Name: Wszechobecne i specyficzne tkankowo celowanie RNA u Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR/CasRx (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Poznaj metody wszechobecnego i specyficznego tkankowo celowania RNA przy użyciu CRISPR/CasRx u Drosophila melanogaster. Protokoły umożliwiają programowalną redukcję transkryptów z oceną fenotypową i molekularną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez finansowanie z grantu DARPA Safe Genes Program (HR0011-17-2-0047) oraz nagród NIH (R21RAI149161A, DP2AI152071) przyznanych O.S.A.

<ol><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Communications%22%5BJournal%5D)">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nat Communications. 9, 1911(2018).</li>
<li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), 5573(2016).</li>
<li>East-Seletsky, A., O'Connell, M., Burstein, D., Knott, G., Doudna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Targeting+by+Functionally+Orthogonal+Type+VI-A+CRISPR-Cas+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes.</a> Molecular Cell. 66 (3), 373-383 (2017).</li>
<li>Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N., Oki, J., Shokhirev, M., Hsu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+Engineering+with+RNA-Targeting+Type+VI-D+CRISPR+Effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.</a> Cell. 173 (3), 665-676 (2018).</li>
<li>Buchman, A., Brogan, D., Sun, R., Yang, T., Hsu, P., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+Targeting+Using+CasRx+in+Flies%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA Targeting Using CasRx in Flies.</a> The CRISPR Journal. 3 (3), 164-176 (2020).</li>
<li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13d+Induces+Efficient+mRNA+Knockdown+in+Animal+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li>
<li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> Nature. 550, 280-284 (2017).</li>
<li>Perrimon, N., Ni, J., Perkins, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+RNAi%3A+today+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo RNAi: today and tomorrow.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 003640(2010).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+resource+of+transgenic+RNAi+lines+for+neurogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics.</a> Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+shRNA+resource+for+transgenic+RNAi+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila.</a> Nature Methods. 8, 405-407 (2011).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+and+parameters+for+targeted+transgenic+RNA+interference+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5, 49-51 (2008).</li>
<li>Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+%28RNAi%29+Screening+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila.</a> Genetics. 208 (3), 853-874 (2018).</li>
<li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+off-target+effects+associated+with+long+dsRNAs+in+Drosophila+melanogaster+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays.</a> Nature Methods. 3, 833-838 (2006).</li>
<li>Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+off-target+effects+in+Drosophila+RNA+interference+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens.</a> Nature. 443, 359-363 (2006).</li>
<li>Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matter+arising%3A+off-targets+and+genome-scale+RNAi+screens+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Matter arising: off-targets and genome-scale RNAi screens in Drosophila.</a> Fly. 1 (1), 1-5 (2007).</li>
<li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nature Genetics. 40, 476-483 (2008).</li>
<li>Champer, J., Buchman, A., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cheating+evolution%3A+engineering+gene+drives+to+manipulate+the+fate+of+wild+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations.</a> Nature Review Genetics. 17 (3), 146-159 (2016).</li>
<li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103(2020).</li>
<li>Mathur, G., Sanchez-Vargas, I., Alvarez, D., Olson, K., Marinotti, O., James, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene-mediated+suppression+of+dengue+viruses+in+the+salivary+glands+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Insect Molecular Biology. 19 (6), 753-763 (2011).</li>
<li>Franz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4198-4203 (2006).</li>
<li>Yen, P., James, A., Li, J., Chen, C., Failloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+miRNAs+induce+dual+arboviral-resistance+phenotypes+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic miRNAs induce dual arboviral-resistance phenotypes in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> Communications Biology. 1, 11(2018).</li>
<li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+Aedes+aegypti+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Engineered resistance to Zika virus in transgenic Aedes aegypti expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li>
<li>Addgene. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/">https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/</a> (2020).</li>
<li>Gibson, D., Young, L., Chuang, R., Venter, J., Hutchison, C., Smith, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Addgene. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr/">https://www.addgene.org/protocols/pcr/</a> (2020).</li>
<li>Indiana University Bloomington. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL</a> (2020).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3Aultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Jiang, W., Brueggeman, A., Horken, K., Plucinak, T., Weeks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryotic Cell. 13 (11), 1465-1469 (2014).</li>
<li>Poe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+CRISPR%2FCas9-Mediated+Tissue-Specific+mutagenesis+reveals+gene+redundancy+and+perdurance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust CRISPR/Cas9-Mediated Tissue-Specific mutagenesis reveals gene redundancy and perdurance in Drosophila.</a> Genetics. 211 (2), 459-472 (2019).</li>
<li>Port, F., Chen, H., Lee, T., Bullock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+CRISPR%2FCas+tools+for+efficient+ger+mLine+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient ger mLine and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 2967-2976 (2014).</li>
<li>Yang, S., Li, S., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shortening+the+Half-Life+of+Cas9+maintains+its+gene+editing+ability+and+reduces+neuronal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Shortening the Half-Life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity.</a> Cell Reports. 25 (10), 2653-2659 (2018).</li>
<li>Port, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+resource+for+tissue-specific+CRISPR+mutagenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila.</a> eLife. 9, 53865(2020).</li>
<li>Zhang, X., Tee, L., Wang, X., Huang, Q., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+Effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4 (17), 264(2015).</li>
<li>Huynh, N., Depner, N., Larson, R., King-Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+toolkit+for+CRISPR-Cas13-based+RNA+manipulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila.</a> Genome Biology. 21, 279(2020).</li>
</ol>

