Name: Kondensaty białkowe wywołane dimeryzacją chemiczną na telomerach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę indukcji kondensatów białkowych na telomerach za pomocą dimeryzacji chemicznej. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę czasową i odwracalność procesu w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (1K22CA23763201 do H.Z., GM118510 do D.M.C.) i fundację Charlesa E. Kaufmana do H.Z. Autorzy pragną podziękować Jasonowi Tonesowi za korektę rękopisu.

1. Produkcja przejściowych linii komórkowych
<ol>
	<li>Komórki akceptorowe U2OS hodowli na szkiełkach nakrywkowych o wymiarach 22 x 22 mm (do obrazowania na żywo) lub okrągłych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm (dla IF lub FISH) pokrytych poli-D-lizyną na 6-dołkowej płytce z pożywką wzrostową (10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% roztworu penicyliny-streptomycyny w DMEM), aż osiągną 60-70% zgrywki.</li>
	<li>Zastąp pożywkę wzrostową 1 ml pożywką do transfekcji (pożywka wzrostowa bez roztworu penicyliny-streptomycyny) przed transfekcją.</li>
	<li>Do każdej studzienki transfekcyjnej dodać 4 μl odczynnika do transfekcji do 150 μl zredukowanej pożywki surowicy, wirować przez 10 sekund, a następnie inkubować przez 5 minut.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać plazmid konstruktu Halo (Halo-GFP-TRF1 lub Halo-TRF1) i plazmid konstruktu eDHFR (mutant mCherry-eDHFR-SIM lub mCherry-eDHFR-SIM) w stosunku masowym 1:1 (0,5 μg plazmidu konstrukującego Halo z 0,5 μg plazmidu konstrukującego eDHFR) do 150 μl zredukowanej pożywki surowicy, kroplami, mieszać przez pipetowanie. 
	UWAGA: Znaczniki są stosunkowo małe (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) i nie zaobserwowano wpływu na separację faz. Zaleca się jednak używanie mutantów, takich jak mutant SIM używany tutaj, aby upewnić się, że zachowanie fazy jest wrażliwe na mutacje, a nie na tagi. Karta SIM pochodzi z PIASx28,30. Sekwencja SIM to AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Mutacja SIM jest generowana przez mutację aminokwasów SIM VIDL do VADA28, a sekwencja to AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGGATGAAGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Zdeponowaliśmy nasze plazmidy w addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mWiśnia-eDHFR-SIM; #164649 Mutant mCherry-eDHFR-SIM.</li>
	<li>Dodać 150 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji i zredukowanej pożywki surowicy do 150 μl zredukowanej pożywki surowicy z DNA, kroplami, mieszać pipetując, inkubować przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 300 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji i DNA do komórek, kroplami, a następnie umieścić komórki z powrotem w inkubatorze.</li>
	<li>Odczekaj 24-48 godzin przed obrazowaniem na żywo, immunofluorescencją (IF) lub fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH).</li>
</ol>
2. Dimeryzacja telomerów
<ol>
	<li>Rozpuścić dimeryzatory w dimetylosulfotlenku w stężeniu 10 mM i przechowywać w plastikowych probówkach do mikrowirówek w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: Zamiast używać dimeryzatora z TMP bezpośrednio połączonym z Halo (TMP-Halo, TH), używany jest dimeryzator TMP-NVOC-Halo (TNH), który ma światłoczuły łącznik, 6-nitroweratryl oksykarbonylowy (NVOC), między TMP a Haloligand31. Dzieje się tak, ponieważ TNH (~5 minut) potrzebuje mniej czasu, aby dyfundować do komórki niż TH (~20 minut). Przedstawione tutaj wyniki można również uzyskać za pomocą TH. Podczas korzystania z TNH należy uważać, aby nie wystawiać dimeryzatora na działanie światła, aby uniknąć rozszczepienia NOVC. Z TNH należy obchodzić się w ciemnym pomieszczeniu ze słabą lampą światła czerwonego, przechowywać dimeryzator w bursztynowych plastikowych rurkach i owinąć pojemnik zawierający TNH lub poddane działaniu substancji ogniwa folią aluminiową. Obrazowanie TNH za pomocą DIC jest bezpieczne.</li>
	<li>Pobrać podwielokrotność 10 mM dimeryzatora od -80 °C i rozcieńczyć w pożywce do stężenia podstawowego 10 μM i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Gdy są gotowe do użycia, rozcieńczyć dimeryzatory z 10 μM roztworu podstawowego do końcowego stężenia roboczego 100 nM w pożywce wzrostowej (do utrwalonego obrazowania) lub pożywce do obrazowania. Potraktuj komórki dimeryzatorami 100 nM (stężenie końcowe) na scenie w celu obrazowania na żywo lub inkubuj przez 4-5 godzin w celu immunofluorescencji (IF) i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). 
	UWAGA: Stężenie zastosowanych dimerizerów wpływa na wydajność dimeryzacji, a tym samym na separację faz. Stężenie dimeryzatora pozwalające na maksymalną wydajność dimeryzacji zależy od typu komórki i stężenia białka kotwicznego, dlatego będzie musiało zostać określone dla różnych eksperymentów. Jednym z prostych sposobów jest inkubacja komórek wykazujących ekspresję białka kotwiczącego i mCherry-eDHFR (bez fuzji z białkiem rozdzielającym fazy lub fuzji z mutantem nierozdzielającym faz) i określenie stężenia dimeryzatora, przy którym osiąga się najwyższą intensywność mCherry w kotwicy. Bardziej systematycznym podejściem jest inkubacja komórek wyrażających kotwicę tylko z różnymi stężeniami dimeryzatorów, a następnie z barwnikiem wiążącym Halo, aby pomóc określić stężenie dimeryzatora, przy którym intensywność barwnika wiążącego Halo zaczyna się stabilizować (tj. wszystkie kotwice połączone Halo są zajęte przez dimeryzator i nie pozostają już dla barwnika wiążącego Halo)32.</li>
