Name: Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj metodę wspólnej hodowli komórek glejaka z neuronami w celu badania migracji i interakcji komórkowych. System ten umożliwia precyzyjną analizę inwazyjności guzów mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole jest wspierany przez Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon jest stypendystą Szpitala Uniwersyteckiego w Tuluzie (CHU Toulouse).

Uzyskano świadomą pisemną zgodę od wszystkich pacjentów (ze Szpitala Haukeland, Bergen, Norwegia, zgodnie z lokalnymi przepisami komisji etyki). Protokół ten jest zgodny z wytycznymi komisji etycznych ds. badań na ludziach i zwierzętach Uniwersytetu w Bordeaux. Ciężarne szczury były trzymane i leczone w ośrodku dla zwierząt Uniwersytetu w Bordeaux. Eutanazja ciężarnej szczurzy, której podano dawkę E18, przeprowadzono przy użyciu CO2 . Wszystkie procedury na zwierzętach zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną. Wszystkie produkty komercyjne są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie wzorzystych slajdów
<ol>
	<li>Przygotowanie podłoża do mikromodelowania
	<ol>
		<li>Szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm należy poddawać aktywacji powietrzem/plazmą przez 5 minut. Umieścić szkiełka nakrywkowe w zamkniętej komorze ze 100 μl (3-aminopropylo)trietoksysilanu w eksykatorze na 1 godzinę.</li>
		<li>Inkubować ze 100 mg/ml walerianianu poli(glikolu etylenowego)-sukcynimidylu (masa cząsteczkowa 5 000 (Peg-SVA)) w 10 mM buforze węglanowym o pH > 8 przez 1 godzinę. Dokładnie spłukać ultraczystą wodą i wysuszyć pod kapturem chemicznym. 
		UWAGA: Na tym etapie próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C w ciemności do dalszego wykorzystania.</li>
		<li>Dodać fotoinicjator, chlorek 4-benzoilobenzylo-trimetyloamoniowy (PLPP), w stężeniu 14,7 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). 
		UWAGA: Można również stosować skoncentrowaną formę PLPP, żel PLPP. Powoduje to krótszy czas oświetlenia ultrafioletowego (UV) wymagany do degradacji szczotki PEG (100 mJ/mm2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie żelu fotoinicjatora
	<ol>
		<li>Przygotuj mieszaninę 3 μl żelu PLPP i 50 μl absolutnego etanolu do osadzenia na środku szkiełka. Umieścić próbkę pod osłoną chemiczną aż do całkowitego odparowania absolutnego etanolu. 
		UWAGA: Na tym etapie próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C w ciemności do dalszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikrowzory szkiełek szklanych
	<ol>
		<li>Zamontuj szkiełko nakrywkowe w komorze Ludina i umieść je na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu wyposażonym w system automatycznego ustawiania ostrości.</li>
		<li>Załaduj do oprogramowania obrazy odpowiadające przewidywanym mikrowzorcom. Zastosuj następujące parametry: replikacja 4 x 4 razy, odstęp 200 μm, dawka UV 1 000 mJ/mm2. Po automatycznej sekwencji oświetlenia UV spłucz PLPP wieloma płukaniami PBS. 
		UWAGA: Jeśli użyto żelu PLPP, usuń go przez obfite płukanie wodą dejonizowaną, wysusz w strumieniu N2 i przechowuj w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Inkubować z lamininą (50 μg/ml w PBS) przez 30 min. Dokładnie przemyć PBS. 
		UWAGA: Fluorescencyjny roztwór oczyszczonego białka zielonej fluorescencji (GFP, 10 μg/ml w PBS) można zmieszać z lamininą w celu wizualizacji mikrowzorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie neuronów i komórek GBM do wspólnej hodowli
<ol>
	<li>Hodowla embrionalnych neuronów hipokampa szczura
	<ol>
		<li>Rozciąć hipokamp zarodków (E18) szczurów i przenieść tkankę do roztworu soli Hanka (HBSS)/1 mM roztworu kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES)/penicyliny-streptomycyny w probówce o pojemności 15 ml. Usuń nadmiar roztworu bez wysuszania hipokampa.</li>
		<li>Dodać 5 ml trypsyny-etylenodiaminy, kwasu tetraoctowego (EDTA) uzupełnionego penicyliną (10 000 jednostek/ml)/streptomycyną (10 000 μg/ml) i 1 mM HEPS i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć 2x roztworem HBSS/HEPES/penicylina-streptomycyna i pozostawić tkankę w tym roztworze przez 2-3 minuty.</li>
		<li>Oddziel tkankę za pomocą dwóch wypolerowanych płomieniowo pipet Pasteura, pipetując w górę i w dół 10 razy każdą tkanką, uważając, aby zminimalizować pienienie. Policz komórki i oceń żywotność zawiesiny komórek. Umieść neurony na mikrowzorzystych szkiełkach nakrywkowych, jak pokazano poniżej. 
