Name: Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj metody mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki miozyn niemięśniowych na poziomie pojedynczych cząsteczek i zespołów. Technika ta pozwala analizować wpływ mutacji na ruchliwość białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Fang Zhangowi za pomoc techniczną w przygotowaniu odczynników używanych do zbierania tych danych. Praca ta była wspierana przez fundusze NHLBI/NIH Intramural Research Program HL001786 J.R.S.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiono tutaj przebieg oczyszczania i charakterystyki in vitro miozyny 5a i miozyny 2b bez mięśni. Ten zestaw eksperymentów jest przydatny do ilościowego określania właściwości mechanochemicznych oczyszczonych konstruktów miozyny w szybki i powtarzalny sposób. Chociaż pokazane tutaj dwie miozyny to tylko dwa konkretne przykłady z wielu możliwości, warunki i techniki mogą być zastosowane, z pewnym dostosowaniem, do większości miozyn i wielu innych białek motorycznych.
Omawiane tutaj proto...

Miozyny to białka motoryczne, które wywierają siłę na filamenty aktynowe, wykorzystując energię pochodzącą z hydrolizy adenozynotrifosforanu (ATP)1. Miozyny zawierają domenę głowy, szyi i ogona. Domena główna zawiera region wiążący aktynę, a także miejsce wiązania i hydrolizy ATP. Domeny szyi składają się z motywów IQ, które wiążą się z łańcuchami świetlnymi, kalmoduliną lub białkami podobnymi do kalmoduliny2,3. Region ogonowy ma kilka funkcji specyficznych dla każdej klasy miozyn, w tym między innymi dimeryzację dwóch łańcuchów ciężkich, wiązanie cząsteczek ładunku i regulację miozyny poprzez interakcje autohamujące z domenami głównymi1.
Właściwości ruchliwe miozyny różnią się znacznie między klasami. Niektóre z tych właściwości obejmują współczynnik wypełnienia (ułamek cyklu mechanicznego miozyny, w którym miozyna jest związana z aktyną) i procesywność (zdolność silnika do wykonywania wielu kroków na swojej torze przed odłączeniem)4. Na podstawie analiz sekwencji określono ponad 40 klas miozyn5,6,7,8. Miozyny klasy 2 są klasyfikowane jako "konwencjonalne", ponieważ były pierwszymi, które zostały zbadane; Wszystkie inne klasy miozyn są zatem klasyfikowane jako "niekonwencjonalne".
Myosin 5a (M5a) jest miozyną klasy 5 i jest motorem procesowym, co oznacza, że może wykonać wiele kroków wzdłuż aktyny przed dysocjacją. Ma wysoki współczynnik obciążenia, co wskazuje, że spędza dużą część swojego cyklu mechanicznego związanego z actin9,10,11,12,13,14. Podobnie jak inne miozyny, łańcuch ciężki zawiera N-końcową domenę motoryczną, która obejmuje zarówno miejsce wiązania aktyny, jak i hydrolizy ATP, po którym następuje obszar szyi, który służy jako ramię dźwigniowe, z sześcioma motywami IQ, które wiążą się z niezbędnymi łańcuchami lekkimi (ELC) i kalmoduliną (CaM)15. Obszar ogona zawiera α-spiralne zwinięte cewki, które dimeryzują cząsteczkę, a następnie kulisty obszar ogona do wiązania ładunku. Jego kinetyka odzwierciedla jego udział w transporcie melanosomów w melanocytach i retikulum endoplazmatycznego w neuronach Purkinjego16,17. M5a jest uważany za prototypowy silnik do transportu ładunków18.
Klasa 2 miozyny, czyli konwencjonalne miozyny, obejmują miozyny, które napędzają skurcze mięśni szkieletowych, sercowych i gładkich, oprócz izoform niemięśniowych miozyny 2 (NM2), NM2a, 2b i 2c<klasa sup="xref">19. Izoformy NM2 znajdują się w cytoplazmie wszystkich komórek i odgrywają wspólne role w cytokinezie, adhezji, morfogenezie tkanek i migracji komórek19,20,21,22. W tym artykule omówiono konwencjonalne protokoły miozyny w kontekście niemięśniowej miozyny 2b (NM2b)23. NM2b, w porównaniu do M5a, ma niski współczynnik obciążenia i jest enzymatycznie wolniejszy zV max 0,2 s-1 23 w porównaniu do M5a Vmax ≈18 s-1 24. Warto zauważyć, że obcięte konstrukty NM2b z dwiema głowicami nie poruszają się łatwo procesowo na aktynie; Raczej każde spotkanie z aktyną skutkuje udarem mocy, po którym następuje dysocjacja cząsteczki25.
NM2b zawiera dwa ciężkie łańcuchy miozyny, każdy z jedną domeną głowy kulistej, jednym ramieniem dźwigniowym (z jednym ELC i jednym regulatorowym łańcuchem lekkim (RLC)) oraz α-spiralną domeną pręta/ogona z cewką zwijaną, o długości około 1100 aminokwasów, która dimeryzuje te dwa ciężkie łańcuchy. Aktywność enzymatyczna i stan strukturalny NM2b są regulowane przez fosforylację klasy RLC23. Nieufosforylowany NM2b, w obecności ATP i fizjologicznych sił jonowych (około 150 mM soli), przyjmuje zwartą konformację, w której dwie głowy uczestniczą w asymetrycznym oddziaływaniu, a ogon składa się z powrotem nad głowami w dwóch miejscach23. W tym stanie miozyna nie oddziałuje silnie z aktyną i ma bardzo niską