Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Protokół ten wspiera scharakteryzowanie roli genów komarów zaangażowanych w różne szlaki fizjologiczne, w tym na przykład w oporność owadów i rozwój pasożytów malarii. Metoda ta napędza insercję transgenu do pojedynczych, wstępnie scharakteryzowanych lokalizacji genomu, a zatem pozwala na bezpośrednie porównywanie fenotypów wynikających z alternatywnych transgenów, skutecznie unikając problemu efektu pozycyjnego. Metoda ta może być stosowana do różnych gatunków owadów o znaczeniu dla zdrowia publicznego i rolnictwa, a jej zastosowania rozciągają się od bakterii po komórki ssaków.

Zacznij od zaprojektowania plazmidów dawcy attB przenoszących dominujący marker fluorescencyjny, miejsca rekombinacji attB i pożądany ładunek transgenu. Użyj pojedynczego miejsca attB do integracji całego plazmidu przenoszącego transgeniczną kasetę lub dwóch odwróconych miejsc attB do wymiany kasety. Oczyść plazmidy dawcy i pomocnika za pomocą zestawu do oczyszczania bez endotoksyn.

Połączyć plazmid dawcy znakowany attB przenoszący interesujący nas transgen i plazmid pomocniczy przenoszący integrazę, aby uzyskać mieszaninę o końcowym stężeniu 350 nanogramów na mikrolitr plazmidu dawcy i 150 nanogramów na mikrolitr plazmidu pomocniczego. Wytrącić DNA, dodając 0,1 objętości trzech molowych octanów sodu i 2,5 objętości lodowatego 100% etanolu, a następnie wirować. Biały osad powinien być natychmiast widoczny.

Przepłukać osad i ponownie zawiesić go w buforze do wstrzykiwań, aby osiągnąć całkowite stężenie końcowe 500 nanogramów na mikrolitr. Następnie przygotuj porcje po 10-15 mikrolitrów każdy i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Krew karmi cztero- do siedmiodniowych komarów z pożądanej linii dokowania i ich dzikich odpowiedników na 72 godziny przed mikrowstrzyknięciem.

Wykonaj mikroiniekcje zarodków Anopheles gambiae w 25-milimolowym chlorku sodu, kierując się na tylny biegun zarodka pod kątem 45 stopni. Wykonaj mikroiniekcje zarodków Anopheles stephensi w oleju halowęglowym, kierując się w tylny biegun pod kątem 30 stopni. Natychmiast po wstrzyknięciu przenieść jaja na szalkę Petriego wypełnioną sterylną wodą destylowaną i przywrócić je do warunków owadobójczych.

Po wykluciu należy codziennie przenosić larwy G0 do tacy z osoloną wodą destylowaną i z powrotem do poczwarek. Sortuj poczwarki G0 według płci pod stereoskopem. Pozwól samcom wyłonić się w oddzielnych klatkach w grupach od trzech do pięciu i dodaj dziesięciokrotny nadmiar samic typu dzikiego w tym samym wieku.

Pozwól samicom wyłonić się w oddzielnych klatkach w grupach od 10 do 15 sztuk i dodaj równą liczbę samców typu dzikiego w tym samym wieku. Pozwól dorosłym łączyć się w pary przez cztery do pięciu dni i zapewnij samicom posiłek z krwi. Zbierz jaja i wychowaj pojawiające się G1 nowej generacji.

Zebrać larwy G1, L3 i L4 na szalce Petriego wyłożonej mokrą bibułą filtracyjną lub na szkiełku mikroskopowym i przesiać je za pomocą stereoskopu fluorescencyjnego na obecność markera wprowadzonego wraz z ładunkiem oznaczonym attB. W przypadku wzorów z pojedynczym attB należy sprawdzić obecność nowego i istniejącego wcześniej znacznika. W przypadku projektów z podwójnym attB do wymiany kasety, ekran pod kątem obecności nowego znacznika i utraty istniejącego wcześniejszego.

