Name: Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Naucz się ukierunkowanej integracji φC31 w komórkach Anopheles do modyfikacji genomu i wymiany kaset transgenicznych. Ta metoda umożliwia badanie genów odpowiedzialnych za odporność na malarię.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Kionie Parker (UCI) za dostarczenie zdjęć transgenicznych larw An. stephensi, oraz Fraserowi Colmanowi (LSTM) i Beth Poulton (LSTM) za dostarczenie transgenicznych larw An. gambiae. Beth Poulton (LSTM) również udzieliła cennej pomocy podczas obrazowania larw An. gambiae. Praca ta została sfinansowana przez Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) oraz LSTM's Director Catalyst Fund, przyznany AA (DCF2014AA). A.A.J. jest profesorem Donalda Brena na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dokładna konstrukcja plazmidów znakowanych attB, które są kompatybilne z wybraną linią dokowania, ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Należy zwrócić szczególną uwagę na wybór znacznika używanego do przesiewania transformantów, w tym barwę fluorescencji i jej wzór wyrazu, który będzie podlegał wzorowi już obecnemu w linii dokowania. Konieczne jest stosowanie markerów fluorescencyjnych, które są łatwe do odróżnienia: dobre kombinacje znaczników obejmują RFP (czerwony)/CFP (cyjan), RFP (czerwony)/GFP (zielony), RFP (czerwony)/YFP (żółty) i YFP (żółty)/CFP (cyjan), podczas gdy kombinacje, których należy unikać, to YFP (żółty)/GFP (zielony) i CFP (cyjan)/GFP (zielony). Promotor 3xP3 39, specyficzny dla oczu i rdzenia nerwowego, jest najczęściej stosowany do kierowania ekspresją markerów fluorescencyjnych transgenezy komarów. Rzeczywiście, wszystkie obecnie dostępne linie dokujące Anopheles wykorzystują ten promotor. Alternatywnymi regionami regulatorowymi są gen poliubikwityny An. gambiae (PUBc)5 lub promotor wirusa IE120, które napędzają ekspresję w wielu tkankach. W przypadku stosowania razem z 3xP3, promotory te rozszerzyłyby możliwe kombinacje kolorów, a nawet użycie tego samego fluoroforu. Wskazane promotory są aktywne przez cały cykl życiowy komara, umożliwiając badania przesiewowe i monitorowanie fluorescencji na wszystkich etapach życia. Dodatkową kwestią braną pod uwagę podczas projektowania plazmidu jest rozmiar ładunku, który ma być zintegrowany lub wymieniony. Chociaż układ φC31 ma niezwykłą nośność18, należy wziąć pod uwagę, że rozmiar plazmidu dawcy na ogół koreluje ujemnie ze wydajnością transformacji22.
W opisanym protokole źródłem integrazy jest plazmid pomocniczy wykazujący wszechobecną ekspresję enzymu40. Wszechobecna obecność integrazy może prowadzić do transformacji komórek somatycznych, jeśli mikroiniekcje nie są precyzyjnie skierowane w miejsce, w którym tworzy się linia zarodkowa. Chociaż takie zdarzenia transformacji zostaną utracone, ponieważ nie są dziedziczne, efekty somatyczne mogą zmniejszyć sprawność osób, którym wstrzyknięto zastrzyk. Aby tego uniknąć i zwiększyć wydajność transformacji, ekspresję integrazy można ograniczyć do linii zarodkowej, na przykład za pomocą promotora vasa 22,26. Inne protokoły opisują użycie transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA (mRNA) jako źródła integrazy φC31 19,24,43. Wiąże się to jednak z pracochłonnym przygotowaniem mRNA i wymaga ostrożnego obchodzenia się z mieszanką iniekcyjną oraz stosowania odczynników wolnych od RNaz, aby uniknąć degradacji. Wykazano, że plazmidowe źródła integrazy zarówno w An. gambiae 9,21,22,26,33,37, jak i An. stephensi (osobista komunikacja AA) są niezawodne i prowadzą do efektywnej transformacji, a zatem są naszą preferowaną opcją. Kolejną opcją dostarczania integrazy jest jej produkcja in vivo w samodokujących liniach pomocniczych. Takie linie zostały stworzone w An. gambiae, które wyrażają integrazę φC31 pod regulacją nanos promotora specyficznego dla linii zarodkowej i stwierdzono, że prowadzą do poprawy wydajności przeżycia i transformacji20. Należy jednak wziąć pod uwagę potencjalne obciążenia kondycyjne wynikające z produkcji enzymu integrazy in vivo na linii pomocniczej.
