Name: Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia in vivo neuronów zwojowych układu smakowego myszy przy użyciu wskaźników GCaMP. Technika umożliwia monitorowanie odpowiedzi neuronalnych na bodźce smakowe w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują S. Humayunowi za hodowlę myszy. Finansowanie tej pracy zostało częściowo zapewnione przez UTSA's Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) oraz NIH-SC2-GM130411 dla L.J.M.

Protokoły dotyczące zwierząt zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committees) Uniwersytetu Teksas w San Antonio.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
UWAGA: Należy pamiętać, że wstępna konfiguracja sprzętu nie została tutaj omówiona, ponieważ zależy ona od zastosowanego systemu pomp, mikroskopu, kamery oraz oprogramowania do obrazowania. Instrukcje dotyczące konfiguracji znajdują się w materiałach instruktażowych dostarczonych przez producenta sprzętu. W przypadku sprzętu użytego przez autorów prosimy o zapoznanie się z Tabelą materiałów.
<ol>
	<li>Upewnij się, że ciecz przepływa przez wszystkie linie nośnika (wody) i substancji smakowej. Jeśli linia jest zablokowana, odłącz ją i przemyj wodą. Jeśli linia jest zagięta, masuj ją, aż ciecz zacznie płynąć. Upewnij się, że przepływ cieczy rozpoczyna się i kończy zgodnie z sygnałem.</li>
	<li>Po potwierdzeniu drożności wszystkich linii, uruchom przepływ nośnika przez 10 s, a następnie zamknij wszystkie zawory.</li>
	<li>Upewnij się, że oprogramowanie do obrazowania jest skonfigurowane ze wszystkimi wymaganymi zmiennymi (np. długość próby, nazwy plików, częstotliwość odświeżania klatek itp.). Używając µManager, otwartego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, wprowadź 200 ms w polu opisanym jako Exposure Time dla częstotliwości 5Hz, wybierz x2 w sekcji binning i naciśnij przycisk Live. Po uruchomieniu wideo naciśnij przycisk po lewej stronie opisany jako ROI. Pozwoli to uzyskać pole widzenia o rozmiarze 512x512.</li>
</ol>
2. Znieczulenie i unieruchomienie zwierzęcia
UWAGA: Poniższy protokół jest procedurą terminalną zoptymalizowaną dla myszy obu płci o masie 18-35 g. Zaleca się stosowanie go u zwierząt w wieku od 10 do 12 tygodni. Może być stosowany u zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECIs), takich jak Snap25-GCaMP6s, lub u zwierząt, którym stereotaktycznie wstrzyknięto wirusowe GECIs. Przez cały czas trwania protokołu należy nosić rękawiczki, fartuch laboratoryjny i maseczkę ochronną.
<ol>
	<li>Utrwal zwierzę przez chwycenie za kark i wykonaj zastrzyk dosytronny z Ketaminy (100 mg/kg) oraz Ksylazyny (10 mg/kg). Przed kontynuacją oceń głębokość znieczulenia za pomocą testu ucisku palca stopy.</li>
	<li>Ogól górną część głowy oraz obszar chirurgiczny w przedniej części szyi.</li>
	<li>Włącz podgrzewacz i połóż zwierzę na nim w pozycji brzusznej.</li>
	<li>Nałóż maść do oczu zwierzęcia, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie (~1 cm) w linii środkowej głowy, aby odsłonić czaszkę zwierzęcia. Usuń tkankę łączną za pomocą sterylnego tamponu, tak aby uzyskać dostęp do odsłoniętej kości. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby upewnić się, że czaszka jest sucha.</li>
	<li>Nałóż klej wet bond na czaszkę. Należy upewnić się, że odsłonięta czaszka została całkowicie pokryta. Odczekaj, aż klej wyschnie.</li>
	<li>W pokrywce szalki Petriego wymieszaj i nałóż warstwę cementu dentystycznego na czaszkę. Do tego procesu dobrze nadaje się tylny koniec aplikatora z bawełnianą końcówką użytego w kroku 2.5. Umieść trzpień głowowy (headpost) na cemencie dentystycznym i nałóż drugą warstwę cementu dentystycznego, aby utwierdzić trzpień na czaszce.</li>
