mikrolitrów kompletnego podłoża i delikatnie zeskrob IPE płaską, wypolerowaną ogniowo pipetą Pasteura. Zbierz zawiesinę komórek i umieść ją w probówce o pojemności 1,5 mililitra.Policz komórki za pomocą komory Neubauera i zasiej 0,2 miliona komórek na studzienkę na 24-dołkowej płytce z jednym mililitrem kompletnego podłoża. Umieść płytkę w inkubatorze i hoduj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby wyizolować komórki RPE, usuń ciało szkliste i siatkówkę z tylnego segmentu za pomocą cienkich kleszczy.Umieść cebulki na płytce 24-dołkowej i dodaj 500 mikrolitrów 0,25% trypsyny na oko i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń trypsynę, dodaj 500 mikrolitrów kompletnej pożywki na kulę i delikatnie zeskrob komórki RPE zakrzywioną, wypolerowaną ogniowo pipetą Pasteura. Zbierz zawiesinę komórek i umieść ją w probówce o pojemności 1,5 mililitra.Policz komórki za pomocą komory Neubauera i zasiej komórki zgodnie z wcześniejszym opisem. Umieścić płytkę w inkubatorze. Oczyść pozostałą tkankę mięśniową i skórę z oczu i zdezynfekuj oczy w roztworze na bazie jodu i przepłucz je PBS.Aby wyizolować komórki IPE, zdejmij soczewkę i wyciągnij tęczówkę, jak opisano wcześniej. Po przygotowaniu dwóch tęczówek dodaj jeden mililitr kompletnego podłoża i wyizoluj komórki, drapiąc płaską, wypolerowaną ogniowo pipetą Pasteura, a następnie policz i zasiej komórki. Umieścić płytkę w inkubatorze.Aby wyizolować komórki RPE, usuń ciało szkliste i siatkówkę z tylnego segmentu i umieść bańkę na szalce Petriego. Napełnij bańkę jednym mililitrem kompletnego podłoża. Za pomocą zakrzywionej, wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura usuń komórki RPE.Zebrać zawiesinę komórek w bańce za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i przenieść ją do probówki o pojemności 1,5 mililitra w celu ponownego zamieszania. Następnie policz i wysiew komórki i inkubuj płytkę, jak pokazano wcześniej. Po oczyszczeniu otwórz oko i przetnij wokół tęczówki, aby usunąć przedni segment, a następnie umieść na szalce Petriego.Pozostaw bańkę z ciałem szklistym, aż komórki RPE zostaną odizolowane. Aby wyizolować komórki IPE, jeśli soczewka jest wyposażona w przedni segment, usuń soczewkę i użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie wyciągnąć tęczówkę zawierającą komórki IPE. Umieść tęczówkę na szalce Petriego i umyj ją sterylnym PBS.Przetnij ciało rzęskowe skalpelem numer 10. Po przygotowaniu tęczówek inkubuj je z dwoma mililitrami 0,25% trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Usuń trypsynę i dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki, a następnie odizoluj komórki, drapiąc płaską, wypolerowaną ogniowo pipetą Pasteura.Przenieść zawiesinę komórek do dwumililitrowej probówki i odwirować komórki przez 10 minut w temperaturze 120 razy G. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach kompletnego podłoża. Zasiej 0,32 miliona komórek na studzienkę na płytce sześciodołkowej w trzech mililitrach kompletnego podłoża. Umieść płytkę w inkubatorze i hoduj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Aby wyizolować komórki RPE, usuń ciało szkliste i siatkówkę z tylnego segmentu za pomocą kleszczy. Unikaj uszkodzenia nabłonka barwnikowego siatkówki. Umyj żarówkę za pomocą PBS.Po przygotowaniu obu oczu napełnij bańkę trypsyną w około trzech czwartych i inkubuj przez 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pokrywką szalki Petriego na wierzchu oczka bańki. Usuń trypsynę i dodaj jeden mililitr kompletnego podłoża. Za pomocą zakrzywionej, wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura usuń komórki RPE.Zbierz zawiesinę komórek w bańce i przenieś ją do 1,5 mililitrowej rurki w celu ponownego zawieszenia. Odwiruj komórki przez 10 minut przy 120-krotności G.Seed 0,32 miliona komórek na studzienkę na sześciodołkowej płytce w trzech mililitrach kompletnego podłoża. Umieść płytkę w inkubatorze i hoduj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnym inkubatorze. Po trzech do czterech dniach pipetuj w górę iw dół, aby zebrać nieprzylegające komórki i umieść połowę objętości w innym dołku. Napełnij studzienkę do jednego mililitra kompletnym podłożem.Po kolejnych trzech do czterech dniach powtórz pobieranie komórek, tym razem łącząc nieprzylegające komórki z dwóch studzienek w jedną. Dodaj pożywkę do wszystkich studzienek. Obserwuj komórki i zmieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu.Gdy komórki osiągną konfluencję, przełącz się na kompletną pożywkę z 1% FBS. Korzystając z wyżej wymienionych protokołów, udało się wyizolować i wyhodować komórki IPE i RPE z pięciu różnych gatunków. Wzorzec ekspresji RPE został potwierdzony w pierwotnych bydlęcych komórkach IPE za pomocą immunofluorescencji dla RPE65.Żywotność komórek badano w celu wykluczenia potencjalnej toksyczności buforu elektroporacyjnego przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do oznaczania cytotoksyczności i elektroporowanej kontroli węzłów. Nie zaobserwowano wpływu na żywotność komórek. Wyhodowane komórki nabłonka barwnikowego różnych gatunków transfekowano żółtym fluorescencyjnym białkiem Wenus.Jako kontrolę pozytywną zastosowano transfekowane komórki RPE19. Kwantyfikacja skuteczności transfekcji w prekulturowanych świniach RPE przedstawiono tutaj. Świeżo wyizolowane komórki nabłonka barwnikowego królika transfekowano żółtym fluorescencyjnym białkiem Venus i monitorowano za pomocą mikroskopii.Komórki nabłonka barwnikowego transfekowano czynnikiem pochodzącym z nabłonka barwnikowego, a wydzielanie białek monitorowano za pomocą Western blot. Sygnał dla komórek transfekowanych był wyższy w porównaniu z komórkami nietransfekowanymi dla wszystkich badanych gatunków i dni, a w tym czasie nie zaobserwowano spadku wydzielania białka. Bardzo ważne jest, aby unikać skrobania komórek ostrymi narzędziami.Tutaj stosuje się polerowane ogniowo pipety Pasteura, z wyjątkiem małych oczu myszy, gdzie należy użyć okrągłego skalpela. Komórki nabłonka barwnikowego mogą być wykorzystywane do opracowywania metod terapii genowej i symulowania stanów patologicznych, na przykład uszkodzeń spowodowanych stresem oksydacyjnym. Modele te mogą być również wykorzystywane do testowania leków terapeutycznych.