Podobnie jak w przypadku innych technik transgenicznych, szczególną uwagę należy zachować przy hodowli i krzyżowaniu osobników pochodzących z wstrzykniętych zarodków, aby zmaksymalizować szanse na odzyskanie transformantów. Osoby, które stabilnie odziedziczyły transgen, mogą być najpierw odzyskane u potomstwa G1. Jednak wczesne oznaki potencjalnej transformacji można ocenić na podstawie obecności przejściowej episomalnej ekspresji markera fluorescencyjnego w brodawkach odbytu i/lub rdzeniu nerwowym larw G0 pierwszego i drugiego stadium rozwojowego podczas stosowania promotora 3xP3 43. Chociaż obecność przejściowej fluorescencji sugeruje pomyślne dostarczenie plazmidu, nie gwarantuje dziedzicznej transformacji linii zarodkowej. Podobnie, brak wyrażenia przejściowego nie wyklucza udanej transformacji. Niemniej jednak zaobserwowano, że osoby przejściowo dodatnie mają większe szanse na wydanie transgenicznego potomstwa w porównaniu z osobnikami przejściowo ujemnymi43,48. W rękach ekspertów hodowla i krzyżowanie tylko pozytywnych osobników może być opcją na zmniejszenie liczby komarów. Jednak biorąc pod uwagę znaczenie i kruchość małych larw G0, nadal zaleca się najmniejszą ilość manipulacji i zawsze zaleca się hodowlę wszystkich osobników G0.
Schemat krycia opisany w tym protokole ma na celu maksymalizację szansy na krycie i odizolowanie niezależnych zdarzeń transformacji. Jeśli jednak problemem jest przestrzeń dla owadów lub dostępność personelu, dorosłe osobniki G0 można gromadzić według płci w pojedynczych klatkach, jeśli zapewniona jest wystarczająca liczba osobników płci przeciwnej. Taki układ nie pozwoli na rozróżnienie między wieloma zdarzeniami transformacji występującymi u osób z tej samej klatki. W zależności od konfiguracji doświadczalnej, podczas procesu przesiewowego spodziewana jest obecność markera podwójnego (pojedyncza całkacja) lub pojedynczego (RMCE). W eksperymentach z pojedynczą integracją ważne jest zweryfikowanie obecności oryginalnego znacznika z linii dokowania, natomiast w RMCE ważne jest zweryfikowanie utraty wcześniej zintegrowanego znacznika. Rzeczywiście, nierzadko w projektach RMCE dochodzi do odzysku transformantów, w których nastąpiła pojedyncza integracja zamiast wymiany w wyniku rekombinacji pojedynczego miejsca attP 9,33. U takich osób obecne są oba markery fluorescencyjne, a także cały szkielet plazmidu dawcy, co podkreśla znaczenie przeprowadzenia dokładnych badań przesiewowych pod kątem obu markerów fluorescencyjnych.
Podczas gdy obecność oczekiwanych wzorców fluorescencyjnych wskazuje na pomyślną transformację, należy podjąć charakterystykę molekularną miejsca insercji. W tym celu przygotowanie dokładnych map przewidywanego locus insercji, w tym bocznych regionów genomowych linii dokowania, ma kluczowe znaczenie dla zaprojektowania odpowiednich diagnostycznych starterów oligonukleotydowych do analiz amplifikacji genów. Pojedyncze zdarzenia integracyjne skutkują powstawaniem miejsc hybrydowych attR i attL na styku nowo zintegrowanego DNA i wcześniej wstawionej kasety. Te witryny mogą być przeznaczone do walidacji witryny wstawiania. W projektach RMCE wprowadzenie kasety dawcy może nastąpić w dwóch alternatywnych orientacjach w odniesieniu do locus genomu, dzięki czemu cztery startery mogą być użyte w alternatywnych kombinacjach PCR w celu wykrycia, jaką orientację przenosi linia. Ponieważ orientacja insercji kasety może wpływać na ekspresję transgenu, w porównawczej analizie ekspresji genów ważne jest, aby używać linii o tej samej orientacji insercji.
Podczas pracy z małą liczbą transformantów poświęcanie całych osobników do analizy molekularnej może nie być pożądane. Opcją jest przeprowadzenie analizy molekularnej DNA wyekstrahowanego z nóg pojedynczej osoby dorosłej46 , ponieważ utrata nóg nie wpływa na zdolność dorosłej samicy do kojarzenia się i składania jaj49. Istnieje jednak ryzyko uszkodzenia osoby w procesie usuwania nogi. Sukces osiągnięto przy użyciu odrzuconych przypadków poczwarek (komunikacja osobista L. Grigoraki), jednak najbezpieczniejszym podejściem jest przeprowadzenie analizy molekularnej na rodzicach G2 po uzyskaniu zdolnego do życia potomstwa G3 .
W ostatnich latach CRISPR/Cas9 zrewolucjonizował sposób wykonywania edycji genomu specyficznego dla danego miejsca 26,41,50,51. W przeciwieństwie do RMCE kierowanego na miejsce, integracje genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 (knock-in) są niezależne od obecności wstępnie wstawionych miejsc rekombinacji, a wymagane jest tylko jednoetapowe zdarzenie transformacji. Niemniej jednak system CRISPR/Cas9 opiera się na obecności dużych znanych sekwencji genomowych otaczających pożądane miejsce insercji w celu skutecznej naprawy kierowanej homologią, a także na skutecznym rozpoznawaniu miejsc za pośrednictwem przewodnikowych RNA. Warunki te nie zawsze mogą być spełnione lub mogą być pracochłonne do rozwiązania, a biorąc pod uwagę dostępność wielu linii dokujących w An. gambiae i An. stephensi oraz linii pochodzących z nich, system φC31 pozostaje bardzo cennym narzędziem do przeprowadzania bezpośrednich porównań fenotypowych między transgenami w tych samych lokalizacjach genomowych.