O.S.A. jest założycielem Agragene, Inc., posiada udziały w kapitale zakładowym i zasiada w Naukowej Radzie Doradczej firmy. Warunki tej umowy zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski w San Diego zgodnie z jego zasadami dotyczącymi konfliktu interesów. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Dzięki trzem różnym projektom zastosowań systemu CasRx, prace te zademonstrowały celowanie w wiwoprogramowalne RNA u muszek. Różne strategie zaspokajają różne potrzeby projektu, takie jak endogenne i egzogenne celowanie w geny oraz wszechobecne w porównaniu z tkankowo specyficznym RNA. Efekty celowania w RNA obejmowały zmiany fenotypowe specyficzne dla genu docelowego, redukcję docelowego transkryptu RNA oraz sporadyczne fenotypy śmiertelności związane z wysoką ekspresją białka CasRx i aktywnością poboczną. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wykazały, że system CasRx jest zdolny do docelowej redukcji transkryptu RNA na poziomie organizmu w programowalny i skuteczny sposób.
Jednym z kluczowych czynników udanej personalizacji systemu CasRx jest konstrukcja gRNA. W szczególności należy przestrzegać następujących zaleceń: sekwencja docelowa ma długość około 30 nukleotydów, długość odcinków poli-U w sekwencji docelowej wynosi 4 pary zasad lub mniej, zawartość GC sekwencji docelowej mieści się w zakresie 30% - 70%, nie przewiduje się, aby sekwencja docelowa tworzyła silne struktury spinki do włosów RNA, a sekwencja docelowa zawiera minimalną przewidywaną strukturę drugorzędową lub trzeciorzędowąRNA 5.
Oprócz projektów gRNA, etap genetyki muchy w każdym protokole ma również kluczowe znaczenie dla udanego wdrożenia. Obecność lub brak zdefiniowanych fenotypów przekazywanych przez rodziców w potomstwie jest ważna dla identyfikacji i ilościowego określenia fenotypów indukowanych przez system CasRx w transheterozygotycznych progeniach. Również ustawienie krzyżówek kontrolnych przy użyciu much dCasRx równolegle jest również pomocne w wykluczaniu niespecyficznych fenotypów w transheterozygotycznych progenies.
Warto zauważyć, że wyniki te ujawniły problem toksyczności spowodowany wszechobecną ekspresją białka CasRx i dCasRx w locie, co jest ograniczeniem systemu CasRx. Wszechobecna ekspresja CasRx lub dCasRx pod samym promotorem Ubiq, bez gRNA, wiązała się z nietrywialnymi kosztami przystosowania, ponieważ ani muchy Ubiq-CasRx, ani Ubiq-dCasRx nie mogły zostać uznane za linie homozygotyczne. Wręcz przeciwnie, muchy UASt-CasRx i UASt-dCasRx można uznać za zdrowe stada homozygotyczne, chociaż ze względu na konstrukcję schematu krzyżowego były one utrzymywane jako stada podwójnie zrównoważone, co potwierdza istnienie toksyczności wywołanej wszechobecną ekspresją białka CasRx. Innym dowodem potwierdzającym jest to, że w eksperymentach kontrolnych z udziałem dCasRx, który jest katalitycznie nieaktywny, odsetek much przenoszących zarówno konstrukty dCasRx, jak i gRNA w całkowitej liczbie much w pokoleniu F1 był konsekwentnie niższy niż 50%, stosunek oczekiwany na podstawie genetyki mendlowskiej, jeśli nie występowała toksyczność związana z dCasRx. Wskazywało to, że wszechobecna ekspresja dCasRx, wraz z gRNA, indukuje toksyczność u muchy, powodując mniejszy niż oczekiwano współczynnik dziedziczenia. Współczynniki dziedziczenia transheterozygotycznych muszek UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 były zgodne z genetyką mendlowską, co ponownie sugeruje toksyczność wywołaną specyficznie przez wszechobecną ekspresję białek CasRx i dCasRx. Toksyczność w systemie CRISPR/Cas nie jest niczym nowym. Wykazano, że duże ilości białka Cas9 są toksyczne dla kilku organizmów, w tym much 29,30,31,32. W niedawnym badaniu opracowano dostosowany system GAL4/UAS, który może dostroić ilość białka Cas9 wyrażanego u muszek poprzez dodanie otwartej ramki odczytu o różnej długości między sekwencją UAS a sekwencją Cas9 w konstrukcji UAS-Cas933. Dlatego warto zbadać sposoby zmniejszenia toksyczności indukowanej przez CasRx poprzez dostrojenie poziomu ekspresji białka CasRx.
Oprócz toksyczności wywołanej wszechobecną ekspresją białek CasRx i dCasRx, wyniki wykazały również śmiertelność związaną z niespecyficznymi efektami pobocznymi systemu CasRx poza celem, co jest cechą wielu systemów CRISPR1, 2, 7, 34. U niektórych podwójnych lub potrójnych muszek transheterozygotycznych z ekspresją CasRx i nieistotnym genem gRNA, na przykład podczas celowania w Notch, transheterozygotyczne muchy CasRx mają znacznie niższy poziom przeżywalności w porównaniu z transheterozgyous dCasRx. W analizie sekwencyjnej RNA tych transheterozygotycznych muszek z ekspresją CasRx i gRNA zaobserwowano zarówno zmniejszenie poziomów transkryptów genu docelowego, jak i zmniejszenie transkryptów genów niedocelowych. Te efekty uboczne były zależne od CasRx i celu, ponieważ obserwowano je tylko u muszek transheterozygotycznych wykazujących ekspresję zarówno białka CasRx, jak i gRNA. Warto zwrócić uwagę, że jeden z docelowych genów, biały, wykazywał jedynie ograniczoną, nieistotną statystycznie redukcję transkryptów, gdy biały gen był celem CasRx, co kontrastowało z fenotypem wyraźnej redukcji pigmentu. Przypuszcza się, że może to wynikać z faktu, że 1) czas pobierania próbek sekwencyjnych RNA nie był dobrze dostosowany do czasu, w którym biały gen osiąga szczytową ekspresję we wczesnym okresie rozwoju, oraz 2) zlokalizowana ekspresja białego genu w oczach utrudnia pobranie odpowiednich tkanek we wczesnej fazie rozwoju, gdy możliwe jest tylko pobranie próbki z całego ciała. Aby zmniejszyć aktywność uboczną w systemie CasRx, potrzebne są dalsze badania, aby w pełni zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw systemu zjawisk poza celem na poziomie organizmu.
Co ciekawe, niedawne badanie35 opisujące narzędzia Cas13 ukierunkowane na RNA u muszek wydaje się łagodzić ogólną toksyczność związaną z ekspresją CasRx, z kilku możliwych powodów. Po pierwsze, autorzy przekodowali transgeny Cas13 w celu optymalizacji ekspresji u Drosophila i wykorzystali promotor o słabszej ekspresji (aktynę 5C) w porównaniu z promotorem ubikwityny zastosowanym w niniejszym badaniu, co prawdopodobnie prowadzi do niższych poziomów ekspresji Cas13, a tym samym mniejszej toksyczności. Rzeczywiście, jest to poparte obserwacjami, że ekspresja CasRx i dCasRx sterowana przez UASt nie była sama w sobie toksyczna, ponieważ to badanie (i autorzy w 35) nie zaobserwowali żadnej oczywistej śmiertelności u much UASt-CasRx. Co więcej, autorzy ci kodowali swoje gRNA inaczej w porównaniu z tym badaniem, co mogło wpłynąć na ich ekspresję i zmniejszyć toksyczność systemu u transheterozygotycznych muszek Cas13 / gRNA. Na przykład w ich badaniu dwa gRNA uległy ekspresji przy użyciu promotora U6:3 i zostały otoczone tRNA, aby umożliwić przetwarzanie gRNA po dojrzewaniu tRNA bez konieczności CasRx35. I odwrotnie, w tym badaniu gRNA zostały zakodowane jako macierze ukierunkowane na maksymalnie 4 lokalizacje na gen i naśladujące endogenną strukturę macierzy Cas13 występującą u bakterii, która wymaga enzymu Cas13 do przetworzenia każdego gRNA. Te różne podejścia mogły prowadzić do różnic w poziomach ekspresji gRNA i innych czynnikach, które mogą mieć nieodłączny wpływ na toksyczność całego systemu. Wreszcie, Huynh i in. celowali w inne geny niż te, które są celem niniejszego badania, co skutkuje różnicami w interakcji cel-Cas / gRNA i aktywności pobocznej oraz może mieć wpływ na obserwowane poziomy śmiertelności. Te różnice w obserwowanej toksyczności uzasadniają dalsze badania w celu określenia sposobów ulepszenia całych systemów.
Ogólnie rzecz biorąc, badanie to jest pierwszą demonstracją funkcjonalnego, genetycznie kodowanego, programowalnego systemu Cas ukierunkowanego na RNA u D. melanogaster, chociaż konieczna będzie dalsza optymalizacja systemu CasRx (zgodnie z tym, co zgłoszono35) w celu dalszego zmniejszenia śmiertelności związanej z niecelowością i zwiększenia skuteczności rozszczepienia CasRx na celu. Celowanie w RNA za pomocą enzymów Cas to szybko rozwijająca się dziedzina z wieloma potencjalnymi zastosowaniami, od kontroli wektorów owadów po zastosowania terapeutyczne 1,2,3,4,5,6,7, a protokół ten oferuje pakiet startowy dla każdego, kto jest zainteresowany zaprojektowaniem swojego pierwszego systemu CasRx u much, będąc jednocześnie kompatybilnym z dostosowywaniem i dalszą optymalizacją systemu. Przedstawione tu przykłady pokazują szereg wyników, z jakimi można się spotkać podczas wdrażania tego systemu in vivo i mogą służyć jako punkt odniesienia dla innych użytkowników w ocenie wydajności systemu CasRx w ich aplikacjach.

