Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro
4 lutego 2021
Przedstawiono tutaj procedurę ekspresji i oczyszczania miozyny 5a, po której następuje dyskusja na temat jej charakterystyki, przy użyciu testów opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro zarówno zespołowych, jak i pojedynczych, oraz jak te metody mogą być modyfikowane do charakterystyki niemięśniowej miozyny 2b.
Protokół ten można wykorzystać do scharakteryzowania dynamiki miozyny niemięśniowej na poziomie białka, co może informować o właściwościach ruchliwych, które przyczyniają się do ich ról w komórkach. Jest to szybka, powtarzalna i wysoce kontrolowana metoda, którą można wykorzystać do badania wpływu różnych warunków regulacyjnych na ruchliwość miozyny, informując o ich zachowaniach komórkowych. Techniki te można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób powodujące chorobę mutacje w miozynach niemięśniowych wpływają na ich zachowanie na poziomie pojedynczej cząsteczki i zespołu.
Ogólne podejście zastosowane w tej metodologii można zastosować do różnych innych układów cytoszkieletu, takich jak charakterystyka oczyszczonych kinezyn i dynein za pomocą mikrotubul. Wszechstronność tego protokołu może rodzić pytania o to, które fluorofory i warunki chemiczne są najbardziej odpowiednie, ale metodę można zoptymalizować stosunkowo szybko. Zrozumienie, jak ustawić i pokryć komory przepływowe, stanowi solidną podstawę, na której można dostosować się do różnych warunków tych eksperymentów.
Na początek przygotuj jednoprocentowy roztwór nitrocelulozy w octanie amylu i umieść okrągłą bibułę filtracyjną o średnicy 125 milimetrów na dnie płytki do hodowli tkankowej. Załaduj osiem kwadratowych szkiełek nakrywkowych na stojak i dokładnie umyj je około dwoma do pięciu mililitrami 200-procentowego etanolu, a następnie dwoma do pięciu mililitrami wody destylowanej. Następnie całkowicie wbij szkiełka nakrywkowe za pomocą przewodu z filtrowanym powietrzem lub przewodu azotowego.
Powoli odpipetować 10 mikrolitrów jednoprocentowego roztworu nitrocelulozy wzdłuż jednej krawędzi szkiełka nakrywkowego. Rozsmaruj go na pozostałej części szkiełka nakrywkowego za pomocą boku końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów jednym płynnym ruchem. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na naczyniu do hodowli tkankowych nitrocelulozową stroną do góry.
Powtórz to dla pozostałych szkiełek nakrywkowych i pozwól im wyschnąć. Przetrzyj szkiełko mikroskopowe papierem do soczewek optycznych, aby usunąć duże zanieczyszczenia. Wytnij dwa kawałki taśmy dwustronnej o długości około dwóch centymetrów i umieść jeden kawałek wzdłuż środka dłuższej krawędzi szkiełka mikroskopowego.
Umieść drugi kawałek taśmy około dwa milimetry poniżej pierwszego kawałka taśmy, tak aby oba były równoległe, tworząc komorę przepływową, która może pomieścić około 10 mikrolitrów roztworu. Ostrożnie przyklej jeden z nasuwek osłony nitrocelulozy na taśmę tak, aby strona pokryta nitrocelulozą stykała się bezpośrednio z taśmą. Za pomocą końcówki do pipet delikatnie dociśnij złącze taśmy ślizgowej, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe jest prawidłowo przylegające do szkiełka.
Następnie odetnij nadmiar taśmy zwisającej z krawędzi zjeżdżalni za pomocą żyletki. Przygotować roztwory miozyny 5a i przechowywać je na lodzie. Przelej 10 mikrolitrów Myosin 5a przez komorę przepływu szkiełka i odczekaj minutę.
Następnie przepływać w 10 mikrolitrach po jednym miligramie na mililitr BSA w buforze ruchliwości z naziemną telewizją cyfrową. Powtórz to dwa razy i odczekaj minutę po trzecim praniu. Użyj rogu bibułki lub bibuły filtracyjnej, aby przesiąknąć roztwór przez kanał, delikatnie umieszczając róg bibuły przy wyjściu z komory przepływowej.
Następnie przemyć 10 mikrolitrami buforu ruchliwości z DTT. Odpipetować roztwór aktyny za pomocą jednomililitrowej strzykawki i igły o rozmiarze 27, aby ściąć włókna aktyny przed wprowadzeniem tego roztworu do komory. Dodaj czarną aktynę do komory w obecności jednego milimolowego ATP w 50 milimolowym MB z jednym milimolowym DTT.
Następnie przelej 50 mikrolitrów buforu ruchliwości z DTT i jednym milimolowym ATP, aby zubożyć komorę wolnych włókien aktynowych. Przemyć 10 mikrolitrami buforu ruchliwości za pomocą naziemnej telewizji cyfrowej trzy razy, aby opróżnić komorę z dowolnego ATP. Przepłynąć w 10 mikrolitrach 20 nanomolowego roztworu aktyny RH zawierającego bufor ruchliwości z naziemną rejestracją informacji o napowietrznym numerze (DTT) i odczekać jedną minutę, aby umożliwić rygorystyczne wiązanie włókien aktynowych z miozyną 5a przyczepioną do powierzchni szkiełka nakrywkowego.