	<li>Aby odwrócić dimeryzację, inkubuj komórki z dimeryzatorami przez 2-5 godzin (z obrazowaniem na żywo lub bez) lub do momentu osiągnięcia pożądanej wielkości kropelki i dodaj do komórek 100 μM wolnego TMP (stężenie końcowe) rozcieńczonego w pożywce do obrazowania.</li>
</ol>
3. Immunofluorescencja (IF) 
<ol>
	<li>Wysiew 105 komórek na okrągłych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm pokrytych poli-D-lizyną na płytce 6-dołkowej. Następnie przetransfekuj dwa plazmidy (Halo-GFP-TRF1 z mutantem mCherry-eDHFR-SIM lub mCherry-eDHFR-SIM) i odczekaj 24-48 godzin przed przystąpieniem do immunofluorescencji. 
	UWAGA: Odczekaj więcej niż jeden dzień po transfekcji, aby uzyskać wyższą ekspresję.  </li>
	<li>Rozcieńczyć dimeryzatory pożywką wzrostową do osiągnięcia końcowego stężenia 100 nM, dodać rozcieńczone dimeryzatory do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4-5 godzin. 
	UWAGA: Separacja faz jest szybko indukowana po dodaniu dimerizerów (< 30 minut). Dłuższa inkubacja pomaga kropelkom zgrubić się do większych rozmiarów. Śledzenie wzrostu kropel za pomocą obrazowania na żywo może być wykorzystane do określenia czasu potrzebnego kropelkom do osiągnięcia pożądanego stanu.</li>
	<li>Utrwal komórki w roztworze PBS zawierającym 4% formaldehydu i 0,1% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby przepuszczalność komórek. Umyj komórki 3 razy za pomocą PBS. 
	UWAGA: Po tym kroku można go wstrzymać, a komórki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia. 
	Uwaga: Formaldehyd jest szkodliwy przez drogi oddechowe, a po połknięciu podrażnia również oczy, układ oddechowy i skórę oraz stanowi potencjalne zagrożenie rakiem. Należy nosić środki ochrony osobistej, używać tylko w okapie chemicznym. Po użyciu wrzuć go również do pojemnika na odpady, nie wyrzucaj go do zlewu.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe przemyć dwukrotnie 50 μl TBS-Tx i raz 50 μl buforu do rozcieńczania przeciwciał (AbDil). TBS-Tx był produkowany przez TBS, 0,1% Triton X-100 i 0,05% Na-azydku. AbDil został wyprodukowany przez TBS-Tx, 2% BSA i 0,05% Na-azydku.</li>
	<li>Inkubować każde szkiełko nakrywkowe z 50 μl pierwszorzędowego przeciwciała anty-PML (rozcieńczenie 1:50 w AbDil) / anty-SUMO1 (rozcieńczenie 1:200 w AbDil) / anty-SUMO2/3 (rozcieńczenie 1:200 w AbDil) w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze przez noc. Można również użyć przeciwciała mCherry (rozcieńczenie 1:200 w AbDil), aby pomóc w wykryciu sygnału mCherry dla FISH. 
	UWAGA: FISH wygasza sygnał fluorescencyjny mCherry, co utrudnia różnicowanie komórek transfekowanych plazmidami mCherry od tych, które nie były transfekowane w eksperymentach FISH. Zaleca się stosowanie przeciwciał mCherry. Alternatywnie można stworzyć stabilną linię komórkową eksprymującą białko zawierające eDHFR.</li>
	<li>Przemyj szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą AbDil, aby usunąć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe.</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym [przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H+L) sprzężone z Alexa Fluor 647 dla PML i SUMO, przeciwciałem anty-króliczym IgG (H+L) skoniugowanym z Alexa Fluor 555 dla mCherry, oba w rozcieńczeniu 1:1000 w AbDil] przez 1 godzinę w ciemnym pudełku w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą TBS-Tx.</li>
	<li>Na szkiełkach należy oznaczyć DAPI rozcieńczonym w podłożu montażowym, aby osiągnąć końcowe stężenie DAPI 1 μg/ml. Następnie umieść 2 μl rozcieńczonego DAPI na szkiełku. Odwróć szkiełka nakrywkowe i umieść je na kropli DAPI, zaczerpnij dodatkowy płyn z krawędzi szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Uszczelnij lakierem do paznokci, pozostaw do wyschnięcia i spłucz wodą od wierzchu szkiełka nakrywkowego. Zapisz w zamrażarce do obrazowania.</li>
</ol>
4. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)
<ol>
	<li>Wysiew 105 komórek na okrągłych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm pokrytych poli-D-lizyną na płytce 6-dołkowej. Komórki transfekcyjne ze zmutowanymi plazmidami Halo-TRF1 i mCherry-eDHFR-SIM lub mCherry-eDHFR-SIM i odczekać 24-48 godzin przed przystąpieniem do FISH. Etap dimeryzacji jest taki sam, jak opisano w 3.2. 
	UWAGA: W tym przypadku TRF1 nie jest połączony z GFP, więc zielony kanał jest zwolniony dla sondy telomerowego DNA.</li>
	<li>Utrwal komórki 4% formaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej i umyj 4 razy PBS. W przypadku IF-FISH należy przejść do protokołu IF i po zmyciu przeciwciał drugorzędowych w IF (3.8) ponownie połączyć komórki z 4% formaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przemyć trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Odwodnić szkiełka nakrywkowe w serii etanolowej (70%, 80%, 90%, po 2 minuty).</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe za pomocą sondy PNA 488-telC (stosunek 1:2000) w 5 μl roztworu hybrydyzacyjnego w temperaturze 75 °C przez 5 minut. Roztwór hybrydyzacyjny zawiera 70% dejonizowanego formamidu, 10 mM Tris (pH 7,4), 0,5% odczynnika blokującego. Następnie inkubować przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe umyć buforem do płukania (70% formamidu, 10 mM Tris) 2 minuty 3 razy w temperaturze pokojowej i zamontować za pomocą 1 μg/ml DAPI w podłożu montażowym do obrazowania. 
