Name: 4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę obrazowania czasowego morfogenezy kubka wzrokowego u zarodków Danio rerio za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia dynamiczną analizę procesów komórkowych podczas rozwoju oka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni byłym i obecnym członkom Kwan Lab za pracę nad podejściem timelapse i dyskusje na temat tego protokołu. Prace te były wspierane przez NIH (EY025378 R01 i EY025780 R01 do KMK; F31 EY030758 do SL; i T32 GM007464 do MAC).

<ol><li>Adler, R., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+optic+vesicle+development%3A+complexities%2C+ambiguities+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of optic vesicle development: complexities, ambiguities and controversies.</a> Developmental Biology. 305 (1), 1-13 (2007).</li>
<li>Chow, R. L., Lang, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+eye+development+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early eye development in vertebrates.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).</li>
<li>Fuhrmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+morphogenesis+and+patterning+of+the+optic+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle.</a> Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).</li>
<li>Martinez-Morales, J. R., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Shaping the vertebrate eye.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 19 (5), 511-517 (2009).</li>
<li>Yang, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+cell-extrinsic+growth+factors+in+vertebrate+eye+pattern+formation+and+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Roles of cell-extrinsic growth factors in vertebrate eye pattern formation and retinogenesis.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 15 (1), 91-103 (2004).</li>
<li>Bogdanovic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb%2FNumbl-Opo+antagonism+controls+retinal+epithelium+morphogenesis+by+regulating+integrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Numb/Numbl-Opo antagonism controls retinal epithelium morphogenesis by regulating integrin endocytosis.</a> Developmental Cell. 23 (4), 782-795 (2012).</li>
<li>Bryan, C. D., Casey, M. A., Pfeiffer, R. L., Jones, B. W., Kwan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+cup+morphogenesis+requires+neural+crest-mediated+basement+membrane+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Optic cup morphogenesis requires neural crest-mediated basement membrane assembly.</a> Development. 147 (4), (2020).</li>
<li>Bryan, C. D., Chien, C. B., Kwan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+laminin+alpha+1+results+in+multiple+structural+defects+and+divergent+effects+on+adhesion+during+vertebrate+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss of laminin alpha 1 results in multiple structural defects and divergent effects on adhesion during vertebrate optic cup morphogenesis.</a> Developmental Biology. 416 (2), 324-337 (2016).</li>
<li>Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2FEphrin+signalling+maintains+eye+field+segregation+from+adjacent+neural+plate+territories+during+forebrain+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis.</a> Development. 140 (20), 4193-4202 (2013).</li>
<li>England, S. J., Blanchard, G. B., Mahadevan, L., Adams, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+fate+map+of+the+forebrain+shows+how+vertebrate+eyes+form+and+explains+two+causes+of+cyclopia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A dynamic fate map of the forebrain shows how vertebrate eyes form and explains two causes of cyclopia.</a> Development. 133 (23), 4613-4617 (2006).</li>
<li>Gordon, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+cell+motility+and+optic+fissure+and+stalk+formation+during+vertebrate+eye+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates cell motility and optic fissure and stalk formation during vertebrate eye morphogenesis.</a> Development. 145 (22), (2018).</li>
<li>Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precocious+acquisition+of+neuroepithelial+character+in+the+eye+field+underlies+the+onset+of+eye+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis.</a> Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+choreography+of+cell+movements+shapes+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye.</a> Development. 139 (2), 359-372 (2012).</li>
<li>Martinez-Morales, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ojoplano-mediated+basal+constriction+is+essential+for+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis.</a> Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).</li>
<li>Miesfeld, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+and+Taz+regulate+retinal+pigment+epithelial+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Yap and Taz regulate retinal pigment epithelial cell fate.</a> Development. 142 (17), 3021-3032 (2015).</li>
<li>Nicolas-Perez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cellular+behavior+and+cytoskeletal+dynamics+reveal+a+constriction+mechanism+driving+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Analysis of cellular behavior and cytoskeletal dynamics reveal a constriction mechanism driving optic cup morphogenesis.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Picker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+coupling+of+pattern+formation+and+morphogenesis+in+the+developing+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000214(2009).</li>
<li>Rembold, M., Loosli, F., Adams, R. J., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+cell+migration+serves+as+the+driving+force+for+optic+vesicle+evagination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination.</a> Science. 313 (5790), 1130-1134 (2006).</li>
<li>Sidhaye, J., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+action+of+neuroepithelial+basal+shrinkage+and+active+epithelial+migration+ensures+efficient+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+issue+of+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish issue of Development.</a> Development. 139 (22), 4099-4103 (2012).</li>
<li>Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR-Cas9-based+methods+for+generating+deletion+mutations+and+F0+embryos+that+lack+gene+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR-Cas9-based methods for generating deletion mutations and F0 embryos that lack gene function in zebrafish.</a> Developmental Cell. 51 (5), 645-657 (2019).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Almeida, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+Fates%3A+a+new+approach+to+the+study+of+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spectrum of Fates: a new approach to the study of the developing zebrafish retina.</a> Development. 141 (9), 1971-1980 (2014).</li>
<li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).</li>
<li>Clark, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Llgl1+in+retinal+neuroepithelia+reveals+links+between+apical+domain+size%2C+Notch+activity+and+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Loss of Llgl1 in retinal neuroepithelia reveals links between apical domain size, Notch activity and neurogenesis.</a> Development. 139 (9), 1599-1610 (2012).</li>
<li>Das, T., Payer, B., Cayouette, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+of+cell+divisions+during+neurogenesis+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina.</a> Neuron. 37 (4), 597-609 (2003).</li>
<li>Kay, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+requirement+for+ganglion+cells+during+assembly+of+retinal+synaptic+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transient requirement for ganglion cells during assembly of retinal synaptic layers.</a> Development. 131 (6), 1331-1342 (2004).</li>
<li>Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+is+the+main+driver+of+interkinetic+nuclear+migration+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina.</a> Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).</li>
<li>Suzuki, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+photoreceptor+types+in+zebrafish+are+generated+by+symmetric+terminal+divisions+of+dedicated+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (37), 15109-15114 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+marginal+zone+of+the+zebrafish+retina%3A+clonal+and+time-lapse+analysis+of+a+continuously+growing+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The ciliary marginal zone of the zebrafish retina: clonal and time-lapse analysis of a continuously growing tissue.</a> Development. 143 (7), 1099-1107 (2016).</li>
<li>Yoshimatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+partner+selection+during+retinal+circuit+reassembly+varies+with+timing+of+neuronal+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo.</a> Nature Communications. 7, 10590(2016).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+visualization+tool+for+multi-channel+confocal+microscopy+data+in+neurobiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Visualization+and+Computer+Graphics%22%5BJournal%5D)">An interactive visualization tool for multi-channel confocal microscopy data in neurobiology research.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 15 (6), 1489-1496 (2009).</li>
<li>Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluoRender%3A+an+application+of+2D+image+space+methods+for+3D+and+4D+confocal+microscopy+data+visualization+in+neurobiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Pacific+Visualization+Symposium%22%5BJournal%5D)">FluoRender: an application of 2D image space methods for 3D and 4D confocal microscopy data visualization in neurobiology research.</a> IEEE Pacific Visualization Symposium. , 201-208 (2012).</li>
<li>Carney, K. R., Bryan, C. D., Gordon, H. B., Kwan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LongAxis%3A+a+MATLAB-based+program+for+3D+quantitative+analysis+of+epithelial+cell+shape+and+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">LongAxis: a MATLAB-based program for 3D quantitative analysis of epithelial cell shape and orientation.</a> Developmental Biology. 458 (1), 1-11 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy protokół znakowania in toto i obrazowania poklatkowego 4D morfogenezy kubka wzrokowego. Przechodzimy przez proces generowania ograniczonego RNA kodującego białka fluorescencyjne w celu oznaczenia różnych przedziałów subkomórkowych; wstrzykiwanie 1-komórkowych zarodków danio pręgowanego; osadzanie 11 zarodków HPF w agarozie w celu obrazowania multipleksowego; oraz pozyskiwanie zestawów danych 4D wielu zarodków na czas morfogenezy miseczki nerwu wzrokowego (12–24 hpf).