Przemyć 10 mikrolitrami 50-milimolowego buforu ruchliwości za pomocą DTT dwukrotnie, aby usunąć niezwiązane włókna aktyny RH. Przepłynąć w 30 mikrolitrach buforu końcowego. Rejestruj obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu długości fali wzbudzenia 561 nanometrów, aby uwidocznić aktynę RH.
Przygotuj roztwory do testu odwróconej ruchliwości miozyny 5a i trzymaj je na lodzie. Umyj je komorą 10 mikrolitrami buforu ruchliwości z naziemną terapią cyfrowo-cyfrową. Przepływ w 10 mikrolitrach po jednym miligramie na mililitr BSA w buforze ruchliwości z naziemną telewizją cyfrową.
Powtórz to dwa razy, czekając minutę po trzecim praniu. Użyj bibuły lub bibuły filtracyjnej, aby przesączyć roztwór przez kanał, delikatnie umieszczając róg bibuły przy wyjściu z komory przepływowej. Następnie trzykrotnie przemyć komorę 10 mikrolitrami buforu ruchliwości z naziemną telewizją cyfrową.
Przepłynąć w 10 mikrolitrach roztworu NeutrAwidin w buforze ruchliwości z naziemną telewizją cyfrową i odczekać minutę. Następnie trzykrotnie przemyć 10 mikrolitrami tego roztworu. Przepłynąć w 10 mikrolitrach buforu plastycznego zawierającego aktynę BRH z naziemną telewizją cyfrową za pomocą końcówki pipety o dużym otworze.
I poczekaj minutę. Następnie przemyć 10 mikrolitrami buforu ruchliwości z trzykrotnym naziemną telewizją cyfrową. Przepływ w 30 mikrolitrach końcowego buforu z 10 nanomolowymi miozynami 5a.
I natychmiast załadować do mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Rozpocznij nagrywanie po znalezieniu optymalnej ostrości do obrazowania TIRF. Oczyszczanie niemięśniowej miozyny 2b, niezbędnych łańcuchów lekkich i regulatorowych łańcuchów lekkich, a także miozyny 5a i kalmoduliny oceniano za pomocą SDS-PAGE.
Test ślizgowych włókien aktynowych wykazuje cechy idealnego i możliwego do śledzenia filmu z płynnymi ruchami znakowanych filamentów aktynowych. Płukanie czarną aktyną zapewniło, że martwe główki miozyny zostały usunięte z pola pomiarowego, co dodatkowo przyczyniło się do ogólnego płynnego ruchu włókien aktynowych. Obrazy wyjściowe śledzenia filamentu z programu szybkiej ścieżki uzyskano dla miozyny 2b i miozyny 5a niezwiązanych z mięśniami.
Reprezentatywny histogram pokazuje, że prędkość poślizgu aktomyozyny 2b wynosi 77 nanometrów na sekundę. A ta z Actomyosin 5a wynosi 515 nanometrów na sekundę. W przypadku braku metylocelulozy włókna aktyny nie pozostają tak ściśle związane z powierzchnią pokrytą miozyną, powodując jej opadanie blisko powierzchni szkiełek nakrywkowych pokrytych miozyną 2b bez mięśni
.Ruch miozyny obserwowano na powierzchniowo uwiązanych fluorescencyjnych włóknach aktyny przy użyciu testu odwróconej ruchliwości. Ważne jest, aby ścinać nieznakowaną aktynę przed wprowadzeniem jej do komórki przepływowej w celu przemytia czarnej aktyny, co pozwoli na płynną translokację aktyny. Dodatkowe eksperymenty mogą zbadać, w jaki sposób mutacje miozyny, białka indukujące obciążenie, siła jonowa i białka regulatorowe wpływają na ruchliwość miozyny.
Różne warunki komórkowe mogą zostać odtworzone do przyszłych badań. Metody te pozwalają na biochemiczne i biofizyczne badania nad tym, jak różne izoformy miozyny różnią się pod względem właściwości ruchomych i mechanicznych na poziomie pojedynczej cząsteczki i zespołu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje ekspresję i oczyszczanie miozyny 5a, a następnie jej charakterystykę z wykorzystaniem testów z użyciem mikroskopii fluorescencyjnej in vitro. Omówiono w nim również modyfikacje służące do badania pozwalania miozyny pozwalnej 2b.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia komórki
- Neuronauka
Wstęp
- Miozyny odgrywają kluczową rolę w ruchliwości komórkowej.
- Zrozumienie dynamiki miozyn jest niezbędne do wyjaśnienia ich funkcji w komórkach.
- Miozyny niemięśniowe biorą udział w różnych procesach komórkowych.
- Techniki charakterystyki mogą ujawnić wpływ mutacji na zachowanie miozyn.