aktywność enzymatyczną. Po fosforylacji RLC przez zależną od kalmoduliny kinazę łańcucha lekkiego miozyny (MLCK) lub kinazę białkową związaną z Rho, cząsteczka rozciąga się i łączy z innymi miozynami przez obszar ogona, tworząc dwubiegunowe włókna około 30 cząsteczek miozyny23. Wspomniana fosforylacja RLC prowadzi również do około czterokrotnego zwiększenia aktywności ATPazy NM2b aktywowanej aktyną26,27,28. Ten bipolarny układ włókien, wyposażony w wiele silników miozyny na każdym końcu, jest zoptymalizowany pod kątem ról w skurczu i utrzymaniu napięcia, gdzie filamenty aktynowe o przeciwstawnych polaryzacjach mogą być przesuwane względem siebie23,29. W związku z tym wykazano, że NM2b działa jako zespół silników podczas interakcji z aktyną. Duża liczba silników w tym żarniku pozwala włóknom NM2b na procesowe poruszanie się po filamentach aktynowych, dzięki czemu procesywność filamentu in vitro jest możliwa do scharakteryzowania29.
Chociaż poczyniono postępy w zrozumieniu roli miozyn w komórce, istnieje potrzeba zrozumienia ich indywidualnych cech na poziomie białka. Aby zrozumieć interakcje aktomiozyny na prostym poziomie interakcji białko-białko, a nie wewnątrz komórki, możemy wyrazić i oczyścić rekombinowane miozyny do wykorzystania w badaniach in vitro. Wyniki takich badań informują następnie mechanobiologów o właściwościach biofizycznych określonych miozyn, które ostatecznie napędzają złożone procesy komórkowe12,13,14,25,29. Zazwyczaj osiąga się to poprzez dodanie znacznika powinowactwa do pełnowymiarowego lub skróconego konstruktu miozyny i oczyszczenie za pomocą chromatografii powinowactwa29,30,31. Dodatkowo, konstrukt może być zmodyfikowany tak, aby zawierał genetycznie kodowalny fluorofor lub znacznik do znakowania białek za pomocą syntetycznego fluoroforu. Dodając taką etykietę fluorescencyjną, można przeprowadzić badania obrazowania pojedynczych cząsteczek w celu obserwacji mechaniki i kinetyki miozyny.
Po oczyszczeniu, miozynę można scharakteryzować na kilka sposobów. Aktywność ATPazy można mierzyć metodami kolorymetrycznymi, zapewniając wgląd w ogólne zużycie energii i powinowactwo do aktyny silnika w różnych warunkach32. Aby poznać mechanochemię jego ruchliwości, wymagane są dalsze eksperymenty. W artykule opisano dwie metody oparte na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro, które można wykorzystać do scharakteryzowania właściwości ruchliwych oczyszczonego białka miozyny.
Pierwszą z tych metod jest test włókien aktynowych ślizgowych, który może być wykorzystany do ilościowego badania właściwości zespołów silników miozynowych, jak również do jakościowego badania jakości partii oczyszczonego białka33. Chociaż w tym artykule omówiono zastosowanie mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do tego testu, eksperymenty te można skutecznie przeprowadzić przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową, powszechnie spotykaną w wielu laboratoriach34. W tym teście warstwa nasycająca silniki miozyny jest przymocowana do szkiełka nakrywkowego. Można to osiągnąć m.in. za pomocą nitrocelulozy, przeciwciał, membran, powierzchni derywatyzowanych2-SiO (takich jak trimetylochlorosilan)29,33,35,36,37,38. Znakowane fluorescencyjnie włókna aktyny są przepuszczane przez komorę szkiełka nakrywkowego, na której aktyna wiąże się z miozyną przyczepioną do powierzchni. Po dodaniu ATP (i kinaz w badaniu NM2), komora jest obrazowana w celu obserwacji translokacji włókien aktyny przez miozyny związane z powierzchnią. Oprogramowanie śledzące może być używane do korelacji prędkości i długości każdego ślizgającego się filamentu aktynowego. Oprogramowanie analityczne może również zapewnić pomiar liczby zarówno ruchomych, jak i stacjonarnych filamentów aktyny, co może być przydatne do określenia jakości danego preparatu miozyny. Proporcja zatrzymanych włókien może być również celowo modulowana przez powierzchniowe wiązanie aktyny z innymi białkami i mierzona w celu określenia zależności obciążenia miozyny39. Ponieważ każde włókno aktyny może być napędzane przez dużą liczbę dostępnych silników, test ten jest bardzo powtarzalny, a końcowa zmierzona prędkość jest odporna na zakłócenia, takie jak zmiany początkowego stężenia miozyny lub obecność dodatkowych czynników w roztworze. Oznacza to, że można go łatwo zmodyfikować w celu zbadania aktywności miozyny w różnych warunkach, takich jak zmieniona fosforylacja, temperatura, siła jonowa, lepkość roztworu i skutki obciążenia indukowanego przez więzy powierzchniowe. Chociaż czynniki takie jak silnie wiążące "martwe głowy" miozyny niezdolne do hydrolizy ATP mogą powodować zatrzymanie włókien aktynowych, istnieje wiele metod łagodzenia takich problemów i pozwalania na dokładne pomiary. Właściwości kinetyczne miozyny różnią się znacznie w zależności od klas i, w zależności od konkretnej użytej miozyny, prędkość ślizgania się włókien aktynowych w tym teście może wahać się od poniżej 20 nm / s (miozyna 9) < klasa sup = "xref">40,41 i do 60 000 nm / s (miozyna Characean 11)42.