Dzięki tym bogatym w informacje zestawom danych można odpowiedzieć na niezliczone pytania. Dane 4D mogą być wizualizowane i analizowane ilościowo na różne sposoby. Chociaż wykracza to poza zakres tego protokołu, zamieszczamy tutaj niektóre z naszych celów i standardowych aplikacji jako przykład rodzajów rzeczy, które można osiągnąć. Oczywiście metody ilościowej analizy obrazu są stale rozwijane i można korzystać zarówno z narzędzi dostępnych na rynku, jak i niestandardowych. Jeśli ktoś wcześniej nie korzystał z takich metod, powinien być przygotowany na pracę nad optymalizacją, aby upewnić się, że pozyskane zestawy danych są odpowiednie dla wybranego podejścia do analizy ilościowej.

Wizualizacja i ilościowa ocena zestawów danych 4D może być trudna ze względu na rozmiar plików. Oprogramowanie do akwizycji może być używane do rozdzielania zestawów danych na poszczególne zarodki, a ImageJ/Fiji może być używane do konwersji plików konfokalnych z formatów komercyjnych na bardziej standardowe stosy tif, w których każdy punkt czasowy jest zapisywany jako osobny plik. Spowoduje to zmniejszenie rozmiarów plików i ujednolicenie formatów plików. Poszczególne sekcje optyczne z każdego punktu czasowego mogą być składane jako timelapse 2D (XY) za pomocą ImageJ/Fiji, co umożliwia szybką wizualizację 2D i ocenę danych. Film 1 jest dokładnie tego przykładem: pojedynczy przekrój optyczny w czasie złożony jako timelapse optymalnej próbki pokazanej na rysunku 4I-I'''. Stamtąd, do wizualizacji 3D i 4D, zwykle używamy FluoRender35,36, który jest dostępny bezpłatnie, ale ma określone wymagania dotyczące karty graficznej. Za pomocą FluoRender można obracać dane renderowane w 3D w dowolnej osi, wizualizować zestaw danych w 4D w czasie, generować przekroje w dowolnej płaszczyźnie oraz zapisywać obroty i wizualizacje jako film lub serię obrazów tif.