	<li>Pozostaw do czasu, aż cement dentystyczny wyschnie i stwardnieje. Przełam aplikator z bawełnianą końcówką na pół i za pomocą ostrych końców sprawdź twardość cementu dentystycznego. Jeśli cement nie ulega naciskowi, zwierzę można obrócić do pozycji grzbietnej.</li>
</ol>
3. Tracheotomia
<ol>
	<li>Nanieść środek do mycia przedoperacyjnego na obszar zabiegu. Po umyciu wykonać nacięcie w linii środkowej o długości ~ 2 cm w skórze gardła, od mostka do brody.</li>
	<li>Odciągnąć skórę i gruczoły podżuchwowe, dbając o pełne odsłonięcie mięśni dwbrzuszych.</li>
	<li>Zlokalizować szczelinę w mięśniach przytchawiczych, rozdzielić ją poprzez tępe rozczłonkowanie i rozsunąć rozwieraczami.</li>
	<li>Ostrożnie wyciąć w górnej części tchawicy otwór wystarczająco duży, aby zmieściła się w nim rurka polietylenowa (I.D. 0.86 mm, O.D. 1.27 mm). Nie przecinać więcej niż do połowy średnicy tchawicy. Wprowadzić rurkę do tchawicy w kierunku płuc.</li>
	<li>Przestawić rozwieracze, aby zwolnić mięśnie przytchawicze i odsunąć gruczoły podżuchwowe.</li>
	<li>Skleić mięśnie przytchawicze nad rurką, używając minimalnej ilości kleju weterynaryjnego (patrz Rycina 1A).</li>
</ol>
4. Otwieranie bańki bębenka
<ol>
	<li>Delikatnie odseparuj wybrany mięsień dwbrzuszkowy (lewy lub prawy) i rozdziel tkankę łączną. Przetnij mięsień na jego przednim końcu, unikając naczyń krwionośnych, a następnie odsuń go ku tyłowi, aż zostanie odsłonięta bąbelek bębenka.</li>
	<li>Lekko odchyl głowę do tyłu, aby unieść bąbelek bębenka. Zlokalizuj odgałęź tętnicy szyjnej znajdującą się przed tylnym punktem przyczepu mięśnia dwbrzuszkowego. Palcem wyczuj wypukłą strukturę bąbelka bębenka, znajdującą się bezpośrednio za tym naczyniem krwionośnym.</li>
	<li>Wyszukaj szczelinę w tkance mięśniowej w tym miejscu (patrz Rysunek 1B). Używając dwóch par precyzyjnych pincet, wykonaj rozbicie tępe wzdłuż szczeliny, aż pojawi się kość bąbelka bębenka. Użyj haczyków do utrzymania wyraźnego widoku bąbelka bębenka.</li>
	<li>Znajdź szczelinę biegnącą od przodu do tyłu na bąbelku (patrz Rysunek 1C). Za pomocą sondy chirurgicznej wykonaj otwór w kości w centrum tej szczeliny. Używając precyzyjnych nożyczek końcowych, wytnij okrągły obszar w kości, uważając, aby nie przeciąć naczyń krwionośnych znajdujących się przed, za oraz głęboko pod bąbelkiem.</li>
</ol>
5. Odsłanianie kolanka
<ol>
	<li>Wewnątrz tego otworu znajduje się wypukły fragment kości – jest to ślimak. Przed ślimakiem znajduje się mięsień, mięsień naprężający błonę bębenkową (patrz Rysunek 1D). Używając nożyczek sprężynowych, przetnij i usuń mięsień naprężający błonę bębenkową.</li>
	<li>Wykonaj test ucisku palca u nogi. Jeśli zwierzę reaguje, podaj mieszaninę ketaminy i ksylazyny w dawce 1/3 dawki pierwotnej.</li>
	<li>Przygotuj płyn do irygacji oraz linię ssącą. Używając sondy chirurgicznej, wykonaj otwór w wyniosłości ślimaka. Natychmiast wypłucz wypływający płyn i usuń go za pomocą ssania. Płyn ten będzie wypływał z tego miejsca mniej lub bardziej w sposób ciągły i będzie wymagał okresowego usuwania.</li>
	<li>Powiększ otwór w ślimaku. Zachowaj ostrożność w obrębie naczynia krwionośnego otaczającego ślimaka od strony tylnej i bocznej krawędzi.</li>
	<li>Przechyl głowę myszy do przodu. Zlokalizuj otwór w kości skroniowej pod miejscem, w którym znajdował się ślimak (patrz Rysunek 1E). Zwróć uwagę na grzebień znajdujący się przed tym otworem; grzebień ten znajduje się bezpośrednio nad nerwem twarzowym (VII nerwem czaszkowym).</li>
	<li>Wprowadź sondę chirurgiczną do otworu i ostrożnie unieś kość skroniową, aby odsłonić nerw twarzowy (patrz Rysunek 1F). Oceń, jaka część nerwu twarzowego jest widoczna; jeśli zwoj zwoj kolanowy nie jest w pełni odsłonięty, odchyl głowę zwierzęcia do tyłu i spróbuj unieść kość znajdującą się przed nerwem.</li>
