Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro
February 4th, 2021
Przedstawiono tutaj procedurę ekspresji i oczyszczania miozyny 5a, po której następuje dyskusja na temat jej charakterystyki, przy użyciu testów opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro zarówno zespołowych, jak i pojedynczych, oraz jak te metody mogą być modyfikowane do charakterystyki niemięśniowej miozyny 2b.
Protokół ten można wykorzystać do scharakteryzowania dynamiki miozyny niemięśniowej na poziomie białka, co może informować o właściwościach ruchliwych, które przyczyniają się do ich ról w komórkach. Jest to szybka, powtarzalna i wysoce kontrolowana metoda, którą można wykorzystać do badania wpływu różnych warunków regulacyjnych na ruchliwość miozyny, informując o ich zachowaniach komórkowych. Techniki te można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób powodujące chorobę mutacje w miozynach niemięśniowych wpływają na ich zachowanie na poziomie pojedynczej cząsteczki i zespołu.
Ogólne podejście zastosowane w tej metodologii można zastosować do różnych innych układów cytoszkieletu, takich jak charakterystyka oczyszczonych kinezyn i dynein za pomocą mikrotubul. Wszechstronność tego protokołu może rodzić pytania o to, które fluorofory i warunki chemiczne są najbardziej odpowiednie, ale metodę można zoptymalizować stosunkowo szybko. Zrozumienie, jak ustawić i pokryć komory przepływowe, stanowi solidną podstawę, na której można dostosować się do różnych warunków tych eksperymentów.
Na początek przygotuj jednoprocentowy roztwór nitrocelulozy w octanie amylu i umieść okrągłą bibułę filtracyjną o średnicy 125 milimetrów na dnie płytki do hodowli tkankowej. Załaduj osiem kwadratowych szkiełek nakrywkowych na stojak i dokładnie umyj je około dwoma do pięciu mililitrami 200-procentowego etanolu, a następnie dwoma do pięciu mililitrami wody destylowanej. Następnie całkowicie wbij szkiełka nakrywkowe za pomocą przewodu z filtrowanym powietrzem lub przewodu azotowego.
Powoli odpipetować 10 mikrolitrów jednoprocentowego roztworu nitrocelulozy wzdłuż jednej krawędzi szkiełka nakrywkowego. Rozsmaruj go na pozostałej części szkiełka nakrywkowego za pomocą boku końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów jednym płynnym ruchem. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na naczyniu do hodowli tkankowych nitrocelulozową stroną do góry.
Powtórz to dla pozostałych szkiełek nakrywkowych i pozwól im wyschnąć. Przetrzyj szkiełko mikroskopowe papierem do soczewek optycznych, aby usunąć duże zanieczyszczenia. Wytnij dwa kawałki taśmy dwustronnej o długości około dwóch centymetrów i umieść jeden kawałek wzdłuż środka dłuższej krawędzi szkiełka mikroskopowego.
Umieść drugi kawałek taśmy około dwa milimetry poniżej pierwszego kawałka taśmy, tak aby oba były równoległe, tworząc komorę przepływową, która może pomieścić około 10 mikrolitrów roztworu. Ostrożnie przyklej jeden z nasuwek osłony nitrocelulozy na taśmę tak, aby strona pokryta nitrocelulozą stykała się bezpośrednio z taśmą. Za pomocą końcówki do pipet delikatnie dociśnij złącze taśmy ślizgowej, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe jest prawidłowo przylegające do szkiełka.
Następnie odetnij nadmiar taśmy zwisającej z krawędzi zjeżdżalni za pomocą żyletki. Przygotować roztwory miozyny 5a i przechowywać je na lodzie. Przelej 10 mikrolitrów Myosin 5a przez komorę przepływu szkiełka i odczekaj minutę.
Następnie przepływać w 10 mikrolitrach po jednym miligramie na mililitr BSA w buforze ruchliwości z naziemną telewizją cyfrową. Powtórz to dwa razy i odczekaj minutę po trzecim praniu. Użyj rogu bibułki lub bibuły filtracyjnej, aby przesiąknąć roztwór przez kanał, delikatnie umieszczając róg bibuły przy wyjściu z komory przepływowej.
Następnie przemyć 10 mikrolitrami buforu ruchliwości z DTT. Odpipetować roztwór aktyny za pomocą jednomililitrowej strzykawki i igły o rozmiarze 27, aby ściąć włókna aktyny przed wprowadzeniem tego roztworu do komory. Dodaj czarną aktynę do komory w obecności jednego milimolowego ATP w 50 milimolowym MB z jednym milimolowym DTT.