	UWAGA: Protokół FISH jest opublikowanym protokołem33'34.</li>
</ol>
5. Obrazowanie na żywo
<ol>
	<li>Gdy komórki są gotowe do obrazowania, zamontuj szkiełka nakrywkowe w komorach magnetycznych z komórkami utrzymywanymi w 1 ml pożywki obrazowej bez czerwieni fenolowej na podgrzewanym stoliku w komorze środowiskowej.</li>
	<li>Ustaw mikroskop i aparaturę do kontroli środowiska. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem z obiektywem 1,4 NA 100x, napędem Piezo Z-Drive, kamerą EMCCD (Electron Multipling Charge-coupled Device) oraz modułem laserowym wyposażonym w lasery 455, 488, 561, 594 i 647 nm sterowane przez oprogramowanie do obrazowania. Moce wyjściowe dla wszystkich laserów wynoszą 20 mW mierzone na końcu światłowodu.</li>
	<li>Zlokalizuj komórki z jasnym sygnałem GFP na telomerach i dyfuzyjnie zlokalizowanym sygnałem mCherry w nukleoplazmie. Znajdź około 20 komórek, zapamiętaj każdą pozycję z informacjami x, y, z i ustaw parametry obrazowania poklatkowego z odstępem 0,5 μm, co daje łącznie 8 μm w Z i 5-minutowym interwałem czasowym przez 2-4 godziny zarówno dla kanałów GFP, jak i mCherry. Używaj 30% intensywności 594 nm i 50% 488 nm, z czasami naświetlania 200 ms i wzmocnieniem kamery 300, 
	UWAGA: Moc wyjściowa jednostek laserowych wynosi 20 mW. Jasne ogniska GFP wskazują na większy rozmiar kotwicy, który może łatwiej zarodkować kondensaty. Znajdź komórki o szerokim zakresie sygnału mCherry, ponieważ separacja faz zależy od stężenia SIM w komórce. Ogniwa ze zbyt słabym lub zbyt jasnym sygnałem mCherry mogą nie rozdzielać faz. Aby uniknąć fotowybielania, nie używaj zbyt dużej mocy lasera ani zbyt długiego czasu naświetlania.</li>
	<li>Rozpocznij obrazowanie i wykonaj jednorazową pętlę jako wstępną dimeryzację. Wstrzymać obrazowanie, dodać 0,5 ml pożywki obrazowej zawierającej 15 μl 10 μM dimeryzatora do komory obrazowania na stoliku, tak aby końcowe stężenie dimeryzatora wynosiło 100 nM. Wznów obrazowanie.</li>
	<li>Gdy jesteś gotowy do odwrócenia dimeryzacji, przerwij obrazowanie, dodaj 0,5 ml pożywki obrazowej zawierającej 2 μl 100 mM podstawowego TMP do komory obrazowania na stoliku, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM TMP. Kontynuuj obrazowanie komórek przez 1-2 godziny.</li>
</ol>
6. Poprawiono obrazowanie
<ol>
	<li>Ten sam mikroskop ustawiony co obrazowanie na żywo, podgrzewanie sceny nie jest potrzebne. Użyj 488 nm do obrazowania telomerów FISH, 561 nm dla mCherry If i 647 nm dla PML lub SUMO IF. 
	UWAGA: Jeśli nie używasz przeciwciała mCherry, po prostu bezpośrednio zobrazuj białko mCherry, ale sygnał może być przyciemniony z powodu wygaszania w FISH. Nadal używaj lasera 561 nm zamiast 594 nm do obrazowania mCherry, aby uniknąć przebijania sygnału Cy5 do mCherry.</li>
	<li>Zlokalizuj około 30-50 komórek z czerwonym sygnałem (mCherry lub mCherry IF), aby wybrać transfekowane komórki.</li>
	<li>Zdjęcia zostały wykonane w odstępach 0,3 μm, co daje łącznie 8 μm w Z, aby zebrać więcej sygnałów. Użyj 80% intensywności 647 nm, 80% 561 nm i 70% intensywności 488 nm, z czasami naświetlania 600 ms i wzmocnieniem aparatu 300.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie obrazów poklatkowych
<ol>
	<li>Zdefiniuj binarny dla telomerów 
	Wybierz jedną komórkę z informacjami o całym czasie i stosie z, wybierz tylko kanał GFP i utwórz warstwę binarną, definiując próg. Dostosuj dolną i górną wartość progu i użyj funkcji, takich jak "Gładki", "Wyczyść" i "Wypełnij otwory", aby zobaczyć, jak dobrze próg podnosi żądane obiekty we wszystkich punktach czasowych.</li>
	<li>Odejmij tło 
	Wybierz wszystkie kanały, narysuj prostokątny region zainteresowania (ROI) na tle (oprócz komórki). Zdefiniuj ten zwrot z inwestycji jako tło, a następnie odejmij intensywność tła.</li>
	<li>Połącz binarne telomery z intensywnością telomerów 
	Wybierz binarny telomery i połącz go z kanałem GFP, aby obliczyć intensywność GFP w obiektach binarnych jako intensywność telomerów.</li>
	<li>Obliczać liczbę telomerów i intensywność w czasie 
	Określ, które informacje mają zostać wyeksportowane, takie jak czas, identyfikator obiektu, średnia intensywność, suma intensywności i dane eksportu. Użyj oprogramowania do wykreślania figur, aby odczytać wyeksportowaną tabelę i wygenerować dane liczbowe liczby telomerów i intensywności telomerów (zsumuj intensywność w objętości każdego telomera, a następnie uśrednij dla wszystkich telomerów w komórce) w czasie.</li>
</ol>
8. Przetwarzanie obrazów o stałych komórkach
<ol>
	<li>Zdefiniuj plik binarny dla APBs 
	Wybierz transfekowane komórki do analizy, szukając sygnału w kanale 561 nm. Postępując zgodnie z procedurą opisaną w 7.1, zdefiniuj próg zarówno w kanale GFP (telomer DNA FISH), jak i Cy5 (PML lub SUMO IF), aby wygenerować plik binarny odpowiednio dla telomerów i ciał PML lub SUMO. Połącz warstwy binarne GFP i Cy5 i utwórz nową warstwę zawierającą cząstki, które mają sygnał GFP i Cy5, aby reprezentować kolokalizację ciała PML na telomerach, a więc APB.</li>
	<li>Obliczać liczbę i intensywność APB/SUMO 
	Odejmij tło obrazu zgodnie z 7.2. Połącz warstwę binarną APB/SUMO z kanałem Cy5 zgodnie z 7.3. Obliczać liczbę i intensywność APB/SUMO. Eksport i wykreślenie danych zgodnie z punktem 7.4.</li>
</ol>