Zdolność do niezawodnej i powtarzalnej modyfikacji genomu komarów będących wektorami chorób wzmocniła walidację funkcjonalną genów in vivo i otworzyła drogę do możliwych do zrealizowania strategii genetycznej kontroli wektorów, takich jak te skierowane przeciwko komarom z rodzaju Anopheles, które przenoszą malarię1.
Wczesne edytowanie genomu komarów opierało się wyłącznie na transformacji za pośrednictwem elementów transpozycyjnych (TE), przy czym piggyBac był najczęściej stosowanym transposonem u Anopheles2,3,4. Jednakże losowy charakter integracji TE może prowadzić do niepożądanych modyfikacji, takich jak nokauty genów (mutogeneza insercyjna) oraz znaczące efekty pozycji wpływające na ekspresję transgenu5,6,7,8. Przy użyciu piggyBac często występują również wielokrotne insercje5,9, co sprawia, że walidacja i izolacja linii transgenicznych z pojedynczymi insercjami są pracochłonne. Inne wady obejmują ich potencjalną remobilizację, zaobserwowaną w linii zarodkowej Anopheles stephensi po dostarczeniu źródła transpozazy piggyBac10,11,12, a także ograniczoną wielkość ładunku DNA (długość 10-15 kb), przy czym wydajność transformacji spada wraz ze wzrostem wielkości plazmidu donora13,14.
W celu rozwiązania tych problemów wprowadzono metody integracji celowanej. Najczęstsza modyfikacja genomu celowana u komarów jest oparta na systemie φC31 (Rycina 1a). Proces ten jest napędzany przez viralną integrazę, która katalizuje rekombinację między dwoma heterospecyficznymi miejscami przyłączenia (att) występującymi naturalnie w genomie bakteriofaga φC31 (attP) oraz w organizmie gospodarza, bakterii z rodzaju Streptomyces (attB)15. Rekombinacja tych dwóch miejsc jest jednokierunkowa i prowadzi do powstania miejsc hybrydowych (attL oraz attR). Rekombinacja takich miejsc hybrydowych (prowadząca do wycięcia DNA) wymagałaby nie tylko obecności aktywnej integrazu viralnej, ale także innego czynnika rekombinacyjnego kodowanego przez faga16,17. W ten sposób generowane jest stabilne miejsce integracji, co eliminuje problem potencjalnej, niepożądanej remobilizacji15. Ponadto system ten umożliwia integrację dużych ładunków (np. zgłoszono integrację konstruktów o wielkości &gt;100 kb u D. melanogaster18), co znacząco zwiększa pojemność przenoszenia. Integracja zachodzi w pojedynczym, zdefiniowanym locus genomicznym, co znacznie upraszcza walidację insercji oraz schemat krzyżowania w celu uzyskania stabilnej linii transgenicznej. Wreszcie, celowany charakter integracji pozwala na normalizację ekspresji, ponieważ alternatywne transgeny znajdują się w tym samym locus i są zatem regulowane w tym samym sąsiednim kontekście genomicznym. Rzeczywiście, jednym z głównych zastosowań tej techniki jest bezpośrednie porównanie fenotypów nadawanych przez różne transgeny po ich insercji do identycznego locus.
Osiągnięcie integracji pośredniczonej przez φC31 składa się z dwóch faz: faza I to tworzenie transgenicznych linii dokujących zawierających miejsce(a) attP, a faza II to ukierunkowana integracja ładunku flankowanego przez attB w genomie linii dokującej19. Tworzenie linii dokujących w fazie I opierało się na losowej integracji konstruktów z tagiem attP pośredniczonej przez TE, co wiązało się z początkowym, żmudnym procesem (obejmującym analizy southern blot i odwrotny PCR u potomstwa pojedynczych samic) w celu wyizolowania i walidacji linii transgenicznych z pojedynczym zdarzeniem integracji w unikalnych, transkrypcyjnie aktywnych i neutralnych pod względem kondycji genomowych lokalizacjach. Niemniej jednak, kilka linii dokujących do pojedynczej integracji pośredniczonej przez φC31 zostało opracowanych i zwalidowanych u An. gambiae19,20,21,22 oraz u An. stephensi23,24,25 (Tabela 1). Każda z tych linii różni się lokalizacją miejsca dokowania w genomie oraz specyficznym dla szczepu tłem genetycznym, a na ich podstawie można stworzyć ogromną różnorodność nowych linii transgenicznych. Złożoną walidację integracji pośredniczonych przez TE w celu wytworzenia linii dokujących można obecnie pominąć dzięki technologii CRISPR/Cas926; wymaga to jednak a priori wiedzy o neutralnych locus, które mają być celem, oraz o ich sekwencjach otaczających.
φC31-pośrednia integracja była szeroko stosowana w edycji genomów owadów, od organizmu modelowego D. melanogaster27, przez komary Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 i An. stephensi24, aż po inne owady, w tym Ceratitis capitata30 i Bombyx mori31.