	<li>Jeśli zwoj nadal nie jest w pełni widoczny, usuń więcej kości od spodu. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie wprowadzać sondy zbyt głęboko pod kość, ponieważ może to uszkodzić zwoj kolanowy.</li>
</ol>
<img alt="Schemat procedury chirurgicznej, etapy oznaczone od A do F, skupiające się na dyssekcji tkanek i odsłonięciu struktur." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62172/62172fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Chirurgiczne odsłonięcie zwoju kolanowatego. (A) Obraz jamy szyjnej myszy po tracheotomii. Strzałka wskazuje mięsień dwbrzuszkowy znajdujący się nad obszarem operacyjnym badanym w pozostałych częściach rysunku. (B) Obraz obszaru pod wcześniej wskazanym mięśniem dwbrzuszkowym. Strzałka wskazuje szczelinę w muskulaturze do dyssekcji tępej. (C) Obraz bąbla słuchowego (Tympanic Bulla). Strzałka wskazuje szczelinę w kości, którą należy przełamać za pomocą sondy chirurgicznej. (D) Obraz obszaru operacyjnego po otwarciu bąbla. Dolna lewa strzałka wskazuje ślimaka, górna strzałka wskazuje mięsień naprężający błonę bębenkową (tensor tympani). Linia w ramce wskazuje obszar widoczny na panelach (E) i (F). (E) Obraz obszaru operacyjnego po przełamaniu ślimaka i usunięciu jego zawartości. Biała strzałka wskazuje miejsce umieszczenia sondy chirurgicznej wspomnianej w kroku 5.6 protokołu. (F) Obraz odsłoniętego zwoju kolanowatego. Strzałka wskazuje ciało nerwu siódmego, przerywany trójkąt otacza zwój kolanowaty. Panele A-B, skala = 5 mm. Panele C-F, skala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62172/62172fig1v2large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
6. Przeprowadzenie panelu degustacyjnego
<ol>
	<li>Odessać płyn znad zwoju kolanowatego. Opcjonalnie umieścić punkt chłonny, aby ograniczyć przesiąkanie i ułatwić nawigację pod mikroskopem.</li>
	<li>Umieścić zwierzę na podkładce chłonnej pod mikroskopem. Zlokalizować zwoj kolanowaty: pomocnymi punktami orientacyjnymi są otwór w bąbelku, otwór w kości skroniowej oraz nerw siódmy. Używając filtra FITC/GFP w mikroskopie epifluorescencyjnym, sprawdzić obecność pojedynczych neuronów zwoju kolanowatego wykazujących ekspresję GCaMP. Obiektyw 10x (odległość robocza 10mm) zapewni wystarczającą rozdzielczość do śledzenia aktywności poszczególnych komórek, ale można również użyć obiektywu 20x (odległość robocza 12 mm).</li>
	<li>Mocno umieścić igłę dozującą linię substancji smakowej w pysku zwierzęcia. Pod pyszczkiem zwierzęcia umieścić szalkę Petriego, aby zbierać wypływający płyn.</li>
	<li>Upewnić się, że kamera obejmuje pole widzenia mikroskopu. Zsynchronizować rozpoczęcie nagrywania wideo z początkiem prezentacji substancji smakowej.</li>
	<li>Podczas nagrywania monitorować obraz na żywo pod kątem odpowiedzi, dryfu oraz przesiąkania.</li>
	<li>W przypadku wystąpienia przesiąkania, odessać płyn aż do momentu, gdy widok zwoju kolanowatego stanie się wyraźny, a następnie powtórzyć procedurę. W przypadku wystąpienia dryfu sprawdzić, czy wszystkie elementy uchwytu głowy są mocno dokręcone. Jeśli nie pojawią się odpowiedzi, sprawdzić, czy płyn przepływa oraz czy mikroskop i kamera są ustawione na właściwym obszarze, a pole widzenia nie jest niczym zasłonięte.</li>
	<li>Powtarzać czynności do momentu uzyskania pożądanej liczby nagrań wideo. Delikatnie poluzować rozwieracze, a następnie powtórzyć kroki 3-6 po przeciwnej stronie.</li>
	<li>Po uzyskaniu wymaganych nagrań wideo dla wszystkich wybranych zwojów, przeprowadzić eutanazję zwierzęcia poprzez zwichnięcie szyi.</li>
</ol>