<ol><li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), (2017).</li>
<li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates%3A+organizers+of+cellular+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li>
<li>Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates in the nucleus.</a> Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).</li>
<li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li>
<li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+formation+by+HP1%CE%B1+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li>
<li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li>
<li>Hur, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK-Regulated+phase+separation+seeded+by+histone+genes+ensures+precise+growth+and+function+of+histone+locus+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies.</a> Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).</li>
<li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+phase+separation+in+live+cells%3A+diagnosis%2C+caveats%2C+and+functional+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li>
<li>Peng, A., Weber, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+and+against+liquid-liquid+phase+separation+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Non-coding+RNA%22%5BJournal%5D)">Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus.</a> Non-coding RNA. 5 (4), (2019).</li>
<li>Erdel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+heterochromatin+adopts+digital+compaction+states+without+showing+hallmarks+of+HP1-driven+liquid-liquid+phase+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation.</a> Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+body+phase+separation+drives+telomere+clustering+in+ALT+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).</li>
<li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 5, 1-9 (2014).</li>
<li>Yeager, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase-negative+immortalized+human+cells+contain+a+novel+type+of+promyelocytic+leukemia+%28PML%29+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.</a> Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).</li>
<li>Zhang, J. M., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+lengthening+of+telomeres%3A+From+molecular+mechanisms+to+therapeutic+outlooks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks.</a> Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).</li>
<li>Corpet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PML+nuclear+bodies+and+chromatin+dynamics%3A+catch+me+if+you+can%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can.</a> Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).</li>
<li>Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PML+nuclear+body+biogenesis%2C+carcinogenesis%2C+and+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).</li>
<li>Dilley, R. L., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALTernative+telomere+maintenance+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">ALTernative telomere maintenance and cancer.</a> Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).</li>
<li>Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+lengthening+of+telomeres%3A+DNA+repair+pathways+converge%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge.</a> Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).</li>
<li>Draskovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+PML+body+function+in+ALT+cells+reveals+spatiotemporal+requirements+for+telomere+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726(2009).</li>
<li>Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+lengthening+of+telomeres+through+two+distinct+break-induced+replication+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways.</a> Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).</li>
<li>Loe, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+heterogeneity+in+ALT+cells+is+maintained+by+PML-dependent+localization+of+the+BTR+complex+to+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres.</a> Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).</li>
<li>Potts, P. R., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SMC5%2F6+complex+maintains+telomere+length+in+ALT+cancer+cells+through+SUMOylation+of+telomere-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).</li>
<li>Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+of+a+PML+nuclear+subcompartment+occurs+through+multiple+pathways+and+induces+telomere+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation.</a> Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).</li>
<li>Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+PML-nuclear+body+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of PML-nuclear body formation.</a> Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).</li>
<li>Shima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+SUMO+modification+system+is+required+for+the+accumulation+of+RAD51+at+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).</li>
<li>Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+SUMOylation+in+telomere+maintenance+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction.</a> Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).</li>
<li>Sarangi, P., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-mediated+regulation+of+DNA+damage+repair+and+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).</li>
<li>Banani, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+control+of+phase-separated+cellular+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Compositional control of phase-separated cellular bodies.</a> Cell. 166 (3), 651-663 (2016).</li>
<li>Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+telomeres+in+phase-separated+nuclear+condensates+engage+mitotic+DNA+synthesis+through+BLM+and+RAD52%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).</li>
<li>Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+SUMO-binding+motif+that+recognizes+SUMO-modified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).</li>
<li>Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7+-+Optogenetic+control+of+mitosis+with+photocaged+chemical+dimerizers%5BTitle%5D)+AND+%22Mitosis+and+Meiosis+Part+A%22%5BJournal%5D)">Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers.</a> Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+kinetochore+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of kinetochore function.</a> Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).</li>
<li>Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+homology+searches+drive+directional+ALT+telomere+movement+and+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis.</a> Cell. 159 (1), 108-121 (2014).</li>
<li>Dilley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break-induced+telomere+synthesis+underlies+alternative+telomere+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance.</a> Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).</li>
<li>Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+control+of+protein+localization+in+living+cells+using+a+photocaged-photocleavable+chemical+dimerizer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optoDroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+nuclear+condensates+mechanically+sense+and+restructure+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome.</a> Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).</li>
<li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+tagging%3A+a+step-by-step+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten wykazał tworzenie i rozpuszczanie kondensatów na telomerach za pomocą systemu dimeryzacji chemicznej. Kinetyka separacji faz i grupowania telomerów wywołanego fuzją kropelek jest monitorowana za pomocą obrazowania na żywo. Lokalizacja i skład kondensatu są określane za pomocą DNA FISH i białka IF.
W tym protokole istnieją dwa krytyczne kroki. Pierwszym z nich jest określenie stężenia białka i dimeryza. Sukces w indukowaniu lokalnej separacji faz w locus genomu opiera się na wzrośc...