Jeśli chodzi o analizę ilościową, istnieje wiele pytań, na które należy odpowiedzieć. Opracowaliśmy oprogramowanie we własnym zakresie, aby pomóc nam w zrozumieniu zachowań komórek leżących u podstaw morfogenezy miseczki wzrokowej. Nasz program, LongTracker, wykorzystuje sygnał jądrowy jako proxy dla pozycji do śledzenia komórek13. Dzięki tym danym możemy określić, kiedy, gdzie i jak poruszają się komórki; jak szybko i jak daleko poruszają się komórki; i jak często dzielą się komórki. Oprócz naszego własnego oprogramowania istnieje wiele dostępnych na rynku i niestandardowych opcji śledzenia komórek 4D. Opracowaliśmy również program LongAxis do przeprowadzania segmentacji komórek oraz ilościowego określania kształtu i organizacji komórek w siatkówce nerwowej37. Zestawy danych wprowadzane do LongAxis są jednak pojedynczymi stosami Z, wykonanymi w wysokiej rozdzielczości. Nieustającym wyzwaniem było generowanie zestawów danych poklatkowych o wystarczająco wysokiej rozdzielczości, aby można było z pewnością segmentować komórki i ekstrapolować ich morfologię. Jedną z alternatyw jest mozaikowe (rzadkie) znakowanie przy użyciu fotokonwertowalnego fluoroforu, takiego jak Kaede, do bezpośredniej wizualizacji kształtu komórki, jak to przeprowadziliśmy i inni w rozwijającym się oku 8,11,13. Upraszcza to problem segmentacji komórek, a kształt i rozmiar komórki można łatwo określić ilościowo za pomocą renderowania 3D w FluoRender.

Każdy krok tego protokołu został zoptymalizowany specjalnie dla naszych celów. Specyfika tego protokołu skutkuje kilkoma ograniczeniami: protokół, tak jak został napisany, nie jest zoptymalizowany pod kątem obrazowania innych aspektów rozwoju oka danio pręgowanego (takich jak neurogeneza siatkówki), innych struktur oka, innych etapów rozwoju lub innych przedziałów subkomórkowych. Orientacja osadzania, szybkość obrazowania i etykiety są zaprojektowane tak, aby umożliwić nam odpowiedź na nasze biologiczne pytania. Na przykład, aby zobrazować neurogenezę siatkówki, opisana tutaj orientacja grzbietowa zarodka może nie pozwalać na wizualizację określonych cech zainteresowania, a szybkość obrazowania może nie być odpowiednia. Wiele aspektów protokołu można dostosować i zmodyfikować do różnych potrzeb, w zależności od konkretnych zainteresowań i celów. Po pierwsze, stosowanie zastrzyków RNA sprawia, że proces etykietowania jest bardzo elastyczny. Konstrukty fuzji białek fluorescencyjnych mogą być używane do oznaczania interesujących struktur subkomórkowych, a ilość wstrzykniętego RNA może być zmieniana w celu optymalizacji znakowania. Opierając się na naszej pracy z fotokonwertowalnym fluoroforem Kaede, wstrzyknięcia RNA wydają się wspierać wybuch translacji, który kończy się o 12 hpf11,13. Wysoki poziom ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu RNA może zwalczać fotowybielanie, ale takie podejście nie wspiera trwałej ekspresji interesującej nas etykiety fluorescencyjnej. Jeśli konieczna jest trwała ekspresja, na przykład podczas obrazowania zarodków w późniejszych stadiach, linie transgeniczne są opcją, a skonstruowanie nowych linii u danio pręgowanego jest proste24.

Następnie protokół może zostać dostosowany do późniejszych etapów rozwoju. Ponieważ pigment może utrudniać obrazowanie na późniejszych etapach, zarodki mogą być leczone fenylotiomocznikiem (PTU) w celu zahamowania tworzenia pigmentu lub można zastosować mutanty genetyczne do syntezy pigmentu. Aby zapobiec drganiu zarodków, do roztworów agarozy i pożywek dla zarodków można dodać trikainę, a w razie potrzeby można dostosować zawartość procentową agarozy. W miarę wzrostu oka może być konieczna zmiana orientacji mocowania; W tym przypadku montujemy zarodki grzbietowo, ale w późniejszych stadiach bardziej sensowne może być montowanie boczne lub przednie, w zależności od interesującej nas struktury. Ponieważ różne procesy zachodzą w różnych skalach przestrzennych i czasowych, można również zoptymalizować krok Z i krok czasowy akwizycji obrazu. Cechy te można tak naprawdę określić tylko empirycznie dla potrzeb każdego laboratorium.

Wreszcie, protokół ten został opracowany specjalnie dla laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, z zarodkami osadzonymi w stosunkowo wysokim procencie agarozy na wczesnym etapie rozwoju oka. Jeśli obrazowanie odbywa się w różnym czasie lub w różnych miejscach podczas rozwoju oka, protokół ten będzie musiał zostać dostosowany do interesującego go procesu. Obecnie możliwych jest wiele różnych podejść do obrazowania, a kolejne są opracowywane przez inżynierów optycznych. Każde podejście wiąże się z innym zestawem wyzwań, od różnych sposobów osadzania i montowania zarodków do obrazowania, po różne rozmiary i formaty plików. We wstępie przedstawiamy kwestie, które mają pokierować procesem optymalizacji, w którym maksymalna rozdzielczość przestrzenna i czasowa jest równoważona z fotowybielaniem, fototoksycznością i ogromnymi rozmiarami plików. Mamy nadzieję, że te ogólne zasady, wraz z praktycznymi informacjami opisanymi powyżej, pomogą innym w ustaleniu metod obrazowania poklatkowego w celu zbadania wielu otwartych pytań dotyczących rozwoju wzroku.