Ograniczeniem integracji zapośredniczonej przez φC31, szczególnie w kontekście potencjalnych uwolnień do środowiska w celu kontroli wektorów, jest integracja w genomie komara całego plazmidu donora zawierającego attB, w tym niepożądanych sekwencji, takich jak markery genów oporności na antybiotyki i elementy szkieletu plazmidu pochodzenia bakteryjnego. Aby temu zaradzić, wdrożono modyfikację standardowego systemu – wymianę kasety zapośredniczoną przez rekombinazę (RMCE), która umożliwia precyzyjne zastąpienie wcześniej zintegrowanej kasety transgenicznej nowym DNA donora (Rysunek 1b). Osiąga się to poprzez zastosowanie dwóch odwróconych miejsc att flankujących kasety donora i biorcy na każdym końcu, co prowadzi do jednoczesnego zajścia dwóch niezależnych zdarzeń rekombinacji, skutkując wymianą kasety bez integracji szkieletu plazmidu. Ta ulepszona konstrukcja zapobiega integracji niepożądanych sekwencji i rozszerza zastosowanie systemów φC31, umożliwiając na przykład integrację nieoznaczonych ładunków DNA poprzez przesiewanie w kierunku utraty wcześniej zintegrowanego markera fluorescencyjnego32.
RMCE osiągnięto po raz pierwszy u D. melanogaster32, a następnie z sukcesem zastosowano u owadów niebędących organizmami modelowymi, w tym u An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 oraz B. mori35. W przypadku An. gambiae opracowano i zwalidowano kilka linii dokujących dla RMCE (Tabela 15,9,26). Z naszej wiedzy wynika, że RMCE nie zostało jeszcze zbadane u innych gatunków wektorów z rodzaju Anopheles.
Do tej pory system φC31 był szeroko stosowany u komarów z rodzaju Anopheles w celu wprowadzenia i badania różnych cząsteczek, w tym efektorów przeciwmalarycznych19,24,36, komponentów systemu GAL4/UAS do nadekspresji i wyciszania genów w badaniach nad odpornością na insektycydy9,33, elementów regulacyjnych, genów reporterowych5,21,37 oraz elementów napędu genowego (gene-drive)26,38.
Niniejszy protokół opisuje sposób przeprowadzenia 1) celowanej integracji ładunku flankowanego sekwencjami attB oraz 2) RMCE konstruktu flankowanego odwróconymi sekwencjami attB do genomu linii dockingowych Anopheles. Jest to osiągane przy użyciu dwóch plazmidów: plazmidu donora z tagiem attB niosącego interesujący transgen oraz plazmidu pomocniczego wykazującego ekspresję integrazji φC31. Główne wektory malarii An. gambiae oraz An. stephensi zostały wykorzystane jako konkretne przykłady, jednak protokoły te mają zastosowanie również do innych gatunków Anopheles.
<img alt="Integracja φC31, formuła attP-attB, schemat przedstawiający proces integracji plazmidu w modyfikacji genetycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Modyfikacje genomu ukierunkowane na konkretne miejsce, pojedyncza integracja oraz wymiana kasety pośredniczona przez rekombinazę (RMCE) z wykorzystaniem systemu φC31. Integraza φC31 (INT, szara podwójna strzałka) katalizuje rekombinację między miejscami attB (fioletowe paski) obecnymi w plazmidzie donora a miejscami attP (niebieskie paski) obecnymi w linii odbiorczej (docking line), co prowadzi do powstania hybrydowych miejsc attL i attR. A) Integracja zachodzi, gdy pojedyncze miejsca attB i attP ulegają rekombinacji, co skutkuje obecnością dwóch zintegrowanych markerów (niebieskiego i czerwonego). B) RMCE zachodzi, gdy dwa miejsca attB/P rekombinują jednocześnie, co prowadzi do zastąpienia kasety znajdującej się między miejscami att linii odbiorczej (niebieski marker) kasetą niesioną przez plazmid donora (czerwony marker). C) Częściowe sekwencje nukleotydowe attP (niebieskie), attB (fioletowe) oraz hybrydowych miejsc attL/R. Rekombinacja zachodzi pomiędzy rdzeniowymi sekwencjami „TT” zaznaczonymi pogrubionym czarnym kolorem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Probówki eppendorfa</td><td></td><td></td><td></td>1,5 ml</tr><tr><td>8-dołkowe mikroszkiełka</td><td>VWR</td><td>MARI1216690</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Zestaw chusteczek</td><td>higienicznych Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree&nbsp; Plazmid&nbsp; Maxi&nbsp; Zestaw (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absolutny, klasa</td><td></td><td></td><td></td>biologii molekularnej</tr><tr><td>Zestaw filtrów CFP do Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm</td><td>Leica</td><td>10446363</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów dsRED do Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm</td><td>Zestaw</td><td></td> filtrów 10447079 <td></td></tr><tr><td>Leica dostosowany do Leica MZ FLIII</td><td>Omega Optical</td><td>500QM25, 500QM35</td><td></td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 27</td><td>Sigma</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Szalki</td><td></td><td></td><td></td>Petriego</tr><tr><td>Potas&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td>chlorek</tr><tr><td>Chlorek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodu Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sód&nbsp; Octan&nbsp; Roztwór (3 M),&nbsp; pH&nbsp; 5.2</td><td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td><td>R1181</td><td></td></tr><tr><td>Stabilna szczotka Rozmiar 0</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φc31 i wymiana kaset w wektorach anopheles malarii