Wiele białek i kwasów nukleinowych przechodzi separację faz ciecz-ciecz (LLPS) i samoorganizuje się w kondensaty biomolekularne, aby uporządkować biochemię w komórkach1,2. LLPS białek wiążących chromatynę prowadzi do powstawania kondensatów, które są związane z określonymi loci genomowymi i są zaangażowane w różne lokalne funkcje chromatyny3. Na przykład LLPS białka HP1 leży u podstaw tworzenia domen heterochromatyny w celu uporządkowania genomu4,5, LLPS czynników transkrypcyjnych tworzy centra transkrypcyjne do regulacji transkrypcji6, LLPS powstających mRNA i wielopłciowych białek grzebieniowych generuje ciała locus histonów w celu regulacji transkrypcji i przetwarzania mRNA histonów7. Jednak pomimo wielu przykładów odkrycia kondensatów związanych z chromatyną, mechanizmy leżące u podstaw powstawania, regulacji i funkcji kondensatu pozostają słabo poznane. W szczególności nie wszystkie kondensaty związane z chromatyną są tworzone przez LLPS i nadal potrzebne są dokładne oceny tworzenia się kondensatu w żywych komórkach8,9. Na przykład wykazano, że białko HP1 u myszy ma tylko słabą zdolność do tworzenia kropelek płynu w żywych komórkach, a ogniska heterochromatyny zachowują się jak zapadnięte kuleczki polimerowe10. Dlatego pożądane są narzędzia do indukowania kondensatów de novo na chromatynie w żywych komórkach, szczególnie te, które pozwalają na wykorzystanie obrazowania na żywo i testów biochemicznych do monitorowania kinetyki tworzenia się kondensatu, właściwości fizycznych i chemicznych powstałych kondensatów oraz komórkowych konsekwencji tworzenia się kondensatu.
Ten protokół informuje o chemicznym systemie dimeryzacji do indukowania kondensatów białkowych na chromatynie11 (Rysunek 1A). Dimeryzator składa się z dwóch połączonych ligandów oddziałujących z białkami: trimetoprimu (TMP) i ligandu Halo i może dimeryzować białka połączone z pokrewnymi receptorami: odpowiednio reduktazę dihydrofolianu Escherichia coli (eDHFR) i bakteryjny enzym alkilodehalogenazę (enzym Halo)<klasa sup = "xref">12. Interakcja między ligandem Halo a enzymem Halo jest kowalencyjna, co pozwala na wykorzystanie enzymu Halo jako kotwicy poprzez fuzję go z białkiem wiążącym chromatynę w celu rekrutacji białka oddzielającego fazy połączonego z eDHFR do chromatyny. Po wstępnej rekrutacji, zwiększone lokalne stężenie białka rozdzielającego fazę przekracza krytyczne stężenie potrzebne do separacji faz i w ten sposób nukleuje kondensat w kotwicy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B). Poprzez fuzję białek fluorescencyjnych (np. mCherry i eGFP) z eDHFR i Halo, zarodkowanie i wzrost kondensatów można wizualizować w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ponieważ interakcja między eDHFR i TMP jest niekowalencyjna, nadmiar wolnego TMP może zostać dodany, aby konkurować z dimeryzatorem o wiązanie eDHFR. Spowoduje to uwolnienie białka separacji faz z kotwicy i rozpuszczenie kondensatu związanego z chromatyną.
Użyliśmy tego narzędzia do wywołania de novo tworzenia ciał jądrowych białaczki promielocytowej (PML) na telomerach w telomerach w telomerazo-ujemnych komórkach nowotworowych, które wykorzystują alternatywny szlak wydłużania telomerów (ALT) do utrzymania telomerów13,14. Ciała jądrowe PML to pozbawione błony przedziały biorące udział w wielu procesach jądrowych15,16 i są unikalnie zlokalizowane w telomerach ALT, tworząc APB, dla ciał PML związanych z telomerami ALT17,18. Telomery grupują się w APB, przypuszczalnie w celu zapewnienia szablonów naprawczych dla ukierunkowanej na homologię syntezy telomerów DNA w ALT19. Rzeczywiście, synteza DNA telomerów została wykryta w APB, a APB odgrywają istotną rolę we wzbogacaniu czynników naprawy DNA na telomerach20,21. Jednak mechanizmy leżące u podstaw składania APB i grupowania telomerów w APB były nieznane. Ponieważ białka telomerów w komórkach ALT są unikalnie modyfikowane przez małe modyfikatory podobne do ubikwityny (SUMO)22, wiele składników APB zawiera miejsca sumoilacji 22,23,24,25 i/lub motywy oddziałujące z SUMO (SIM)26,27 i interakcje SUMO-SIM napędzają separację faz28, postawiliśmy hipotezę, że sumoilacja na telomerach prowadzi do wzbogacenia białek zawierających SUMO/SIM, a interakcje SUMO-SIM między tymi białkami prowadzą do separacji faz. Białko PML, które ma trzy miejsca sumoilacji i jedno miejsce SIM, może być rekrutowane do sumoilowanych telomerów w celu utworzenia APB, a koalescencja płynnych APB prowadzi do grupowania telomerów. Aby przetestować tę hipotezę, użyliśmy systemu dimeryzacji chemicznej, aby naśladować tworzenie APB wywołane sumoilacją poprzez rekrutację SIM do telomerów (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2A) 11. GFP jest połączony z haloenzymem w celu wizualizacji oraz z białkiem wiążącym telomery TRF1 w celu zakotwiczenia dimeryzatora w telomerach. Karta SIM jest połączona z eDHFR i mCherry. Kinetyka tworzenia kondensatu i grupowania telomerów wywołanego fuzją kropel jest śledzona za pomocą obrazowania żywych komórek. Separacja faz jest odwracana przez dodanie nadmiaru wolnego TMP, aby konkurować z wiązaniem eDHFR. Immunofluorescencja (IF) i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) służą do określania składu kondensatu i asocjacji telomerowej. Rekrutacja SIM wzbogaca SUMO o telomery, a indukowane kondensaty zawierają PML, a zatem są APB. Rekrutacja mutanta SIM, który nie może wchodzić w interakcje z SUMO, nie wzbogaca SUMO w telomery ani nie indukuje separacji faz, co wskazuje, że podstawową siłą napędową kondensacji APB jest interakcja SUMO-SIM. Zgadzając się z tą obserwacją, polimery polySUMO-polySIM, które połączyły się z czynnikiem wiążącym TRF2 RAP1, mogą również indukować tworzenie APB29. W porównaniu z systemem fuzji polySUMO-polySIM, w którym separacja faz zachodzi tak długo, jak długo produkowana jest wystarczająca ilość białek, przedstawione tutaj podejście do dimeryzacji chemicznej indukuje separację faz na żądanie, a tym samym oferuje lepszą rozdzielczość czasową w celu monitorowania kinetyki separacji faz i procesu grupowania telomerów. Ponadto ten system dimeryzacji chemicznej pozwala na rekrutację innych białek w celu oceny ich zdolności do indukowania separacji faz i grupowania telomerów. Na przykład, nieuporządkowane białko rekrutowane do telomerów może również tworzyć kropelki i grupować telomery bez indukowania tworzenia APB, co sugeruje, że grupowanie telomerów jest niezależne od chemii APB i opiera się tylko na właściwości cieczy APB11.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna, 0,1% EDTA w HBSS bez wodorowęglanu wapnia, magnezu i sodu</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehydu (w/v), bez metanolu</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td>Przygotuj 1% w 1x PBS</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka hodowlana</td><td>VWR</td><td>10861-554</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-101</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mCherry</td><td>Abcam</td><td>Ab183628</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PML</td><td>Santa Cruz</td><td>sc966</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-SUMO1</td><td>Abcam</td><td>Ab32058</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-SUMO2/3</td><td>Cytoszkielet</td> Odczynnik blokujący <td>Asm23</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706100</td><td></td></tr><tr><td>Tuba BTX micro 1,5ML&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89511-258</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe kołowe</td> Mikroskop konfokalny <td>Thermo Scientific</td><td>3350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MQS31000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>DMEM z L-Glutaminą, 4,5 g/l glukozy i pirogronianem sodu</td><td>Corning</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>iXon Life&nbsp;</td><td>897</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>4355221</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, regiony zatwierdzone przez USDA</td><td>Gibco</td><td>A4766801</td><td></td></tr><tr><td>Formamid, Dejonizowany</td><td>MilliporeSigma</td><td>46-101-00ML</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG (H + L), rekombinowane przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A28181</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG (H+L), rekombinowane przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna, prosta, stożkowa, ultra cienka pęseta punktowa / kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Moduł scalania laserowego&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NIIMHF47180</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do kreślenia figurek, MATLAB</td> Pudełko na slajdy <td>mikroskopu MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>34487</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-071</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania, NIS-Elements&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Zredukowany środek surowicy</td><td>Gibco</td><td>51985091</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x, pH 7,4</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-011-044</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Piezo Z-Drive&nbsp;</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>91985</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>10017</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe z gładkimi i matowymi narożnikami</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli-D-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Wirujący dysk</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowe szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x rozwiązanie</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2471500</td><td></td></tr><tr><td>TelC-Alexa488</td><td>PNA Bio</td><td>F1004</td><td></td></tr><tr><td>TMP</td><td>Zsyntetyzowane przez laboratorium</td><td></td> Chenoweth <td>Dostępne na żądanie</td></tr><tr><td>TNH</td><td>Zsyntetyzowane przez laboratorium</td><td></td> Chenoweth <td>Dostępne na żądanie</td></tr><tr><td>Tris Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>92-901-00ML</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 10% roztwór</td><td>MilliporeSigma</td><td>64-846-350ML</td><td>Przygotuj 0,5% w 1x linia komórkowa PBS</td></tr><tr><td>U2Os</td><td>Z laboratorium E.V. Makayev (Uniwersytet Technologiczny Nanyang, Singapur)</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>NC9524612</td><td></td></tr></tbody></table>