<ol><li>Krimm, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+regulate+embryonic+gustatory+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Factors that regulate embryonic gustatory development.</a> BMC Neuroscience. 8, Suppl 3 4(2007).</li>
<li>Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+taste+cells+lacking+synapses+mediate+neurotransmission%3F+CALHM1%2C+a+voltage-gated+ATP+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel.</a> Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).</li>
<li>Taruno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+transduction+and+channel+synapses+in+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv-European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Taste transduction and channel synapses in taste buds.</a> Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).</li>
<li>Kinnamon, S. C., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taste+for+ATP%3A+neurotransmission+in+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A taste for ATP: neurotransmission in taste buds.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264(2013).</li>
<li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+sense+about+taste%3A+from+mammals+to+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Common sense about taste: from mammals to insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li>
<li>Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+neural+response+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Gustatory neural response in the mouse.</a> Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).</li>
<li>Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opponent+effects+of+quinine+and+sucrose+on+single+fiber+taste+responses+of+the+chorda+tympani+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve.</a> Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).</li>
<li>Frank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+classification+of+mammalian+afferent+taste+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">The classification of mammalian afferent taste nerve fibers.</a> Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).</li>
<li>Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+gustatory+nerve+fiber+discharge+pattern+with+change+in+stimulus+concentration+and+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality.</a> Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).</li>
<li>Sollars, S. I., Hill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recordings+from+rat+geniculate+ganglia%3A+taste+response+properties+of+individual+greater+superficial+petrosal+and+chorda+tympani+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones.</a> Journal of Physiology. 564, Pt 3 877-893 (2005).</li>
<li>Yokota, Y., Bradley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geniculate+ganglion+neurons+are+multimodal+and+variable+in+receptive+field+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics.</a> Neuroscience. 367, 147-158 (2017).</li>
<li>Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+modulates+taste+responsiveness+and+stimulates+gustatory+neurons+in+the+rat+geniculate+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%3A+A+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress.</a> Neuron. 98 (4), 865(2018).</li>
<li>Barreto, R. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517, 373-376 (2015).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+animal+calcium+imaging+of+the+geniculate+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion.</a> Protocol Exchange. , 106(2015).</li>
<li>Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewiring+the+taste+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rewiring the taste system.</a> Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171(2015).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li>
<li>Li, K. The image stabilizer plugin for ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cs.cmu.edu/~ kangli/code/Image_Stabilizer. html">http://www.cs.cmu.edu/~ kangli/code/Image_Stabilizer. html</a> (2008).</li>
<li>Ackman, J. dF Over F movie ImageJ Plugin. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/5817461">https://gist.github.com/ackman678/5817461</a> (2014).</li>
<li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZcalcium%3A+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Frontiers in Neural Circuits. 14, 25(2020).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sour+sensing+from+the+tongue+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sour sensing from the tongue to the brain.</a> Cell. 179 (2), 392-402 (2019).</li>
<li>Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+logic+of+sensory+coding+revealed+by+optical+tagging+of+physiologically-defined+neuronal+types%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types.</a> bioRxiv. , 692079(2019).</li>
<li>Moeyaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+marking+active+neuron+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Improved methods for marking active neuron populations.</a> Nature Communication. 9 (1), 4440(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zgłoszenia konfliktu interesów.