Sortuj przekształcone poczwarki G1 według płci i krzyżuj je masowo z osobnikami dzikiej płci przeciwnej płci w tym samym wieku. Pozwól dorosłym łączyć się w pary przez cztery do pięciu dni i zapewnij posiłek z krwi. W przypadku eksperymentów z pojedynczą integracją zbieraj jaja bezpośrednio z krzyżówki en masse.

W przypadku eksperymentów z wymianą kasetową należy zebrać jaja od pojedynczych samic i utrzymać potomstwo oddzielnie do czasu zakończenia oceny molekularnej ze względu na potencjalną obecność dwóch alternatywnych orientacji kaset. Przebadaj potomstwo G2 pod kątem obecności markera fluorescencyjnego i odłóż na bok podzbiór osobników z dodatnim wynikiem G2 do analizy molekularnej. Resztę wychowaj do dorosłości.

Przeprowadzić walidację molekularną miejsc insercji za pomocą PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. W przypadku pojedynczej integracji upewnij się, że przewidywane miejsce insercji zawiera oryginalną konstrukcję dokującą oraz całą sekwencję plazmidu dawcy między dwoma miejscami hybrydowymi attL i attR. W przypadku wymiany kasety upewnij się, że przewidywane miejsce włożenia jest identyczne z miejscem linii dokowania, w której hybrydowe odwrócone miejsca attL zastępują oryginalne odwrócone miejsca attP, a szablon wymiany zastępuje kasetę pierwotnie znajdującą się między nimi.

Protokół wykorzystano do wygenerowania stabilnej linii transgenicznej Anopheles w ciągu około 10 tygodni. Walidację fenotypową transformacji przeprowadzono poprzez badanie przesiewowe pod kątem markerów fluorescencyjnych regulowanych przez promotor 3xP3, pokazano tutaj. Nowa linia Anopheles stephensi została uzyskana przez włożenie kasety DS oznaczonej na czerwono do linii dokującej oznaczonej CFP, co spowodowało ekspresję potomstwa G1 obu markerów, na co wskazuje czerwona i niebieska fluorescencja w oczach.

Projekty wymiany kaset skutkują wymianą markera pierwotnie włożonego do linii dokującej na marker plazmidu dawcy. Ta wymiana markerów została zademonstrowana na linii dokującej Anopheles gambiae, gdzie znacznik CFP został utracony, a marker YFP nabyty, co spowodowało fluorescencję żółtego oka i rdzenia nerwowego. Czasami RMCE może skutkować pojedynczym zdarzeniem integracyjnym zamiast wymiany pożądanej kasety transgenicznej, w której larwa jest oznaczana zarówno oryginalnymi znacznikami CFP, jak i nowymi markerami YFP.

Podczas badań przesiewowych na obecność markera fluorescencyjnego ważne jest, aby odróżnić jego sygnał od możliwej autofluorescencji tła. Zwiększenie powiększenia i skupienie się na tkankach i narządach, w których oczekuje się, że fluorescencja będzie napędzana przez promotor, jest konieczne do identyfikacji osób z prawdziwym dodatnim CFP. Poszczególne transformanty oceniano również molekularnie za pomocą PCR, aby potwierdzić oczekiwane miejsce insercji.

Walidacja PCR u osób z linii wymiany Anopheles gambiae jest pokazana tutaj. Nawet odpowiednia technika mikroiniekcji, dokładne zaprojektowanie i przygotowanie plazmidów dawcy i plazmidu pomocniczego, a także przestrzeganie odpowiedniego schematu hodowli komarów są kluczowe dla uzyskania osobników transgenicznych. Procedura ta może być stosowana do wprowadzania elementów powodujących nadekspresję lub wyciszanie genów, na przykład systemu GAL4/UAS, a także elementów napędu genowego i cząsteczek przeciwpatogennych do genetycznej kontroli komarów.