kondensaty białkowe wywołane dimeryzacją chemiczną na telomerach

Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

Kondensaty związane z chromatyną są zaangażowane w wiele procesów jądrowych, ale mechanizmy leżące u ich podstaw pozostają nieuchwytne. Protokół ten opisuje chemicznie indukowany system dimeryzacji białek w celu wytworzenia kondensatów na telomerach. Dimeryzator chemiczny składa się z dwóch połączonych ligandów, z których każdy może wiązać się z białkiem: odpowiednio ligand Halo z enzymem Halo i trimetoprim (TMP) z reduktazą dihydrofolianu E. coli (eDHFR). Fuzja enzymu Halo z białkiem telomeru zakotwicza dimeryzatory w telomerach poprzez kowalencyjne wiązanie ligandu i enzymu Halo. Wiązanie TMP z eDHFR rekrutuje białka oddzielające fazę fuzji eDHFR do telomerów i indukuje tworzenie kondensatu. Ponieważ interakcja TMP-eDHFR jest niekowalencyjna, kondensację można odwrócić, wykorzystując nadmiar wolnego TMP do konkurowania z dimeryzatorem o wiązanie eDHFR. Przedstawiono przykład indukowania tworzenia ciał jądrowych białaczki promielocytowej (PML) na telomerach oraz określania wzrostu, rozpuszczania, lokalizacji i składu kondensatu. Metodę tę można łatwo dostosować do indukowania kondensatów w innych lokalizacjach genomu poprzez fuzję Halo z białkiem, które bezpośrednio wiąże się z lokalną chromatyną lub z dCas9, które jest ukierunkowane na locus genomu z przewodnikiem RNA. Oferując rozdzielczość czasową wymaganą do obrazowania na żywo pojedynczej komórki przy jednoczesnym zachowaniu separacji faz w populacji komórek do testów biochemicznych, metoda ta jest odpowiednia do badania zarówno powstawania, jak i funkcji kondensatów związanych z chromatyną.

