Name: Analiza neutralnej syntezy lipidów w Saccharomyces cerevisiae za pomocą znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy syntezy lipidów neutralnych w Saccharomyces cerevisiae przy użyciu znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej. Protokół umożliwia badanie regulacji enzymów metabolizmu lipidów w różnych kontekstach genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratorium Henne za pomoc i porady koncepcyjne w ukończeniu tego badania. W.M.H. jest wspierany przez fundusze z Welch Foundation (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Medical Research Fund oraz UT Southwestern Endowed Scholars Program. Firma S.R otrzymała wsparcie w ramach grantu programu T32 (5T32GM008297).

1. Wzrost i znakowanie komórek drożdży kwasem 14C-octowym
<ol>
	<li>Zaszczepić kulturę drożdży, wybierając kolonię z płytki i dozując ją do 20 ml syntetycznej pożywki kompletnej (SC) zawierającej 2% dekstrozy (patrz Plik uzupełniający dla receptury pożywki SC). Inkubować w temperaturze 30 °C przez noc z wytrząsaniem przy 200 obr./min. 
	UWAGA: Warunki wzrostu, objętość próbki i traktowanie będą się różnić w zależności od interesującego lipidu (lipidów). Przed przeprowadzeniem pełnych eksperymentów należy empirycznie określić optymalne warunki wzrostu i objętość hodowli. Protokół ten omawia znakowanie radioaktywne kultur drożdży wyhodowanych do fazy stacjonarnej, fazy wzrostu, w której wzrost błon biologicznych i komórek spowalnia, a synteza NL jest bardzo aktywna.</li>
	<li>Zmierzyć OD600 w nocnej hodowli za pomocą spektrofotometru i rozcieńczyć hodowlę komórkową drożdży do końcowego OD600 wynoszącego 0,2 w 50 ml świeżej pożywki SC zawierającej 2% dekstrozy. Hoduj komórki przez 24 godziny lub do momentu, gdy osiągną fazę stacjonarną (która jest zwykle definiowana przez płaską wyściółkę komórki podwajającą pomiar OD600).</li>
	<li>Przed zebraniem komórek należy sporządzić bufor do gaszenia (szczegółowe informacje znajdują się w pliku uzupełniającym). Sporządzić dwie podwielokrotności buforu hartowniczego o pojemności 20 ml dla każdej próbki (tj. 40 ml buforu hartowniczego dla każdej próbki) i równomiernie podzielić na dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml). Przechowywać porcje bufora hartowniczego w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Gdy kultury osiągną pożądany OD lub fazę wzrostu, zebrać komórki, odwirowując przy 4 100 x g przez 10 minut. Gdy próbki znajdują się w wirówce, należy przygotować pożywkę do znakowania radioaktywnego, dodając sól sodową kwasu octowego [1–14°C] do pożywki SC niezawierającej dekstrozy w końcowym stężeniu 10 μCi/ml. 
	UWAGA: Podczas pracy z materiałami radioaktywnymi należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE). Zawsze postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi prawidłowego przechowywania, użytkowania i usuwania materiałów radioaktywnych. 
	UWAGA: Zarówno stężenie kwasu 14C-octowego w pożywce znakującej, jak i czas inkubacji znakowania radioizotopem powinny być dostosowane do metabolitu (metabolitów) będącego przedmiotem zainteresowania. W tym przypadku stosuje się 20-minutową inkubację impulsów znakowania radioaktywnego, która jest wystarczająca do oznakowania gatunków NL o różnym zakresie liczebności.</li>
	<li>Usunąć supernatant z granulowanych komórek i przemyć osad komórkowy raz 20 ml pożywki SC bez dekstrozy, ponownie zawieszając osad za pomocą pipety. Ponownie zebrać komórki, odwirowując przy 4 100 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki SC bez dekstrozy i przenieść komórki do znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Zebrać komórki ponownie, odwirowując przy 4 100 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl pożywki SC bez dekstrozy. Wstępnie schłodzić wirówkę wyposażoną w probówki stożkowe o pojemności 50 ml do temperatury -10 °C lub przy najniższym ustawieniu temperatury.</li>
	<li>Okres znakowania radioaktywnego należy rozpocząć od szybkiego dodania 500 μl pożywki znakowanej radioizotopem do każdych 500 μl zawiesiny komórek (końcowe stężenie 14C-kwasu octowego = 5 μCi/ml). Inkubować probówki w inkubatorze obrotowym w temperaturze 30 °C przez 20 min. 2 minuty przed końcem okresu etykietowania, przenieść jedną 20 ml porcji buforu hartowniczego na każdą próbkę z zamrażarki w temperaturze -80 °C do wiadra z lodem</li>
	<li>Po zakończeniu okresu znakowania radioizotopem za pomocą pipety zanurzyć całą 1 ml próbkę w 20 ml zimnego buforu do hartowania. Wirować stożkowe probówki przez 5-10 s, aby upewnić się, że próbka została dokładnie wymieszana z buforem hartującym. Próbki należy inkubować w buforze hartowniczym przez 2 minuty na lodzie.</li>
	<li>Zebrać osad komórkowy, wirując w wirówce o sile 5 000 x g przez 3 minuty ustawiony na -10 °C lub na najniższą temperaturę. Podczas wirowania probówek z próbkami przenieść kolejny zestaw porcji buforu hartowniczego z zamrażarki o temperaturze -80 °C do wiadra wypełnionego lodem (tj. jedną probówkę buforu hartowniczego o pojemności 20 ml na próbkę).</li>
	<li>Usunąć supernatant buforu wygaszającego z osadów komórkowych i zastąpić go 20 ml świeżym, zimnym buforem hartującym. Wstrząsnąć i wstrząsnąć próbkami, aż osad zostanie usunięty z dna stożkowej rurki i całkowicie zawieszony w buforze hartowniczym. Ponownie odwirować próbki o masie 5 000 x g przez 3 minuty w temperaturze -10 °C w celu zebrania komórek.</li>
	<li>Po granulowaniu komórek należy dokładnie usunąć cały bufor gasnący z próbek, wylewając supernatant i usuwając nadmiar za pomocą pipety. Probówki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszej obróbki.</li>
</ol>
2. Izolacja całkowitej ilości lipidów z drożdży
UWAGA: Poniższy protokół izolacji lipidów opiera się na dobrze znanej i często stosowanej metodzie, która skutecznie ekstrahuje najbardziej neutralne gatunki lipidów17,18. 