Drugi test odwraca geometrię testu z włókien aktynowych ślizgowych12. W tym przypadku filamenty aktynowe są przyłączane do powierzchni szkiełka nakrywkowego i wizuowany jest ruch pojedynczych cząsteczek M5a lub pojedynczych bipolarnych włókien NM2b. Test ten można wykorzystać do ilościowego określenia długości i prędkości pojedynczych cząsteczek lub włókien miozyny na aktynie. Szkiełko nakrywkowe jest pokryte związkiem chemicznym, który blokuje niespecyficzne wiązanie i jednocześnie funkcjonalizuje powierzchnię, takim jak glikol biotynowo-polietylenowy (biotyna-PEG). Dodanie zmodyfikowanych pochodnych awidyny następnie zagruntowuje powierzchnię, a biotynylowana aktyna jest przepuszczana przez komorę, w wyniku czego warstwa F-aktyny jest stabilnie związana z dnem komory. Wreszcie, aktywowana i znakowana fluorescencyjnie miozyna (zwykle 1-100 nM) przepływa przez komorę, która jest następnie obrazowana w celu obserwacji ruchu miozyny nad nieruchomymi włóknami aktyny.
Te modalności reprezentują szybkie i powtarzalne metody, które mogą być wykorzystane do zbadania dynamiki zarówno niemięśniowych, jak i mięśniowych miozyn. Niniejszy raport przedstawia procedury oczyszczania i charakterystyki zarówno M5a, jak i NM2b, reprezentujących odpowiednio niekonwencjonalne i konwencjonalne miozyny. Następnie omówiono niektóre adaptacje specyficzne dla miozyny, które można wykonać, aby osiągnąć pomyślne uchwycenie ruchu w dwóch typach testu.
Ekspresja i biologia molekularna 
cDNA dla interesującej nas miozyny musi zostać sklonowane na zmodyfikowany wektor pFastBac1, który koduje albo C-końcowy znacznik FLAG (DYKDDDDK), jeśli wyraża M5a-HMM, lub N-końcowy znacznik FLAG, jeśli wyraża pełnowymiarową cząsteczkę NM2b23,43,44,45,46. C-końcowe znaczniki FLAG na NM2b powodują osłabienie powinowactwa białka do kolumny powinowactwa do FLAG. W przeciwieństwie do tego, N-końcowe białko oznaczone flagą zwykle dobrze wiąże się z kolumną powinowactwa FLAG23. N-końcowe białko zachowuje aktywność enzymatyczną, aktywność mechaniczną i regulację zależną od fosforylacji23.
W tym artykule użyto obciętego konstruktu podobnego do ciężkiej meromyozyny M5a z GFP między znacznikiem FLAG a C-końcem ciężkiego łańcucha miozyny. Należy zauważyć, że w przeciwieństwie do NM2b, M5a-HMM może być z powodzeniem oznaczony i oczyszczony za pomocą N- lub C-końcowych znaczników FLAG i w obu przypadkach wynikowa konstrukcja będzie aktywna. Łańcuch ciężki M5a został obcięty na aminokwasie 1090 i zawiera łącznik trzech aminokwasów (GCG) między GFP a regionem cewki zwijanej klasy M5a47. Nie dodano żadnego dodatkowego konsolidatora między GFP a znacznikiem FLAG. M5a-HMM ulegał jednoczesnej ekspresji z kalmoduliną. Pełnowymiarowy ludzki konstrukt NM2b uległ jednoczesnej ekspresji z ELC i RLC. N-końce RLC zostały połączone z GFP za pośrednictwem łącznika pięciu aminokwasów (SGLRS). Bezpośrednio do znacznika FLAG przymocowany był HaloTag. Pomiędzy HaloTag a N-końcem łańcucha ciężkiego miozyny znajdował się łącznik zbudowany z dwóch aminokwasów (AS).
Oba preparaty miozyny zostały oczyszczone z jednego litra hodowli komórek Sf9 zakażonych bakulowirusem o gęstości około 2 x 106 komórek/ml. Objętości bakulowirusa dla każdej podjednostki zależały od wielości infekcji wirusa, określonej w instrukcjach producenta. W przypadku M5a komórki były jednocześnie zakażone dwoma różnymi bakulowirusami - jednym dla kalmoduliny, a drugim dla łańcucha ciężkiego M5a. W przypadku NM2b komórki zostały zakażone trzema różnymi wirusami - jednym dla ELC, jednym dla RLC i jednym dla łańcucha ciężkiego NM2b. W przypadku laboratoriów pracujących z różnymi miozynami (lub innymi wielozłożonymi białkami) podejście to jest skuteczne, ponieważ pozwala na wiele kombinacji łańcuchów ciężkich i lekkich, a powszechnie stosowane łańcuchy lekkie, takie jak kalmodulina, mogą być współtransfekowane z wieloma różnymi łańcuchami ciężkimi miozyny. Wszystkie prace na celi zostały wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednią sterylną techniką, aby uniknąć kontaminacji.
Dla ekspresji zarówno M5a, jak i NM2b, komórki Sf9 produkujące rekombinowane miozyny zostały zebrane 2-3 dni po zakażeniu, poprzez wirowanie, i przechowywane w temperaturze -80 °C. Granulki komórek uzyskano przez odwirowanie współzakażonych komórek Sf9 w temperaturze 4 °C przez 30 minut przy 2,800 x g. Proces oczyszczania białka jest szczegółowo opisany poniżej.