		UWAGA: Wskaźnik żywotności komórek wynosi 85-90% po ekstrakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórkowa neuronów na mikrowzorzystych szkiełkach nakrywkowych
	<ol>
		<li>Ponownie uwodnić szkiełka z mikrowzorem za pomocą PBS i inkubować kompletną pożywkę do hodowli komórek neuronalnych.</li>
		<li>Wysiewaj neurony hipokampa uzyskane od szczurów E18 Sprague-Dawley bezpośrednio nad szkiełkiem nakrywkowym z mikrowzorem o gęstości 50 000 komórek nacm2 w podłożu neurobazalnym (NBM) wzbogaconym o 3% surowicę końską. Umieść neurony z mikrowzorem w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) przez 48 godzin 
		UWAGA: Po ~6 godzinach można zauważyć pierwotne neurony hipokampa przylegające do mikrowzorów lamininy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wspólna hodowla ludzkich komórek macierzystych podobnych do GBM na neuronach 
	UWAGA: W tym badaniu błonowe komórki GBM GFP-dodatnie i pochodzące od pacjentów z pomidorami jądrowymi były hodowane zgodnie z poprzednio opublikowanymi protokołami10.
	<ol>
		<li>Gdy komórki w kształcie sferoidy rosną w zawiesinie, odwirować zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 200 × g. Przemyć sferoidy 5 ml PBS i inkubować komórki z 0,5 ml odczynnika do dysocjacji komórek (patrz Tabela Materiałów) przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodaj 4,5 ml kompletnego NBM (uzupełnionego suplementem witaminy B27, heparyną, czynnikiem wzrostu fibroblastów 2, penicyliną i streptomycyną, jak opisano wcześniej8) i policz komórki za pomocą techniki automatycznego liczenia.</li>
		<li>Wysiewaj 1,000 komórek GBM na mikrowzorzystej kulturze neuronalnej w NBM wzbogaconym o 3% surowicę końską. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie żywych komórek
<ol>
	<li>Bezpośrednio po wysianiu komórek GBM należy umieścić próbkę na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w komorę termostatyczną. Wykonuj obrazowanie żywych komórek na mikroskopie wyposażonym w zmotoryzowany stolik do rejestrowania wielu pozycji za pomocą wielowymiarowego zestawu narzędzi do akwizycji w oprogramowaniu. Wykonuj obrazy w jasnym polu i epifluorescencji GFP/Tomato co 5 minut przez 12 godzin za pomocą obiektywu 20x w środowisku o kontrolowanej temperaturze (37 °C) i gazie (5%CO2).</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
UWAGA: Korzystając z Fidżi, dwuwymiarowy (2D) stos obrazów został półautomatycznie przetworzony lub przetworzony za pomocą domowego i przyjaznego dla użytkownika narzędzia (dostępnego pod tym adresem: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), które jest napisane w języku makr IJ1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Zautomatyzowany przepływ pracy i procedury są podsumowane w Rysunek 2B.
<ol>
	<li>Analiza sieci neuronalnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2Bi)
	<ol>
		<li>Zaznacz jeden obraz stosu. Kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie Sieć, aby otworzyć odpowiednie okno dialogowe Opcje i dostosować ustawienia (np. Próg = Trójkąt, Li, Huang..., Rozmycie gaussowskie i Mediana filtrów = 1, 2, 3...), aby uzyskać precyzyjną segmentację obrazów. Następnie kliknij OK.</li>
		<li>Kliknij lewym przyciskiem myszy narzędzie Sieć, aby automatycznie aktywować następującą procedurę.
