Szybkie przygotowanie siatki do czasowo-rozdzielczej mikroskopii krioelektronowej

Witam i witam w tym filmie JoVE". Chcemy przedstawić Wam konfigurację, którą mamy tutaj do szybkiego tworzenia sieci, badanie z rozdzielczością czasową, nad którym pracujemy w Leeds. Należy pamiętać, że nie jest to standardowy system, ale mamy nadzieję, że dzięki szczegółowemu opisowi wszystkich rzeczy i parametrów, które wykonujemy, będziesz w stanie opracować podobne systemy we własnych laboratoriach.

Szczegółowy opis urządzenia znajduje się w protokole z Richmond. Tutaj przedstawimy przewodnik krok po kroku dotyczący szybkiego przygotowania siatki i rozdzielczości czasowej EM.In naszego doświadczenia wynika, że stężenie białka powinno wynosić dwa miligramy na mililitr lub więcej. Protokół wymaga minimalnej objętości około 50 mikrolitrów.

Włącz urządzenie. Następnie włącz komputer sterujący i uruchom oprogramowanie sterujące. Zainicjuj wszystkie pompy strzykawkowe, naciskając przycisk inicjalizacji na każdej pompie strzykawki.

Włącz zasilanie potencjometru, ustaw je na dziewięć woltów i uruchom oprogramowanie sterujące oscyloskopem. Do wytworzenia rozpylonego azotu potrzebny jest gazowy azot pod ciśnieniem. Otwórz butlę z azotem i ustaw ciśnienie na 2 bary.

Upewnij się, że wszystkie zawory pompy strzykawkowej są w pozycji obciążenia. Aby to zrobić, przełącz wszystkie zawory na dozowanie w oprogramowaniu sterującym, a następnie z powrotem na ładowanie. Ustawić wszystkie strzykawki na zero.

Na tym etapie należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza obecne w systemie. W tym celu może być konieczne odkręcenie strzykawek, ręczne usunięcie pęcherzyków i ponowne zamontowanie strzykawek, gdy nie zawierają już pęcherzyków. System obsługi cieczy jest zwykle przechowywany w wodzie.

Przed załadowaniem próbki system jest równoważony za pomocą bufora. Odbywa się to poprzez umycie rurki nadmiarem buforu. Umieścić probówkę zawierającą co najmniej 200 mikrolitrów buforu na strzykawce numer jeden.

Górna część rurki musi być przebita, aby ją przymocować. Odessać odpowiednią ilość buforu, od 50 do stu mikrolitrów za pomocą strzykawki za pomocą oprogramowania sterującego. Przełącz zawór pierwszy, aby dozować.

Dozuj cały płyn do pierwszej strzykawki. Ustaw zawór zwrotny pierwszy do pozycji ładowania i naciśnij przycisk inicjalizacji na strzykawce, aby przygotować system do następnego cyklu prania. Czynności te są zwykle powtarzane trzy razy, aby zapewnić dokładne umycie rurki.

Następnie umieszczana jest dysza natryskowa. Umieść siatkę EM w ramieniu wgłębnym. Umieść kratkę przed dyszą natryskową.

Dozować bufor za pomocą oprogramowania sterującego. Jeśli dysza i siatka są wyrównane, płyn powinien gromadzić się po rozpyleniu przez dłuższy czas. W razie potrzeby wyreguluj położenie dyszy, a następnie ponownie sprawdź, gdzie płyn gromadzi się na ruszcie.

Następnie wyreguluj położenie kubka na etan. Końcówka pęsety powinna sięgać mniej więcej do środka kubka na etan. Wykonaj przebieg testowy, aby upewnić się, że wszystkie ustawienia są poprawne.

Zamknij komorę wilgotności. Upewnij się, że ścieżka tłoka jest wolna. Zassać do strzykawki objętość buforu wymaganą do pojedynczego uruchomienia.

Przełącz zawór pierwszy, aby dozować. Rozpocznij bieg, naciskając run'w oprogramowaniu sterującym. Sprawdź, czy pierwsza pompa strzykawkowa jest w ruchu, w tym przypadku dwie sekundy, a siatka jest zanurzana po odpowiednim opóźnieniu, tutaj 1,5 sekundy.

Po zakończeniu pracy ustaw nacisk na ramię tłoka na żądaną wartość. Naciśnij OK'w oprogramowaniu sterującym, aby zwolnić nacisk z ramienia zanurzającego. Teraz kubek na etan jest chłodny i wypełniony ciekłym etanem.

Rozładuj żar na kratkach przed użyciem. Typowe wyładowanie jarzeniowe trwa 90 sekund przy 10 miliamperach w powietrzu o ciśnieniu 0,1 milibara. Rurka jest następnie równoważona z próbką.

Jeżeli dostępna objętość próbki jest mała, rurka może być zrównoważona tylko jedną objętością martwą. Odessać próbkę. Zazwyczaj martwa objętość wynosi około 30 mikrolitrów.

Przełącz zawór pierwszy, aby dozować. Dozować próbkę przez rurkę i dyszę. Następnie odessać ilość próbki wymaganą dla pojedynczego cyklu.

Przełącz zawór pierwszy, aby dozować. Sprawdź, czy wilgotność względna osiągnęła żądaną wartość. Zazwyczaj przygotowujemy siatki na poziomie 60% lub wyższym.

Może to potrwać kilka minut. Umieść pęsetę trzymającą rozżarzoną siatkę w ramieniu wgłębnym. Ustaw suwak potencjometru w pozycji startowej, gotowy do pomiaru prędkości.

Ustaw wyzwalacz pomiaru prędkości w oprogramowaniu oscyloskopu. Umieść kubek z ciekłym etanem i zbliż do komory wilgotności. Upewnij się, że ścieżka tłoka jest wolna.

Uruchom bieg w oprogramowaniu sterującym. Po zakończeniu biegu naciśnij OK' w oprogramowaniu sterującym, aby zwolnić nacisk z ramienia wgłębnego. Otwórz komorę wilgotności, poluzuj połączenie między ramieniem wgłębnym a pęsetą.

Przesuń ramię wgłębne w górę, utrzymując siatkę w ciekłym etanie. Następnie przenieś siatki do ciekłego azotu i do magazynowania. Zapisz pomiar oscyloskopu.

Ręcznie zresetuj pozycję suwaka potencjometru i tłoka. Powtórz protokół, aby przygotować siatki replikacji. Eksperymenty czasowo-rozdzielcze są przeprowadzane w podobny sposób.

Do eksperymentów z rozdzielczością czasową potrzebne są wyższe stężenia podstawowe ze względu na rozcieńczenie na etapie mieszania. W eksperymencie z rozdzielczością czasową należy użyć wszystkich trzech strzykawek. Rurka jest podłączona do pomp strzykawkowych i do dyszy rozpylającej.

Zastosowana tutaj mikroprzepływowa dysza natryskowa zawiera również element mieszający. Należy pamiętać, że dłuższe probówki dają większą objętość martwą, a etapy równoważenia płukania wymagają więcej buforu i próbki. Zrównoważyć wszystkie strzykawki z buforem i próbką oddzielnie.

Zazwyczaj strzykawka pierwsza jest używana do próbki A', a strzykawki druga i trzecia są używane do próbki B'Po wyrównaniu rurki załaduj próbkę A do strzykawki pierwszej, a próbkę B do strzykawki drugiej i trzeciej. Następnie przełącz zawory od jednego do trzech, aby dozować. Uruchom bieg w oprogramowaniu sterującym.

Należy pamiętać, że w przypadku eksperymentu z rozdzielczością czasową wymagany jest inny skrypt uruchamiania. Różne opóźnienia czasowe można osiągnąć na dwa sposoby. Regulując prędkość tłoka, można zmienić opóźnienie czasowe od mieszania do zamrażania.

Większa prędkość zanurzania doprowadzi do krótszego opóźnienia czasowego. Alternatywnie odległość natryskiwania etanu zmienia się poprzez regulację pionowego położenia dyszy natryskowej. Zwiększenie odległości spowoduje wydłużenie opóźnienia.

W mikroskopie elektronowym przy małym powiększeniu typowa siatka wygląda tak. Obszary cienkiego lodu, jak wskazano, nadają się do pozyskiwania danych. Przy większych powiększeniach cząstki powinny być wyraźnie widoczne.

W przypadku próbki testowej, takiej jak apoferrytyna, stosunkowo mały zestaw danych z pojedynczej siatki jest wystarczający do rekonstrukcji w rozdzielczości od trzech do czterech angstremów. W przypadku eksperymentów z rozdzielczością czasową zbieramy zestawy danych z różnych punktów czasowych lub siatek. Przydatne jest połączenie danych w celu klasyfikacji 3D, a następnie prześledzenie cząstek z powrotem do ich punktów czasowych.

W ten sposób dane mogą dostarczyć informacji strukturalnych i informacji o kinetyce reakcji. Podsumowując, mamy nadzieję, że podobał Ci się film. Mamy nadzieję, że dzięki szczegółowym opisom zawartym w artykule JoVE wraz z filmem, będziesz w stanie przeprowadzić własne eksperymenty za pomocą szybkiego tworzenia siatki, która, jak wykazano, łagodzi niektóre problemy związane z mutacją lub pomaga w interakcjach na granicy powietrzno-wodnej, co jest wszystkim, czego potrzebujesz do przeprowadzenia własnych badań z rozdzielczością czasową, aby spróbować złapać niektóre z tych stanów nierównowagi.

A więc szczęśliwego tworzenia siatki.