Rozwój oka kręgowców zaczyna się od pojawienia się, czyli wytworzenia pęcherzyków wzrokowych z potencjalnego neuroepitelium mózgu. Pęcherzyki wzrokowe przechodzą następnie szereg zmian kształtu tkanki, wydłużając się, a następnie wnikając, aby wytworzyć miseczkę wzrokową. W miseczce optycznej siatkówka nerwowa i nabłonek barwnikowy siatkówki, oba pochodzące z nabłonka nerwowego, otaczają powstającą soczewkę, która pochodzi z powierzchni ektodermy. Cały proces wymaga złożonej serii ruchów komórek i tkanek oraz sygnalizacji molekularnej, skoordynowanych między populacjami komórek neuroepithelium, ektodermy i mezenchymalów. Te początkowe zdarzenia ustalają podstawową strukturę oka, a późniejsze etapy rozwoju oka, w tym tworzenie tęczówki i rogówki, są rozwinięciem wczesnej organizacji. Zakłócenia we wczesnym rozwoju i morfogenezie oka leżą u podstaw wielu stanów upośledzenia wzroku u ludzi, w tym anoftalmii, mikroftalmii i colobomy. Odblokowanie mechanizmów komórkowych i molekularnych rządzących morfogenezą kubka wzrokowego ma kluczowe znaczenie dla dalszego zrozumienia rozwoju układu wzrokowego i stanów patologicznych, które powstają, gdy procesy te przebiegają nieprawidłowo.
Nasze zrozumienie rozwoju i morfogenezy oka kręgowców wyłoniło się z ogromnej ilości pracy, obejmującej klasyczne badania histologiczne do embriologicznych i genetycznych podejść w różnych organizmach modelowych, w tym myszy, piskląt, żab i ryb1,2,3,4,5. Podczas gdy w ramach tych prac ustalono mechanizmy molekularne, które regulują wczesny rozwój oka, historycznie rzecz biorąc, istnieje słaba wiedza na temat morfogenezy oka: pojawienia się jego struktury 3D. Większość tych odkryć pochodzi z obrazowania pociętych zarodków w dyskretnych punktach czasowych. Chociaż jest to wystarczające, aby zapewnić wgląd w morfologię tkanek w 2 wymiarach, morfogeneza jest dynamicznym procesem 3D. Aby określić, jak kształt tkanki zmienia się w 3 wymiarach w czasie, jak zachowują się pojedyncze komórki i jak te zachowania przyczyniają się do zmian w kształcie tkanki 3D, konieczne są różne podejścia.
Jednym z rozwiązań, które pozwala wypełnić tę znaczącą lukę w wiedzy, jest obrazowanie na żywo, które umożliwia dynamiczną obserwację komórek i tkanek w czasie rzeczywistym, gdy narząd nabiera kształtu. Niestety, nie jest to łatwo wykonalne w wielu organizmach modelowych ze względu na ograniczenia rozwoju embrionalnego. Na przykład zarodki myszy i piskląt (rozwijające się w macicy lub w skorupce jaja) nie są łatwo dostępne, a wiele żywych zarodków nie jest optycznie przezroczystych, co powoduje znaczne rozproszenie światła i ogranicza głębokość, na jaką można uzyskać obrazy. Danio pręgowany, z zewnętrznym rozwojem i przezroczystymi zarodkami, daje wyjątkową okazję do przeprowadzenia na żywo obrazowania morfogenezy oka6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Dostępnych jest również wiele linii transgenicznych i zmutowanych, a także narzędzia do generowania nowych transgenicznych i mutantów20,21,22,23,24. Co więcej, morfogeneza kubka wzrokowego zachodzi szybko u danio pręgowanego, w ciągu 12 godzin (12-24 godziny po zapłodnieniu, hpf), co umożliwia obrazowanie całego procesu.
Wysiłki związane z obrazowaniem na żywo zostały przyspieszone dzięki rozszerzeniu i optymalizacji rodziny białek fluorescencyjnych, które umożliwiają genetycznie kodowane znakowanie struktur subkomórkowych, a także dzięki ulepszeniom i innowacjom w metodach mikroskopowych. Opisany tutaj protokół wykorzystuje laserową skaningową mikroskopię konfokalną, a nie inne obecne podejścia do obrazowania embriogenezy danio pręgowanego, w tym mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, mikroskopię selektywnego oświetlenia płaszczyznowego (SPIM i jego warianty) oraz inne bardziej specjalistyczne metody mikroskopii. W przypadku rozwijającego się oka danio pręgowanego stwierdziliśmy, że mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem nie była wystarczająca do obrazowania głębiej w tkance. Chociaż SPIM może pochwalić się niezwykle szybkim czasem obrazowania i staje się coraz powszechniej stosowany, obsługa dużych zbiorów danych do wizualizacji i analizy pozostaje wyzwaniem. W przeciwieństwie do tego, laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna jest łatwo dostępna, szczególnie dla osób bez doświadczenia w montażu sprzętu optycznego. Mamy nadzieję, że szeroka dostępność laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej sprawi, że nasz protokół będzie przydatny dla wielu laboratoriów.