<table><tbody><tr><td>1 mL Strzykawka</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td><silny>2</silny> M CaCl2 Solution</td><td>VWR</td><td>10128-558</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2 Solution</td><td>Igła miernika VWR</td><td>10128-298</td><td></td></tr><tr><td>27</td><td>Becton Dickinson</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>5 M roztwór NaCl</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3270</td><td></td></tr><tr><td><silny>kwas octowy</mocny></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>984303</td><td></td></tr><tr><td>Amyl Acetate</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdfATP</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowana G-aktyna</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Millipore Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>bPEG-silan</td><td>Laysan Bio, Inc</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Koncentrat odczynnika</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Calmodulin</td><td></td><td>PMID: 2985564</td><td></td></tr><tr><td>Catlazae</td><td>Millipore Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Cell Line (Sf9) w SF-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11496015</td><td>http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf</td></tr><tr><td>Circular Filter Lab - Test ślizgowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001125</td><td></td></tr><tr><td>Circular Filter Paper - Odwrócony test</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001090</td><td></td></tr><tr><td>cOmpete, wolne od EDTA tabletki z inhibitorem proteazy</td><td>Millipore Sigma</td><td>5056489001</td><td>Należy go przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Tabletki mogą być używane bezpośrednio lub mogą być rozpuszczone w postaci 25-krotnego roztworu podstawowego, rozpuszczając 1 tabletkę w 2 ml wody destylowanej. Otrzymany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez 1-2 tygodnie lub co najmniej 12 tygodni w temperaturze -20 stopni C.</td></tr><tr><td>Concentrating Tubes (100 000 MWCO)</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>UFC910024</td><td>MWCO probówki niekoniecznie jest "uniwersalny", o ile MWCO jest mniejsze niż całkowita masa cząsteczkowa oczyszczanego białka. NM2b w tym przypadku został skoncentrowany za pomocą lampy o mocy 100 000 MWCO, a M5a został skoncentrowany za pomocą lampy o mocy 30 000 MWCO.</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip Rack</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z688568-1EA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Coverslips: Test włókien ślizgowych</mocny></td><td>VWR International</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe: Test odwróconej ruchliwości </td> Rurka do dializy <td>Azer Scientific</td><td>ES0107052</td><td></td></tr><tr><td> (3500 Dalton MCWO)</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-670-5A Średnica</td><td>rurki do dializy może się różnić, ale MWCO powinno być takie samo. Zastosowany w tym artykule NM2b był dializowany w rurze dializacyjnej o średnicy 18 mm. Probówki można przechowywać w 20% roztworze alkoholu w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Dwustronna taśma</td><td>Office Depot</td><td>909955</td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK Peptyd</td><td>GenScript</td><td>RP10586</td><td>Można go rozpuścić w buforze zawierającym 0,1 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3 i 10 mM MOPS (pH 7,2) do końcowego stężenia 50 mg/ml. Można to zapisać w temperaturze -20 &deg; C jak 300 &mikro; Porcje L.&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna elucyjna</td><td>Bio-Rad</td><td>761-1550</td><td>Można je ponownie wykorzystać. Aby wyczyścić, przepłucz kolumnę 2-3 objętościami PBS i wodą destylowaną. Schłodzić kolumnę w temperaturze 4&deg; C przed użyciem.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>G-actin</td><td></td><td>PMID: 4254541</td><td>zapas G-aktyny może być przechowywany w temperaturze 200 μ; M w cieczy N2.</td></tr><tr><td>Glukoze</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Millipore Sigma</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy glicyny, 100 mM, pH 2-2,5, 1 L</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-295018</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag</td><td>Promega</td><td>G100A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fischer Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z dużym otworem</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy leupeptyny</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78435</td><td></td></tr><tr><td>Mark12 Niebarwiona drabina standardowa</mocna></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC5677</td><td></td></tr><tr><td><mocna>metanolowa</mocna></td><td>Millipore Sigma</td><td>MX0482</td><td></td></tr><tr><td><mocna>Metyloceluloza</mocna></td><td>Millipore Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td><mocna>Szkiełka mikroskopowe</mocna></td><td>Fischer Scientific</td><td>12-553-10</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP308-100</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-silane</td><td>Laysan Bio, Inc</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>miozynowa kinaza łańcucha lekkiego</td><td></td><td>PMID: MLCK 23148220</td><td>znakowany FLAGA może być oczyszczany w taki sam sposób, w jaki myozyna znakowana FLAGA została oczyszczona w niniejszym dokumencie.