Reprezentatywne obrazy lokalizacji telomerowej SUMO, zidentyfikowane za pomocą telomerowej hybrydyzacji in situ DNA (FISH) oraz immunofluorescencji (IF) białka SUMO, przedstawiono na Rysunku 2. Komórki z rekrutacją SIM wykazywały zwiększone wzbogacenie SUMO1 oraz SUMO 2/3 na telomerach w porównaniu z komórkami z rekrutacją zmutowanego SIM. Wskazuje to, że indukowane dimeryzacją SIM wzbogacenie SUMO na telomerach zależy od oddziaływań SUMO-SIM.
Reprezentatywny film...

Ten protokół ilustruje chemicznie indukowany system dimeryzacji białek w celu tworzenia kondensatów na chromatynie. Pokazano tworzenie ciała jądrowego białaczki promielocytowej (PML) na telomerach za pomocą chemicznych dimeryzatorów. Wzrost, rozpuszczanie, lokalizacja i skład kropel są monitorowane za pomocą obrazowania żywych komórek, immunofluorescencji (IF) i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Kondensaty białkowe wywołane dimeryzacją chemiczną na telomerach

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

Protokół ten opisuje system dimeryzacji chemicznej w celu indukowania kondensatów białkowych na telomerach. Można go łatwo przystosować do indukowania kondensatów na innych loci genomowych i nadaje się do badania powstawania i funkcji kondensatów związanych z chromatyną. Metoda ta zapewnia rozdzielczość czasową wymaganą do obrazowania żywych komórek i utrzymuje separację faz w populacji komórek do testów biochemicznych.Na początek rozpuść dimeryzatory w DMSO w temperaturze 10 milimolów i przechowuj je w plastikowych probówkach do mikrowirówek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Rozcieńczyć podwielokrotność 10-milimolowego dimeryzatora w pożywce do stężenia podstawowego 10 mikromoli i przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Gdy są gotowe do użycia, rozcieńczyć dimeryzatory do końcowego stężenia roboczego 100 nanomolowych w pożywce wzrostowej lub pożywce do obrazowania.Zasiej od 10 do piątych komórek w okrągłych szkłach nakrywkowych o średnicy 12 milimetrów pokrytych poli-D-lizyną na sześciodołkowej płytce. Następnie przetransfekuj komórki zmutowanymi plazmidami Halo-GFP-TRF1 i mCherry-eDHFR-SIM lub mCherry-eDFR-SIM i odczekaj od 24 do 48 godzin przed przystąpieniem do immunofluorescencji. Dodaj rozcieńczone 100 nanomolowych dimeryzatorów do komórek i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery do pięciu godzin.Po inkubacji utrwalić komórki w roztworze PBS zawierającym 4% formaldehydu i 0,1% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby przepuszczalność komórek. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS. Szkiełka nakrywkowe przemyć dwukrotnie 50 mikrolitrami TBS-Tx i raz 50 mikrolitrami buforu do rozcieńczania przeciwciał.Inkubować każde szkiełko nakrywkowe z 50 mikrolitrami pierwszorzędowego przeciwciała anty-PML, anty-SUMO-1 lub anty-SUMO-2 i 3 w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze przez noc. Przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie buforem do rozcieńczania przeciwciał w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym przez godzinę w ciemnym pudełku w temperaturze pokojowej. Po zabarwieniu trzykrotnie umyj szkiełka nakrywkowe za pomocą TBS-Tx.Oznacz szkiełka, dodając dwa mikrolitry po jednym mikrogramie na mililitr DAPI, a następnie odwróć szkiełka pokrywy i umieść je na kropli DAPI. Odessać nadmiar płynu z krawędzi szkiełka nakrywkowego. Uszczelnij szkiełko lakierem do paznokci, pozostaw do wyschnięcia i spłucz górną część szkiełka nakrywkowego wodą.Umieść szkiełka w zamrażarce do czasu obrazowania. Zasiaj od 10 do piątych komórek na 12-milimetrowych okrągłych szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną na sześciodołkowej płytce i transfekuj je zmutowanymi plazmidami Halo-TRF1 i mCherry-eDHFR-SIM lub mCherry-eDHFR-SIM. Utrwal komórki 4% formaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej i umyj je czterokrotnie PBS.W przypadku IF-FISH należy wybarwić komórki przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi i ponownie utrwalić je 4% formaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć je czterokrotnie PBS i odwodnić szkiełka nakrywkowe w serii etanolowej. Inkubować szkiełka nakrywkowe za pomocą sondy C-PNA o stężeniu 488 telomerów w pięciu mikrolitrach roztworu hybrydyzacyjnego w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie inkubować szkiełka nakrywkowe przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie buforem do płukania przez dwie minuty na pranie w temperaturze pokojowej i umieść je z jednym mikrogramem na mililitr DAPI w podłożu montażowym do obrazowania.W przypadku obrazowania na żywo należy zamontować szkiełka nakrywkowe w komorach magnetycznych na podgrzewanym stoliku w komorze środowiskowej, utrzymując komórki w jednym mililitrze podłoża do obrazowania bez czerwieni fenolowej. Ustaw mikroskop i aparaturę do kontroli środowiska zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Zlokalizuj komórki z jasnym sygnałem GFP na telomerach i dyfuzyjnym sygnałem mCherry w cytozolu.Znajdź około 20 komórek, zapamiętując każdą pozycję za pomocą informacji XYZ i ustaw parametry obrazowania poklatkowego. Użyj odstępu 0,5 mikrometra, co daje łącznie osiem mikrometrów w Z i pięciominutowego odstępu czasu przez dwie do czterech godzin zarówno dla kanałów GFP, jak i mCherry. Użyj 30% intensywności energii 594 nanometrów i 50% 488 nanometrów, z czasami naświetlania 200 milisekund i wzmocnieniem kamery 300.Rozpocznij obrazowanie i wykonaj jedną pętlę czasową jako wstępną dimeryzację. Następnie wstrzymaj obrazowanie, dodaj 0,5 mililitra pożywki obrazowej zawierającej 15 mikrolitrów 10-mikromolowego dimeryzatora do komory obrazowania, uważając, aby nie dotknąć stolika, i wznów obrazowanie. Gdy będziesz gotowy do odwrócenia dimeryzacji, wstrzymaj obrazowanie i dodaj 0,5 mililitra pożywki obrazowej zawierającej dwa mikrolitry 100-milimolowego TMP do komory obrazowania.Kontynuuj obrazowanie komórek przez jedną do dwóch godzin. W przypadku obrazowania stacjonarnego należy użyć tej samej konfiguracji mikroskopu, co obrazowanie na żywo, ale bez podgrzewania stolika. Zlokalizuj około 30 do 50 komórek z czerwonym sygnałem, aby wybrać transfekowane komórki.Uzyskuj obrazy z odstępem 0,3 mikrometra, co daje łącznie osiem mikrometrów w Z. Użyj 80% intensywności energii 647 nanometrów, 80% 561 nanometrów i 70% intensywności 488 nanometrów, z czasami naświetlania 600 milisekund i wzmocnieniem kamery 300. Telomerową lokalizację SUMO zidentyfikowano za pomocą telomerów DNA FISH i immunofluorescencji białka SUMO. Komórki z rekrutacją SIM wzbogaciły SUMO-1 i SUMO-2 i 3 w porównaniu z komórkami z rekrutacją mutanta SIM, co wskazuje, że wzbogacenie SUMO w telomery wywołane dimeryzacją SIM zależy od interakcji SUMO-SIM.Film poklatkowy TRF-1 i SIM po dimeryzacji jest pokazany tutaj. SIM udało się zrekrutować do telomerów, a zarówno ogniska SIM, jak i TRF-1 stały się większe i jaśniejsze, zgodnie z przewidywaniami dotyczącymi tworzenia się i wzrostu kropelek cieczy. Ponadto zaobserwowano fuzję ognisk TRF-1, co doprowadziło do grupowania telomerów, co przejawia się zmniejszoną liczbą telomerów i zwiększoną intensywnością telomerów w czasie.W przeciwieństwie do tego, mutant SIM został zrekrutowany do telomerów po dimeryzacji, ale nie indukował żadnego tworzenia kropelek ani grupowania telomerów, co wskazuje, że separacja faz i grupowanie telomerów jest napędzane przez interakcje SUMO-SIM. Odwrócenie separacji faz i grupowania telomerów zaobserwowano po dodaniu nadmiaru wolnego TMP. Liczba telomerów zwiększała się, a intensywność telomerów zmniejszała się z czasem.Reprezentatywne obrazy APB zidentyfikowanych za pomocą telomerów DNA, FISH i białka PML IF przedstawiono tutaj. Komórki z rekrutacją SIM mają więcej APB niż komórki z mutantem SIM, co sugeruje, że kondensaty wywołane dimeryzacją są rzeczywiście APB. Wykonując ten protokół, nie wystawiaj światłoczułych ściemniaczy na działanie światła.Pracuj w ciemnym pomieszczeniu z lampą emitującą czerwone światło i owiń komórki folią aluminiową podczas inkubacji. Zgodnie z tą procedurą, etykietowanie zbliżeniowe może być wykorzystane do wygenerowania wyczerpującej listy składników w indukowanym kondensacie. Obrazowanie na żywo może być wykorzystywane do śledzenia dynamiki składników w kondensacie.Metody te mogą pomóc w określeniu ról kontroli składu kondensatu.