UWAGA: Podczas korzystania z rozpuszczalnika organicznego zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej i jeśli to możliwe, pracuj wewnątrz dygestorium. Podczas ekstrakcji lipidów należy unikać stosowania tworzyw sztucznych, które są niekompatybilne z rozpuszczalnikami organicznymi. Rurki polipropylenowe są odpowiednie dla następującego protokołu.
<ol>
	<li>Odważyć 0,3 g szklanych kulek przemytych kwasem na każdą próbkę i przechowywać je w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml na lodzie. Wyjmij granulki komórek z zamrażarki w temperaturze -80 °C i trzymaj je na lodzie. Do każdej próbki dodać 350 μl metanolu i 700 μl chloroformu, zawiesić ponownie i przenieść do probówek do mikrowirówek zawierających wstępnie zważone kulki szklane.</li>
	<li>Lizuj komórki, mieszając probówki na wirze 3x przez 1 minutę, z 30-sekundową inkubacją na lodzie między mieszaniami. Alternatywnie, komórki mogą być poddawane lizie za pomocą mini ubijaka do kulek przez trzy 1-minutowe cykle. Zaoszczędź 25-30 μl lizatu pełnokomórkowego w osobnej probówce do liczenia scyntylacyjnego. 
	UWAGA: Zapisany lizat zostanie wykorzystany do określenia względnej ilości radioizotopu pobranego przez każdą próbkę w okresie impulsu, co wpłynie na ilość każdej próbki załadowanej na płytkę TLC. Zostało to omówione bardziej szczegółowo w kroku 3.2.</li>
	<li>Wlać całą zawartość probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml do szklanej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml [probówka A]. Umyj probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml, dodając 1 ml metanolu i wirując przez 10-15 sekund. Przenieść 1 ml metanolu do probówki A i dodać 2 ml chloroformu do probówki A, a następnie 400 μl wody, aby uzyskać końcową objętość próbki 4,45 ml.</li>
	<li>Wirować próbki przez 1 minutę, a następnie odwirować przez 5 minut przy 1 000 x g. Po odwirowaniu faza wodna (górna) i organiczna (dolna) powinny być wyraźnie oddzielone wizualnie z resztkami komórek leżącymi na granicy faz.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety Pasteura zebrać fazę organiczną z probówki A i przenieść do nowej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml (probówka B). Dodaj 1 ml 1M KCl do probówki B. Do probówki A dodać 1 ml metanolu i 2 ml chloroformu oraz 200 μl wody MiliQ. Powtórz kroki wirowania i wirowania na probówce A.</li>
	<li>Ponownie zebrać fazę organiczną z probówki A i dodać ją do probówki B. Probówkę A wyrzucić do odpowiedniego pojemnika. Wirować probówkę B przez 1 minutę, a następnie odwirować przez 5 minut przy 1 000 x g.</li>
	<li>Usunąć górną warstwę wody z probówki B i wyrzucić. Dodać 1 ml świeżego 1 M KCl z powrotem do probówki B i powtórzyć etap wirowania/wirowania. Po rozdzieleniu warstw ostrożnie zbierz całą dolną warstwę organiczną do oznakowanej szklanej fiolki o pojemności 4 ml. 
	UWAGA: Na tym etapie ekstrakty lipidowe mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub protokół może być kontynuowany w celu oddzielenia lipidów TLC.</li>
</ol>
3. Separacja i kwantyfikacja znakowanych radioizotopowo NL metodą chromatografii cienkowarstwowej
<ol>
	<li>Jeżeli ekstrakty lipidowe umieszczono w temperaturze -80 °C, powoli doprowadzić do temperatury pokojowej poprzez inkubację na lodzie, a następnie na blacie stołu. Całkowicie odparować rozpuszczalnik z ekstraktów lipidowych poprzez suszenie próżniowe lub przy użyciu delikatnego strumienia gazu obojętnego (np. argonu lub azotu). W międzyczasie rozgrzej piekarnik do 145 °C, aby podgrzać płytę TLC.</li>
	<li>Zanim próbki będą mogły zostać załadowane na płytkę TLC, należy określić względne ilości znaku radioaktywnego pobranego przez komórki. Odpipetować 10 μl lizatu komórkowego z kroku 2.2 do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 6 ml, dodać 6 ml płynu scyntylacyjnego i umieścić fiolki w stojaku. Użyj licznika scyntylacyjnego, aby zmierzyć cpm lub dpm każdej próbki przy użyciu opcji zliczania pojedynczego stojaka ustawionej na 1-minutowy czas zliczania. Zmierzyć każdy lizat całych komórek w dwóch egzemplarzach, aby uzyskać średnią dla każdej próbki. Dostosuj ilość wsadu zgodnie z typem dzikim lub próbką referencyjną 
	UWAGA: Ilość każdej próbki do załadowania na płytkę TLC można określić za pomocą następującego równania: (średnia liczba próbek)/(średnia liczba referencyjna) x żądana objętość ładowania. Na przykład, jeśli 20 μl próbki referencyjnej ma zostać załadowane na płytkę TLC i ma średnią liczbę 1 000, to próbka doświadczalna o średniej liczbie 2 000 będzie miała 10 μl załadowanych na płytkę TLC.</li>
	<li>Rozpuść lipidy próbki w 40-50 μl chloroformu 1:1 (v/v%) chloroform:metanol, wirując przez 5 minut. Przygotować 101 ml rozpuszczalnika fazy ruchomej w szklanym cylindrze z podziałką (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki w celu zapoznania się z przykładem separacji głównych gatunków NL za pomocą 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Heksan:Eter naftowy:Eter dietylowy: Rozpuszczalnik kwasu octowego).</li>
	<li>Wlać rozpuszczalnik do szklanej komory TLC zawierającej wkładkę nasycającą 20 x 20 TLC i szczelnie przylegającą pokrywkę. Przygotuj kanałową płytkę z żelem krzemionkowym 20 x 20 G 60 G, delikatnie zaznaczając ołówkiem linię 1,5 cm nad dnem płytki. Linia wyznacza pochodzenie i miejsce, w którym zostaną załadowane lipidy. Poniżej linii delikatnie oznacz próbkę, która zostanie załadowana na każdym pasie. Po przygotowaniu płytki TLC inkubuj ją w piekarniku o temperaturze 145 °C przez co najmniej 30 minut, aby podgrzać płytkę i usunąć nadmiar wilgoci.</li>