&nbsp;</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Millipore Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31050</td><td></td></tr><tr><td>Nitroceluloza</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10800</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 do 12% Bis-Tris Mini żel białkowy, 15-dołkowy</silny></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323PK2</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore Sigma</td><td>78830</td><td>PMSF może być wytwarzany jako 0,1 M roztwór podstawowy w izopropanolu i przechowywany w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Dodanie izopropanolu powoduje wytrącanie się kryształów, które można rozpuścić przez mieszanie w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed użyciem PMSF można dodawać kroplami do szybko mieszającego roztworu do końcowego stężenia 0,1 mM.</td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Office Depot</td><td>397492</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R415</td><td>Stock można rozcieńczyć w 100% metanolu do końcowego stężenia 200 &mu;M.</td></tr><tr><td>Sf9 Media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12658-027</td><td>Należy go przechowywać w temperaturze 4& stopni C. Jego okres trwałości wynosi 18 miesięcy od daty produkcji.</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish - Gliding Assay</td><td>Corning</td><td>353025</td><td>Każda szalka do hodowli tkankowej może pomieścić około dziewięciu szkiełek nakrywkowych.</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish - Inverted Assay</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Każda szalka do hodowli tkankowej może pomieścić około czterech szkiełek nakrywkowych.</td></tr><tr><td><mocny> Gładki bok 200 & mikro; L Końcówki do pipet</mocny></td><td>Thomas Scientific</td><td>1158U38</td><td></td></tr><tr><td><mocny>SPRZĘT</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><mocny>Wirówka</mocny></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75006590</td><td></td></tr><tr><td><mocny>mikroskop</silny></td><td>Nikon</td><td>Model: Eclipse Ti z systemem H-TIRF z obiektywem TIRF 100x (brak danych 1,49)</td><td></td></tr><tr><td><silna>Kamera mikroskopowa< / silna></td><td>Andor</td><td>Model: Kamera iXon DU888 EMCCD (format czujnika 1024 x 1024)</td><td></td></tr> <tr><td>< silna>Mikroskopowa skrzynka kontroli środowiska< / mocna></td><td>Tokai HIT</td><td>Niestandardowy termobox</td><td></td></tr><tr><td><silny>Jednostka laserowa mikroskopu< / mocna></td><td></td><td>Czteroczęściowa jednostka laserowa Nikon LU-n4 z laserami półprzewodnikowymi do 405 nm, 488 nm, 561 nm i 640 nm</td><td></td></tr><tr><td>Mid Wirówka stołowa</mocna></td><td>ThermoFisher</td><td>Model naukowy: CR3i</td><td></td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-Xp Ultrawirówka stołowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Cleaner</td><td>Diener electronic GmbH + Co. KG</td><td>System Typ: Sonda Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (3,2 mm)</td><td>Qsonica</td><td>4418</td><td></td></tr><tr><td>Standard Inkubator</td><td>Binder</td><td>Model: 56</td><td></td></tr><tr><td>Waverly Tube Mixer</td><td>Waverly</td><td>TR6E</td><td></td></tr><tr><td>SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ FIJI</td><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads<</td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>FAST (wersja 1.01)</td><td>http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements</td><td>FAST jest dostępny dla systemów Mac OSX i Linux.</td><td></td></tr><tr><td>Image Stabilizer Plugin</td><td>https://imagej.net/Image_Stabilizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ TrackMate</td><td>https://imagej.net/TrackMate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Software</td><td>NIS Elements (pakiet AR)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> File:TrackMate-manual.pdf <td>https://github.com/turalaksel/FASTrack</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Białka miozyny wiążą się i oddziałują z nitkowatą aktyną (F-aktyną) i znajdują się w organizmach w całym drzewie filogenetycznym. Ich struktura i właściwości enzymatyczne są dostosowane do konkretnej funkcji, jaką pełnią w komórkach. Miozyna 5a procesowo chodzi na F-aktynie, aby transportować melanosomy i pęcherzyki w komórkach. I odwrotnie, miozyna 2b bez mięśni działa jako bipolarne włókno zawierające około 30 cząsteczek. Przesuwa F-aktynę o przeciwnej polaryzacji w kierunku środka włókna, gdzie cząsteczki miozyny działają asynchronicznie, aby związać aktynę, nadać uderzenie mocy i dysocjować przed powtórzeniem cyklu. Miozyna 2b niemięśniowa, wraz z innymi izoformami miozyny 2 bez mięśni, pełni role obejmujące adhezję komórek, cytokinezę i utrzymanie napięcia. Mechanochemię miozyn można badać, wykonując testy ruchliwości in vitro przy użyciu oczyszczonych białek. W teście ślizgania się włókien aktynowych miozyny są wiązane z powierzchnią szkiełka nakrywkowego mikroskopu i przemieszczają fluorescencyjnie znakowaną F-aktynę, którą można śledzić. Jednak w teście ruchliwości pojedynczej cząsteczki/zespołu F-aktyna jest związana ze szkiełkiem nakrywkowym i obserwuje się ruch znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek miozyny na F-aktynie. W niniejszym raporcie przedstawiono oczyszczanie rekombinowanej miozyny 5a z komórek Sf9 za pomocą chromatografii powinowactwa. Następnie przedstawiamy dwa testy oparte na mikroskopii fluorescencyjnej: test ślizgowych włókien aktynowych i test odwróconej ruchliwości. Z tych testów można wyodrębnić takie parametry, jak prędkości translokacji aktyny oraz długości i prędkości przebiegu pojedynczej cząsteczki, za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Techniki te mogą być również stosowane do badania ruchu pojedynczych włókien izoform miozyny 2 bez mięśni, omówionych w niniejszym dokumencie w kontekście miozyny niemięśniowej 2b. Ten przepływ pracy reprezentuje protokół i zestaw narzędzi ilościowych, które można wykorzystać do badania dynamiki pojedynczej cząsteczki i zespołu miozyn niemięśniowych.

