Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Technika ta może odpowiedzieć na ważne pytania funkcjonalne dotyczące reakcji neuronalnych na smak w zwojach kolankowatych, kluczowej części szlaku smakowego struny bębenkowej. Technika ta może być wykorzystana do monitorowania reakcji w czasie rzeczywistym wielu pojedynczych neuronów w jednym badaniu eksperymentalnym, ponieważ komórki rejestrowane na zwierzę są znacznie wyższe niż zwykle obserwowane za pomocą metody elektrofizjologicznej. Trzymając mysz zamontowaną na szpilce w pozycji leżącej na poduszce grzewczej, wykonaj dwucentymetrowe nacięcie w linii środkowej skóry nad gardłem, od mostka do podbródka.

I cofnij skórę i gruczoły podszczękowe, aby w pełni odsłonić mięśnie dwubrzuścowe. Po zlokalizowaniu szwu w mięśniach przytchawiczych, oddziel szew rozwarstwieniem i cofnij tkankę, aby ją otworzyć. Ostrożnie wytnij otwór w górnej części tchawicy wystarczająco duży, aby zmieścił się kawałek rurki polietylenowej bez przecinania więcej niż połowy średnicy tchawicy i włóż rurkę do tchawicy w kierunku płuc.

Zmień położenie retraktorów, aby zwolnić mięśnie przytchawicze i cofnąć gruczoły podszczękowe. Następnie użyj niewielkiej ilości kleju weterynaryjnego, aby uszczelnić mięśnie przytchawicze nad rurką. Aby rozbić pęcherz bębenkowy, delikatnie drażnij pożądany mięsień dwubrzuścowy w górę i rozsuń tkankę łączną.

Wykonaj nacięcie na przednim końcu mięśnia, omijając naczynia krwionośne. I cofnij się do tyłu, aż odejdziesz od pęcherza bębenkowego. Odchyl lekko głowę do tyłu, aby unieść pęcherz bębenkowy i zlokalizować gałąź tętnicy szyjnej przed tylnym punktem przyczepu mięśnia dwubrzuścowego.

Wykonaj badanie palpacyjne tuż za tym naczyniem krwionośnym dla wypukłej struktury pęcherza bębenkowego i zlokalizuj szew w mięśniach. Używając dwóch zestawów cienkich kleszczy, tępo wyciąć szew, aż kość pęcherza bębenkowego będzie widoczna i użyj retraktorów, aby zachować wyraźny widok kości. Zlokalizuj szew biegnący od przodu do tyłu na pęcherzu i użyj sondy chirurgicznej, aby zrobić dziurę w kości w środku szwu, a następnie użyj zestawu cienkich nożyczek końcowych, aby wyciąć okrągły obszar w kości, uważając, aby nie przeciąć naczyń krwionośnych z przodu i z tyłu lub poniżej pęcherza.

Aby odsłonić kolankowaty, zlokalizuj ślimak. Przed ślimakiem znajduje się mięsień napinający błonę bębenkową. Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć i usunąć ten mięsień.

Użyj sondy chirurgicznej, aby zrobić dziurę w cyplu ślimaka i natychmiast użyj ssania, aby zassać płyn, który wypływa z otworu. Powiększ otwór w ślimaku, uważając, aby nie uszkodzić naczynia krwionośnego otaczającego ślimak, do tylnej i bocznej krawędzi. I przechyl głowę myszy do przodu, aby zlokalizować otwór w kości skroniowej pod dawną strukturą ślimaka.

Zwróć uwagę na grzbiet przed otworem, który znajduje się bezpośrednio nad siódmym nerwem. I włóż sondę chirurgiczną do otworu, aby umożliwić ostrożne uniesienie kości skroniowej w celu odsłonięcia siódmego nerwu. Jeśli kolankowaty nie jest w pełni widoczny, delikatnie odchyl głowę zwierzęcia do tyłu i spróbuj podciągnąć kość przed nerwem.

Jeśli zwoje są nadal zasłonięte, wyciągnij więcej kości od spodu, uważając, aby nie umieścić sondy głęboko pod kością, ponieważ może to uszkodzić kolankowaty. Aby uruchomić panel degustacyjny, użyj odsysania, aby usunąć płyn znad kolankowatego i umieść mysz na podkładce chłonnej pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj otworu pozostawionego w pęcherzu, otworu w kości skroniowej i siódmego nerwu, aby zlokalizować zwój kolankowaty.

I użyj filtra FITCGFP na epifluorescencyjnym teleskopie, aby sprawdzić, czy poszczególne neurony kolankowate GCaMP wyrażają GCaMP. Umieść igłę dozującą dla jednej linii degustacyjnej mocno w pysku zwierzęcia i umieść szalkę Petriego pod pyskiem, aby złapać płyn. Zsynchronizuj początek nagrywania wideo z początkiem prezentacji degustacji, obserwując transmisję na żywo pod kątem odpowiedzi, dryfu i przesiąkania podczas nagrywania.

Jeśli dojdzie do przesiąkania, zassaj płyn, aż widok kolanka będzie wyraźny i ponownie dostarcz degustację. Jeśli wystąpi znoszenie, sprawdź, czy wszystkie części sztycy są mocno dokręcone. Jeśli nie nastąpi żadna reakcja, sprawdź, czy ciecz płynie i czy mikroskop i kamera są ustawione we właściwym miejscu, bez zasłaniania pola widzenia.

Po zakończeniu wszystkich pożądanych eksperymentów delikatnie rozluźnij zwijacze i powtórz ekspozycję i analizę degustacyjną po przeciwnej stronie zwierzęcia. Jak zaobserwowano, bodźce smakowe stosowane na język powinny powodować szybki, przejściowy wzrost fluorescencji GCaMP, powodując zauważalną zmianę jasności wśród reagujących neuronów. Analiza nagrań wideo z fluorescencji pozwala na wygenerowanie śladów odpowiadających zmianom fluorescencji w stosunku do odpowiedzi wyjściowej w obrębie poszczególnych obszarów zainteresowania w czasie.

Zmiany intensywności fluorescencji powyżej poziomu progowego uważa się za odpowiedź pozytywną. Oprócz uszkodzenia zwojów jajowych ważne jest, aby unikać krwawienia. Jeśli wystąpi krwawienie, poczekaj, aż krew zacznie krzepnąć, zanim zastosujesz sól fizjologiczną i odsysanie, aby usunąć krew z pola widzenia.

Wizualizacja zwojów kolankowatych pozwoliła naukowcom na bezpośredni pomiar reakcji neuronów na bodźce smakowe i zidentyfikowanie tych neuronów za pomocą narzędzi takich jak GCaMP zależny od Cre.