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Funkcjonalna analiza genomiczna i związane z nią strategie genetycznej kontroli malarii opierają się na sprawdzonych i powtarzalnych metodach dokładnej modyfikacji genomu komarów Anopheles. Wśród tych metod, system φC31 umożliwia precyzyjną i stabilną integrację transgenów ukierunkowaną na miejsce lub substytucję zintegrowanych kaset transgenicznych poprzez wymianę kasetową za pośrednictwem rekombinazy (RMCE). Metoda ta opiera się na działaniu integrazy bakteriofagowej Streptomyces φC31 w celu katalizowania rekombinacji między dwoma specyficznymi miejscami przyłączenia oznaczonymi jako attP (pochodzące z faga) i attB (pochodzące od bakterii gospodarza). System wykorzystuje jedno lub dwa miejsca attP, które zostały wcześniej zintegrowane z genomem komara i miejscem (miejscami) attB w DNA dawcy dawcy. Tutaj pokazujemy, jak stabilnie modyfikować genom linii dokujących Anopheles zawierających attP za pomocą dwóch plazmidów: dawcy znakowanego attB przenoszącego szablon integracji lub wymiany oraz plazmidu pomocniczego kodującego integrazę φC31. Podajemy dwa reprezentatywne wyniki modyfikacji ukierunkowanej na miejsce za pośrednictwem φC31: pojedyncza integracja transgenicznej kasety w An. stephensi i RMCE w An. komary gambiae. Manipulacja genomem za pośrednictwem φC31 oferuje przewagę w postaci powtarzalnej ekspresji transgenu z zwalidowanych, neutralnych pod względem dopasowania miejsc genomowych, umożliwiając porównawcze analizy jakościowe i ilościowe fenotypów. Ukierunkowany na miejsce charakter integracji znacznie upraszcza również walidację pojedynczego miejsca insercji i schematu kojarzenia w celu uzyskania stabilnej linii transgenicznej. Te i inne cechy sprawiają, że system φC31 jest niezbędnym składnikiem genetycznego zestawu narzędzi do transgenicznej manipulacji malarią, komarami i innymi wektorami owadów.

