Name: Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj metodę izolacji i obrazowania poklatkowego pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy. Protokół umożliwia ilościową analizę zbiorowych atrybutów ruchowych w badaniach biologii czaszkowo-twarzowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był częściowo wspierany przez granty National Institutes of Health DE026172 (I.S.) i GM102801 (A.C.). I.S. był również częściowo wspierany przez grant Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), grant Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418), oraz grant Centrum Badań nad Niepełnosprawnością Intelektualną i Rozwojową w Kansas (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

<ol><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palatogenesis%3A+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139 (2), 231-243 (2012).</li>
<li>Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate.</a> Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).</li>
<li>Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).</li>
<li>Li, C., Lan, Y., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+of+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms of palate development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).</li>
<li>Gritli-Linde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+etiopathogenesis+of+cleft+lip+and+cleft+palate%3A+usefulness+and+caveats+of+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models.</a> Current Topics in Developmental Biology. 84, 37(2008).</li>
<li>Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+mechanisms+in+palatogenesis+and+cleft+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate.</a> Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).</li>
<li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%3A+understanding+genetic+and+environmental+influences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).</li>
<li>Kousa, Y. A., Schutte, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+orofacial+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Toward an orofacial gene regulatory network.</a> Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).</li>
<li>Jin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cell+remodeling+during+mouse+secondary+palate+reorientation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation.</a> Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).</li>
<li>Yu, K., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histomorphological+study+of+palatal+shelf+elevation+during+murine+secondary+palate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).</li>
<li>Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+remodeling+during+palatal+shelf+elevation+revealed+by+extracellular+matrix+and+F-actin+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns.</a> Frontiers in Physiology. 7, 392(2016).</li>
<li>Paul, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARHGAP29+mutation+is+associated+with+abnormal+oral+epithelial+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).</li>
<li>Hall, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPECC1L+regulates+palate+development+downstream+of+IRF6%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6.</a> Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).</li>
<li>Walker, B. E., Fraser, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closure+of+the+secondary+palate+in+three+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Closure of the secondary palate in three strains of mice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).</li>
<li>Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Zfhx1a+mutant+mice+reveals+palatal+shelf+contact-independent+medial+edge+epithelial+differentiation+during+palate+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion.</a> Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).</li>
<li>Kouskoura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+etiology+of+cleft+palate+formation+in+BMP7-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice.</a> PLoS One. 8 (3), 59463(2013).</li>
<li>Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgb1+regulates+protein+glycosylation+and+is+crucial+for+mammalian+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development.</a> Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).</li>
<li>He, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+regulates+directional+cell+migration+and+cell+proliferation+via+Ror2-mediated+noncanonical+pathway+in+mammalian+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development.</a> Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).</li>
<li>Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hyaluronan+synthase-2+in+craniofacial+and+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development.</a> Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).</li>
<li>Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+is+required+for+palatal+shelf+movement+and+its+interaction+with+the+tongue+during+palatal+shelf+elevation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation.</a> Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).</li>
<li>Goering, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPECC1L-deficient+palate+mesenchyme+cells+show+speed+and+directionality+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1452(2021).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K-mediated+PDGFRalpha+signaling+regulates+survival+and+proliferation+in+skeletal+development+through+p53-dependent+intracellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways.</a> Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).</li>
<li>Vasudevan, H. N., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRF+regulates+craniofacial+development+through+selective+recruitment+of+MRTF+cofactors+by+PDGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling.</a> Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).</li>
<li>Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinases+modulate+distinct+transcriptional+programs+by+differential+usage+of+intracellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways.</a> Elife. 4, 07186(2015).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C3%2C7%2C8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin+and+TGFbeta3-mediated+mouse+embryonic+palatal+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dose+Response%22%5BJournal%5D)">2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells.</a> Dose Response. 17 (1), 1559325818786822(2019).</li>
<li>Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoxa2+inhibits+bone+morphogenetic+protein+signaling+during+osteogenic+differentiation+of+the+palatal+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme.</a> Frontiers in Physiology. 8, 929(2017).</li>
<li>Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt6+influences+the+viability+of+mouse+embryonic+palatal+mesenchymal+cells+via+the+beta-catenin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+interplay+of+retinoic+acid+and+TGF-beta+signaling+mediated+by+TG-interacting+factor+to+modulate+mouse+embryonic+palate+mesenchymal-cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+B%3A+Developmental+and+Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation.</a> Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).</li>
<li>Bush, J. O., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-B1+forward+signaling+regulates+craniofacial+morphogenesis+by+controlling+cell+proliferation+across+Eph-ephrin+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries.</a> Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).</li>
<li>Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+and+Pdgfrb+genetically+interact+in+the+murine+neural+crest+cell+lineage+to+regulate+migration+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation.</a> Frontiers in Physiology. 11, 588901(2020).</li>
<li>He, F., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+PDGFRalpha+signaling+in+medial+nasal+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development.</a> PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+immortalized+mouse+embryonic+palatal+mesenchyme+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line.</a> PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).</li>
<li>Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+image+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Live cell image segmentation.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).</li>
<li>Neufeld, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Allee+effect+in+modelling+post+resection+recurrence+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma.</a> PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818(2017).</li>
<li>Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+image-based+method+for+computational+tissue+fate+mapping+during+early+avian+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis.</a> Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).</li>
<li>Czirok, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical-flow+based+non-invasive+analysis+of+cardiomyocyte+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10404(2017).</li>
<li>Biggs, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+6+regulates+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration.</a> Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).</li>
<li>Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+streams+in+epithelial+monolayers+depend+on+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion.</a> New Journal of Physics. 15, 75006(2013).</li>
<li>Szabo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+motion+in+endothelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell motion in endothelial monolayers.</a> Physical Biology. 7 (4), 046007(2010).</li>
<li>Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+cell+culture-related+3D+printed+structures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Software tools for cell culture-related 3D printed structures.</a> PLoS One. 13 (9), 0203203(2018).</li>
<li>Soderholm, J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+n%27+screen+for+inhibitors+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch n' screen for inhibitors of cell migration.</a> Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).</li>
<li>Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+cell+tracks%3A+Quantifying+cell+migration+by+time+lapse+image+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis.</a> Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRbeta+regulates+craniofacial+development+through+homodimers+and+functional+heterodimers+with+PDGFRalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha.</a> Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).</li>
<li>Rafi, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-epileptic+drug+topiramate+upregulates+TGF%CE%B21+and+SOX9+expression+in+primary+embryonic+palatal+mesenchyme+cells%3A+Implications+for+teratogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity.</a> PLoS ONE. , In Press (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Elewacja szelfu podniebiennego stanowi przebudowę pionowo-poziomą 1,3,4,9,11. Postuluje się, że ten proces przebudowy wymaga, aby komórki mezenchymalne szelfu podniebienia zachowywały się koordynacyjnie. Analizy z komórkami MEPM typu dzikiego pokazują, że to zachowanie komórek jest wewnętrzne i można je określić ilościowo21. W związku z...