Oczyszczanie miozyny można ocenić, wykonując redukującą elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), jak pokazano na Rysunku 2. Choć rysunek ten przedstawia końcową, poddaną dializie miozynę, analizę SDS-PAGE można przeprowadzić na alikwotach z różnych etapów procedury oczyszczania, aby zidentyfikować produkty utracone do nadsączu. HMM miozyny 5a tworzy prążek w zakresie 120-130 kDa, a pełnowymiarowa niemięśniowa miozyna 2b tworzy prążek w zakresie 20...

Przedstawiono tutaj procedurę ekspresji i oczyszczania miozyny 5a, po której następuje dyskusja na temat jej charakterystyki, przy użyciu testów opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro zarówno zespołowych, jak i pojedynczych, oraz jak te metody mogą być modyfikowane do charakterystyki niemięśniowej miozyny 2b.

Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Protokół ten można wykorzystać do scharakteryzowania dynamiki miozyny niemięśniowej na poziomie białka, co może informować o właściwościach ruchliwych, które przyczyniają się do ich ról w komórkach. Jest to szybka, powtarzalna i wysoce kontrolowana metoda, którą można wykorzystać do badania wpływu różnych warunków regulacyjnych na ruchliwość miozyny, informując o ich zachowaniach komórkowych. Techniki te można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób powodujące chorobę mutacje w miozynach niemięśniowych wpływają na ich zachowanie na poziomie pojedynczej cząsteczki i zespołu.Ogólne podejście zastosowane w tej metodologii można zastosować do różnych innych układów cytoszkieletu, takich jak charakterystyka oczyszczonych kinezyn i dynein za pomocą mikrotubul. Wszechstronność tego protokołu może rodzić pytania o to, które fluorofory i warunki chemiczne są najbardziej odpowiednie, ale metodę można zoptymalizować stosunkowo szybko. Zrozumienie, jak ustawić i pokryć komory przepływowe, stanowi solidną podstawę, na której można dostosować się do różnych warunków tych eksperymentów.Na początek przygotuj jednoprocentowy roztwór nitrocelulozy w octanie amylu i umieść okrągłą bibułę filtracyjną o średnicy 125 milimetrów na dnie płytki do hodowli tkankowej. Załaduj osiem kwadratowych szkiełek nakrywkowych na stojak i dokładnie umyj je około dwoma do pięciu mililitrami 200-procentowego etanolu, a następnie dwoma do pięciu mililitrami wody destylowanej. Następnie całkowicie wbij szkiełka nakrywkowe za pomocą przewodu z filtrowanym powietrzem lub przewodu azotowego.Powoli odpipetować 10 mikrolitrów jednoprocentowego roztworu nitrocelulozy wzdłuż jednej krawędzi szkiełka nakrywkowego. Rozsmaruj go na pozostałej części szkiełka nakrywkowego za pomocą boku końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów jednym płynnym ruchem. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na naczyniu do hodowli tkankowych nitrocelulozową stroną do góry.Powtórz to dla pozostałych szkiełek nakrywkowych i pozwól im wyschnąć. Przetrzyj szkiełko mikroskopowe papierem do soczewek optycznych, aby usunąć duże zanieczyszczenia. Wytnij dwa kawałki taśmy dwustronnej o długości około dwóch centymetrów i umieść jeden kawałek wzdłuż środka dłuższej krawędzi szkiełka mikroskopowego.Umieść drugi kawałek taśmy około dwa milimetry poniżej pierwszego kawałka taśmy, tak aby oba były równoległe, tworząc komorę przepływową, która może pomieścić około 10 mikrolitrów roztworu. Ostrożnie przyklej jeden z nasuwek osłony nitrocelulozy na taśmę tak, aby strona pokryta nitrocelulozą stykała się bezpośrednio z taśmą. Za pomocą końcówki do pipet delikatnie dociśnij złącze taśmy ślizgowej, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe jest prawidłowo przylegające do szkiełka.Następnie odetnij nadmiar taśmy zwisającej z krawędzi zjeżdżalni za pomocą żyletki. Przygotować roztwory miozyny 5a i przechowywać je na lodzie. Przelej 10 mikrolitrów Myosin 5a przez komorę przepływu szkiełka i odczekaj minutę.Następnie przepływać w 10 mikrolitrach po jednym miligramie na mililitr BSA w buforze ruchliwości z naziemną telewizją cyfrową. Powtórz to dwa razy i odczekaj minutę po trzecim praniu. Użyj rogu bibułki lub bibuły filtracyjnej, aby przesiąknąć roztwór przez kanał, delikatnie umieszczając róg bibuły przy wyjściu