Cel badania
- Charakterystyka dynamiki miozyny niemięśniowej na poziomie białka.
- Określenie właściwości ruchowych przyczyniających się do pełnienia funkcji komórkowych.
- Zbadanie wpływu warunków regulacyjnych na ruchliwość miozyny.
Zastosowane metody
- Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek i zespołów cząsteczek.
- Charakterystyka oczyszczonych miozyn.
- Optymalizacja fluoroforów i warunków chemicznych.
- Przygotowanie i powlekanie komór przepływowych do eksperymentów.
Główne wyniki
- Protokół jest szybki, powtarzalny i ściśle kontrolowany.
- Umożliwia badanie mutacji chorobotwórczych w niemięśniowych miozynach.
- Wszechstronna metodologia możliwa do zastosowania w innych układach cytoszkieletowych.
- Szybka optymalizacja dla różnych warunków eksperymentalnych.
Wnioski
- Zrozumienie dynamiki miozyny poszerza wiedzę na temat zachowań komórkowych.
- Metoda ta stanowi solidną podstawę dla przyszłych badań.
- Podnosi ona istotne pytania dotyczące funkcji miozyny w stanie zdrowia i choroby.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia ilościową charakterystykę ruchliwości miozyny na poziomie pojedynczych cząsteczek oraz zespołów cząsteczek, dostarczając mechanistycznych wglądów w funkcję białek motorowych. Wspiera on walidację celów terapeutycznych poprzez powiązanie właściwości biochemicznych z fenotypami komórkowymi, co pozwala na ograniczanie ryzyka w strategiach terapeutycznych skierowanych przeciwko miozynie. Podejście to można dostosować do modeli istotnych w kontekście chorób, co ułatwia przedkliniczną ocenę dynamiki izoform miozyny w kontrolowanych warunkach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanochemii miozyny w celu wyjaśnienia jej funkcji w transporcie komórkowym i adhezji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty prędkości translokacji i długości przebiegu w celu oceny zaangażowania celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących tego, w jaki sposób warunki regulacyjne lub mutacje zmieniają zachowanie białek motorowych, co pomaga w ocenie pewności wyboru celu.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość analizy: Pozwala na generowanie standaryzowanych testów motywności opartych na fluorescencji, kompatybilnych z obrazowaniem wysokiej treści (high-content imaging) w celu screeningu związków.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza mierzalne parametry, takie jak prędkość translokacji aktyny i długość biegu pojedynczej cząsteczki, do analizy zależności dawka-odpowiedź.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Możliwość adaptacji do innych systemów cytoszkieletowych (np. kinezyny/dyneiny z mikrotubulami), co umożliwia przeniesienie testów na różne cele molekularne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Modelowanie chorób: Pozwala na odtworzenie warunków komórkowych w celu badania mutacji wywołujących choroby w miozynach niemięśniowych na poziomie białka.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Łączy defekty motoryki molekularnej z fenotypami komórkowymi, wspierając dopasowanie translacyjnych biomarkerów.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy walidację celu na etapie odkrywania z przedkliniczną oceną funkcjonalną poprzez ujednolicony format testu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, oferując charakterystykę biofizyczną, która pozwala zrozumieć zależności między strukturą a funkcją w białkach motorycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków i walidację funkcjonalną izoform miozyny poprzez bezpośrednią obserwację dynamiki ruchu.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów służących do oceny wpływu związków na aktywność białek motorowych w kontrolowanych warunkach buforowych.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary prędkości i procesywności, co pozwala na porównania między izoformami, mutantami lub warunkami traktowania.
- Badania translacyjne: Łączy zachowanie pojedynczych cząsteczek z efektami na poziomie całego zespołu, które są istotne dla funkcji komórkowych, takich jak cytochineza i utrzymanie napięcia.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania różnorodnych białek motorowych w różnych obszarach terapeutycznych, co ogranicza nakłady na ponowne opracowywanie testów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności w sprzężeniu mechanochemicznym miozyny.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację testów pomiędzy laboratoriami dzięki określonym protokołom przygotowania komory przepływowej i obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania mutacji zmieniających ruchliwość lub efektów regulacyjnych.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację celów miozynowych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane domeny funkcjonalne i profile ruchliwości.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie oczyszczania białek, mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizy obrazu w celu śledzenia motywności.
- Zależy od dostępu do systemów mikroskopii fluorescencyjnej TIRF lub szerokopolowej oraz możliwości wykonania komory przepływowej.
- Wymaga standaryzacji składu buforów, stężeń ATP i doboru fluoroforów we wszystkich powtórzeniach eksperymentalnych.
- Konieczne jest uwzględnienie optymalizacji dla różnych izoform miozyny pod kątem gęstości powierzchniowej, siły jonowej oraz dołączenia białek regulacyjnych.
- Ograniczone koniecznością pozyskania oczyszczonych, funkcjonalnych preparatów białkowych; aktywność może być wpływana przez znaczniki, degradację lub nieprawidłowe fałdowanie.