Następnie przelej 50 mikrolitrów buforu ruchliwości z DTT i jednym milimolowym ATP, aby zubożyć komorę wolnych włókien aktynowych. Przemyć 10 mikrolitrami buforu ruchliwości za pomocą naziemnej telewizji cyfrowej trzy razy, aby opróżnić komorę z dowolnego ATP. Przepłynąć w 10 mikrolitrach 20 nanomolowego roztworu aktyny RH zawierającego bufor ruchliwości z naziemną rejestracją informacji o napowietrznym numerze (DTT) i odczekać jedną minutę, aby umożliwić rygorystyczne wiązanie włókien aktynowych z miozyną 5a przyczepioną do powierzchni szkiełka nakrywkowego.
Przemyć 10 mikrolitrami 50-milimolowego buforu ruchliwości za pomocą DTT dwukrotnie, aby usunąć niezwiązane włókna aktyny RH. Przepłynąć w 30 mikrolitrach buforu końcowego. Rejestruj obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu długości fali wzbudzenia 561 nanometrów, aby uwidocznić aktynę RH.
Przygotuj roztwory do testu odwróconej ruchliwości miozyny 5a i trzymaj je na lodzie. Umyj je komorą 10 mikrolitrami buforu ruchliwości z naziemną terapią cyfrowo-cyfrową. Przepływ w 10 mikrolitrach po jednym miligramie na mililitr BSA w buforze ruchliwości z naziemną telewizją cyfrową.
Powtórz to dwa razy, czekając minutę po trzecim praniu. Użyj bibuły lub bibuły filtracyjnej, aby przesączyć roztwór przez kanał, delikatnie umieszczając róg bibuły przy wyjściu z komory przepływowej. Następnie trzykrotnie przemyć komorę 10 mikrolitrami buforu ruchliwości z naziemną telewizją cyfrową.
Przepłynąć w 10 mikrolitrach roztworu NeutrAwidin w buforze ruchliwości z naziemną telewizją cyfrową i odczekać minutę. Następnie trzykrotnie przemyć 10 mikrolitrami tego roztworu. Przepłynąć w 10 mikrolitrach buforu plastycznego zawierającego aktynę BRH z naziemną telewizją cyfrową za pomocą końcówki pipety o dużym otworze.
I poczekaj minutę. Następnie przemyć 10 mikrolitrami buforu ruchliwości z trzykrotnym naziemną telewizją cyfrową. Przepływ w 30 mikrolitrach końcowego buforu z 10 nanomolowymi miozynami 5a.
I natychmiast załadować do mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Rozpocznij nagrywanie po znalezieniu optymalnej ostrości do obrazowania TIRF. Oczyszczanie niemięśniowej miozyny 2b, niezbędnych łańcuchów lekkich i regulatorowych łańcuchów lekkich, a także miozyny 5a i kalmoduliny oceniano za pomocą SDS-PAGE.
Test ślizgowych włókien aktynowych wykazuje cechy idealnego i możliwego do śledzenia filmu z płynnymi ruchami znakowanych filamentów aktynowych. Płukanie czarną aktyną zapewniło, że martwe główki miozyny zostały usunięte z pola pomiarowego, co dodatkowo przyczyniło się do ogólnego płynnego ruchu włókien aktynowych. Obrazy wyjściowe śledzenia filamentu z programu szybkiej ścieżki uzyskano dla miozyny 2b i miozyny 5a niezwiązanych z mięśniami.
Reprezentatywny histogram pokazuje, że prędkość poślizgu aktomyozyny 2b wynosi 77 nanometrów na sekundę. A ta z Actomyosin 5a wynosi 515 nanometrów na sekundę. W przypadku braku metylocelulozy włókna aktyny nie pozostają tak ściśle związane z powierzchnią pokrytą miozyną, powodując jej opadanie blisko powierzchni szkiełek nakrywkowych pokrytych miozyną 2b bez mięśni
.Ruch miozyny obserwowano na powierzchniowo uwiązanych fluorescencyjnych włóknach aktyny przy użyciu testu odwróconej ruchliwości. Ważne jest, aby ścinać nieznakowaną aktynę przed wprowadzeniem jej do komórki przepływowej w celu przemytia czarnej aktyny, co pozwoli na płynną translokację aktyny. Dodatkowe eksperymenty mogą zbadać, w jaki sposób mutacje miozyny, białka indukujące obciążenie, siła jonowa i białka regulatorowe wpływają na ruchliwość miozyny.