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia wytworzenie stabilnej linii transgenicznej Anopheles w ciągu ok. 10 tygodni (przy założeniu 21-dniowego cyklu życiowego komarów).
Oczekuje się, że wskaźniki wykluwania się larw po iniekcji u An. gambiae są zazwyczaj niższe niż u An. stephensi, jednak zgłaszano wskaźniki wykluwania na poziomie 10-50%9,20,24,26,33,43,47. Przy zastosowaniu odpowiedniej techniki iniekcji wskaźniki wykluwania ≥20% są zazwyczaj wystarczające do uzyskania transformantów. Pobór DNA przez embriony można ocenić poprzez przesiewowe badanie młodych larw pod kątem przejściowej ekspresji markera fluorescencyjnego. W udanych eksperymentach RMCE u An. gambiae z wykorzystaniem promotora 3xP3 do 50% przeżywających larw G0 wykazywało episomalną ekspresję markera w brodawkach odbytu48.
Uogólnione szacunki wydajności transformacji są trudne do oceny pomiędzy laboratoriami, a nawet pomiędzy poszczególnymi eksperymentami, ponieważ transformacja zależy od złożonej interakcji wielu zmiennych, w tym czystości, stężenia, wielkości i potencjalnej toksyczności wstrzykiwanego DNA, jakości jaj, obchodzenia się z jajami przed i po iniekcji, hodowli komarów, a przede wszystkim doświadczenia operatora. W przypadku RMCE u An. gambiae uzyskano wskaźniki transformacji do 7% (obliczone jako liczba niezależnych zdarzeń transformacji w całkowitej liczbie osobników G0)9,26,33, natomiast dla integracji u An. stephensi wskaźnik transformacji wyniósł do 2,2%. Sugerujemy iniekcję co najmniej 500 embrionów, co powinno prowadzić do wyklucia co najmniej 100 larw G0 oraz do uzyskania 2-7 dorosłych osobników założycielskich G0, z których można pozyskać stabilnie transformowane potomstwo. W przypadku przesiewania pod kątem ekspresji przejściowej w larwach G0 można spodziewać się do 40 larw pozytywnych.
Przykłady walidacji fenotypowej transformacji poprzez przesiewanie markerów fluorescencyjnych regulowanych przez 3xP3 doniesiono o obecności promotorów w Rysunek 4 i Rysunek 5. Rysunek 4 pokazuje nową *An. stephensi* linia uzyskana poprzez insercję kasety znakowanej białkiem DsRed do linii dokującej znakowanej CFP (80,9, Tabela 1), co skutkuje G1 potomstwo wykazujące ekspresję obu markerów, o czym świadczy czerwona i niebieska fluorescencja wykryta w oczach.
Oczekuje się, że projekty RMCE doprowadzą do zastąpienia markera pierwotnie wprowadzonego do linii dokującej markerem z plazmidu donora. Rysunek 5A oraz Rysunek B ilustrują tę wymianę markerów w linii dokującej An. gambiae znakowanej CFP (A11, Tabela 1), gdzie po pomyślnym RMCE marker CFP zostaje utracony, a nabyty zostaje marker YFP, co skutkuje żółtą (ale nie niebieską) fluorescencją oczu i sznura nerwowego33. Sporadycznie RMCE może prowadzić do pojedynczego zdarzenia integracji zamiast wymiany pożądanej kasety transgenicznej, co zilustrowano na Rysunku 5C, gdzie pokazano larwę znakowaną zarówno oryginalnym markerem CFP, jak i nowym markerem YFP. Donosi się, że do 50% całkowitej liczby zdarzeń transformacji to pojedyncze integracje9, 33.
Podczas przesiewania w celu wykrycia obecności znacznika fluorescencyjnego kluczowe jest odróżnienie jego sygnału od możliwej autofluorescencji tła. Jest to szczególnie istotne przy użyciu CFP, ponieważ larwy Anopheles wykazują naturalną niebieską autofluorescencję (Rysunek 6A). Aby zidentyfikować prawdziwe osobniki CFP-dodatnie, konieczne jest zwiększenie powiększenia i skupienie uwagi na tkankach oraz organach, w których oczekuje się ekspresji fluorescencji sterowanej przez promotor, co zilustrowano na Rysunku 6B przy użyciu znacznika 3xP3-CFP.
Pojedyncze transformanty są ostatecznie oceniane molekularnie za pomocą PCR w celu potwierdzenia oczekiwanego miejsca insercji. Rysunek 7 przedstawia walidację PCR u osobników z linii wymiany An. gambiae, wykazującą dwie potencjalne orientacje insercji w genomie komara33.
<img alt="Proces edycji genów poprzez integrację φC31 na kolorowych obrazach mikroskopowych; analiza efektów linii dokującej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Walidacja pojedynczej integracji φC31 w larwach An. stephensi (widok grzbietowy). A) Linia dokująca (80.9, Tabela 1) wykazuje ekspresję CFP w oczach pod regulacją promotora 3xP3. B) Skuteczna integracja skutkuje ekspresją nowo nabytego DsRed oraz oryginalnego markera CFP w oczach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Edycja genów φC31; mikroskopia fluorescencyjna; proces RMCE; wyniki integracji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Walidacja RMCE φC31 u larw An. gambiae (widok brzuszny). A) Linia dokująca (A10, Tabela 1) wykazuje ekspresję CFP pod regulacją promotora 3xP3 w oczach (e) i rdzeniu nerwowym (nc)5. B) Pomyślne RMCE skutkuje zamianą markera fluorescencyjnego z CFP na YFP33. C) Pojedyncze zdarzenie integracji wystąpiło podczas eksperymentu RMCE, w którym larwa transformowana wykazuje ekspresję obu markerów, CFP i YFP. Larwa ta niesie komponenty GAL4/UAS, które powodują szeroki wzorzec ekspresji YFP, szczególnie silny w mięśniach odwłoka (am). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza fluorescencji CFP, schemat przedstawiający organizmy znakowane CFP- oraz CFP+ pod wpływem wzbudzenia światłem niebieskim." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Autofluorescencja CFP w larwach An. gambiae (widok grzbietowy). A) Obraz porównawczy larwy dodatniej (CFP+) i ujemnej (CFP-) w stadium L4 z zastosowaniem filtra CFP. B) Powiększony obraz oczu larwy, ujawniający osobnika CFP+ vs CFP-. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz żelu z analizy PCR pokazujący wzory prążków DNA dla orientacji A i B wraz ze schematami genetycznymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Walidacja molekularna orientacji insercji kasety w reprezentatywnych osobnikach transgenicznych An. gambiae stworzonych za pomocą φC31 RMCE. Kaseta transgeniczna może zostać wstawiona w jednej z dwóch alternatywnych orientacji (A lub B) względem miejsca insercji. W każdej reakcji PCR (I - IV) zastosowano kombinację starterów (5-8)33 zaprojektowanych tak, aby uzyskać diagnostyczny fragment amplifikacji dla każdej orientacji, zgodnie ze schematami map plazmidów. T1: reprezentatywny osobnik transgeniczny z orientacją insercji A; T2: reprezentatywny osobnik transgeniczny z orientacją insercji B; WT: typ dziki; DL: linia dockingowa; -: ujemna kontrola reakcji, w której jako matrycy użyto wody. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Adolfi et al. (2019)33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Gatunek</td>
			<td >Szczep</td>
			<td >Nazwa</td>
			<td >attP(s)</td>
			<td >Chromosom</td>
			<td >Promotor-marker</td>
			<td >Instytucja pochodzenia</td>
			<td >Referencja</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >An. stephensi</td>
			<td >Indiana</td>
			<td >26.10b</td>
			<td >Pojedynczy</td>
			<td >2R</td>
			<td >3xP3-eCFP</td>
			<td >Univ. of California Irvine</td>
			<td >25</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >An. stephensi</td>
			<td >Indiana</td>
			<td >44Cb</td>
			<td >Pojedynczy</td>
			<td >X</td>
			<td >3xP3-eCFP</td>
			<td >Univ. of California Irvine</td>
			<td >23, 24</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >An. stephensi</td>
			<td >Indiana</td>
			<td >80.9b</td>
			<td >Pojedynczy</td>
			<td >2L</td>
			<td >3xP3-eCFP</td>
			<td >Univ. of California Irvine</td>
			<td >Niniejsze badanie</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >An. gambiae</td>
			<td >G3</td>
			<td >113</td>
			<td >Pojedynczy</td>
			<td >2R</td>
			<td >3xP3-eCFP</td>
			<td >Univ. of California Irvine</td>
			<td >Niniejsze badanie</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >An. gambiae</td>
			<td >KIL</td>
			<td >Ec</td>
			<td >Pojedynczy</td>
			<td >3R</td>
			<td >3xP3-eCFP</td>
			<td >Keele Univ.</td>
			<td >19, 43</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >An. gambiae</td>
			<td >G3</td>
			<td >X1</td>
			<td >Pojedynczy</td>
			<td >2L</td>
			<td >Brak markera</td>
			<td >Univ. of Strasbourg</td>
			<td >22</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >An. gambiae</td>
			<td >G3</td>
			<td >YAttP</td>
			<td >Pojedynczy</td>
			<td >Y</td>
			<td >3xP3-RFP</td>
			<td >Imperial College London</td>
			<td >21</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >An. gambiae</td>
			<td >G3</td>
			<td >A10b</td>
			<td >Podwójny</td>
			<td >2R</td>
			<td >3xP3-eCFP</td>
			<td >Liverpool School Trop. Med.</td>
			<td >5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >An. gambiae</td>
			<td >G3</td>
			<td >A11b</td>
			<td >Podwójny</td>
			<td >2R</td>
			<td >3xP3-eCFP</td>
			<td >Liverpool School Trop. Med.</td>
			<td >9</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="8">a. Szczep z Johns Hopkins University (dar od M. Jacobs-Lorena) utrzymywany w kulturze w Univ. of California Irvine przez &gt;20 lat.</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="8">b. Linie te są dostępne od autorów na uzasadnioną prośbę.</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="8">c. Linia ta jest dostępna w repozytorium BEI pod adresem www.beiresources.org jako MRA-1163.</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Linie dockingowe Anopheles attP .