Rozwój podniebienia był intensywnie badany, ponieważ defekty w palatogenezie prowadzą do rozszczepu podniebienia - powszechnej wady wrodzonej, która występuje w pojedynczych przypadkach lub jako część setek zespołów1,2. Rozwój podniebienia embrionalnego jest procesem dynamicznym, który obejmuje ruch i fuzję tkanki embrionalnej. Proces ten można podzielić na cztery główne etapy: 1) indukcja półek podniebiennych, 2) pionowy wzrost półek podniebiennych obok języka, 3) podniesienie półek podniebiennych powyżej języka oraz 4) fuzja półek podniebiennych w linii środkowej1,3,4. W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat zidentyfikowano wiele mutantów myszy, które manifestują rozszczep podniebienia5,6,7,8. Charakterystyka tych modeli wykazała defekty w etapach indukcji, proliferacji i fuzji szelfu podniebiennego; Wady elewacji półki podniebiennej były jednak rzadkie. Tak więc zrozumienie dynamiki podnoszenia się szelfu podniebiennego jest intrygującym obszarem badań.
Dokładna analiza niektórych mutantów myszy z wadami wysokości półki podniebiennej doprowadziła do obecnego modelu pokazującego, że bardzo przedni obszar półki podniebiennej wydaje się przechylać do góry, podczas gdy ruch pionowy do poziomego lub "przebudowa" półek podniebiennych występuje w środkowych i tylnych obszarach podniebienia1, 3,4,9,10,11. Nabłonek krawędzi przyśrodkowej półki podniebiennej prawdopodobnie inicjuje sygnalizację wymaganą do tej przebudowy, która jest następnie napędzana przez mezenchymę szelfu podniebiennego. Ostatnio wielu badaczy zidentyfikowało opóźnienie uniesienia półki podniebiennej w modelach mysich, które wykazały przejściowe zrosty jamy ustnej obejmujące półki podniebienne12,13. Remodeling mezenchymalny polega na reorganizacji komórek w celu utworzenia wybrzuszenia w kierunku poziomym, przy jednoczesnym cofnięciu półki podniebiennej w kierunku pionowym9,10,14. Wśród kilku proponowanych mechanizmów wpływających na uniesienie półki podniebiennej i leżącą u podstaw przebudowę mezenchymalną są: proliferacja komórek15,16,17, gradienty chemotaktyczne18 i komponenty macierzy zewnątrzkomórkowej19,20. Pojawiło się ważne pytanie: czy opóźnienie podniesienia półki podniebiennej obserwowane u myszy z niedoborem Specc1l jest również częściowo spowodowane defektem w przebudowie półki podniebiennej i czy ten defekt przebudowy może przejawiać się w wewnętrznej defektywności w zachowaniu pierwotnych komórek MEPM21?
Pierwotne komórki MEPM były używane w polu twarzoczaszki do wielu badań związanych z ekspresją genów22,23,24,25,26,27,28,29, oraz kilka związanych z rozprzestrzenianiem30,31 i migration25,31,32, ale brak do zbiorczej analizy zachowania komórek. Obrazowanie poklatkowe komórek MEPM przeprowadzono w hodowli 2D i testach gojenia ran, aby pokazać, że komórki MEPM wykazywały ruch kierunkowy i tworzyły strumienie komórkowe zależne od gęstości - atrybuty ruchu zbiorowego21. Co więcej, zmutowane komórki Specc1l tworzyły węższe strumienie komórkowe i wykazywały bardzo zmienne trajektorie migracji komórek. Uważa się, że ten brak skoordynowanej ruchliwości przyczynia się do opóźnienia uniesienia podniebienia u zmutowanych zarodków Specc1l13,21. Tak więc te stosunkowo proste testy wykorzystujące pierwotne komórki MEPM mogą służyć jako proxy do badania przebudowy mezenchymalnej podczas podnoszenia półki podniebiennej. W artykule opisano izolację i hodowlę pierwotnych komórek MEPM, a także obrazowanie i analizę poklatkową w testach 2D i gojeniu ran.

