4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Nasza wiedza na temat morfogenezy oka pochodzi z wcześniejszych badań nad tkankami stałymi. Jednak w badaniach tych brakowało dynamiki komórek i tkanek. Korzystając z obrazowania poklatkowego, jesteśmy w stanie uchwycić cały ten proces w celu wizualizacji i analizy.

Nasza metoda, która wykorzystuje zewnętrzny rozwój przejrzystości optycznej zarodków danio pręgowanego, które ułatwiają obrazowanie na żywo, i wykorzystuje laserową skaningową mikroskopię konfokalną, która jest łatwo dostępna w większości kampusów badawczych. Badacze, którzy nie znają tej metody, powinni spodziewać się kilku prób i błędów przed uzyskaniem użytecznego zestawu danych. Wiele kroków, zwłaszcza zastrzyki i osadzanie, musi iść dobrze, aby odnieść sukces, więc uzbrój się w cierpliwość.

Gdy danio pręgowany zacznie się rozmnażać, czekając od 15 do 20 minut, aby upewnić się, że jaja zostaną zapłodnione, użyj pipety P10 i końcówek P10 mikrolitrów, aby ponownie załadować ciągniętą szklaną kapilarną igłę do mikroiniekcji z 2,5 do 5 mikrolitrami interesującego nas rozcieńczenia RNA. Gdy jaja są gotowe, użyj pipety transferowej i mikroskopu preparacyjnego, aby ostrożnie załadować jaja do formy wtryskowej, używając kleszczy do zwinięcia zarodków tak, aby pojedyncza komórka była widoczna w razie potrzeby. Następnie wstrzyknij wszystkie zarodki w stadium jednokomórkowym, celując w komórkę, a nie w żółtko, aby zapewnić jednolite oznakowanie rozwijającego się zarodka.

Po około 11 godzinach od zapłodnienia umieść od jednego do pięciu mililitrów podwielokrotności 1,6% niskotopliwej agarozy w podłożu E3 w bloku grzewczym o temperaturze 42 stopni Celsjusza i użyj mikroskopu fluorescencyjnego do badania przesiewowego w poszukiwaniu pomyślnie wstrzykniętych zarodków o ogólnej jasności kwiatowości. Policz somity, aby prawidłowo ustawić zarodki. Po 11 godzinach od zapłodnienia należy obserwować trzy somity.

Idealna próbka będzie miała silne sygnały EGFP i mCherry oraz będzie na prawidłowym etapie rozwoju. Przed zamontowaniem umieść zarodki w naczyniu pokrytym agarem i użyj kleszczy, aby usunąć kosmówkę z każdego zarodka. Gdy wszystkie zarodki zostaną obnażone, użyj szklanej pipety rolkowej, aby odessać jeden zarodek.

Wyrzuć jak najwięcej E3 tak, aby zarodek znalazł się na końcu szklanej pipety Pasteura i wrzuć zarodek do probówki z agarozą z bloku grzewczego. Pozwól zarodkom zanurzyć się w agarozie na kilka sekund przed zasysaniem niewielkiej objętości agarozy wraz z zarodkiem, uważając, aby zarodek pozostał na końcu pipety. Wyrzuć zarodek i agarozę do kropli agarozy w naczyniu ze szklanym dnem i szybko, ale ostrożnie użyj kleszczyków, aby ustawić zarodek grzbietową stroną w dół, zanim kropla agarozy stwardnieje.

Po zamontowaniu od 10 do 12 zarodków w ten sam sposób, dodaj tyle agarozy, aby całkowicie pokryło dno naczynia, otaczając wszystkie kropelki w jednym krążku agarozy. Gdy agaroza stwardnieje, nałożyć warstwę E3 na agarozę, aby próbki były uwodnione. Po ustawieniu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego na odpowiednie parametry do obrazowania poklatkowego, obficie pokryj spód naczynia ze szklanym dnem medium zanurzeniowym pasującym do współczynnika załamania światła wody, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, i nałóż niewielką kroplę medium immersyjnego na obiektyw wodny 40X.

Zabezpiecz naczynie ze szklanym dnem we wkładce scenicznej i dodaj dodatkowe podłoże E3, aby zarodki były wilgotne przez noc. Użyj plasteliny, aby uszczelnić plastikową pokrywkę nad naczyniem i podnieś cel, aby zetknął się z naczyniem. Pod nagłówkiem pozycji w oprogramowaniu mikroskopu kliknij przycisk Dodaj, aby zapisać informacje XYZ pierwszej próbki, która ma być poklatkowa, i wybrać próbkę o silnej fluorescencji i optymalnym mocowaniu.

Na karcie lokalizowania wyszukaj następną próbkę, a następnie kliknij pozycję i dodaj, aby wybrać próbkę zgodnie z pokazano. Po wybraniu wszystkich próbek podświetl pierwszą pozycję i kliknij przycisk przenieś do. Podczas ciągłego skanowania wyrównaj pęcherzyk wzrokowy w ramce, pozostawiając dużo miejsca w obszarach przednich i dystalnych w stosunku do pęcherzyka wzrokowego i mózgu.

Aby przypisać pierwszy i ostatni plasterek Z, wybierz ustaw jako pierwszy i ustaw ostatni, przesuwając się w kierunku Z za pomocą pokrętła precyzyjnego ustawiania ostrości, utrzymując łączną liczbę plasterków około 63, aby dostosować się do wzrostu muszli optycznej. Uwzględnij dodatkowe miejsce po brzusznej stronie pęcherzyka wzrokowego, aby zapewnić miejsce na wzrost. Po ustawieniu pierwszego i ostatniego plasterka Z kliknij C, aby przejść do środka stosu Z i dostosować moc i wzmocnienie lasera dla obu laserów.

Po ustawieniu mocy i wzmocnienia lasera przerwij skanowanie i kliknij przycisk aktualizuj, aby zaktualizować informacje o pozycji. Aby przejść do następnej pozycji, kliknij pozycję drugą. Po zdefiniowaniu zarówno pierwszego, jak i ostatniego wycinka Z, jak pokazano, otwórz nagłówek szeregów czasowych i ustaw liczbę cykli na 300, a interwał czasu na 2,5 minuty.

Po przejrzeniu ustawień, aby upewnić się, że wszystko zostało sfinalizowane, kliknij start, aby rozpocząć film poklatkowy i potwierdź, że pierwsza runda obrazowania została uchwycona poprawnie, zanim pozwolisz, aby film poklatkowy działał przez noc. Bezpośrednie wstrzyknięcie do pojedynczej komórki jest niezbędne do uzyskania jednolitego oznakowania i silnej fluorescencji. Po zanurzeniu w agarozie zarodki powinny być równomiernie rozmieszczone w całym naczyniu.

Jeśli zarodki są prawidłowo ustawione, wystarczająco fluorescencyjne i odpowiednio zamontowane, pozostaną w ramie obrazowania podczas filmu poklatkowego, umożliwiając obrazowanie całego narządu. Próbki, które nie są zorientowane wzdłuż osi grzbietowej, takie jak te, które są poziome lub ukośne, będą wyrastać z ramki obrazowania w miarę postępu filmu poklatkowego i nie będą mogły być wykorzystane do dalszej analizy. Zarodek, który jest nadmiernie obrócony, spowoduje bardziej tylny upływ czasu.

Zarodek, który jest niedostatecznie obrócony, pozwoli na obserwację tylko najbardziej przedniej tkanki. Ponadto próbki, które są zamontowane z uwzględnieniem orientacji kadru, mają większe szanse na udane wykonanie filmu poklatkowego. To odchylenie w kierunku strony brzusznej zapewnia dodatkową przestrzeń do wzrostu tkanki w kierunku brzusznym, co skutkuje optymalnym upływem czasu.

Gdy te kryteria nie są spełnione, film poklatkowy nie będzie już rejestrował całej objętości 3D tkanki w miarę jej rozwoju i nie będzie mógł być wykorzystany do dalszej analizy. Te bogate w informacje zestawy danych można analizować na wiele sposobów, w tym śledzenie komórek 4D z kwantyfikacją prędkości i trajektorii komórek, pomiary objętości komórek i tkanek oraz wizualizacje 3 i 4D.