	<li>Gdy płyta zostanie wystarczająco podgrzana, a podkładka do nasycania TLC zostanie nasycona rozpuszczalnikiem, wyjmij płytkę TLC z piekarnika i natychmiast przystąp do ładowania płytki TLC. Załadowanie płytki, gdy jest ciepła, zapewnia szybkie odparowanie rozpuszczalnika. Dla każdego rodzaju lipidów będących przedmiotem zainteresowania należy załadować 5-20 μg oczyszczonego wzorca lipidowego na tor płytki TLC, aby śledzić separację i oczekiwaną drogę migracji. Za pomocą pipety umieść 5 μl próbki na początku każdego pasa znajdującego się 1,5 cm nad dnem płytki TLC. Powtarzaj ładowanie plamek o pojemności 5 μl, aż do momentu, gdy 20-40 μl próbki zostanie załadowane na każdą ścieżkę. 
	UWAGA: 5-20 μg nieznakowanych oczyszczonych lipidów można dodać do każdego toru próbki jako znaczniki, które można barwić i wizualizować po oddzieleniu lipidów TLC. Obecność barwionego wzorca pozwala na łatwe śledzenie i wycinanie znakowanych radioaktywnie prążków lipidowych w celu późniejszego zliczenia scyntylacyjnego. To, które oczyszczone wzorce zostaną załadowane na płytkę, zostanie określone przez interesujące nas gatunki NL. Patrz sekcja Reprezentatywne wyniki, aby zapoznać się z przykładami rozdzielania kwasu oleinowego (FFA), 1,2-dioleoilo-glicerolu (DG), trioleiny (TG), cholesterolu (Chol), cholesterolu (Chol), cholesterolu cholesterolu (SE) i skwalenu na pasach przylegających do pasów próbek.</li>
	<li>Po załadowaniu wzorca i próbek doświadczalnych umieścić płytkę w komorze wywoływania i poczekać, aż rozpuszczalnik dotrze do górnej części płytki (40-60 min). Gdy płytka jest w pełni rozwinięta, wyjmij ją z komory i pozostaw do wyschnięcia w dygestorii przez 20 minut.</li>
	<li>Po wyschnięciu płytki przykryj ją folią z tworzywa sztucznego i umieść w kasecie wywołującej z ekranem autoradiograficznym. Pozwól płytce rozwijać się wraz z sitkiem przez 24-48 godzin.</li>
</ol>
4. Wizualizacja i kwantyfikacja lipidów oddzielonych TLC
<ol>
	<li>Wyjmij ekran z kasety wywoływania i umieść go w imagerze luminoforowym. Wybierz opcję obrazowania luminoforowego i wywołuj przy 800-1000 V. 
	UWAGA: Obrazowanie luminoforowe daje jakościowy widok lipidów znakowanych radioaktywnie na płytce TLC. Jednak kwantyfikacja lipidów znakowanych radioaktywnie najlepiej jest przeprowadzić przez zliczanie scyntylacyjne, które opisano poniżej.</li>
	<li>Wymieszać 100 ml odczynnika aldehydu p-aniasowego (patrz plik uzupełniający) i umieścić w szklanej butelce z rozpylaczem. Spryskać płytkę TLC odczynnikiem aldehydu p-aniszowego, aż krzemionka zostanie nasycona. Piecz talerz w piekarniku o temperaturze 145 °C przez 5 minut lub do momentu, aż pojawią się pasma.</li>
	<li>Aby określić ilościowo poszczególne gatunki lipidów za pomocą zliczania scyntylacyjnego znakowanego radioizotopem, użyj żyletki, aby zeskrobać żel krzemionkowy ze szklanej płytki TLC. Przenieść każde pasmo żelu krzemionkowego odpowiadające pojedynczemu rodzajowi lipidów znakowanego radioaktywnie do szklanej fiolki scyntylacyjnej i dodać 6 ml płynu scyntylacyjnego. Energicznie wirować, aż pasmo krzemionki zostanie zredukowane na małe kawałki.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, lipidy można wyekstrahować z pasma żelu krzemionkowego przy użyciu protokołu ekstrakcji lipidów w sekcji 3. Jeżeli lipidy są ekstrahowane z żelu krzemionkowego, należy całkowicie odparować rozpuszczalnik, jak w kroku 3.1, i dodać 6 ml płynu scyntylacyjnego do wysuszonych lipidów. Umieścić stojak zawierający fiolki scyntylacyjne w liczniku scyntylacyjnym. Wybierz opcję Policz pojedynczy stojak i ustaw czas liczenia na 2 minuty na fiolkę. Wyniki z licznika scyntylacyjnego zostaną wydrukowane i mogą być wizualizowane w postaci wykresu słupkowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li>
<li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Lipid+Insights%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li>
<li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet biogenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).</li>
<li>Olzmann, J. A., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+functions+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamics and functions of lipid droplets.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).</li>
<li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+fat%3A+lipid+droplets+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li>
<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+atherosclerosis%3A+A+perspective+for+the+1990s%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s.</a> Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).</li>
<li>Zhang, C., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet%3A+A+conserved+cellular+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet: A conserved cellular organelle.</a> Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).</li>
<li>Wältermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+lipid-body+formation+in+prokaryotes%3A+How+bacteria+fatten+up%3A+Lipid-body+formation+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).</li>
<li>Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Lipid+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).</li>
<li>Kotapati, H. K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099(2020).</li>
<li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li>
<li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li>
<li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+%5BRNQ%2B%5D+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Separations%22%5BJournal%5D)">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006(2018).</li>
<li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), Chichester, England. 1607-1633 (1996).</li>
<li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li>
<li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Biomedical+Sciences+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Bligh+and+Dyer%22+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708(2017).</li>
<li>Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma sprzecznych interesów w przygotowaniu tego manuskryptu.