Tutaj opisujemy naszą metodę przechwytywania zestawów danych 4D morfogenezy kubka wzrokowego, używając in toto znakowania zarodka pod kątem błon i chromatyny, oraz laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego do pozyskiwania obrazów (schemat w <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Zastosowane tu białka fluorescencyjne (EGFP-CAAX i H2A. F/Z-mCherry) zostały wybrane w celu zapewnienia znakowania tkanek z rozdzielczością pojedynczej komórki. Używamy zestawów danych wygenerowanych za pomocą tego protokołu do różnych funkcji analizy i wizualizacji obrazu. Protokół ten można łatwo dostosować, jeśli pożądane są inne struktury subkomórkowe. Znakowanie błony plazmatycznej zostało wybrane do wizualizacji kształtu komórki: używamy EGFP-CAAX, w którym ostatnie 21 aminokwasów H-ras, służących jako sekwencja sygnału prenylacji, jest połączonych z C-końcem EGFP13. Inne białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę plazmatyczną (np. fuzja transbłonowa lub mirystoylowane) prawdopodobnie będą działać równie dobrze. Do oznaczania jąder wybraliśmy H2A. F/Z-mCherry, w którym mCherry jest połączone z białkiem histonowym13. Zapewnia to łatwą wizualizację podziału komórek, w tym orientacji wrzeciona mitotycznego.
Przy każdym podejściu do obrazowania na żywo, należy rozważyć kompromisy między zwiększeniem prędkości obrazowania przy jednoczesnej maksymalizacji stosunku sygnału do szumu, rozdzielczości osiowej i zachowaniu próbki. Zoptymalizowaliśmy nasze metody, aby zmaksymalizować jakość obrazu i liczbę zarodków, które można zobrazować w jednym przebiegu. Często celem jest zobrazowanie morfogenezy miseczki nerwu wzrokowego w homozygotycznym zmutowanym zarodku, który może być fenotypowo nieodróżnialny od typu dzikiego na początku morfogenezy miseczki wzrokowej i potomstwa heterozygotycznego krzyżówki (25% zarodków to pożądany genotyp). Optymalizując, a następnie multipleksując akwizycję obrazu, zwiększa się prawdopodobieństwo uchwycenia zestawu danych homozygotycznego zmutowanego zarodka.
Rozdzielczość czasowa, czyli jak często dane objętościowe (stosy Z) są pozyskiwane, jest kluczowym aspektem obrazowania poklatkowego. W zależności od przeznaczenia takich zestawów danych istnieją różne wymagania dotyczące szybkości. Początkowo protokół ten został opracowany do ręcznego śledzenia komórek 4D. Śledzenie pojedynczych komórek w jednolicie znakowanej tkance wymaga wystarczająco wysokiej rozdzielczości czasowej, aby zapewnić pewność, że dowolna komórka jest śledzona w sposób ciągły w czasie. Odkryliśmy, że stosy Z morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego muszą być pozyskiwane co najmniej co 3,1 minuty przez 12 godzin; tutaj zoptymalizowaliśmy naszą akwizycję na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym tak, że możemy uzyskać stosy Z zawierające 4-5 zarodków co 2,5 minuty.
Ustalenie rozmiaru kroku Z było kluczowym krokiem w optymalizacji protokołu: do renderowania i wizualizacji 3D idealne są dane izotropowe, w których rozmiar kroku Z jest równy wymiarowi piksela XY. W rzeczywistości niezwykle trudno jest uzyskać takie dane poklatkowe za pomocą żywych próbek, biorąc pod uwagę ograniczenia związane z czasem obrazowania i fotowybielaniem. W związku z tym określenie odpowiedniego rozmiaru kroku Z jest ważne dla potrzeb renderowania i wizualizacji eksperymentu, a w szczególności, jaki stosunek wokseli X:Y:Z jest potrzebny, aby zmaksymalizować informacje osiowe przy jednoczesnym zachowaniu prędkości i zapobieganiu fotowybielaniu. Dla tego protokołu ustalony stosunek wokseli wynosił 1:1:3,5 (0,6 μm x 0,6 μm x 2,1 μm rozmiar kroku Z przy użyciu 40-krotnie dużego odległości roboczej obiektywu zanurzenia w wodzie). Przy uzyskiwaniu głębokości Z 130-140 μm uzyskuje się dane objętościowe o odpowiedniej rozdzielczości czasowej i niewielkim fotowybielaniu.
Jak omówiono powyżej, ten protokół jest specyficzny dla obrazowania 4D morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego, przy użyciu embrionów in toto znakowanych dla błony plazmatycznej i chromatyny, oraz laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Poniższy protokół można łatwo dostosować do różnych eksperymentów i potrzeb. Po pierwsze, w odniesieniu do struktur subkomórkowych, można zobrazować każdą strukturę, dla której istnieje marker żywej komórki. Następnie, mimo że nacisk kładziony jest wyłącznie na morfogenezę gałki wzrokowej, obrazowanie poklatkowe można dostosować do innych etapów rozwoju oka, na przykład neurogenezy25,26,27,28,29,30,31,32,33. Do późniejszego obrazowania rozwoju może być konieczne uwzględnienie unieruchomienia zarodka (gdy spontaniczna aktywność mięśni zaczyna się około 24 hpf), pigmentacji (która zaczyna się pojawiać około 24 hpf), wielkości tkanki (oko znacznie zwiększa swoją objętość podczas neurogenezy) i prędkości obrazowania (która powinna być dostosowana w zależności od szybkości interesującego procesu). Wszystkie te kwestie można łatwo rozwiązać. Protokół jest dość elastyczny; Oprócz szczegółów konkretnego protokołu znajdują się tutaj ogólne zasady, które pomogą osobom zainteresowanym obrazowaniem na żywo w innych aspektach rozwoju oka.