chemical-dimerization-induced-protein-condensates-on-telomeres

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnałowego pęknięć dwuniciowych DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, a także jego lokalizacji podczas mitozy.

Dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

Tworzenie chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek o pożądanym powinowactwie i specyficzności dla dowolnego ligandu małych cząsteczek miałoby wiele zastosowań w biologicznym wykrywaniu i uruchamianiu. W tym miejscu opisujemy wydajną, uogólnioną metodę inżynierii de novo chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji poprzez krokowy wybór kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych wyświetlanej przez fagi.

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

Tutaj opisujemy użycie metody obrazowania pojedynczych cząsteczek, Zasłon DNA, do badania biofizycznego mechanizmu gromadzenia się kondensatów EWS-FLI1 na DNA.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 składających się na DNA

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych kondensatów biomolekularnych składających się z amfifilowych nanogwiazd DNA, zaczynając od ich składowych oligonukleotydów DNA. Kondensaty są wytwarzane z pojedynczego składnika nanogwiazdy lub dwóch składników i są modyfikowane w celu podtrzymania transkrypcji RNA in vitro z osadzonej matrycy DNA.

Syntetyczne kondensaty i architektury podobne do komórek z amfifilowych nanostruktur DNA

Ten protokół demonstruje użycie pęsety magnetycznej do badania interakcji między telomerowymi białkami wiążącymi DNA (Telomer Repeat-binding Factor 1 [TRF1] i TRF2) a długimi telomerami ekstrahowanymi z komórek ludzkich. Opisano w nim etapy przygotowawcze do telomerów i telomerowych czynników wiążących powtórzenia, wykonywanie eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach oraz metody gromadzenia i analizy danych.

Analiza telomerowych oddziaływań białko-DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej

Opisano krótki protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 w żelach poliakrylamidowych, który nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego, stosowanych w klasycznych procedurach barwienia CBB.

Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

Dołączony film opisuje sposób wykorzystania systemu frakcjonowania GELFREE 8100, który rozdziela złożone próbki białek na podstawie masy cząsteczkowej i odzyskuje frakcje w fazie ciekłej. Film wyjaśnia zasadę działania tej technologii, sposób jej zastosowania oraz przedstawia uzyskane dane z analizy frakcjonowanego homogenatu wątroby bydlęcej za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym.

Wykorzystanie systemu frakcjonowania GELFREE 8100 do frakcjonowania w oparciu o masę cząsteczkową z odzyskiem w fazie ciekłej

Poznaj metodę indukcji kondensatów białkowych na telomerach za pomocą dimeryzacji chemicznej. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę czasową i odwracalność procesu w żywych komórkach.

Kondensaty białkowe wywołane dimeryzacją chemiczną na telomerach

Przeglądaj więcej filmów