isolation-culture-genetic-engineering-mammalian-primary-pigment

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokazujemy procedurę pozyskiwania komórek nabłonka pigmentowego oka od modelu królika. Komórki są pomocne w opracowywaniu strategii terapeutycznych w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki.

Izolowanie komórek IPE i RPE: technika pozyskiwania komórek nabłonka pigmentowego oka z oka królika

W tym filmie opisujemy technikę izolowania komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki z oczu świń w celu uzyskania ich pierwotnych kultur do badań in vivo i ex vivo. Te komórki pigmentowe mogą być genetycznie modyfikowane w celu zbadania metod regeneracyjnych w leczeniu chorób oczu.

Izolacja komórek IPE i RPE: technika uzyskiwania pigmentowanych komórek nabłonkowych z izolowanego oka świni

Ten film pokazuje procedurę izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i komórek nabłonka barwnika tęczówki (IPE) z pobranych oczu bydła. Wyizolowane komórki można hodować w celu zbadania ich roli w leczeniu chorób oczu.

Izolowanie komórek RPE i IPE z oka bydła: procedura zbierania i hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego bydła

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Opracowaliśmy protokół transfekcji pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka barwnikowego za pomocą elektroporacji za pomocą genu kodującego czynnik pochodzenia pigmentu (PEDF) za pomocą systemu transpozonów Śpiącej Królewny (SB). Udaną transfekcję wykazano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), immunoblottingu i testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Oparta na elektroporacji modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich komórek nabłonka barwnikowego przy użyciu systemu transpozonów Sleeping Beauty

Ten manuskrypt opisuje uproszczony protokół stopniowej izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z oczu myszy. Protokół obejmuje wyłuszczenie i sekcję oczu myszy, a następnie izolację, wysiew i hodowlę komórek RPE.

Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy

Tutaj prezentowana jest łatwa do naśladowania metoda hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świni in vitro.

Pierwotna hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń

Opisujemy prostą i skuteczną metodę izolowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od oczu młodych pigmentowanych świnek morskich. Procedura ta pozwala na dalsze badania biologii molekularnej wyizolowanego RPE, w tym analizy ekspresji genów.

Izolacja komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z oczu świnki morskiej

Ten protokół opisuje procedurę pozyskiwania i hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z lokalnie pozyskiwanych oczu świń. Komórki te służą jako wysokiej jakości alternatywa dla komórek macierzystych i nadają się do badań siatkówki in vitro.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń do modelowania in vitro

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Poznaj izolację i transfekcję pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego tęczówki i siatkówki z pięciu gatunków ssaków przy użyciu niewirusowego systemu transposonu SB100X. Ta metoda umożliwia badania terapii genowej w okulistyce z wysoką żywotnością komórek.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Przeglądaj więcej filmów