<table><tbody><tr><td>Zlewka, 250 ml (x2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-100-250</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Matheson Gas</td><td>UN1013</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe, 15 ml (x1)</td><td>Midwest Scientific</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Analiza</td><td></td><td></td><td>obliczeniowa obrazów poklatkowych</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane Orły Dulbecco Średni/Wysoki poziom glukozy z 4 mM L-glutamina i pirogronian sodu</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>EtOH, 100%</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Auto</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator sceniczny EVOS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMC1000</td><td></td></tr><tr><td>EVOS Uchwyt na naczynia na scenie, płytki wielodołkowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEPVH028</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fine point #5 Kleszcze ze stali nierdzewnej (x2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td> Narzędzie <td>do preparacji</td></tr><tr><td>sterylizator kąpiel koralikowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrocetrifugi, 1,5 ml</td><td>Nożyczki</td> ze stali nierdzewnej Avant <td>2925</td><td></td></tr> do <tr><td>mikropreparacji, proste</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>Rozwarstwienie</td></tr><tr><td>NucBlue (Hoechst) Sondy gotowe do użycia</td><td>na żywo ThermoFisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór streptomycyny penicyliny, 100x</td> wkładka silikonowa <td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>, 2-dołkowa</td><td>Ibidi</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>Mała perforowana łyżka ze stali nierdzewnej</td><td>Fine Science Tools</td><td>MC17C</td><td></td></tr><tr><td>Sprężyna preparcyjna Nożyczki, 4 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna 10 cm dyszafka(e)</td><td>Corning</td><td>430293</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna płytka 12-dołkowa(e)</td><td>PR1MA</td><td>667512</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna płytka(a) 6-dołkowa(e)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna plastikowa pipeta</td> <td>do przenoszenia bańkiThermoFisher Scientific</td><td>202-1S</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, 0,25%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes

Rozwój podniebienia to dynamiczny proces, który obejmuje pionowy wzrost obustronnych półek podniebiennych obok języka, a następnie wyniesienie i fuzję ponad językiem. Wady tego procesu prowadzą do rozszczepu podniebienia, powszechnej wady wrodzonej. Ostatnie badania wykazały, że uniesienie półki podniebiennej obejmuje proces przebudowy, który zmienia orientację półki z pionowej na poziomą. Rola komórek mezenchymalnych szelfu podniebiennego w tej dynamicznej przebudowie była trudna do zbadania. Analiza ilościowa oparta na obrazowaniu poklatkowym została ostatnio wykorzystana do wykazania, że pierwotne embrionalne komórki mezenchymalne podniebienia myszy (MEPM) mogą samoorganizować się w ruch zbiorowy. Analizy ilościowe pozwoliły zidentyfikować różnice w zmutowanych komórkach MEPM w porównaniu z modelem mysim z wadami uniesienia podniebienia. W artykule opisano metody izolacji i hodowli komórek MEPM z zarodków E13.5 - w szczególności do obrazowania poklatkowego - oraz określenia różnych atrybutów komórkowych ruchu zbiorowego, w tym pomiarów tworzenia strumieni, wyrównania kształtu i trwałości kierunku. Zakłada ona, że komórki MEPM mogą służyć jako model zastępczy do badania roli mezenchymy szelfu podniebiennego podczas dynamicznego procesu podnoszenia. Te metody ilościowe pozwolą badaczom zajmującym się twarzoczaszką ocenić i porównać zbiorowe atrybuty ruchowe w komórkach kontrolnych i zmutowanych, co poszerzy wiedzę na temat przebudowy mezenchymalnej podczas podnoszenia półki podniebiennej. Co więcej, komórki MEPM stanowią rzadki mezenchymalny model komórkowy do badania zbiorowych ruchów komórek w ogóle.

Preparatoryka podniebienia jest przedstawiona na Rysunku 1. Sekwencja nacięć została zaprojektowana tak, aby zminimalizować przesuwanie się tkanki. Po usunięciu głowy (Rysunek 1A,B), usuwa się żuchwę (Rysunek 1B,C). Nacięcie górnej części głowy (Rysunek 1C,D) wykonuje się w celu stabilizacji tkanki po umieszczeniu jej odwróconą stroną do góry (<strong c...

Przedstawiamy protokół izolacji i hodowli pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymalnych podniebienia myszy do obrazowania poklatkowego dwuwymiarowego (2D) wzrostu i gojenia ran. Udostępniamy również metodologię analizy danych z obrazowania poklatkowego w celu określenia powstawania strumienia komórkowego i ruchliwości kierunkowej.

Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and ...