Od czasu pojawienia się technologii CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), większość uwagi w tej dziedzinie skupia się na edycji DNA, która oferuje przełomowe zastosowania w medycynie i biotechnologii1. Trwała zmiana sekwencji DNA nie zawsze jest jednak pożądana ze względów etycznych. W związku z tym w ostatnich badaniach rozpoczęto opracowywanie narzędzi opartych na CRISPR do celowania w RNA i wykazano, że technologie CRISPR mogą być rzeczywiście wykorzystywane do celowania w RNA w różnych systemach biologicznych2,3,4,5,6,7. W wielu z tych testowanych systemów obecnie szeroko stosowanym podejściem do ukierunkowania RNA i redukcji transkryptu jest interferencja RNA (RNAi), która jest daleka od doskonałości, często wykazując różną skuteczność i wysoką aktywność poza celem, gdy jest stosowana in vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. W związku z tym, biorąc pod uwagę status tych technologii, warto dalej badać potencjał narzędzi opartych na CRISPR do celowania w RNA.
Jedno z ostatnich godnych uwagi badań wykazało, że rybonukleaza CasRx, należąca do klasy Cas13d, może skutecznie obniżać poziom transkryptów genów w hodowli komórek ludzkich i posiada atrakcyjny profil poza celem4. Odkrycie to skłoniło do postawienia pytania, czy ta nowa rybonukleaza może utrzymać swoją skuteczność i niski wskaźnik niecelowania w RNA na poziomie organizmu. Niedawne badanie zajęło się tym pytaniem, pokazując, że system CasRx może być wykorzystany do osiągnięcia wszechobecnej i specyficznej tkankowo redukcji transkryptów genów u Drosophila melanogaster5.
Aby usprawnić użyteczność tego niedawno opublikowanego podejścia, ten protokół szczegółowo opisuje metody z tej ostatniej pracy, która składa się z trzech głównych części: 1) wszechobecne celowanie in vivo RNA przy użyciu dwuskładnikowego systemu CasRx; 2) wszechobecne celowanie in vivo w egzogenne RNA z wykorzystaniem trójskładnikowego systemu CasRx; oraz 3) celowanie w swoiste tkankowo RNA in vivo przy użyciu trójskładnikowego systemu CasRx.
Przewodnikowe RNA (gRNA) ukierunkowane na różne geny docelowe pod kontrolą wszędobylskiego promotora zostały zaprojektowane i wygenerowano linie muchowe wyrażające te konstrukty zawierające gRNA. Zaprojektowano również konstrukty CasRx pod kontrolą wszechobecnego promotora lub promotora warunkowej sekwencji aktywacji (UASt) aktywowanego przez czynnik transkrypcyjny GAL4, a linie muchowe zawierające te konstrukty zawierające CasRx zostały wygenerowane. Katalitycznie nieaktywne konstrukty CasRx, dCasRx, zostały zaprojektowane i wykorzystane jako kontrole ujemne. Wszechobecne celowanie w RNA u much osiąga się poprzez krzyżowanie linii muchowych wykazujących ekspresję gRNA z wszechobecnymi liniami muchowymi wykazującymi ekspresję CasRx. Potomstwo wykazujące ekspresję zarówno konstruktu gRNA ukierunkowanego na określony transkrypt genu, jak i białka CasRx, ma wszechobecną redukcję docelowych transkryptów genów. Celowanie w tkankowo swoiste RNA u muszek osiąga się poprzez pierwsze skrzyżowanie muszek wykazujących ekspresję gRNA z muszkami wykazującymi ekspresję UASt-CasRx, uzyskując transheterozygotyczne muchy przenoszące zarówno konstrukty gRNA, jak i UASt-CasRx. Takie muchy z kolei są krzyżowane z muszkami wykazującymi ekspresję GAL4 specyficzną dla tkanki, co skutkuje generowaniem specyficznej tkankowo ekspresji CasRx i celowania w RNA u much.
Programowalny charakter systemu CasRx oferuje możliwość dostosowania i optymalizacji, aby pomóc osiągnąć wysoką skuteczność i niską aktywność poza celem dla celowania in vivo RNA. Potencjalne zastosowania celowania w RNA oparte na CRISPR są liczne, w tym zastąpienie RNAi w laboratorium i przyczynienie się do zwalczania wektorów owadów w środowisku naturalnym. Spośród tych ostatnich jedną z globalnych niezaspokojonych potrzeb jest opracowanie skutecznych narzędzi do zwalczania zakażeń wirusami RNA przenoszonymi przez komary. Wiele wirusów RNA, takich jak denga, Zika i wirus chikungunya, jest przenoszonych przez komary, wpływając na zdrowie ludzi i przyczyniając się do śmiertelności. Przedstawiono wiele propozycji inżynierii populacji komarów z odpornością na wirusy w celu zapobiegania chorobom; jednak żadna obecna technologia nie jest w stanie sprawić, że komary będą jednocześnie odporne na wszystkie znaczące wirusy RNA18,19,20,21,22,23. Systemy CAS ukierunkowane na RNA mogą stanowić punkt wyjścia dla takiej technologii, umożliwiając programowalną platformę do celowania we wszystkie wirusy RNA przenoszone przez komary.

<table><tbody><tr><td>100% sok winogronowy</td><td>Welch Foods Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr> aktywnych <tr><td>suchych drożdży (908g)</td><td>Red Star Yeast Company, LLC</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>DMC4500 kolorowego aparatu</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC4500</td><td></td></tr><tr><td>System testowy reporterowy z podwójną lucyferazyą</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-GMR leci</td><td>Centrum Magazynowe Bloomington Drosophila</td><td>29967</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-y muchy</td><td>Centrum Magazynowe Bloomington Drosophila</td><td>44373</td><td></td></tr><tr><td>Luminometr Glomax 20/20</td><td>Promega</td><td>E5331</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencer Illumina HiSeq2500</td><td>Illumina, Inc.</td><td>Stereoskopowy fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy HiSeq2500</td><td></td></tr><tr><td>M165FC</td><td>Leica Microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop OneC Spektrofotometr UV-vis</td><td>ThermoFisher</td><td>NDONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Zestaw do przygotowania biblioteki RNA</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>E7770</td><td></td></tr><tr><td>plazmid # 112686</td><td>Addgene</td><td>112686</td><td></td></tr><tr><td>plazmid # 112688</td><td>Addgene</td><td>112688</td><td></td></tr><tr><td>plazmid # 132416</td><td>Addgene</td><td>132416</td><td></td></tr><tr><td>plazmid # 132417</td><td>Addgene</td><td>132417</td><td></td></tr><tr><td>plazmid # 132419</td><td>Addgene</td><td>132419</td><td></td></tr><tr><td>plazmid # 132420</td><td>Addgene</td><td>132420</td><td></td></tr><tr><td>plazmid # 132421</td><td>Addgene</td><td>132421</td><td></td></tr><tr><td>plazmid # 132422</td><td>Addgene</td><td>132422</td><td></td></tr><tr><td>plazmid # 132425</td><td>Addgene</td><td>132425</td><td></td></tr><tr><td>plazmid # 132426</td><td>Addgene</td><td>132426</td><td></td></tr><tr><td>plazmid # 133304</td><td>Addgene</td><td>133304</td><td></td></tr><tr><td>plazmid # 164586</td><td>Addgene</td><td>164586</td><td></td></tr><tr><td>plazmid #132418</td><td>Addgene</td><td>132418</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pJFRC81</td><td>Addgene</td><td>36432</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleazy restrykcyjne AscI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0558L</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleazy restrykcyjne NotI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleazy restrykcyjne PacI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleazy restrykcyjne PstI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0140L</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleazy restrykcyjne SwaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0604L</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleazy restrykcyjne XbaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0145L</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Zestaw Pico do bioanalizatora</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-Fluc muchy</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84125</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-GFP; Muchy OpIE2-GFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84986</td><td></td></tr><tr><td>Muchy U6-3:4-gRNA-N</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84122</td><td></td></tr><tr><td>Muchy U6-3:4-gRNA-w</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>Muchy U6-3:4-gRNA-y</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84123</td><td></td></tr><tr><td>Muchy UASt-CasRx</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centrum</td><td>84121</td><td></td></tr><tr><td>UASt-dCasRx leci</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84120</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-CasRx leci</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84118</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-dCasRx leci</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84119</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla leci</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84127</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy do odzyskiwania DNA Zymoclean Gel</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>D4007</td><td></td></tr></tbody></table>

wszechobecne i specyficzne tkankowo celowanie rna u drosophila melanogaster przy użyciu crispr/casrx

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

CasRx, członek rodziny Cas13 ukierunkowanej na RNA, jest obiecującym nowym dodatkiem technologii CRISPR/Cas do efektywnej redukcji transkryptów genów z atrakcyjnym profilem off-target zarówno na poziomie komórkowym, jak i organizmu. Niedawno pojawiły się doniesienia, że system CRISPR/CasRx może być wykorzystany do osiągnięcia wszechobecnej i specyficznej tkankowo redukcji transkryptów genów u Drosophila melanogaster. Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje metody z ostatnich prac, składające się z trzech części: 1) wszechobecne celowanie w endogenne RNA in vivo przy użyciu dwuskładnikowego systemu CasRx; 2) wszechobecne celowanie in vivo w egzogenne RNA z wykorzystaniem trójskładnikowego systemu CasRx; oraz 3) celowanie w tkankowo specyficzne RNA in vivo przy użyciu trójskładnikowego systemu CasRx. Zaobserwowane efekty celowania w RNA obejmują zmiany fenotypowe specyficzne dla docelowego genu, ukierunkowaną redukcję transkryptu RNA oraz sporadyczne fenotypy śmiertelności związane z wysoką ekspresją białka CasRx i aktywnością poboczną. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te pokazały, że system CasRx jest zdolny do celowej redukcji transkryptu RNA na poziomie organizmu w programowalny i skuteczny sposób, demonstrując, że celowanie i inżynieria transkryptomu in vivo są wykonalne i stanowią podstawę dla przyszłych technologii celowania RNA opartych na CRISPR in vivo.