<table><tbody><tr><td>Delta TPG Dish 0,17 mm przezroczysty</td><td>Bioptechs</td><td>0420041500C</td><td>dno szkła osłonowego zapewniające kompatybilność optyczną</td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety Pasteura</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>długość całkowita 14,6 cm (53/4")</td></tr><tr><td>Dumont #5, #55 lub #5SF Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Do stylu #5: prosta końcówka, końcówka 0,05 x 0,01 mm, inox, długość 11 cm</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Ściągacz</td> <td>do mikropipetSutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Immersol W</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>4449690000000</td><td>płyn zanurzeniowy do celów z emisją wody, bezhalogenowy, niskofluorescencyjny</td></tr><tr><td>Adaptacyjne narzędzia naukowe</td> do<td>mikroiniekcji</td><td>TU-1</td><td>Sześć ramp, jedna pod kątem 90 stopni i jedna pod kątem 45 stopni.</td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Microloader, końcówka do napełniania mikrokapilar szklanych, 0,5 &ndash; 20 &micro; L</td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Zestaw do transkrypcji</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td>zawiera mieszankę enzymów SP6, 10-krotny bufor reakcyjny, 2XNTP i frasl; Roztwór CAP, roztwór GTP, pTRI-Xef, TURBO DNaza, roztwór zatrzymujący octan amonu, roztwór wytrącający chlorek litu i bufor do ładowania żelu i wszystkie są przechowywane w &ndash; 20&deg;C. Woda wolna od nukleaz może być przechowywana w dowolnej temperaturze.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Nikon SMZ645</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>służy do wstrzykiwania zarodków (patrz rys. 2B)</td></tr><tr><td>Enzym NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td>jest dostarczany z barwnikiem ładującym żel, fioletowy (6X)</td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>drobna rozdzielczość, niskotopliwa agaroza</td></tr><tr><td>Obiektyw LD "C-Apochromat" 40x/1,1 W Korr M27</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>421867-9970-000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Olympus SZX16</td><td>Olympus</td><td>SZX2-ZB16</td><td>służy do badań przesiewowych, osadzania zarodków (patrz rys. 3A)</td></tr><tr><td>Roztwór czerwieni fenolowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>0,5% w DPBS, sterylnie filtrowany, testowany pod kątem endotoksyn, testowany na kulturach komórkowych</td></tr><tr><td>Mikroiniektor Pico-litr</td><td>Aparat Harvard</td><td>PLI-100</td><td>Femtolitr do mikrolitrów zastrzyki; cyfrowe odczyty liczby, czasu i ciśnienia wtrysku; zawiera 5 ciśnień, w tym wstrzykiwanie, równoważenie, czyszczenie, napełnianie i przytrzymywanie</td></tr><tr><td>Pipeta z pompką do pipet</td><td>SP Bel-Art</td><td>F37898</td><td>pasuje do jednorazowej pipety Pasteura, zawiera pokrętło z boku do zasysania lub dozowania oraz tłok do szybkiego opróżniania</td></tr><tr><td>Wysokiej jakości cienkościenne kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Warner Instruments</td><td>G100T-4</td><td>1,0 x 0,78 mm</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>zawiera QIAquick Spin Columns,, probówki zbiorcze (2 ml)</td></tr><tr><td>H2O</td><td>Invitrogen</td><td>AM9906</td><td>bez RNaz, klasa biologii molekularnej, bez RNaz RNeasy</td></tr><tr><td>Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>zawiera RNeasy Mini Spin Columns, probówki zbiorcze (1,5 ml i 2 ml), odczynniki i wolne od RNaz</td></tr><tr><td>Przystawka do stolika Z PIEZO WSB 500</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>432339-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka stolikowa Z PIEZO WSB Uniwersalna</td><td>mikroskopia Carl Zeiss</td><td>432339-9030-000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 z Airyscan</td><td>Mikroskop Carl Zeiss Mikroskop</td><td></td><td>odwrócony Axio Observer</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Zen Black 2.3 SP1</td> Carl <td>Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td><td>Zeiss Efficient Navigation (ZEN) steruje wszystkimi systemami mikroskopów świetlnych firmy Zeiss</td></tr></tbody></table>