Protokół ten pozwala badaczom zajmującym się twarzoczaszką na ilościowe porównanie zbiorowych atrybutów ruchu w komórkach kontrolnych i zmutowanych jako sposób na zrozumienie przebudowy mezenchymalnej podczas uniesienia szelfu podniebiennego. Wykorzystanie pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymalnych podniebienia myszy i obrazowanie poklatkowe zapewnia dostępną metodę zastępczą do oceny dynamiki uniesienia szelfu podniebiennego. Aby pobrać muszle podniebienne z zarodka myszy, użyj wysterylizowanej perforowanej łyżki, aby umieścić zarodek embrionalny w dniu 13,5 dnia w sterylnym 10-centymetrowym naczyniu wypełnionym sterylną pożywką hodowlaną MEPM pod mikroskopem stereoskopowym.Po ścięciu głowy włóż jedną końcówkę wysterylizowanych cienkich kleszczy nr 5 do ust tuż wewnątrz policzka i wciśnij końcówkę kleszczy, aż wyjdzie z tyłu czaszki. Ustaw kleszcze tak, aby druga ręka unosiła się tuż nad kanałem słuchowym, zanim ściśniesz kleszcze, aby przeciąć tkankę. Powtórz nacięcie po drugiej stronie głowy, kontynuując procedurę cięcia szczypania, aż dolna szczęka, język i dolna część czaszki zostaną usunięte, odsłaniając półki podniebienne.Z głową umieszczoną na boku, umieść końcówki małych, sterylnych nożyczek ze stali nierdzewnej przed i za czaszką, mniej więcej na poziomie oczu zarodka i przetnij tuż nad oczami, aby usunąć czaszkę czaszki, tworząc płaską powierzchnię. Następnie ustaw głowę do góry nogami tak, aby górna część spoczywała płasko na dnie naczynia i zlokalizuj półki podniebienne, które powinny być widoczne jako dwa wypukłe mostki po obu stronach środkowego rowka w przedniej połowie głowy. Aby przymocować głowę do naczynia, włóż jedną końcówkę cienkich kleszczyków przez tkankę w pobliżu nosa głowy przed półkami podniebiennymi, a drugą przez podstawę czaszki za półkami podniebiennymi.Włóż oba punkty drugiej pary bardzo ostrych, cienkich kleszczyków do tkanki u podstawy bocznej powierzchni półki i powoli i ostrożnie ściśnij, aby przeciąć tkankę. Powtórz nacięcie wzdłuż podstawy przyśrodkowej powierzchni półki oraz zarówno na przednim, jak i tylnym końcu półki, aby odłączyć półkę od jej mocowania do głowy, a następnie delikatnie podnieś półkę, wykonując dodatkowe szczypanie w razie potrzeby, aby całkowicie uwolnić skorupę od otaczającej tkanki. Gdy druga półka podniebienna zostanie usunięta w ten sam sposób, użyj sterylnej plastikowej pipety do przenoszenia gruszki, aby przenieść półki do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej w około 500 mikrolitrach PBS na lodzie.Aby skonfigurować hodowlę komórkową MEPM, po zebraniu wszystkich półek, odessać PBS bez naruszania tkanek i natychmiast dodać 200 mikrolitrów trypsyny o temperaturze 37 stopni Celsjusza 0,25% do każdej probówki tkanki półki podniebiennej. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów kilkakrotnie krótko odpipetować tkanki i inkubować tkanki przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie krótko pipetować po pięciu minutach. Pod koniec inkubacji ponownie odpipetować tkanki, a następnie dodać 800 mikrolitrów pożywki hodowlanej MEPM do każdej probówki i odwirować probówki w celu zebrania komórek.Po zasysaniu supernatantu, ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze świeżej pożywki hodowlanej MEPM na probówkę i umieść komórki w indywidualnych dołkach sześciodołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych, zawierającej dwa mililitry na studzienkę, do końcowej sumy trzech mililitrów na studzienkę, a następnie pozwól komórkom przylegać do plastikowej powierzchni przez 12 godzin w sterylnym inkubatorze do hodowli komórek. Aby skonfigurować zbiorczy test migracji 2D, usuń górną część jednej sterylnej dwudołkowej wkładki silikonowej na wysokość około jednego milimetra dla każdej próbki, która ma być analizowana, i użyj sterylnych kleszczyków do płytki skróconych, sterylnych wkładek dwudołkowych w środku poszczególnych dołków sześciodołkowej płytki. Dociśnij wzdłuż wszystkich krawędzi, aby upewnić się, że wkładki są całkowicie przylegające do dna studzienki i zasiać 300 komórek MEPM na milimetr kwadratowy skróconych wkładek silikonowych w łącznej objętości od 40 do 50 mikrolitrów pożywki hodowlanej MEPM do każdej wkładki w celu inkubacji przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych.Aby przygotować test gojenia ran, użyj sterylnych kleszczy, aby umieścić jedną niezmodyfikowaną sterylną dwudołkową wkładkę silikonową w środku jednego dołka sześciodołkowej płytki na próbkę i mocno dociśnij krawędzie wkładki, aby przymocować wkładkę do płytki hodowlanej. Następnie wysiewaj 1 400 komórek na milimetr kwadratowy w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej MEPM do każdej wkładki i inkubuj komórki przez 48 godzin w pożywce do hodowli komórkowych. Podczas wykonywania zbiorczego testu migracji 2D, wysiewanie komórek w dwudołkowych wkładkach silikonowych w dużym naczyniu hodowlanym zazwyczaj zapewnia lepszą gęstość komórek do obrazowania.Małe pierścienie wydrukowane w 3D umieszczone w 35-milimetrowej czaszy mogą być również używane do analizy ruchliwości 2D. W przypadku testów gojenia ran komórki są hodowane w dwudołkowych wkładkach silikonowych aż do wysokiej konfluencji. Wkładki są następnie usuwane, a rana jest obrazowana aż do jej zamknięcia.Trajektorie MEPM są trwałe, a kierunek ruchliwości komórki utrzymuje się przez kilka godzin. Analiza średniego przemieszczenia w funkcji czasu wskazuje, że trwałość w postaci przemieszczenia jest proporcjonalna do czasu, który upłynął. Analiza przepływu danych dotyczących ruchliwości ujawnia, że współporuszające się klastry komórek MEPM mają wielkość około 300 mikronów.Obserwuje się również głęboką różnicę w ruchliwości między komórkami typu dzikiego i zmutowanymi komórkami MEPM. Procedura ta może być stosowana na różnych liniach myszy transgenicznych oraz do traktowania komórek MEPM różnymi odczynnikami biochemicznymi w celu zbadania ich wpływu na ruch komórek. Skupiliśmy się na pierwotnych komórkach mezenchymy podniebiennej, ale obrazowanie poklatkowe i analizy ilościowe można również wykorzystać do zbadania atrybutów migracji dowolnego typu komórek ruchliwych w dynamicznych procesach rozwojowych.

isolation-time-lapse-imaging-primary-mouse-embryonic-palatal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy artykuł opisuje znakowanie powierzchniowe oraz hodowlę tkanek ex ovo we wczesnym embrionie kurczaka. Przedstawiono techniki umożliwiające obrazowanie w jasnym polu, fluorescencyjne oraz z wykorzystaniem tomografii optycznej koherencyjnej w trybie time-lapse. Śledzenie znaczników powierzchniowych z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną pozwala na obliczenie wielkości kinematycznych, takich jak odkształcenia morfogenetyczne, zarówno w dwóch, jak i w trzech wymiarach.

Śledzenie deformacji tkankowych w procesach morfogenetycznych we wczesnym zarodku kurczaka

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Obrazowanie na żywo ślimaka embrionalnego ssaka jest wyzwaniem, ponieważ procesy rozwojowe przebiegają w tempie czasowym przez dziesięć dni. W tym miejscu przedstawiamy metodę hodowli, a następnie obrazowania embrionalnej tkanki eksplantatu ślimaka pobranej od fluorescencyjnej myszy reporterowej w ciągu pięciu dni.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy

Opracowaliśmy protokół do generowania agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują samoorganizację, łamanie symetrii i wydłużanie równolegle do rozwoju osiowego. Technika ta pozwala na badanie osiowych procesów rozwojowych i generowanie typów komórek, które w innym przypadku są trudne do wykonania w hodowli jednowarstwowej.

Generowanie agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują łamanie symetrii, polaryzację i emergentne zachowania zbiorowe in vitro

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania na żywo fuzji wtórnego podniebienia myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być stosowany w połączeniu z różnymi fluorescencyjnymi liniami myszy reporterowych oraz z inhibitorami szlaków w celu uzyskania wglądu mechanistycznego. Protokół ten może być zaadaptowany do obrazowania na żywo w innych systemach rozwojowych.

Obrazowanie na żywo fuzji wtórnego podniebienia myszy

Opisujemy metody fluorescencyjnego znakowania stycznie migrujących komórek za pomocą elektroporacji, oraz obrazowania poklatkowego ruchu oznaczonej komórki w hodowli płaskiej w celu wizualizacji zachowania migrujących komórek w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt.

Wizualizacja migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt

Ten protokół opisuje wykrywanie migracji komórek macierzystych okostnej szkieletu za pośrednictwem CCL5 w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii intravital żywych zwierząt.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym indukowanej przez CCL5 migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy

Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli i obrazowania embrionów myszy, który umożliwia obrazowanie 3D + czasowe komórek progenitorowych serca. Ten zestaw narzędzi wideo omawia kluczowe umiejętności wymagane do skutecznego obrazowania na żywo, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zdobycia z publikacji tekstowych.

Obrazowanie na żywo wczesnych progenitorów serca w zarodku myszy

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę izolacji i obrazowania poklatkowego pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy. Protokół umożliwia ilościową analizę zbiorowych atrybutów ruchowych w badaniach biologii czaszkowo-twarzowej.

Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

Przeglądaj więcej filmów