Szeroko zakresłe celowanie w RNA in vivo przy użyciu dwuskładnikowego systemu CasRx 
Muchy transheterozygotyczne F1 wykazujące ekspresję zarówno konstruktów Ubiq-CasRx, jak i gRNA (celujących w geny endogenne i egzogenne) wykazały wyraźne fenotypy w porównaniu z muchami kontrolnymi wykazującymi ekspresję konstruktów Ubiq-dCasRx i gRNA (Ryc. 2 oraz Ryc. 4). W szczególności muchy transheterozygotyczne CasRx charakteryzowały się znacznie niższym wskaźnikiem przeżywalności w porównaniu z muchami transheterozygotycznymi dCasRx, co wskazuje na toksyczność systemu Ubiq-CasRx (Ryc. 2A i Ryc. 4A). Warto zauważyć, że zarówno muchy transheterozygotyczne CasRx, jak i dCasRx wykazują wskaźnik dziedziczenia poniżej 50%, co jest spodziewanym stosunkiem opartym na genetyce mendlowskiej. Z trzech genów docelowych, muchy Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ oraz Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAy/+ są nieżywotne (0% dziedziczenia) i nie przekroczyły stadium drugiego poczwalnego larwy (Ryc. 2A-2B). Przeżywające muchy Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAw/+, których wskaźnik dziedziczenia wyniósł 12,9%, wykazały wyraźny, w pełni penetrujący fenotyp białych oczu (Ryc. 2B). Oprócz obserwowalnych cech związanych z CasRx, udało nam się potwierdzić znaczną redukcję transkrypty genów docelowych dla 3 genów: Notch, yellow oraz GFP (Ryc. 2E-2G). Redukcję transkryptów genu white zaobserwowano u much Ubiq-CasRx/+, U6-gRNAw/+ w porównaniu z kontrolnymi muchami Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAw/+, choć redukcja ta nie była statystycznie istotna (Ryc. 2E - 2F). Dowody na aktywność poza celową (off-target) indukowaną przez CasRx znaleziono podczas porównywania transkryptów o zróżnicowanej ekspresji między próbkami z much wykazujących ekspresję CasRx a próbkami z much wykazujących ekspresję dCasRx (Ryc. 2E, 2G). Liczba transkryptów pozacelowych o istotnie zróżnicowanej ekspresji przedstawia się następująco: white, 253 (1,4% wszystkich transkryptów); Notch, 30 (1,7%); yellow, 41 (0,23%); GFP, 5 80 (3%) (Ryc.2G). Spośród łącznie 17 79 różnych transkryptów, 6 transkryptów pozacelowych wykazywało istotnie zróżnicowaną ekspresję we wszystkich 4 grupach próbek. Jednym z 6 zidentyfikowanych transkryptów był Gadd45, gen zaangażowany w apoptozę i zatrzymanie cyklu komórkowego u much, co sugeruje możliwość, że enzymatyczne działanie CasRx może bezpośrednio wywoływać apoptozę komórkową lub pośrednio wywoływać błędną ekspresję innych genów, co z kolei prowadzi do apoptozy. Na koniec warto zaznaczyć, że muchy Ubiq-CasRx i Ubiq-dCasRx nie zostały ustanowione jako linie homozygotyczne, prawdopodobnie z powodu toksyczności wynikającej z wysokiej powszechnej ekspresji. W konsekwencji do krzyżowania z homozygotycznymi liniami much gRNA wykorzystano muchy heterozygotyczne Ubiq-CasRx/CyO i Ubiq-dCasRx/CyO. Podsumowując, dwuskładnikowy system Ubiq-CasRx pozwala na powszechne celowanie w RNA zarówno w przypadku celów endogennych, jak i egzogennych, co skutkuje obserwowalnymi fenotypami i redukcją transkrypty. Wyniki te wykazały również, że celowanie w RNA za pośrednictwem CasRx może wprowadzać toksyczność in vivo.
Wszechobecne celowanie w egzogenne RNA in vivo z wykorzystaniem trójskładnikowego systemu CasRx 
Wyniki dwuetapowego krzyżowania wykazały, że pomimo egzogennego charakteru genu docelowego (tj. Fluc), ekspresja wszystkich trzech transgenów u potrójnych transheterozygot F2 (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) doprowadziła do 10% letalności w porównaniu z krzyżowaniami kontrolnymi z użyciem Ubiq-dCasRx, gdzie u potrójnych transheterozygot F2 (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) nie zaobserwowano letalności (Rycina 3B-C). Bardziej szczegółowo, tylko kombinacja wszystkich trzech transgenów (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) spowodowała 10% letalność (Rycina 3B oraz D), podczas gdy genotypy (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6) oraz (Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) były żywotne i nie wykazywały fenotypów, a ich wskaźniki dziedziczenia były zgodne z oczekiwanymi prawami Mendla. Sugeruje to, że dostępność sekwencji docelowej (tj. lucyferazy świetlikowej) w połączeniu z Ubiq-CasRx/+ i gRNAFluc&#160;przyczynił się do zaobserwowanych fenotypów letalności, co prawdopodobnie wynika z aktywności kolateralnej enzymów Cas132,8. Ponadto, u transheterozygot F1 (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ lub Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) nie zaobserwowano wyraźnych fenotypów ani gwałtownego wpływu na dziedziczenie w porównaniu z kontrolami Ubiq-dCasRx (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ lub Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) (Rycina 3B), co wskazuje, że do uzyskania obserwowanych fenotypów letalności niezbędny jest katalitycznie aktywny enzym. Co więcej, poziomy ekspresji Fluc i Rluc u much wszystkich żywotnych genotypów nie wykazały znaczącej redukcji ekspresji Fluc u potrójnych transheterozygot Ubiq-dCasRx (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) w porównaniu z kontrolami z podwójnym reporterem lucyferazy. Sugeruje to, że poziomy ekspresji białka Fluc nie zostały obniżone przez celowanie dCasRx (Rycina 3D). Podsumowując, wspólny fenotyp letalności w dwóch różnych eksperymentach wszechobecnego celowania w RNA za pomocą CasRx wskazuje, że przy zastosowaniu w tkankach w sposób wszechobecny, celowanie w RNA za pośrednictwem CasRx może być toksyczne dla organizmu.
Tkankowo specyficzne celowanie w RNA in vivo z wykorzystaniem trójskładnikowego systemu CasRx 
Wysoki poziom toksyczności zaobserwowany w eksperymentach powszechnego celowania w RNA skłonił nas do zbadania tkankowo specyficznego celowania w RNA z wykorzystaniem trójskładnikowego systemu CasRx, którego projekt szczegółowo opisano w sekcji metod. Rzeczywiście, poziom zaobserwowanej toksyczności uległ zmniejszeniu, gdy ogólna ekspresja CasRx została obniżona przy użyciu promotora UASt w porównaniu z promotorem Ubiq; egzemplifikuje to trzy aspekty: 1) linie UASt-CasRx i UASt-dCasRx utrzymywano jako linie homozygotyczne, choć w oparciu o dwuetapowy schemat krzyżowania do przeprowadzania krzyżówek użyto podwójnie zrównoważonych linii UASt-CasRx i UASt-dCasRx, 2) wszystkie wskaźniki dziedziczenia potrójnych transheterozygot dCasRx w pokoleniu F2 odpowiadały oczekiwanemu 25% wskaźnikowi dziedziczenia mendlowskiego oraz 3) fenotyp letalności potrójnych transheterozygot CasRx w pokoleniu F2 był umiarkowanie zredukowany. W eksperymencie celowania w white, z 25% oczekiwanych wskaźników dziedziczenia mendlowskiego w potrójnych transheterozygotach F2, zaobserwowano jedynie 0,57% żywych dorosłych much (UASt-CasRx/+; gRNAw/GMR-Gal4), z których wszystkie wykazywały ciężkie fenotypy pigmentacji i morfologii specyficzne dla oka (Rycina 4A i 4B). W przypadku krzyżowania celowanego w white, wskaźnik dziedziczenia potrójnych transheterozygot F2 wykazujących ekspresję CasRx był znacząco niższy niż w grupie kontrolnej potrójnych transheterozygot wykazujących ekspresję dCasRx (27,6%) (Rycina 4A). W eksperymencie celowania w Notch, potrójne transheterozygoty wykazujące ekspresję CasRx i posiadające wszystkie trzy transgeny były w 10% letalne, podczas gdy wskaźnik dziedziczenia kontroli dCasRx wynosił 29,3% (Rycina 4A). W eksperymencie celowania w yellow, potrójne transheterozygoty F2 wykazujące ekspresję CasRx, gRNAy oraz y-GAL4 wykazywały marginalną redukcję pigmentu chitynowego w postaci małych żółtych plamek kutykuli na klatce piersiowej i odwłoku, przy wskaźniku dziedziczenia wynoszącym 2,67%, co było znacznie niższe niż w grupie kontrolnej dCasRx (25,2%) (Rycina 4A). Wszystkie kontrolne potrójne transheterozygoty dCasRx nie wykazywały oczywistych fenotypów takich jak muchy wykazujące ekspresję CasRx, co wskazuje, że aktywność katalityczna CasRx przyczyniła się do zaobserwowanych fenotypów. Niski wskaźnik dziedziczenia w grupie potrójnych transheterozygot CasRx zasugerował, że w celowaniu w RNA za pomocą CasRx istnieją dwa źródła toksyczności: jedno wiąże się z wysoką ekspresją CasRx, której toksyczność została zredukowana przez ograniczoną ekspresję CasRx, a drugie wiąże się z aktywnością poboczną. Podsumowując, wyniki te wykazały, że system CasRx może umożliwiać tkankowo specyficzne celowanie w RNA in vivo poprzez wykorzystanie klasycznego systemu Gal4/UASt, a jednocześnie redukować toksyczność. Niemniej jednak, toksyczność i sporadyczne fenotypy letalności były nadal obserwowane, choć na niższym poziomie nasilenia w porównaniu z podejściami powszechnymi, co wskazuje, że aktywność cięcia pobocznego wiąże się z toksycznością.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Ogólny przegląd targetowania RNA z wykorzystaniem systemu Cas13D. (A) Schematy jednokrokowego krzyżowania genetycznego w powszechnym targetowaniu RNA in vivo z użyciem dwuskładnikowego systemu CasRx. (B) Schematy dwukrokowego krzyżowania genetycznego w powszechnym&#160;targetowaniu egzogennego RNA in vivo z użyciem trójskładnikowego systemu CasRx. (C) Schematy dwukrokowego krzyżowania genetycznego w tkankowo specyficznym targetowaniu RNA in vivo z użyciem trójskładnikowego systemu CasRx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig02.jpg" /> 
Rycina 2: Powszechne celowanie w RNA in vivo przy użyciu dwuskładnikowego systemu CasRx (reprodukowano5). (A) Całkowite procenty dziedziczenia much transheterozygotycznych dziedziczących Ubiq-CasRx (lub Ubiq-dCasRx) oraz gRNA. Niebieskie zacieniowanie na wykresie pudełkowym wskazuje penetrację fenotypową. (B) Fenotypy much transheterozygotycznych. Strzałki wskazują nekrozę tkanek w oku. Czarno-biała mucha oznaczona znakiem „X” reprezentuje letalność. (C) Całkowite procenty dziedziczenia much transheterozygotycznych w krzyżowaniach dwukierunkowych między muchami Ubiq-CasRx (lub Ubiq-dCasRx) a gRNAGFP-OpIE2-GFP. M – dziedziczenie CasRx po linii matczynej; P – dziedziczenie CasRx po linii ojcowskiej. (D) Potomstwo larwalne F1 w krzyżowaniu ojcowskim. (E) Oceny maximum a posteriori transkryptów dla logarytmicznej zmiany krotności (logarithmic fold change). Wykorzystano potok analizy DESeq2. (F) Liczba transkryptów na milion (TPM) celowanych za pomocą CasRx lub dCasRx. (G) Procent transkryptów o różnicowej ekspresji zależnej od CasRx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig03.jpg" /> 
Rycina 3: Powszechne celowanie w egzogenne RNA in vivo przy użyciu trójskładnikowego systemu CasRx. (A) Schematy dwuetapowego krzyżowania genetycznego. (B) Całkowite procenty dziedziczenia dla wszystkich genotypów pojawiających się w pokoleniu F2. Dziedziczenie wszystkich trzech transgenów (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc oraz gRNAFLuc) w potomstwie F2 skutkowało 10% letalnością i było znacząco niższe w porównaniu z kontrolną grupą potrójnych transheterozygot Ubiq-dCasRx (p = 0.01, test t). (C) Obecność samego Ubiq-CasRx/gRNAFluc lub samego Ubiq-CasRx i Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc nie prowadziła do silnej letalności, a stosunki dziedziczenia między transheterozygotami Ubiq-CasRx i Ubiq-dCasRx nie różniły się znacząco (odpowiednio p = 0.41 i p = 0.51, test t). (D) Stosunki lucyferazy normalizujące odczyty Fluc do odczytów Rluc. Muchy potrójnie transheterozygotyczne wykazujące ekspresję Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc i gRNAFLuc wykazywały letalność zarodkową, co oznaczono muchą z symbolem „X”, w związku z czym nie zmierzono ekspresji lucyferazy. Stosunek Fluc/Rluc transheterozygot Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb był znacząco niższy niż w pozostałych grupach wykazujących ekspresję Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc (p = 1.2e-06 lub mniej, test t). Wyniki z grupy z samym gRNAFLuc były znacząco niższe niż we wszystkich pozostałych grupach (p = 1.2e-06 lub mniej, test t). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Tkankowo specyficzne celowanie w RNA in vivo z wykorzystaniem trójskładnikowego systemu CasRx (reprodukowano5). (A) Całkowity procent dziedziczenia u potrójnie transheterozygotycznych much niosących trzy transgeny (UASt-CasRx lub UASt-dCasRx, gRNA oraz driver Gal4). (B) Fenotypy potrójnie transheterozygotycznych much. Biała strzałka wskazuje redukcję pigmentu chitynowego w klatce piersiowej. Czarno-biała mucha oznaczona symbolem „X” oznacza letalność. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Konstrukt</td>
			<td>Opis</td>
			<td>Starter</td>
			<td>Sekwencja startera (5’ do 3’)</td>
			<td>Matryca PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">OA-1050E</td>
			<td rowspan="2">CasRx</td>
			<td>1050E.C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC 
			ATCTATTTTGAC 
			CCGCAGATTAATTA 
			ATGAGCCCCAAGA 
			AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1050E.C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA 
			TTTTAAAAACGATT 
			CATTCTAGCTAGCT 
			TAAGCGTAATCTGG 
			AACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">OA-1050R</td>
			<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050E.C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC 
			ATCTATTTTGAC 
			CCGCAGATTA 
			ATGAGCCCCAAGA 
			AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1050E.C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA 
			TTTTAAAAACGATT 
			CATTCTAGCTAGCT 
			TAAGCGTAATCTG 
			GAACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">OA-1050L</td>
			<td rowspan="2">promotor UASt</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTCGA 
			CGGTCACGGCGG 
			GCATGTCGACGC 
			GGCCGCAACCAA 
			CAACACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1041.C1</td>
			<td>CTGGCCTCCACC 
			TTTCTCTTCTTCT 
			TGGCTCATGT 
			TTAAACCCAATT 
			CCCTATTCAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">CasRx</td>
			<td>1050L.C1</td>
			<td>AATACAAGAAGA 
			GAACTGAATA 
			GGGAATTGGGT 
			TTAAACATGAGC 
			CCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pCasRx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1050E.C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT 
			TATTTTAAAAAC 
			GATTCATTCTA 
			GCTAGCTTAAG 
			CGTAATCTGGA 
			ACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">OA-1050S</td>
			<td rowspan="2">promotor UASt</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTC 
			GACGGTCACG 
			GCGGGCATGT 
			CGACGCGGCC 
			GCAACCAACAA 
			CACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1041.C1</td>
			<td>CTGGCCTCCA 
			CCTTTCTCTTC 
			TTCTTGGCT 
			CATGTTTAAAC 
			CCAATTCCCTA 
			TTCAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050L.C1</td>
			<td>AATACAAGAAG 
			AGAACTGAAT 
			AGGGAATTGGG 
			TTTAAACATGAG 
			CCCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pdCasRx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1050E.C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT 
			TATTTTAAAAAC 
			GATTCATTCTAG 
			CTAGCTTAAGCG 
			TAATCTGGAACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">OA-1043</td>
			<td rowspan="2">promotor U6:3</td>
			<td>1043.C1</td>
			<td>GGGAATTGGGA 
			ATTGGGCAATAT 
			TTAAATGGCGGC 
			GCGCCGAATTCT 
			TTTGCTCACCT</td>
			<td rowspan="2">plazmid Addgene nr 164586</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1043.C23</td>
			<td>ACACTAGTGGAT 
			CTAGGTAC 
			CGTTGCGGCCG 
			CAAAAAAGTTGT 
			AATAGCCCCTCA 
			AAACTGGACCTT 
			CCACAACTGCAG 
			CCGACGTTAAAT 
			TGAAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">OA-1052B</td>
			<td rowspan="2">promotor Ubiq</td>
			<td>1052B.C1</td>
			<td>GGGAATTGGGCA 
			ATATTTAAATGGC 
			GGCTGCAGCGC 
			GCAGATCGCCGAT</td>
			<td rowspan="2">Plazmid Addgene nr 12686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1052B.C2</td>
			<td>TTTCTTTATGTTT 
			TTGGCGTCTTCC 
			ATCCTAGGTCTG 
			CGGGTCAAAATA 
			GAGATG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">T2A-eGFP</td>
			<td>908A1</td>
			<td>ATAAAGGCCAAG 
			AAGGGCGGAAA 
			GATCGCCGTGG 
			AGGGCAGGA 
			AGTCTTCTAACAT 
			GC</td>
			<td rowspan="2">plazmid Addgene nr 12686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>908A2</td>
			<td>TTGTTATTTTAAAA 
			ACGATTCATTCTA 
			GGCGATCGCTTA 
			CTTGTACAGCTC 
			GTCCATGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Odwrócony promotor Ubiq</td>
			<td>908A3</td>
			<td>ACCGTGACCTAC 
			ATCGTCGACACTA 
			GTGGATCTCTAGA 
			CGCAGATCGC 
			CGATG</td>
			<td rowspan="2">Plazmid Addgene nr 12686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>908A4</td>
			<td>GGATCATAAACTT 
			TCGAAGTCATGC 
			GGCCGCTCTGCG 
			GGTCAAAATAG 
			ATGT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista konstruktów molekularnych i starterów użytych w niniejszym badaniu. Lista ta obejmuje wszystkie konstrukty (zarówno identyfikator, jak i opis) oraz powiązane z każdym konstruktem startery (zarówno identyfikator, jak i sekwencje (5' do 3')) oraz użyte matryce.