W tej pracy opisano krok po kroku protokół chirurgicznego odsłaniania zwoju kolankowatego i wizualnego rejestrowania aktywności jego neuronów za pomocą GCaMP6s. Procedura ta jest bardzo podobna do opisanej wcześniej17, z kilkoma godnymi uwagi wyjątkami. Po pierwsze, zastosowanie słupka pod głowę pozwala na łatwą regulację ułożenia głowy podczas zabiegu. Po drugie, jeśli chodzi o dostarczanie bodźców, podejście Wu i Dvoryanchikova polega na przepływie bodźców smakowych przez rurki przełykowe<sup cl...

Kluczowym elementem obwodowego systemu smakowego ssaków jest kolankowaty ganglion. Oprócz niektórych neuronów somatosensorycznych, które unerwiają małżowinę uszną ucha, kolankowate składa się z ciał komórkowych neuronów smakowych unerwiających przedni język i podniebienie. Podobnie jak inne obwodowe neurony czuciowe, neurony kolankowate są pseudo-jednobiegunowe z długim aksonem wystającym obwodowo do kubków smakowych i centralnie do jądra pnia mózgu samotnego odcinka komunikacyjnego1. Neurony te są aktywowane głównie przez uwalnianie ATP przez komórki receptora smaku reagujące na bodźce smakowe w jamie ustnej2,3. ATP jest niezbędnym neuroprzekaźnikiem do sygnalizacji smaku, a receptory P2rx wyrażane przez neurony zwojowe smaku są niezbędne do ich aktywacji4. Biorąc pod uwagę, że komórki receptorów smaku wyrażają specyficzne receptory smaku dla określonej modalności smaku (słodkiego, gorzkiego, słonego, umami lub kwaśnego), postawiono hipotezę, że reakcje neuronów zwojowych smaku na bodźce smakowe byłyby również wąsko dostrojone5.
Nagrania całego nerwu wykazały, że zarówno struna bębenkowa, jak i większy górny nerw petrosalny przewodzą sygnały smakowe reprezentujące wszystkie pięć modalności smaku do zwoju kolankowatego6,7. Wciąż jednak pozostawiało to pytania o specyfikę reakcji neuronalnych na dany smak: czy istnieją neurony specyficzne dla modalności smaku, neurony polimodalne, czy też mieszanina obu. Zapisy pojedynczych włókien dostarczają więcej informacji na temat aktywności poszczególnych włókien i ich wrażliwości chemicznej8,9,10, ale ta metodologia ogranicza się do zbierania danych z niewielkiej liczby włókien. Podobnie, zapisy elektrofizjologiczne in vivo poszczególnych neuronów kolankowatych szczurów dostarczają informacji o reakcjach poszczególnych neuronów11,12,13, ale nadal traci aktywność populacji i daje stosunkowo niewiele zapisów neuronów na zwierzę. Aby przeanalizować wzorce odpowiedzi zespołów neuronalnych bez utraty z oczu aktywności poszczególnych neuronów, konieczne było zastosowanie nowych technik.
Obrazowanie wapnia, szczególnie przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, takich jak GCaMP, dostarczyło tego przełomu technicznego14,15,16,17,18. GCaMP wykorzystuje wapń jako wskaźnik aktywności neuronalnej, zwiększając zieloną fluorescencję wraz ze wzrostem poziomu wapnia w komórce. Wciąż rozwijane są nowe formy GCaMP w celu poprawy stosunku sygnału do szumu, dostosowania kinetyki wiązania i dostosowania do specjalistycznych eksperymentów19. GCaMP zapewnia rozdzielczość pojedynczego neuronu, w przeciwieństwie do zapisu całego nerwu, i może jednocześnie mierzyć odpowiedzi zespołów neuronów, w przeciwieństwie do zapisu pojedynczego włókna lub pojedynczej komórki. Obrazowanie wapniowe zwojów kolankowatych dostarczyło już ważnych informacji na temat profili strojenia tych neuronów u myszy typu dzikiego16,20 i zidentyfikowało fenotypy błędnego smaku obwodowego u genetycznie zmodyfikowanych myszy18.
Jedną z głównych trudności w zastosowaniu technik obrazowania wapnia in vivo do kolankowatego ganglionu jest to, że jest on zamknięty w kostnej błonie bębenkowej. Aby uzyskać dostęp optyczny do kolankowatego, konieczna jest delikatna operacja usunięcia warstw kości, przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonego ganglionu. W tym celu stworzyliśmy ten przewodnik, aby pomóc innym badaczom uzyskać dostęp do zwoju kolankowatego i zobrazować reakcje fluorescencyjne tych neuronów za pośrednictwem GCaMP na bodźce smakowe in vivo.