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Funkcja systemu wzrokowego wymaga precyzyjnego tworzenia struktur tkanek i narządów. W oku kręgowców wady strukturalne są częstą przyczyną zaburzeń widzenia, jednak mechanizmy morfogenezy oka są nadal słabo poznane. Podstawowa organizacja oka embrionalnego jest zachowana u kręgowców, dlatego obrazowanie na żywo zarodków danio pręgowanego stało się potężnym podejściem do bezpośredniej obserwacji rozwoju oka w czasie rzeczywistym w normalnych i patologicznych warunkach. W zarodku można uwidocznić dynamiczne procesy komórkowe, w tym ruchy, morfologie, interakcje, podział i śmierć. Opracowaliśmy metody jednolitego znakowania struktur subkomórkowych oraz poklatkowej mikroskopii konfokalnej wczesnego rozwoju oka u danio pręgowanego. Protokół ten przedstawia metodę generowania zamkniętego mRNA do wstrzyknięcia do 1-komórkowego zarodka danio pręgowanego, montowania zarodków w stadium pęcherzyka wzrokowego (~ 12 godzin po zapłodnieniu, hpf) i wykonywania wielowymiarowego obrazowania poklatkowego morfogenezy kubka wzrokowego na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym, tak aby wiele zestawów danych jest pozyskiwanych sekwencyjnie w tej samej sesji obrazowania. Takie podejście daje dane, które można wykorzystać do różnych celów, w tym śledzenia komórek, pomiarów objętości, renderowania trójwymiarowego (3D) i wizualizacji. Nasze podejścia pozwalają nam wskazać mechanizmy komórkowe i molekularne napędzające rozwój kubka nerwu wzrokowego, zarówno w warunkach dzikich, jak i zmutowanych genetycznie. Metody te mogą być stosowane bezpośrednio przez inne grupy lub adaptowane do wizualizacji wielu dodatkowych aspektów rozwoju oka danio pręgowanego.