z komory przepływowej.Następnie przemyć 10 mikrolitrami buforu ruchliwości z DTT. Odpipetować roztwór aktyny za pomocą jednomililitrowej strzykawki i igły o rozmiarze 27, aby ściąć włókna aktyny przed wprowadzeniem tego roztworu do komory. Dodaj czarną aktynę do komory w obecności jednego milimolowego ATP w 50 milimolowym MB z jednym milimolowym DTT.Następnie przelej 50 mikrolitrów buforu ruchliwości z DTT i jednym milimolowym ATP, aby zubożyć komorę wolnych włókien aktynowych. Przemyć 10 mikrolitrami buforu ruchliwości za pomocą naziemnej telewizji cyfrowej trzy razy, aby opróżnić komorę z dowolnego ATP. Przepłynąć w 10 mikrolitrach 20 nanomolowego roztworu aktyny RH zawierającego bufor ruchliwości z naziemną rejestracją informacji o napowietrznym numerze (DTT) i odczekać jedną minutę, aby umożliwić rygorystyczne wiązanie włókien aktynowych z miozyną 5a przyczepioną do powierzchni szkiełka nakrywkowego.Przemyć 10 mikrolitrami 50-milimolowego buforu ruchliwości za pomocą DTT dwukrotnie, aby usunąć niezwiązane włókna aktyny RH. Przepłynąć w 30 mikrolitrach buforu końcowego. Rejestruj obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu długości fali wzbudzenia 561 nanometrów, aby uwidocznić aktynę RH.Przygotuj roztwory do testu odwróconej ruchliwości miozyny 5a i trzymaj je na lodzie. Umyj je komorą 10 mikrolitrami buforu ruchliwości z naziemną terapią cyfrowo-cyfrową. Przepływ w 10 mikrolitrach po jednym miligramie na mililitr BSA w buforze ruchliwości z naziemną telewizją cyfrową.Powtórz to dwa razy, czekając minutę po trzecim praniu. Użyj bibuły lub bibuły filtracyjnej, aby przesączyć roztwór przez kanał, delikatnie umieszczając róg bibuły przy wyjściu z komory przepływowej. Następnie trzykrotnie przemyć komorę 10 mikrolitrami buforu ruchliwości z naziemną telewizją cyfrową.Przepłynąć w 10 mikrolitrach roztworu NeutrAwidin w buforze ruchliwości z naziemną telewizją cyfrową i odczekać minutę. Następnie trzykrotnie przemyć 10 mikrolitrami tego roztworu. Przepłynąć w 10 mikrolitrach buforu plastycznego zawierającego aktynę BRH z naziemną telewizją cyfrową za pomocą końcówki pipety o dużym otworze.I poczekaj minutę. Następnie przemyć 10 mikrolitrami buforu ruchliwości z trzykrotnym naziemną telewizją cyfrową. Przepływ w 30 mikrolitrach końcowego buforu z 10 nanomolowymi miozynami 5a.I natychmiast załadować do mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Rozpocznij nagrywanie po znalezieniu optymalnej ostrości do obrazowania TIRF. Oczyszczanie niemięśniowej miozyny 2b, niezbędnych łańcuchów lekkich i regulatorowych łańcuchów lekkich, a także miozyny 5a i kalmoduliny oceniano za pomocą SDS-PAGE.Test ślizgowych włókien aktynowych wykazuje cechy idealnego i możliwego do śledzenia filmu z płynnymi ruchami znakowanych filamentów aktynowych. Płukanie czarną aktyną zapewniło, że martwe główki miozyny zostały usunięte z pola pomiarowego, co dodatkowo przyczyniło się do ogólnego płynnego ruchu włókien aktynowych. Obrazy wyjściowe śledzenia filamentu z programu szybkiej ścieżki uzyskano dla miozyny 2b i miozyny 5a niezwiązanych z mięśniami.Reprezentatywny histogram pokazuje, że prędkość poślizgu aktomyozyny 2b wynosi 77 nanometrów na sekundę. A ta z Actomyosin 5a wynosi 515 nanometrów na sekundę. W przypadku braku metylocelulozy włókna aktyny nie pozostają tak ściśle związane z powierzchnią pokrytą miozyną, powodując jej opadanie blisko powierzchni szkiełek nakrywkowych pokrytych miozyną 2b bez mięśni.Ruch miozyny obserwowano na powierzchniowo uwiązanych fluorescencyjnych włóknach aktyny przy użyciu testu odwróconej ruchliwości. Ważne jest, aby ścinać nieznakowaną aktynę przed wprowadzeniem jej do komórki przepływowej w celu przemytia czarnej aktyny, co pozwoli na płynną translokację aktyny. Dodatkowe eksperymenty mogą zbadać, w jaki sposób mutacje miozyny, białka indukujące obciążenie, siła jonowa i białka regulatorowe wpływają na ruchliwość miozyny.Różne warunki komórkowe mogą zostać odtworzone do przyszłych badań. Metody te pozwalają na biochemiczne i biofizyczne badania nad tym, jak różne izoformy miozyny różnią się pod względem właściwości ruchomych i mechanicznych na poziomie pojedynczej cząsteczki i zespołu.