W tym miejscu przedstawiono wszechstronny protokół znakowania radioaktywnego do ilościowego monitorowania syntezy gatunków NL w drożdżach. Protokół ten jest bardzo modułowy, co pozwala na zakończenie zabiegu w ciągu 3-6 dni. Ponadto istnieje bogata literatura na temat stosowania TLC do oddzielania form lipidów i metabolitów, co powinno pozwolić użytkownikowi na wykrycie kilku interesujących gatunków lipidów za pomocą prostej zmiany systemów rozpuszczalników TLC16,19</s...

Acetylo-CoA jest podstawowym budulcem różnorodnych biomolekuł, w tym neutralnych lipidów (NL), które służą jako wszechstronna waluta biomolekularna do budowy błon, generowania ATP i regulowania sygnalizacji komórkowej1,2. Dostępność NL, które mogą zostać przetoczone do którejkolwiek z tych odpowiednich ścieżek, jest częściowo regulowana przez ich magazynowanie. Kropelki lipidów (LD), organelle cytoplazmatyczne złożone z hydrofobowych rdzeni trójglicerydów (TG) i estrów steroli (SE), są głównymi przedziałami magazynowymi większości komórkowych NL. W związku z tym LD sekwestrują i regulują NL, które mogą być degradowane, a następnie wykorzystywane do procesów biochemicznych i metabolicznych3,4. Wiadomo, że nieprawidłowa regulacja białek związanych z NL i LD jest skorelowana z wystąpieniem patologii, w tym lipodystrofii i zespołów metabolicznych5,6. Z tego powodu obecne badania nad LD koncentrują się na tym, w jaki sposób synteza NL jest regulowana przestrzennie, czasowo i w różnych tkankach organizmów wielokomórkowych. Ze względu na wszechobecne role komórkowe NL, wiele enzymów odpowiedzialnych za syntezę i regulację NL jest konserwatywnych we wszystkich eukariontach7. Rzeczywiście, nawet niektóre prokariota przechowują NL w LDs8. W związku z tym genetycznie podatne organizmy modelowe, takie jak Saccharomyces cerevisiae (drożdże pączkujące), okazały się przydatne do badania syntezy i regulacji NL.
Separacja i kwantyfikacja NLs z ekstraktów komórkowych może być realizowana na wiele sposobów, włączając w to chromatografię gazową ze spektrometrią mas (GC-MS), wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) i ultra-sprawną chromatografię cieczową ze spektrometrią mas (UPLC-MS)9,10,11. Być może najprostszą metodą separacji NL jest chromatografia cienkowarstwowa (TLC), która pozwala na późniejszą densytometryczną kwantyfikację z krzywej wzorcowej12,13. Chociaż TLC zapewnia tylko ziarnistą separację NL, pozostaje potężną techniką, ponieważ jest niedroga i pozwala na szybkie oddzielenie NL od kilku próbek jednocześnie. Dwa z najpoważniejszych wyzwań stojących przed badaniem NL za pomocą TLC to: 1) szeroki zakres liczebności komórkowej gatunków NL i ich produktów pośrednich oraz 2) zakres hydrofilowości/hydrofobowości pośrednich lipidów w szlakach syntezy NL. W związku z tym oznaczanie ilościowe gatunków NL za pomocą TLC jest zazwyczaj ograniczone do gatunków najliczniejszych; jednak wprowadzenie znakowania radioaktywnego kwasem 14C-octowym może znacznie poprawić wykrywanie produktów pośrednich o niskiej liczebności w szlakach NL. Kwas octowy jest szybko przekształcany w acetylo-CoA przez syntetazę acetylo-CoA ACS214, co sprawia, że kwas 14C-octowy jest odpowiednim substratem do znakowania radioaktywnego w drożdżach15. Dodatkowo, separacja zarówno hydrofobowych NL, jak i hydrofilowych produktów pośrednich NL może być osiągnięta przez TLC poprzez zastosowanie wielu systemów rozpuszczalników16. W tym miejscu przedstawiono metodę rozdzielania NL przy użyciu znakowania metabolicznego 14C-octowym kwasu octowego w drożdżach. Lipidy znakowane w okresie impulsowym są następnie izolowane za pomocą dobrze ugruntowanego protokołu całkowitej izolacji lipidów17, po czym następuje separacja gatunków NL przez TLC. Opracowanie płytek TLC zarówno za pomocą autoradiografii w celu wizualizacji znakowanych lipidów, jak i sprayu chemicznego w celu wizualizacji całkowitych lipidów, pozwala na zastosowanie wielu metod kwantyfikacji. Poszczególne prążki lipidowe można również łatwo wyekstrahować z płytki TLC za pomocą żyletki, a zliczanie scyntylacyjne można wykorzystać do ilościowego określenia ilości materiału znakowanego radioaktywnie w paśmie.