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Protokół ten wspiera scharakteryzowanie roli genów komarów zaangażowanych w różne szlaki fizjologiczne, w tym na przykład w oporność owadów i rozwój pasożytów malarii. Metoda ta napędza insercję transgenu do pojedynczych, wstępnie scharakteryzowanych lokalizacji genomu, a zatem pozwala na bezpośrednie porównywanie fenotypów wynikających z alternatywnych transgenów, skutecznie unikając problemu efektu pozycyjnego. Metoda ta może być stosowana do różnych gatunków owadów o znaczeniu dla zdrowia publicznego i rolnictwa, a jej zastosowania rozciągają się od bakterii po komórki ssaków.Zacznij od zaprojektowania plazmidów dawcy attB przenoszących dominujący marker fluorescencyjny, miejsca rekombinacji attB i pożądany ładunek transgenu. Użyj pojedynczego miejsca attB do integracji całego plazmidu przenoszącego transgeniczną kasetę lub dwóch odwróconych miejsc attB do wymiany kasety. Oczyść plazmidy dawcy i pomocnika za pomocą zestawu do oczyszczania bez endotoksyn.Połączyć plazmid dawcy znakowany attB przenoszący interesujący nas transgen i plazmid pomocniczy przenoszący integrazę, aby uzyskać mieszaninę o końcowym stężeniu 350 nanogramów na mikrolitr plazmidu dawcy i 150 nanogramów na mikrolitr plazmidu pomocniczego. Wytrącić DNA, dodając 0,1 objętości trzech molowych octanów sodu i 2,5 objętości lodowatego 100% etanolu, a następnie wirować. Biały osad powinien być natychmiast widoczny.Przepłukać osad i ponownie zawiesić go w buforze do wstrzykiwań, aby osiągnąć całkowite stężenie końcowe 500 nanogramów na mikrolitr. Następnie przygotuj porcje po 10-15 mikrolitrów każdy i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Krew karmi cztero- do siedmiodniowych komarów z pożądanej linii dokowania i ich dzikich odpowiedników na 72 godziny przed mikrowstrzyknięciem.Wykonaj mikroiniekcje zarodków Anopheles gambiae w 25-milimolowym chlorku sodu, kierując się na tylny biegun zarodka pod kątem 45 stopni. Wykonaj mikroiniekcje zarodków Anopheles stephensi w oleju halowęglowym, kierując się w tylny biegun pod kątem 30 stopni. Natychmiast po wstrzyknięciu przenieść jaja na szalkę Petriego wypełnioną sterylną wodą destylowaną i przywrócić je do warunków owadobójczych.Po wykluciu należy codziennie przenosić larwy G0 do tacy z osoloną wodą destylowaną i z powrotem do poczwarek. Sortuj poczwarki G0 według płci pod stereoskopem. Pozwól samcom wyłonić się w oddzielnych klatkach w grupach od trzech do pięciu i dodaj dziesięciokrotny nadmiar samic typu dzikiego w tym samym wieku.Pozwól samicom wyłonić się w oddzielnych klatkach w grupach od 10 do 15 sztuk i dodaj równą liczbę samców typu dzikiego w tym samym wieku. Pozwól dorosłym łączyć się w pary przez cztery do pięciu dni i zapewnij samicom posiłek z krwi. Zbierz jaja i wychowaj pojawiające się G1 nowej generacji.Zebrać larwy G1, L3 i L4 na szalce Petriego wyłożonej mokrą bibułą filtracyjną lub na szkiełku mikroskopowym i przesiać je za pomocą stereoskopu fluorescencyjnego na obecność markera wprowadzonego wraz z ładunkiem oznaczonym attB. W przypadku wzorów z pojedynczym attB należy sprawdzić obecność nowego i istniejącego wcześniej znacznika. W przypadku projektów z podwójnym attB do wymiany kasety, ekran pod kątem obecności nowego znacznika i utraty istniejącego wcześniejszego.Sortuj przekształcone poczwarki G1 według płci i krzyżuj je masowo z osobnikami dzikiej płci przeciwnej płci w tym samym wieku. Pozwól dorosłym łączyć się w pary przez cztery do pięciu dni i zapewnij posiłek z krwi. W przypadku eksperymentów z pojedynczą integracją zbieraj jaja bezpośrednio z krzyżówki en masse.W przypadku eksperymentów z wymianą kasetową należy zebrać jaja od pojedynczych samic i utrzymać potomstwo oddzielnie do czasu zakończenia oceny molekularnej ze względu na potencjalną obecność dwóch alternatywnych orientacji kaset. Przebadaj potomstwo G2 pod kątem obecności markera fluorescencyjnego i odłóż na bok podzbiór osobników z dodatnim wynikiem G2 do analizy molekularnej. Resztę wychowaj do dorosłości.Przeprowadzić walidację molekularną miejsc insercji za pomocą PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. W przypadku pojedynczej integracji upewnij się, że przewidywane miejsce insercji zawiera oryginalną konstrukcję dokującą oraz całą sekwencję plazmidu dawcy między dwoma miejscami hybrydowymi attL i attR. W przypadku wymiany kasety upewnij się, że przewidywane miejsce włożenia jest identyczne z miejscem linii dokowania, w której hybrydowe odwrócone miejsca attL zastępują oryginalne odwrócone miejsca attP, a szablon wymiany zastępuje kasetę pierwotnie znajdującą się między nimi.Protokół wykorzystano do wygenerowania stabilnej linii transgenicznej Anopheles w ciągu około 10 tygodni. Walidację fenotypową transformacji przeprowadzono poprzez badanie przesiewowe pod kątem markerów fluorescencyjnych regulowanych przez promotor 3xP3, pokazano tutaj. Nowa linia Anopheles stephensi została uzyskana przez włożenie kasety DS oznaczonej na czerwono do linii dokującej oznaczonej CFP, co spowodowało ekspresję potomstwa G1 obu markerów, na co wskazuje czerwona i niebieska fluorescencja w oczach.Projekty wymiany kaset skutkują wymianą markera pierwotnie włożonego do linii dokującej na marker plazmidu dawcy. Ta wymiana markerów została zademonstrowana na linii dokującej Anopheles gambiae, gdzie znacznik CFP został utracony, a marker YFP nabyty, co spowodowało fluorescencję żółtego oka i rdzenia nerwowego. Czasami RMCE może skutkować pojedynczym zdarzeniem integracyjnym zamiast wymiany pożądanej kasety transgenicznej, w której larwa jest oznaczana zarówno oryginalnymi znacznikami CFP, jak i nowymi markerami YFP.Podczas badań przesiewowych na obecność markera fluorescencyjnego ważne jest, aby odróżnić jego sygnał od możliwej autofluorescencji tła. Zwiększenie powiększenia i skupienie się na tkankach i narządach, w których oczekuje się, że fluorescencja będzie napędzana przez promotor, jest konieczne do identyfikacji osób z prawdziwym dodatnim CFP. Poszczególne transformanty oceniano również molekularnie za pomocą PCR, aby potwierdzić oczekiwane miejsce insercji.Walidacja PCR u osób z linii wymiany Anopheles gambiae jest pokazana tutaj. Nawet odpowiednia technika mikroiniekcji, dokładne zaprojektowanie i przygotowanie plazmidów dawcy i plazmidu pomocniczego, a także przestrzeganie odpowiedniego schematu hodowli komarów są kluczowe dla uzyskania osobników transgenicznych. Procedura ta może być stosowana do wprowadzania elementów powodujących nadekspresję lub wyciszanie genów, na przykład systemu GAL4/UAS, a także elementów napędu genowego i cząsteczek przeciwpatogennych do genetycznej kontroli komarów.