myosin-specific-adaptations-vitro-fluorescence-microscopy-based

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie przeprowadzamy test ruchliwości in vitro, aby przeanalizować interakcje aktyna-miozyna. Ślizgający się ruch włókien aktynowych na unieruchomionych cząsteczkach miozyny jest wizualizowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test ślizgowych włókien aktynowych: test ruchliwości in vitro w celu zbadania translokacji włókien aktynowych na unieruchomione miozyny

Test odwróconej ruchliwości: technika in vitro do wizualizacji ruchu miozyny na unieruchomionych włóknach aktyny

Tutaj prezentowany jest protokół identyfikacji ładunków Kinesin-1. Bezsilnikowy mutant ciężkiego łańcucha Kinesin-1 (KIF5B) agreguje się w cytoplazmie i indukuje agregację jej ładunków. Oba agregaty są wykrywane pod mikroskopią fluorescencyjną. Podobną strategię można zastosować do identyfikacji ładunków innych białek motorycznych.

Identyfikacja ładunków kinezyny-1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ostatnie odkrycia sugerują, że bakteryjne silniki wiciowe wyczuwają różne sygnały środowiskowe i w odpowiedzi na nie przebudowują się. Oczekuje się, że omówione tutaj testy perełkowe pomogą wyjaśnić rolę przebudowy w adaptacji komórek do stresorów środowiskowych.

Biofizyczna charakterystyka funkcji motorycznych wici

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Dwukierunkowa mitoza kinezyna-5 Cin8 gromadzi się w klastrach, które rozdzielają się i łączą podczas swojej ruchliwości. Akumulacja w gromadach zmienia również prędkość i kierunkowość Cin8. W tym miejscu opisano protokół oznaczania ruchliwości z oczyszczonym Cin8-GFP oraz analizy właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8.

Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae

Przedstawiono i omówiono tworzenie wiązek aktomiozyny in vitro oraz pomiar siły generowania zespołu miozyny za pomocą pęsety optycznej.

Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Ten protokół szczegółowo opisuje procedury rekombinacyjnego wytwarzania ludzkiego holoenzymu miozyny-7a za pomocą systemu MultiBac Baculovirus oraz badania jego ruchliwości za pomocą dostosowanego testu ślizgowego in vitro.

Oczyszczanie oparte na systemie MultiBac i biofizyczna charakterystyka ludzkiej miozyny-7a

Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.

Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych

Poznaj metody mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki miozyn niemięśniowych na poziomie pojedynczych cząsteczek i zespołów. Technika ta pozwala analizować wpływ mutacji na ruchliwość białek.

Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro

Przeglądaj więcej filmów