<table><tbody><tr><td>[1-C14] Sól sodowa kwasu octowego Aktywność specyficzna: 45-60mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC084H001MC</td><td></td></tr><tr><td>18:1 1,2 dioleoilo-sn-glicerol</td><td>Avanti</td><td>800811O</td><td></td></tr><tr><td>200 proof absolutny</td> etanol <td>Sigma</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane płukane kwasem 425-600um</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynowe żarówki do pipet Pastuer</td><td>Fisher</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu >99%</td><td>Sigma</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS6500 Licznik scyntylacyjny</td><td>PerkinElmer</td><td>A481000</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (klasa HPLC)</td><td>Fisher</td><td>C607SK</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol >99%</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr> Cholesterol cholesterolu <tr><td>>98%</td><td>Sigma</td><td>C0289</td><td></td></tr><tr><td>Skoncentrowany kwas siarkowy</td><td>Sigma</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50mL probówki stożkowe, polipropylen z nakrętką centristar</td><td>Sigma</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>dekstroza, bezwodna Sigma</td><td></td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy bezwodny</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka</td><td>Fisher</td><td>11-475-155</td><td></td></tr><tr><td>Ciecz scyntylacyjna EcoLume</td><td>Wirówka VWR</td><td>IC88247001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R</td><td>Fisher</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>GE Przechowywanie sita fosforowego</td><td>Sigma</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>GE Typhoon FLA9500 imager</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy, klasa ACS</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Szklane fiolki scyntylacyjne 6 ml</td><td>Sigma</td><td>M1901</td><td></td></tr><tr><td>Szklane nakrętki do probówek wirówkowych</td><td>Fisher</td><td>14-595-36A</td><td></td></tr><tr><td>Szklane probówki wirówkowe</td><td>Fisher</td><td>14-595-35A Szklane</td><td></td></tr><tr><td>pipety Pasteura</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Heksan bezwodny</td><td>Sigma</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>L-adenina >99%</td><td>Sigma</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>L-alanina >98%</td><td>Sigma</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina >99%</td><td>Sigma</td><td>A1270000</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagina >98%</td><td>Sigma</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>L-asparaginian >98%</td><td>Sigma</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina >97%</td><td>Sigma</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>Jednowodna sól monosodowa kwasu L-glutaminowego >98%</td><td>Sigma</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina >99%</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-glicyna >99%</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>L-histydyna >99%</td><td>Sigma</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Izoleucyna >98%</td><td>Sigma</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-leucyna >98%</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-lizyna >98%</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina, klasa HPLC</td><td>Sigma</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-fenyloalanina, odczynnik klasy</td><td>Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina >99%</td><td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-seryna >99%</td><td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-teronina, klasa odczynnika</td><td>Sigma</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptofan >98%</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrozyna >98%</td><td>Sigma</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-Uracyl >99%</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-walina >98%</td><td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, klasa ACS Kwas</td> oleinowy <td>Fisher</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>>99%</td><td>Sigma</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>aldehyd anżynowy</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td></td></tr><tr><td>Eter naftowy, klasa ACS</td><td>Sigma</td><td>184519</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatydylocholina, dipalmitoilo >99%</td><td>Sigma</td><td>P1652</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Eppendorf</td><td>2231000713</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu, klasa ACS</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Granulki wodorotlenku sodu, certyfikowane ACS</td><td>Fisher</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Skwalen >98%</td><td>Sigma</td><td>S3626</td><td></td></tr><tr><td>Kwas bursztynowy krystaliczna/certyfikowana</td> podkładka saturcyjna <td>Fisher</td><td>110-15-6</td><td></td></tr><tr><td>TLC</td><td>Sigma</td><td>Z265225</td><td></td></tr><tr><td>żel krzemionkowy TLC 60G szklana płytka kanałowa</td><td>Fisher</td><td>NC9825743</td><td>Brak wskaźników fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Przezroczysta folia z tworzywa sztucznego</td><td>Apollo</td><td>829903</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Trioleina >99%</td><td>Sigma</td><td>T7140</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta ekspozycyjna Whatman</td><td>Sigma</td><td>WHA29175523</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowa baza azotowa bez siarczanu amonu i aminokwasów</td><td>Sigma</td><td>Y1251</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza neutralnej syntezy lipidów w saccharomyces cerevisiae za pomocą znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Neutralne lipidy (NLs) to klasa hydrofobowych, bezładunkowych biomolekuł, które odgrywają kluczową rolę w homeostazie energetycznej i lipidowej. NL są syntetyzowane de novo z acetylo-CoA i są obecne głównie w eukariontach w postaci trójglicerydów (TG) i estrów steroli (SE). Enzymy odpowiedzialne za syntezę NL są wysoce konserwatywne od Saccharomyces cerevisiae (drożdży) do ludzi, co czyni drożdże użytecznym organizmem modelowym do analizy funkcji i regulacji enzymów metabolizmu NL. Chociaż wiele wiadomo o tym, w jaki sposób acetylo-CoA jest przekształcany w różnorodny zestaw gatunków NL, mechanizmy regulacji enzymów metabolizmu NL i to, jak nieprawidłowa regulacja może przyczyniać się do patologii komórkowych, są nadal odkrywane. Liczne metody izolacji i charakterystyki gatunków NL zostały opracowane i wykorzystane w ciągu dziesięcioleci badań; jednak ilościowy i prosty protokół kompleksowej charakterystyki głównych gatunków NL nie został omówiony. W tym artykule przedstawiono prostą i adaptowalną metodę ilościowego oznaczania syntezy de novo głównych gatunków NL w drożdżach. Stosujemy znakowanie metaboliczne 14kwasów C-octowych w połączeniu z chromatografią cienkowarstwową w celu oddzielenia i ilościowego określenia różnorodnego zakresu fizjologicznie ważnych NL. Ponadto metoda ta może być łatwo zastosowana do badania szybkości reakcji in vivo enzymów NL lub degradacji gatunków NL w czasie.

W niniejszym protokole wykazaliśmy, że znakowanie, detekcja i kwantyfikacja frakcji NL mogą zostać przeprowadzone za pomocą znakowania metabolicznego kwasem octowym z 14C. Główne frakcje NL można rozdzielić w układzie rozpuszczalników heksan:eter naftowy:eter dietylowy:kwas octowy w proporcji 50:40:10:1 (v/v/v/v%) (Rycina 1A,B). Obrazowanie fosforowe umożliwia wizualizację znakowanych wolnych kwasów tłuszczowych (FFA), triacylogliceroli (TG), diacylogliceroli (DG)...

Tutaj przedstawiono protokół metabolicznego znakowania drożdży kwasem 14C-octowym, który jest sprzężony z chromatografią cienkowarstwową w celu oddzielenia obojętnych lipidów.

Analiza neutralnej syntezy lipidów w Saccharomyces cerevisiae za pomocą znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Technika ta wykorzystuje instrumenty powszechnie spotykane w większości środowisk laboratoryjnych i pozwala na jednoczesną analizę kilku próbek. Metoda ta może dostarczyć kluczowych informacji na temat tego, w jaki sposób enzymy metabolizmu lipidów są regulowane w kontekście komórkowym i w różnych tłach genetycznych. Zaszczepić kolonię z płytki hodowli drożdży do 20 mililitrów pożywki SC zawierającej 2% dekstrozy i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc z wytrząsaniem przy 200 obr./min.Następnego dnia rozcieńczyć kulturę w 50 mililitrach świeżej pożywki do końcowego OD 0,2 i hodować przez 24 godziny, aż do osiągnięcia fazy stacjonarnej. Przygotować dwie 20-mililitrowe porcje buforu hartowniczego dla każdej próbki i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Jednocześnie przygotować pożywkę do znakowania promieniami, dodając sól sodową kwasu octowego do pożywki SC wolnej od dekstrozy w końcowym stężeniu 10 mikrokiurów na mililitr.Zebrać komórki, odwirowując przy 4,100 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i przemyć osad komórkowy raz 20 mililitrami pożywki SC bez dekstrozy. Zebrać komórki ponownie, wirując przy 4,100 x g przez pięć minut i przenieść je do oznakowanej dwumililitrowej probówki do mikrowirówki przy użyciu ręcznej wolnej pożywki.Odwiruj komórki przez kolejne dwie minuty. Ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach pożywki SC wolnej od dekstrozy i rozpocząć okres znakowania radioizotopowego, szybko dodając 500 mikrolitrów pożywki znakowanej radioaktywnie do każdej zawiesiny komórki. Inkubować probówki w inkubatorze obrotowym w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 20 minut.W międzyczasie wstępnie schłodzić wirówkę wyposażoną w 50-mililitrowe stożkowe probówki do minus 10 stopni Celsjusza i rozmrozić jedną 20-mililitrową porcję buforu hartującego. Po zakończeniu okresu znakowania radioaktywnego użyj pipety, aby zanurzyć całą jednomililitrową próbkę w rozmrożonym buforze hartowniczym na lodzie. Zebrać osad komórkowy, wirując we wstępnie schłodzonej wirówce o sile 5 000 x g przez trzy minuty i dodać 20 mililitrów świeżego buforu do hartowania na zimno.Odwirować i wstrząsnąć próbki, aby całkowicie zawiesić je w buforze hartowniczym i ponownie odwirować próbki w celu zebrania komórek. Po granulowaniu komórek należy dokładnie usunąć cały bufor gasnący z próbek, wylewając supernatant i usuwając nadmiar za pomocą pipety. Przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej obróbki.Odważyć 0,3 grama szklanych kulek przemytych kwasem dla każdej próbki i przechowywać je w dwóch mililitrowych probówkach do mikrowirówek na lodzie. Wyjmij granulki komórek z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni i umieść je na lodzie. Następnie dodaj 350 mikrolitrów metanolu i 700 mikrolitrów chloroformu do każdej próbki i ponownie zawieś komórki.Przenieś je do mikroprobówek wirówkowych zawierających wstępnie zważone szklane kulki. Lizować komórki, wirując trzykrotnie przez jedną minutę, z 30-sekundową inkubacją na lodzie między mieszaniami. Wlej komórki do szklanej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów i oznacz probówkę jako probówkę A. Umyj probówkę mikrowirówki jednym mililitrem metanolu, wymieszaj ją i wlej metanol do probówki A. Dodaj dwa mililitry chloroformu, a następnie 400 mikrolitrów wody do probówki A, aby uzyskać końcową objętość próbki 4,45 mililitra.Wirować próbki przez jedną minutę, a następnie odwirować przez pięć minut przy 1000 x g, aby wyraźnie oddzielić fazę wodną i organiczną z resztkami komórek leżącymi na granicy faz. Za pomocą szklanej pipety pastwiskowej zebrać fazę organiczną do nowej szklanej probówki wirówkowej oznaczonej B i dodać jeden mililitr jednego molowego chlorku potasu. Dodaj jeden mililitr metanolu i dwa mililitry chloroformu do probówki A i powtórz etapy wirowania i wirowania.Wirować i odwirować probówkę B w celu oddzielenia fazy wodnej i organicznej. Usuń górną warstwę wodną i zbierz całą dolną warstwę organiczną do czteromililitrowej szklanej fiolki. Całkowicie odparować rozpuszczalnik z ekstraktów lipidowych poprzez suszenie w gazie obojętnym i rozgrzać piekarnik do 145 stopni Celsjusza w celu podgrzania płytki TLC.Określić względne ilości znaku radioaktywnego pobranego przez komórki przed załadowaniem ich na płytkę TLC. Rozpuść lipidy próbki w 40 do 50 mikrolitrach chloroformu i metanolu zmieszanych w stosunku jeden do jednego, wirując przez pięć minut. Przygotować 101 mililitrów rozpuszczalnika fazy ruchomej w szklanym cylindrze z podziałką.Następnie wlej rozpuszczalnik do szklanej komory TLC zawierającej podkładkę nasycającą 20 na 20 TLC i szczelnie dopasowaną pokrywkę. Przygotuj kanałową płytkę z żelem krzemionkowym 60G o wymiarach 20 na 20 i zaznacz ołówkiem linię 1,5 centymetra nad dnem płytki. Gdy płyta zostanie wystarczająco podgrzana, a wkładka nasycająca TLC zostanie nasycona rozpuszczalnikiem, wyjmij płytkę TLC z piekarnika i natychmiast przystąp do jej ładowania.Za pomocą pipety narysuj pięć mikrolitrów próbki na początku każdego pasa znajdującego się 1,5 centymetra nad dnem płytki TLC i powtarzaj ładowanie, aż do włożenia od 20 do 40 mikrolitrów próbki na każdą ścieżkę. Po załadowaniu wzorca i próbek umieścić płytkę w komorze wywoływania i poczekać, aż rozpuszczalnik dotrze do górnej części płytki. Gdy płytka jest w pełni rozwinięta, wyjmij ją z komory i pozostaw do wyschnięcia w dygestorii przez 20 minut.Po wyschnięciu płytki przykryj ją folią z tworzywa sztucznego i umieść w kasecie wywołującej z ekranem autoradiograficznym. Wyjmij ekran z kasety wywoływania i umieść go w imagerze luminoforowym. Spryskaj płytkę TLC odczynnikiem p-aldehydu aniowego, aż krzemionka zostanie nasycona, a następnie piecz ją w piekarniku o temperaturze 145 stopni przez pięć minut lub do momentu, gdy pojawią się pasma.Aby określić ilościowo gatunki lipidów, należy zeskrobać żel krzemionkowy zawierający poszczególne gatunki lipidów i przenieść je do szklanych fiolek scyntylacyjnych. Dodaj sześć mililitrów płynu scyntylacyjnego i energicznie wiruj, aż pasmo krzemionki zostanie zredukowane na małe kawałki. Umieścić stojak z fiolkami scyntylacyjnymi w liczniku scyntylacyjnym i policzyć, dostosowując czas liczenia do dwóch minut na fiolkę.Obrazowanie luminoforowe pozwala na wizualizację autoradiogramu bezznacznikowych kwasów tłuszczowych, triacyloglicerolu, diacyloglicerolu, cholesterolu i skwalanu. Wykazano, że oczyszczone formy lipidów można w ten sposób oddzielić, a następnie uwidocznić poprzez spryskanie płytki TLC odczynnikiem p-aldehydu anżynowego. Wizualizowane gatunki obejmują wszystkie wcześniej wymienione lipidy oprócz sterylnych estrów.Stosując 10-minutowy okres pościgu w pożywkach wolnych od radioznacznika po pulsie, zaobserwowano, że w głównej puli skwalan zniknął, a całkowity cholesterol został podwyższony. Podobnie pojawienie się diacyloglicerolu w okresie pościgu korelowało ze spadkiem sygnału wolnych kwasów tłuszczowych. Przed wykonaniem pełnego protokołu ważne jest, aby ustalić, czy komórki będą przyjmować radioznacznik kwasu octowego w warunkach wzrostu i tle genetycznym będącym przedmiotem zainteresowania.