<table><tbody><tr><td>1 x #5 Kleszcze Inox</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>NC9792102</td><td></td></tr><tr><td>1ml Strzykawka z blokadą luer Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>2 x #3 Kleszcze Inox</td><td>Narzędzia do nauki o napięciu</td><td>M3S 11200-10</td><td></td></tr><tr><td>igła dozująca o grubości 27</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1372532</td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0398332</td><td></td></tr><tr><td>4-40 Śruba maszynowa Nakrętki sześciokątne</td><td></td><td>3SNMS004C</td><td></td></tr><tr><td>4-40 Śruba z gniazdowym</td><td></td><td>3SSCS04C004</td><td></td></tr><tr><td>Punkty chłonne</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-930-668</td><td></td></tr><tr><td>Acesulfam</td><td>K Fisher Scientific</td><td>A149025G</td><td></td></tr><tr><td>Sztuczne łzy</td><td>Akorn</td><td>59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>BD Tace dla alergików z Igła przymocowana na stałe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-6D</td><td></td></tr><tr><td>zwijacze</td><td>FST</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do krojenia chleba</td><td>Thor Labs</td><td>MB8</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A95-3</td><td></td></tr><tr><td>Cohan-Vannas Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki o naprawie</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>Współczesny płyn Ortho-Jet</td><td>Lang</td><td>1504</td><td></td></tr><tr><td>Współczesny proszek Ortho-Jet</td><td>Lang</td><td>1520</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher</td><td>19-062-616</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowy uchwyt słupka</td><td>głowicy eMachineShop</td><td></td><td>Zobacz załączony plik 202410.ems</td></tr><tr><td>Niestandardowy metalowy słupek głowicy</td><td>eMachineShop</td><td></td><td>Zobacz załączony plik 202406.ems</td></tr><tr><td>Regulator temperatury DC</td><td>FHC</td><td>Aparat cyfrowy 40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>, sCMOS OrcaFlash4 Mikroskop zamontowany na mikroskopie</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440</td><td></td></tr><tr><td>Luneta sekcyjna</td><td>Maszynki</td> do strzyżenia włosów Leica <td>M80</td><td></td></tr> Kent <tr><td></td><td>Scientific</td><td>CL7300-Kit</td><td></td></tr><tr><td>IMP</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6195906</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Ketaved</td><td>NDC 50989-996-06</td><td></td></tr><tr><td>LED Zimne światło Źródło:</td><td>Leica Mcrosystems</td><td>KL300LED</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock 1/16" Adaptery do węży</td><td>Fisher</td><td>01-000-116</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Mini-series Słupki optyczne</td><td>Thorlabs</td><td>MS2R</td><td></td></tr><tr><td>MPG</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1723230</td><td></td></tr><tr><td>MXC-2.5 Obrotowy zacisk sondy</td><td>Siskiyou</td><td>14030000E</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-947-346</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Powietrze pod ciśnieniem</td><td>Airgas</td><td>AI Z300</td><td></td></tr><tr><td>Chinina</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC163720050</td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepna taśma etykietująca</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowa rurka zaworu zaciskowego 1/32 "x 1/16" ode (na stopę)</td><td>Automate Scientific</td><td>05-14</td><td></td></tr><tr><td>Sola SM Light</td><td>Engine Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Snap25-2A-GCaMP6s-D</td><td>JAX</td><td>025111</td><td></td></tr><tr><td>Student Cienkie nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Sonda chirurgiczna</td><td>Roboz Sklep chirurgiczny</td><td>RS-6067</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgiczny Uchwyt sondy</td><td>Roboz Sklep chirurgiczny</td><td>RS-6061</td><td></td></tr><tr><td>Gwint</td><td>G&uuml; termann</td><td>02776</td><td></td></tr><tr><td>Rurka BD Intramedic</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046941</td><td></td></tr><tr><td>Dwustopniowy regulator gazu</td><td>Rurki</td> winylowe Airgas <td>Y12FM244B580-AG</td><td></td></tr><tr><td>Tygon - 1/16"</td><td>Automate Scientific</td><td>05-11</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik cyfrowy/ręczny Valvelink8.2</td><td>Automate Scientific</td><td>01-18</td><td></td></tr><tr><td>Zawór zaciskowy Valvelink8.2 System perfuzyjny</td><td>Automate Scientific</td><td>17-pp-54</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Anazowana</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