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

Nasza wiedza na temat morfogenezy oka pochodzi z wcześniejszych badań nad tkankami stałymi. Jednak w badaniach tych brakowało dynamiki komórek i tkanek. Korzystając z obrazowania poklatkowego, jesteśmy w stanie uchwycić cały ten proces w celu wizualizacji i analizy.Nasza metoda, która wykorzystuje zewnętrzny rozwój przejrzystości optycznej zarodków danio pręgowanego, które ułatwiają obrazowanie na żywo, i wykorzystuje laserową skaningową mikroskopię konfokalną, która jest łatwo dostępna w większości kampusów badawczych. Badacze, którzy nie znają tej metody, powinni spodziewać się kilku prób i błędów przed uzyskaniem użytecznego zestawu danych. Wiele kroków, zwłaszcza zastrzyki i osadzanie, musi iść dobrze, aby odnieść sukces, więc uzbrój się w cierpliwość.Gdy danio pręgowany zacznie się rozmnażać, czekając od 15 do 20 minut, aby upewnić się, że jaja zostaną zapłodnione, użyj pipety P10 i końcówek P10 mikrolitrów, aby ponownie załadować ciągniętą szklaną kapilarną igłę do mikroiniekcji z 2,5 do 5 mikrolitrami interesującego nas rozcieńczenia RNA. Gdy jaja są gotowe, użyj pipety transferowej i mikroskopu preparacyjnego, aby ostrożnie załadować jaja do formy wtryskowej, używając kleszczy do zwinięcia zarodków tak, aby pojedyncza komórka była widoczna w razie potrzeby. Następnie wstrzyknij wszystkie zarodki w stadium jednokomórkowym, celując w komórkę, a nie w żółtko, aby zapewnić jednolite oznakowanie rozwijającego się zarodka.Po około 11 godzinach od zapłodnienia umieść od jednego do pięciu mililitrów podwielokrotności 1,6% niskotopliwej agarozy w podłożu E3 w bloku grzewczym o temperaturze 42 stopni Celsjusza i użyj mikroskopu fluorescencyjnego do badania przesiewowego w poszukiwaniu pomyślnie wstrzykniętych zarodków o ogólnej jasności kwiatowości. Policz somity, aby prawidłowo ustawić zarodki. Po 11 godzinach od zapłodnienia należy obserwować trzy somity.Idealna próbka będzie miała silne sygnały EGFP i mCherry oraz będzie na prawidłowym etapie rozwoju. Przed zamontowaniem umieść zarodki w naczyniu pokrytym agarem i użyj kleszczy, aby usunąć kosmówkę z każdego zarodka. Gdy wszystkie zarodki zostaną obnażone, użyj szklanej pipety rolkowej, aby odessać jeden zarodek.Wyrzuć jak najwięcej E3 tak, aby zarodek znalazł się na końcu szklanej pipety Pasteura i wrzuć zarodek do probówki z agarozą z bloku grzewczego. Pozwól zarodkom zanurzyć się w agarozie na kilka sekund przed zasysaniem niewielkiej objętości agarozy wraz z zarodkiem, uważając, aby zarodek pozostał na końcu pipety. Wyrzuć zarodek i agarozę do kropli agarozy w naczyniu ze szklanym dnem i szybko, ale ostrożnie użyj kleszczyków, aby ustawić zarodek grzbietową stroną w dół, zanim kropla agarozy stwardnieje.Po zamontowaniu od 10 do 12 zarodków w ten sam sposób, dodaj tyle agarozy, aby całkowicie pokryło dno naczynia, otaczając wszystkie kropelki w jednym krążku agarozy. Gdy agaroza stwardnieje, nałożyć warstwę E3 na agarozę, aby próbki były uwodnione. Po ustawieniu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego na odpowiednie parametry do obrazowania poklatkowego, obficie pokryj spód naczynia ze szklanym dnem medium zanurzeniowym pasującym do współczynnika załamania światła wody, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, i nałóż niewielką kroplę medium immersyjnego na obiektyw wodny 40X.Zabezpiecz naczynie ze szklanym dnem we wkładce scenicznej i dodaj dodatkowe podłoże E3, aby zarodki były wilgotne przez noc. Użyj plasteliny, aby uszczelnić plastikową pokrywkę nad naczyniem i podnieś cel, aby zetknął się z naczyniem. Pod nagłówkiem pozycji w oprogramowaniu mikroskopu kliknij przycisk Dodaj, aby zapisać informacje XYZ pierwszej próbki, która ma być poklatkowa, i wybrać próbkę o silnej fluorescencji i optymalnym mocowaniu.Na karcie lokalizowania wyszukaj następną próbkę, a następnie kliknij pozycję i dodaj, aby wybrać próbkę zgodnie z pokazano. Po wybraniu wszystkich próbek podświetl pierwszą pozycję i kliknij przycisk przenieś do. Podczas ciągłego skanowania wyrównaj pęcherzyk wzrokowy w ramce, pozostawiając dużo miejsca w obszarach przednich i dystalnych w stosunku do pęcherzyka wzrokowego i mózgu.Aby przypisać pierwszy i ostatni plasterek Z, wybierz ustaw jako pierwszy i ustaw ostatni, przesuwając się w kierunku Z za pomocą pokrętła precyzyjnego ustawiania ostrości, utrzymując łączną liczbę plasterków około 63, aby dostosować się do wzrostu muszli optycznej. Uwzględnij dodatkowe miejsce po brzusznej stronie pęcherzyka wzrokowego, aby zapewnić miejsce na wzrost. Po ustawieniu pierwszego i ostatniego plasterka Z kliknij C, aby przejść do środka stosu Z i dostosować moc i wzmocnienie lasera dla obu laserów.Po ustawieniu mocy i wzmocnienia lasera przerwij skanowanie i kliknij przycisk aktualizuj, aby zaktualizować informacje o pozycji. Aby przejść do następnej pozycji, kliknij pozycję drugą. Po zdefiniowaniu zarówno pierwszego, jak i ostatniego wycinka Z, jak pokazano, otwórz nagłówek szeregów czasowych i ustaw liczbę cykli na 300, a interwał czasu na 2,5 minuty.Po przejrzeniu ustawień, aby upewnić się, że wszystko zostało sfinalizowane, kliknij start, aby rozpocząć film poklatkowy i potwierdź, że pierwsza runda obrazowania została uchwycona poprawnie, zanim pozwolisz, aby film poklatkowy działał przez noc. Bezpośrednie wstrzyknięcie do pojedynczej komórki jest niezbędne do uzyskania jednolitego oznakowania i silnej fluorescencji. Po zanurzeniu w agarozie zarodki powinny być równomiernie rozmieszczone w całym naczyniu.Jeśli zarodki są prawidłowo ustawione, wystarczająco fluorescencyjne i odpowiednio zamontowane, pozostaną w ramie obrazowania podczas filmu poklatkowego, umożliwiając obrazowanie całego narządu. Próbki, które nie są zorientowane wzdłuż osi grzbietowej, takie jak te, które są poziome lub ukośne, będą wyrastać z ramki obrazowania w miarę postępu filmu poklatkowego i nie będą mogły być wykorzystane do dalszej analizy. Zarodek, który jest nadmiernie obrócony, spowoduje bardziej tylny upływ czasu.Zarodek, który jest niedostatecznie obrócony, pozwoli na obserwację tylko najbardziej przedniej tkanki. Ponadto próbki, które są zamontowane z uwzględnieniem orientacji kadru, mają większe szanse na udane wykonanie filmu poklatkowego. To odchylenie w kierunku strony brzusznej zapewnia dodatkową przestrzeń do wzrostu tkanki w kierunku brzusznym, co skutkuje optymalnym upływem czasu.Gdy te kryteria nie są spełnione, film poklatkowy nie będzie już rejestrował całej objętości 3D tkanki w miarę jej rozwoju i nie będzie mógł być wykorzystany do dalszej analizy. Te bogate w informacje zestawy danych można analizować na wiele sposobów, w tym śledzenie komórek 4D z kwantyfikacją prędkości i trajektorii komórek, pomiary objętości komórek i tkanek oraz wizualizacje 3 i 4D.

4-dimensional-imaging-of-zebrafish-optic-cup-morphogenesis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje metodę montowania delikatnych zarodków danio pręgowanego do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta tania metoda jest łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod dowolnym mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Tutaj dostępny jest protokół do obrazowania poklatkowego morfogenezy oka za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu lightsheet i stacji roboczej do przetwarzania obrazu w celu analizy uzyskanych danych. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury znieczulenia zarodka, zatopienia w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zawieszenia w komorze obrazowania, ustawienia parametrów obrazowania i wreszcie analizy danych obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP

Ten protokół wykorzystuje obrazowanie za pomocą arkusza świetlnego do badania funkcji skurczu serca u larw danio pręgowanego i uzyskania wglądu w mechanikę serca poprzez śledzenie komórek i interaktywną analizę.

Obrazowanie 4D Light-sheet skurczu serca danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Poznaj metodę obrazowania czasowego morfogenezy kubka wzrokowego u zarodków Danio rerio za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia dynamiczną analizę procesów komórkowych podczas rozwoju oka.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów