Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

Protokół ten pozwala badaczom zajmującym się twarzoczaszką na ilościowe porównanie zbiorowych atrybutów ruchu w komórkach kontrolnych i zmutowanych jako sposób na zrozumienie przebudowy mezenchymalnej podczas uniesienia szelfu podniebiennego. Wykorzystanie pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymalnych podniebienia myszy i obrazowanie poklatkowe zapewnia dostępną metodę zastępczą do oceny dynamiki uniesienia szelfu podniebiennego. Aby pobrać muszle podniebienne z zarodka myszy, użyj wysterylizowanej perforowanej łyżki, aby umieścić zarodek embrionalny w dniu 13,5 dnia w sterylnym 10-centymetrowym naczyniu wypełnionym sterylną pożywką hodowlaną MEPM pod mikroskopem stereoskopowym.

Po ścięciu głowy włóż jedną końcówkę wysterylizowanych cienkich kleszczy nr 5 do ust tuż wewnątrz policzka i wciśnij końcówkę kleszczy, aż wyjdzie z tyłu czaszki. Ustaw kleszcze tak, aby druga ręka unosiła się tuż nad kanałem słuchowym, zanim ściśniesz kleszcze, aby przeciąć tkankę. Powtórz nacięcie po drugiej stronie głowy, kontynuując procedurę cięcia szczypania, aż dolna szczęka, język i dolna część czaszki zostaną usunięte, odsłaniając półki podniebienne.

Z głową umieszczoną na boku, umieść końcówki małych, sterylnych nożyczek ze stali nierdzewnej przed i za czaszką, mniej więcej na poziomie oczu zarodka i przetnij tuż nad oczami, aby usunąć czaszkę czaszki, tworząc płaską powierzchnię. Następnie ustaw głowę do góry nogami tak, aby górna część spoczywała płasko na dnie naczynia i zlokalizuj półki podniebienne, które powinny być widoczne jako dwa wypukłe mostki po obu stronach środkowego rowka w przedniej połowie głowy. Aby przymocować głowę do naczynia, włóż jedną końcówkę cienkich kleszczyków przez tkankę w pobliżu nosa głowy przed półkami podniebiennymi, a drugą przez podstawę czaszki za półkami podniebiennymi.

Włóż oba punkty drugiej pary bardzo ostrych, cienkich kleszczyków do tkanki u podstawy bocznej powierzchni półki i powoli i ostrożnie ściśnij, aby przeciąć tkankę. Powtórz nacięcie wzdłuż podstawy przyśrodkowej powierzchni półki oraz zarówno na przednim, jak i tylnym końcu półki, aby odłączyć półkę od jej mocowania do głowy, a następnie delikatnie podnieś półkę, wykonując dodatkowe szczypanie w razie potrzeby, aby całkowicie uwolnić skorupę od otaczającej tkanki. Gdy druga półka podniebienna zostanie usunięta w ten sam sposób, użyj sterylnej plastikowej pipety do przenoszenia gruszki, aby przenieść półki do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej w około 500 mikrolitrach PBS na lodzie.

Aby skonfigurować hodowlę komórkową MEPM, po zebraniu wszystkich półek, odessać PBS bez naruszania tkanek i natychmiast dodać 200 mikrolitrów trypsyny o temperaturze 37 stopni Celsjusza 0,25% do każdej probówki tkanki półki podniebiennej. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów kilkakrotnie krótko odpipetować tkanki i inkubować tkanki przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie krótko pipetować po pięciu minutach. Pod koniec inkubacji ponownie odpipetować tkanki, a następnie dodać 800 mikrolitrów pożywki hodowlanej MEPM do każdej probówki i odwirować probówki w celu zebrania komórek.

Po zasysaniu supernatantu, ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze świeżej pożywki hodowlanej MEPM na probówkę i umieść komórki w indywidualnych dołkach sześciodołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych, zawierającej dwa mililitry na studzienkę, do końcowej sumy trzech mililitrów na studzienkę, a następnie pozwól komórkom przylegać do plastikowej powierzchni przez 12 godzin w sterylnym inkubatorze do hodowli komórek. Aby skonfigurować zbiorczy test migracji 2D, usuń górną część jednej sterylnej dwudołkowej wkładki silikonowej na wysokość około jednego milimetra dla każdej próbki, która ma być analizowana, i użyj sterylnych kleszczyków do płytki skróconych, sterylnych wkładek dwudołkowych w środku poszczególnych dołków sześciodołkowej płytki. Dociśnij wzdłuż wszystkich krawędzi, aby upewnić się, że wkładki są całkowicie przylegające do dna studzienki i zasiać 300 komórek MEPM na milimetr kwadratowy skróconych wkładek silikonowych w łącznej objętości od 40 do 50 mikrolitrów pożywki hodowlanej MEPM do każdej wkładki w celu inkubacji przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Aby przygotować test gojenia ran, użyj sterylnych kleszczy, aby umieścić jedną niezmodyfikowaną sterylną dwudołkową wkładkę silikonową w środku jednego dołka sześciodołkowej płytki na próbkę i mocno dociśnij krawędzie wkładki, aby przymocować wkładkę do płytki hodowlanej. Następnie wysiewaj 1 400 komórek na milimetr kwadratowy w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej MEPM do każdej wkładki i inkubuj komórki przez 48 godzin w pożywce do hodowli komórkowych. Podczas wykonywania zbiorczego testu migracji 2D, wysiewanie komórek w dwudołkowych wkładkach silikonowych w dużym naczyniu hodowlanym zazwyczaj zapewnia lepszą gęstość komórek do obrazowania.

Małe pierścienie wydrukowane w 3D umieszczone w 35-milimetrowej czaszy mogą być również używane do analizy ruchliwości 2D. W przypadku testów gojenia ran komórki są hodowane w dwudołkowych wkładkach silikonowych aż do wysokiej konfluencji. Wkładki są następnie usuwane, a rana jest obrazowana aż do jej zamknięcia.

Trajektorie MEPM są trwałe, a kierunek ruchliwości komórki utrzymuje się przez kilka godzin. Analiza średniego przemieszczenia w funkcji czasu wskazuje, że trwałość w postaci przemieszczenia jest proporcjonalna do czasu, który upłynął. Analiza przepływu danych dotyczących ruchliwości ujawnia, że współporuszające się klastry komórek MEPM mają wielkość około 300 mikronów.

Obserwuje się również głęboką różnicę w ruchliwości między komórkami typu dzikiego i zmutowanymi komórkami MEPM. Procedura ta może być stosowana na różnych liniach myszy transgenicznych oraz do traktowania komórek MEPM różnymi odczynnikami biochemicznymi w celu zbadania ich wpływu na ruch komórek. Skupiliśmy się na pierwotnych komórkach mezenchymy podniebiennej, ale obrazowanie poklatkowe i analizy ilościowe można również wykorzystać do zbadania atrybutów migracji dowolnego typu komórek ruchliwych w dynamicznych procesach rozwojowych.