W ciągu ostatnich dziesięciu lat, postęp w genetycznie kodowanych wskaźnikach wapnia (GECI) przyczynił się do rewolucji w funkcjonalnym obrazowaniu in vivo. Wykorzystując wapń jako wskaźnik aktywności neuronalnej, techniki te umożliwiają monitorowanie reakcji poszczególnych komórek w dużych zespołach neuronalnych na różne bodźce w czasie rzeczywistym. My i inni zastosowaliśmy te techniki do zobrazowania reakcji poszczególnych neuronów kolankowatego zwoju na bodźce smakowe zastosowane na języki żywych, znieczulonych myszy. Zwój kolankowaty składa się z ciał komórkowych neuronów smakowych unerwiających przedni język i podniebienie, a także niektórych neuronów somatosensorycznych unerwiających małżowinę uszną ucha. Obrazowanie reakcji wywołanych smakiem poszczególnych neuronów kolankowatych zwojów za pomocą GCaMP dostarczyło ważnych informacji na temat profili strojenia tych neuronów u myszy typu dzikiego, a także sposobu na wykrycie fenotypów błędnych połączeń smaku obwodowego u myszy zmodyfikowanych genetycznie. Tutaj pokazujemy procedurę chirurgiczną polegającą na odsłonięciu zwoju kolankowatego, akwizycję obrazu fluorescencyjnego GCaMP, początkowe kroki analizy danych i rozwiązywanie problemów. Technika ta może być stosowana z transgenicznie kodowanym GCaMP lub z ekspresją GCaMP za pośrednictwem AAV i może być modyfikowana w celu zobrazowania określonych podzbiorów genetycznych będących przedmiotem zainteresowania (tj. Ekspresji GCaMP za pośrednictwem Cre). Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie wapnia in vivo neuronów kolankowatych jest potężną techniką monitorowania aktywności obwodowych neuronów smakowych i dostarcza informacji uzupełniających do bardziej tradycyjnych nagrań struny bębenkowej całego nerwu lub testów zachowań smakowych.

Zgodnie z protokołem, zwierzę transgeniczne Snap25-GCaMP6s zostało poddane sedacji, odsłonięto zwoje kolanowe i aplikowano substancje smakowe na język podczas rejestracji wideo. Celem eksperymentu było określenie, które substancje smakowe wywołują odpowiedzi w każdej komórce. Substancje smakowe (30 mM AceK, 5 mM chininy, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM kwasu cytrynowego)18 rozpuszczono w wodzie dejonizowanej (DI) i aplikowano na język przez 2 s, z 13 s przerwami wypełnionymi wodą DI.
<...

Tutaj prezentujemy, jak odsłonić kolankowaty ganglion żywej, znieczulonej myszy laboratoryjnej i jak wykorzystać obrazowanie wapnia do pomiaru reakcji zespołów tych neuronów na bodźce smakowe, co pozwala na wielokrotne próby z różnymi stymulantami. Pozwala to na dogłębne porównania, które neurony reagują na które degustacje.

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

Technika ta może odpowiedzieć na ważne pytania funkcjonalne dotyczące reakcji neuronalnych na smak w zwojach kolankowatych, kluczowej części szlaku smakowego struny bębenkowej. Technika ta może być wykorzystana do monitorowania reakcji w czasie rzeczywistym wielu pojedynczych neuronów w jednym badaniu eksperymentalnym, ponieważ komórki rejestrowane na zwierzę są znacznie wyższe niż zwykle obserwowane za pomocą metody elektrofizjologicznej. Trzymając mysz zamontowaną na szpilce w pozycji leżącej na poduszce grzewczej, wykonaj dwucentymetrowe nacięcie w linii środkowej skóry nad gardłem, od mostka do podbródka.I cofnij skórę i gruczoły podszczękowe, aby w pełni odsłonić mięśnie dwubrzuścowe. Po zlokalizowaniu szwu w mięśniach przytchawiczych, oddziel szew rozwarstwieniem i cofnij tkankę, aby ją otworzyć. Ostrożnie wytnij otwór w górnej części tchawicy wystarczająco duży, aby zmieścił się kawałek rurki polietylenowej bez przecinania więcej niż połowy średnicy tchawicy i włóż rurkę do tchawicy w kierunku płuc.Zmień położenie retraktorów, aby zwolnić mięśnie przytchawicze i cofnąć gruczoły podszczękowe. Następnie użyj niewielkiej ilości kleju weterynaryjnego, aby uszczelnić mięśnie przy

in-vivo-calcium-imaging-mouse-geniculate-ganglion-neuron-responses-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Shannonhouse, J., et al. In vivo Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego. J. Vis. Exp. (2023). Film przedstawia technikę obrazowania wapnia in vivo w celu monitorowania aktywności neuronalnej w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) myszy transgenicznej. Neurony DRG wyrażają wskaźnik wapnia, który zwiększa intensywność fluorescencji po związaniu się z wapniem. Bodźce mechaniczne lub termiczne...

Obrazowanie in vivo wapnia zespołów neuronalnych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego myszy

Źródło: Fowler, B. E., et al. Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych przestępczych myszy na bodźce smakowe. J. Vis. Exp. (2021) Ten film demonstruje protokół dostarczania degustantów do chirurgicznie odsłoniętego zwoju kolankowatego u znieczulonej myszy i wykorzystania fluorescencji GCaMP z mikroskopią epifluorescencyjną do wizualizacji odpowiedzi neuronalnych w czasie rzeczywistym, wspomagając badania nad przetwarzaniem sygnałów smaku obwodowego.

Obrazowanie in vivo odpowiedzi neuronów zwojowych układu nerwowego za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Obecny protokół opisuje obrazowanie wapnia in vivo do pomiaru odpowiedzi zespołów neuronów DRG lędźwiowych-6 na bodźce somatyczne i trzewne. Można dokonać dokładnych porównań między neuronami reagującymi na różne bodźce. Protokół ten jest cenny w badaniu mechanizmów bólu trzewnego i stymulacji somatycznej, takich jak akupunktura.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe reakcji neuronów zwojów korzenia grzbietowego na bodźce somatyczne i trzewne

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

Podejście do obrazowania wapnia umożliwia rejestrowanie reakcji wywołanych smakiem w mózgach obudzonych muszek, podczas gdy roztwór jest nakładany na labellum. Jako przykład podano pierwotne reakcje smakowe u Drosophila melanogaster, ale protokół ten można dostosować do badania neuronów w dół rzeki lub innych gatunków.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia reakcji neuronalnych wywołanych smakiem u dorosłych Drosophila

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Poznaj metodę obrazowania wapnia in vivo neuronów zwojowych układu smakowego myszy przy użyciu wskaźników GCaMP. Technika umożliwia monitorowanie odpowiedzi neuronalnych na bodźce smakowe w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Przeglądaj więcej filmów