analysis-neutral-lipid-synthesis-saccharomyces-cerevisiae-metabolic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Opisujemy nową ilościową metodę lipidomiki służącą do identyfikacji licznych gatunków lipidów w drożdżach z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją przez elektroryś spray w trybie skanowania przeglądowego (ESI/MS). Metoda ta przewyższa obecnie dostępne metody identyfikacji i oznaczania ilościowego lipidów pod względem zdolności do rozdzielania różnych form cząsteczkowych lipidów, czułości oraz szybkości analizy.

Ilościowa ocena lipidomu drożdży z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową

Znakowanie izotopem 13C jest użyteczną techniką określania centralnego metabolizmu komórkowego dla różnych typów mikroorganizmów. Po hodowli komórek ze specyficznym znakowanym substratem, pomiar GC-MS może ujawnić funkcjonalne szlaki metaboliczne na podstawie unikalnych wzorów znakowania w aminokwasach proteinogennych.

Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych 15N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania wskaźnika kropelek lipidów (indeksu LD) w celu zbadania dynamiki triacylogliceroli w komórkach hodowanych w eksperymentach wysokoprzepustowych. Test wskaźnika LD jest łatwą i niezawodną metodą, która wykorzystuje BODIPY 493/503. Ten test nie wymaga jednorazowej ekstrakcji lipidów ani analizy mikroskopowej.

Oznaczanie indeksu lipidowego metodą odzyskiwania ciekłej fluorescencji w patogenie grzybowym Ustilago maydis

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Tutaj prezentujemy implementację MATLAB automatycznego wykrywania i ilościowego opisu kropelek lipidów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej rozszczepienia i pączkowania komórek drożdży.

Analiza zawartości kropelek lipidów w drożdżach rozszczepialnych i pączkujących przy użyciu zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Prezentujemy protokół wykorzystujący chromatografię cieczową w połączeniu z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji i ilościowego oznaczania głównych lipidów komórkowych u Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda ilościowej oceny głównych klas lipidów w komórce drożdży jest wszechstronna, solidna i czuła.

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem polipeptydów. Celem obecnego protokołu jest oznaczenie ich wszystkich, a następnie wizualizacja ich jako oddzielnych pasm.

Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Poznaj metodę ilościowej analizy syntezy lipidów neutralnych w Saccharomyces cerevisiae przy użyciu znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej. Protokół umożliwia badanie regulacji enzymów metabolizmu lipidów w różnych kontekstach genetycznych.

Analiza neutralnej syntezy lipidów w Saccharomyces cerevisiae za pomocą znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej (Wideo) | JoVE Journal

Analiza neutralnej syntezy lipidów w Saccharomyces cerevisiae za pomocą znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej

Przeglądaj więcej filmów