Różne warunki komórkowe mogą zostać odtworzone do przyszłych badań. Metody te pozwalają na biochemiczne i biofizyczne badania nad tym, jak różne izoformy miozyny różnią się pod względem właściwości ruchomych i mechanicznych na poziomie pojedynczej cząsteczki i zespołu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje ekspresję i oczyszczanie miozyny 5a, po czym omawia jej charakterystykę z wykorzystaniem badań mikroskopowych fluorescencyjnych in vitro. Zawiera również informacje na temat modyfikacji dotyczących badania miozyny nie-szkieletowej 2b.
Kluczowe elementy badania
Dział obszaru nauki
- Biochemię
- Biologię komórkową
- Neurobiologię
Wprowadzenie
- Miozyny odgrywają kluczowe role w ruchu komórkowym.
- Zrozumienie dynamiki miozyny jest niezbędne do wyjaśnienia ich funkcji w komórkach.
- Miozyny nie-szkieletowe biorą udział w różnych procesach komórkowych.
- Techniki charakteryzacji mogą ujawnić wpływ mutacji na zachowanie miozyny.
Cel badania
- Charakteryzacja dynamiki miozyny nie-szkieletowej na poziomie białka.
- Informowanie o właściwościach motorycznych przyczyniających się do ról komórkowych.
- Badanie wpływu warunków regulacyjnych na ruchomość miozyny.
Wykorzystane metody
- Mikroskopia fluorescencyjna na poziomie zespołu i pojedynczej cząsteczki.
- Charakteryzacja oczyszczonych miozyn.
- Optymalizacja barwników fluorescencyjnych i warunków chemicznych.
- Konfiguracja i pokrywanie komór przepływowych do eksperymentów.
Główne wyniki
- Protokół jest szybki, powtarzalny i wysoce kontrolowany.
- Umożliwia badanie mutacji powodujących choroby w miozynach nie-szkieletowych.
- Wszechstronna metodologia stosowalna do innych układów cytoszkieletowych.
- Szybka optymalizacja dla różnych warunków eksperymentalnych.
Wnioski
- Zrozumienie dynamiki miozyny poszerza wiedzę na temat zachowań komórkowych.
- Ta metoda stanowi solidne podstawy dla przyszłych badań.
- Budzi ważne pytania dotyczące funkcji miozyny w zdrowiu i chorobie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative characterization of myosin motility at single molecule and ensemble levels, providing mechanistic insights into motor protein function. It supports target validation by linking biochemical properties to cellular phenotypes, informing de-risking of myosin-directed therapeutic strategies. The approach is adaptable to disease-relevant models, facilitating preclinical evaluation of myosin isoform dynamics under controlled conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myosin mechanochemistry to clarify functional roles in cellular transport and adhesion.
- Operational Value: Provides reproducible, quantitative readouts of translocation velocity and run length for target engagement assessment.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of how regulatory conditions or mutations alter motor protein behavior, aiding in target confidence scoring.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, fluorescence-based motility assays compatible with high-content imaging for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers measurable parameters such as actin translocation velocity and single molecule run length for dose-response analysis.
- Platform Reuse: Adaptable to other cytoskeletal systems (e.g., kinesin/dynein with microtubules), enabling cross-target assay portability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Allows reconstitution of cellular conditions to study disease-causing mutations in non-muscle myosins at the protein level.
- Mechanistic De-risking: Links molecular motility defects to cellular phenotypes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical functional assessment through conserved assay format.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, offering biophysical characterization that informs structure-function relationships in motor proteins.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of myosin isoforms through direct observation of motility dynamics.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for evaluating compound effects on motor protein activity under controlled buffer conditions.
- Analytics: Provides quantitative measurements of velocity and processivity that allow comparison across isoforms, mutants, or treatment conditions.
- Translational Research: Connects single molecule behavior to ensemble-level outputs relevant to cellular functions like cytokinesis and tension maintenance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying diverse motor proteins across therapeutic areas, reducing assay redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in myosin mechanochemical coupling.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and standardization across laboratories through defined flow chamber preparation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of motility-altering mutations or regulatory effects.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of myosin targets based on validated functional domains and motility profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, fluorescence microscopy, and image analysis for motility tracking.
- Depends on access to TIRF or widefield fluorescence microscopy systems and flow chamber fabrication capabilities.
- Necessitates standardization of buffer conditions, ATP concentrations, and fluorophore selection across experimental replicates.
- Involves optimization considerations for different myosin isoforms regarding surface density, ionic strength, and regulatory protein inclusion.
- Limited by the need for purified, functional protein preparations; activity may be affected by tags, degradation, or improper folding.