site-directed-c31-mediated-integration-cassette-exchange-anopheles

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Komary z gatunku Anopheles stephensi są wektorami malarii zamieszkującymi Indie oraz cały obszar Azji. Niniejszy film demonstruje technikę wykonywania mikroiniekcji u tego gatunku z wykorzystaniem transgenów, które nadadzą komarowi odporność na malarię. Większość metodologii przedstawionej w tym filmie ma zastosowanie w technikach mikroiniekcji u innych gatunków komarów.

Iniekcja embrionów An. stephensi w celu wytworzenia komarów odpornych na malarię

Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Wśród trzech rodzajów komarów, mianowicie Anopheles, Aedes oraz Culex, techniki fizycznego mapowania genomu opracowano jedynie dla Anopheles, którego przedstawiciele posiadają czytelne chromosomy politeniczne. W przypadku rodzajów Aedes i Culex mapowanie cytogenetyczne pozostaje jednak wyzwaniem ze względu na niską jakość chromosomów politenicznych. Przedstawiamy tutaj uniwersalny protokół otrzymywania wysokiej jakości preparatów chromosomów mitotycznych oraz zoptymalizowany protokół FISH dla...

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ na chromosomach mitotycznych komarów

W tym filmie demonstrujemy integrację transgenu w zarodku Anopheles za pośrednictwem phiC31 za pośrednictwem mikroiniekcji. Metoda ta pomaga wprowadzić pożądane geny do systemu gospodarza do zastosowań badawczych i przemysłowych.

phiC31-Integraza-Medi-Site-Directed Transgene Integration: Technika mikroiniekcji do specyficznej dla miejsca integracji transgenu z wektorem Anopheles

Komary przenoszące malarię mają wiele ważnych epidemiologicznie cech, które można wykryć tylko za pomocą technik molekularnych. Wykorzystując platformę genotypowania SNP opartą na MALDI-TOF, opracowaliśmy test do jednoczesnego wykrywania wielu kluczowych cech (gatunek, odporność na insektycydy, zakażenie pasożytami i wybór żywiciela) wektorów malarii.

Test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię

Poprzez inokulację koralikami, opisana technika umożliwia stymulację reakcji melanizacji komarów w układzie krążenia hemolimfy. Ilość melaniny pokrywającej koraliki można zmierzyć po rozbiorze jako miarę odpowiedzi immunologicznej.

Inokulowanie komarów Anopheles gambiae koralikami w celu wywołania i zmierzenia odpowiedzi immunologicznej melanizacji

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Przedstawione tutaj protokoły ilustrują trzy alternatywne sposoby oceny wydajności genetycznie modyfikowanych komarów przeznaczonych do kontroli wektorów w laboratoryjnych próbach z małymi klatkami. Każdy protokół jest dostosowany do konkretnej modyfikacji, jaką niesie ze sobą szczep komarów (napęd genowy lub nie-genowy) oraz rodzajów mierzonych parametrów.

Badania laboratoryjne w małych klatkach genetycznie modyfikowanych komarów anofeliny

Techniki mikroiniekcji są niezbędne do wprowadzenia egzogennych genów do genomów komarów. Protokół ten wyjaśnia metodę stosowaną przez laboratorium Jamesa do mikrowstrzykiwania konstruktów DNA do embrionów Anopheles gambiae w celu wygenerowania przekształconych komarów.

Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Naucz się ukierunkowanej integracji φC31 w komórkach Anopheles do modyfikacji genomu i wymiany kaset transgenicznych. Ta metoda umożliwia badanie genów odpowiedzialnych za odporność na malarię.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Przeglądaj więcej filmów