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół użycia enzymu Cas13D ukierunkowanego na RNA (RfxCas13D) u much.

Wszechobecne i specyficzne tkankowo celowanie RNA u Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR/CasRx

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

Jak pokazuje nasz protokół, technologie CRISPR CasRx mogą być wykorzystywane do osiągania wszechobecnych i specyficznych dla tkanek redukcji transkryptów genów u muszek owocowych. Nasza technika oferuje pakiet startowy dla każdego, kto jest zainteresowany wykorzystaniem redukcji transkryptów genów w oparciu o CRISPR u muszek owocowych, a jednocześnie jest kompatybilna z dalszym dostosowywaniem i optymalizacją. Aby skonfigurować wszechobecne celowanie RNA in vivo przy użyciu dwuskładnikowego systemu CasRx, zbierz 10 dziewiczych dorosłych samic much z homozygotycznej linii gRNA i pięć dorosłych samców much ze zrównoważonej heterozygotycznej Ubiq CasRx CurlyO.Umieścić muszki rodzicielskie w fiolce uzupełnionej 100 mikrogramami suchych drożdży w proszku i przechowywać fiolki przez 48 godzin w temperaturze 26 stopni Celsjusza. Obserwuj fiolki codziennie, aby zobaczyć, czy z łona pokolenia F1 wyłoniło się jakieś nowe dorosłe potomstwo i znieczulij któregokolwiek z dorosłych dwutlenkiem węgla przez 10 sekund. Gdy muchy staną się nieruchome, opróżnij fiolkę na podkładkę połączoną ze zbiornikiem dwutlenku węgla z ciągłym dwutlenkiem węgla i użyj kolorowej kamery podłączonej do fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby ocenić i zobrazować fenotypy much.Następnie policz liczbę potomstwa o różnych fenotypach, zgodnie z ekspresją sygnału fluorescencyjnego. W oparciu o genetykę mendlowską, oczekuje się, że 50% potomstwa będzie wykazywać ekspresję docelowego RNA. Należy zauważyć, że toksyczność systemu Ubiq CasRx może zmniejszyć stosunek docelowego potomstwa wykazującego ekspresję RNA do mniej niż 50% Aby ustawić wszechobecne celowanie egzogennego RNA in vivo przy użyciu trójskładnikowego systemu CasRx, należy zebrać od ośmiu do 10 dziewiczych dorosłych samic much z podwójnej linii ekspresji lucyferazy i czterech do pięciu dorosłych samców much ze zrównoważonej heterozygotycznej Ubiq CasRx Curly plus TM6, Linia STB, która jednocześnie wykazuje białe oczy, kręcone skrzydła i czerwoną fluorescencję ds.Umieść krok rodzicielski w fiolce uzupełnionej 100 mikrogramami suchych drożdży w proszku i hoduj tę krzyżówkę przez 48 godzin w temperaturze 26 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji należy usunąć wszystkie muchy rodzicielskie z każdej fiolki i umieścić fiolki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 26 stopni Celsjusza na co najmniej 14 dni. W ciągu 14 dni, jak wspomniano wcześniej, zbierz od 8 do 10 dziewic z homozygotycznej lucyferazy świetlika, celując trzykrotnie w linię gRNA.Obserwuj fiolki krzyżowe kroku pierwszego każdego dnia, aby sprawdzić, czy z poczwarek wyłoniło się jakieś nowe dorosłe potomstwo, znieczulając dwutlenkiem węgla, aby umożliwić zebranie czterech do pięciu samców muchy wyrażających zarówno Ubiq CasRx, jak i podwójny reporter lucyferazy, jeśli są dostępne. Umieść muchy w nowej fiolce z 10 dziewiczymi samicami lucyferazy muszki owocowej ukierunkowanej na linię gRNA i umieść te krzyżówki w temperaturze 26 stopni Celsjusza na 48 godzin. Zbierz kolejne pięć jednodniowych samców wyrażających zarówno Ubiq CasRx, jak i reporter podwójnej lucyferazy z fiolek krzyżowych kroku pierwszego i inkubuj muchy przez dwa do czterech dni w samej temperaturze 26 stopni Celsjusza przed przeniesieniem ich do wirówki o pojemności 1,5 mililitra do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji należy wyjąć wszystkie fiolki rodzicielskie z każdej z fiolek krzyżowych kroku drugiego. I włóż fiolki z powrotem do inkubatora o temperaturze 26 stopni Celsjusza na co najmniej 20 dni. Obserwuj krok drugi fiolki krzyżowe każdego dnia, aby sprawdzić, czy z łona wyłoniło się jakieś nowe dorosłe potomstwo, znieczulając muchy dwutlenkiem węgla, gdy stają się dostępne, oraz oceniając i obrazując ich fenotypy, jak pokazano.Genetyka mendlowska sugeruje, że jeśli wszystkie muchy są zdolne do życia, 25% potomstwa powinno wyrażać docelowe RNA. Aby przeprowadzić test lucyferazy, wygeneruj potrójne muchy heterozygotyczne trans, a także muchy kontrolne, jak pokazano. Zbieranie samców much po urodzeniu i starzenie ich do trzeciego dnia życia.Przenieś trzydniowe muchy do 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych i poddaj je lizie za pomocą buforu w buforze do lizy lucyferazy z dostępnego na rynku zestawu do oznaczania lucyferazy. Następnie użyj pięciu mikrolitrów zlizowanej tkanki z każdej próbki i luminometru, aby zmierzyć zarówno muszki owocowe, jak i aktywność lucyferazy, zgodnie ze standardowymi protokołami testów lucyferazy. F1, trans heterozygotyczne CasRx, mają znacznie niższe wskaźniki przeżycia w porównaniu z trans heterozygoycznymi muchami dCasRx.Potwierdzając toksyczność systemu Ubiq CasRx trzech docelowych genów, heterozygotyczne muchy U6 gRNA Y są niezdolne do życia i nie wyrastają poza stadium larwalne drugiego stadium rozwojowego. Heterozygotyczne muchy Ubq, CasRx i U6 gRNA W, które przeżyły, wykazują wyraźny, w pełni penetrujący fenotyp o szerokich oczach. Ponadto obserwuje się również znaczne zmniejszenie transkryptów genów docelowych dla trzech genów docelowych.Dowody na aktywność poza celem indukowaną przez CasRx obserwuje się również, gdy porównuje się transkrypty o zróżnicowanej ekspresji między próbkami od much z ekspresją CasRx a próbkami od much z ekspresją dCasRx. W dwuetapowym krzyżowaniu tylko połączenie wszystkich trzech genów trans skutkuje 100% śmiertelnością. Gdy stosuje się celowanie w swoiste tkankowo RNA przy użyciu trzyskładnikowego systemu CasRx, poziom toksyczności zmniejsza się, gdy ogólna ekspresja CasRx jest obniżona przy użyciu promotora UAST w porównaniu z promotorem Ubiq.Ważne jest, aby prawidłowo ustawić proces genetyczny przy użyciu much o prawidłowej płci i prawidłowych fenotypach.

ubiquitous-tissue-specific-rna-targeting-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykazano, że interferencja RNA jest bardzo skuteczną metodą analizy funkcji genów w rozwoju tchawki Drosophila. Przedstawiono szczegółowy protokół stosowany w laboratorium Jiang do wstrzykiwania dsRNA do embrionów muchy w celu wyciszenia ekspresji genów. Technika ta daje możliwość przesiewania genów niezbędnych do rozwoju tkanek i narządów u Drosophila.

Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

Celem tej publikacji jest wizualizacja i dyskusja na temat etapów działania protokołu Enhanced Northern Blot na RNA ekstrahowanym z zarodków, komórek i tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten jest szczególnie przydatny do skutecznego wykrywania małych gatunków RNA.

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy metodę generowania specyficznych dla tkanek binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez zastąpienie pierwszego kodującego eksonu genów sterownikami transkrypcji. Metoda oparta na CRISPR/Cas9 umieszcza sekwencję transaktywatora pod endogenną regulacją zastąpionego genu, a w konsekwencji ułatwia ekspresję transktywatora wyłącznie we wzorcach czasoprzestrzennych specyficznych dla genu.

Skuteczna strategia generowania specyficznych tkankowo binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez edycję genomu

Prezentowany tutaj jest protokół użycia systemu CRISPR-Cas9 do zmniejszenia produkcji białka w mózgu dorosłej pszczoły miodnej w celu zbadania swoistości przeciwciał.

Testowanie przeciwciał przeciwko receptorom anty-RDL i anty-mGlutR1 w skrawkach mózgu pszczoły miodnej przy użyciu CRISPR-Cas9

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Tutaj prezentujemy uproszczony protokół endogennego znakowania genów dla Drosophila, który wykorzystuje technikę opartą na PCR do bezmarkerowej identyfikacji udanych modyfikacji genetycznych, ułatwiając rozwój stabilnych linii knock-in.

Jednoetapowa strategia endogennego znakowania genów w oparciu o CRISPR u Drosophila melanogaster

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Poznaj metody wszechobecnego i specyficznego tkankowo celowania RNA przy użyciu CRISPR/CasRx u Drosophila melanogaster. Protokoły umożliwiają programowalną redukcję transkryptów z oceną fenotypową i molekularną.

Wszechobecne i specyficzne tkankowo celowanie RNA u Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR/CasRx

Przeglądaj więcej filmów