		<ol>
			<li>Zduplikuj zaznaczony obraz i podziel go na trzy kanały kolorów (czerwony-szary-zielony).</li>
			<li>Wybierz kanał szarości (jasne pole) i wykonaj wzmocnienie rozciągnięcia kontrastu (CSE), aby zwiększyć separację między różnymi obszarami. Użyj detektora krawędzi Sobel (SED), aby wykonać operację przetwarzania sygnału 2D konwolucji, która jest już zgrupowana w poleceniu Znajdź krawędź.</li>
			<li>W przypadku podwójnego filtrowania (F) zastosuj filtr rozmycia gaussowskiego i mediany, aby zredukować szum i wygładzić sygnał obiektu. Konwertuj na maskę (CM), wykonując dostosowane algorytmy progowe, aby uzyskać obraz binarny (BIN-szary) z czarnymi pikselami (obszar komórki) i białymi pikselami (tło). Szkieletyzuj (Sk) obszar komórki w prostą sieć (NET) i filtruj cząstki (EP) w obrazie NET, usuwając małe, niepołączone w sieć cząstki.</li>
			<li>W przypadku kanałów czerwonych i zielonych (jądro i błona) wykonaj podwójne filtrowanie, przekonwertuj na Maskę przy użyciu dostosowanej metody progowania i pozwól BIN-green określić morfologię komórki za pomocą polecenia Analizuj cząstki.</li>
			<li>Scal wszystkie kanały, używając ich obszaru zainteresowania (ROI) z operatorem OR (połącz) i ponownie dostosuj ich początkowy kolor do prostego obrazu RGB.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza ruchliwości pojedynczej komórki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2Bii)
	<ol>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie Śledzenie pojedynczej komórki, aby otworzyć odpowiednie okno dialogowe Opcje i dostosuj ustawienia (np. Typ ścieżki = Jądro lub Membrana, Próg = Trójkąt, Li, Huang..., Projekcja Z = Maksymalna intensywność, Suma wycinków..., Rozmycie gaussowskie i Filtry mediany = 1, 2, 3...), aby uzyskać precyzyjną segmentację obrazów. Następnie kliknij OK.</li>
		<li>Kliknij lewym przyciskiem myszy narzędzie do śledzenia pojedynczych komórek, aby automatycznie aktywować następującą procedurę.
		<ol>
			<li>Usuń szary kanał. Zastosuj rzut Z na stosie, który wygeneruje obraz odpowiadający stosowi obrazów zgodnie z czasem (T-stack). Dwukrotnie przefiltruj i przekonwertuj na Maskuj ślady pozostawione przez komórki. Usuń małe cząstki z czerwonego/zielonego obrazu BIN.</li>
			<li>Korzystając z ROI, zaznacz każdy kontur śladu komórki i zaznacz pole wyboru Pomiń wykrywanie krawędzi w oknie dialogowym Opcje, aby pominąć ten krok przetwarzania wstępnego dla kolejnych kroków.</li>
			<li>Wyizoluj kanał czerwony (typ śladu = jądro) na oryginalnym stosie. Wybierz jeden zwrot z inwestycji i usuń obszar zewnętrzny. Dwukrotnie przefiltruj wszystkie obrazy i przekonwertuj je na maskę (BIN-czerwony). Określ położenie środka ciężkości X/Y każdego binaryzowanego jądra.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Korzystając z już opublikowanego makra dla arkusza kalkulacyjnego software13, oblicz średnie przemieszczenie kwadratowe, współczynnik kierunkowości i średnią prędkość dla tej komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza śledzenia wielu komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2Biii)
	<ol>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie Śledzenie, aby otworzyć odpowiednie okno dialogowe Opcje i dostosować ustawienia (np. Próg = Trójkąt, Li, Huang..., Rozmycie gaussowskie i Mediana filtrów = 1, 2, 3...), aby uzyskać precyzyjną segmentację obrazów. Następnie kliknij OK.</li>
		<li>Kliknij lewym przyciskiem myszy narzędzie do śledzenia, aby automatycznie aktywować następującą procedurę.
		<ol>
			<li>Usuń szary kanał.</li>
			<li>Podziel kanały czerwony i zielony, podwójnie przefiltruj i przekonwertuj na maskę.</li>
			<li>Połącz kanały za pomocą polecenia Image Calculator... z operatorem AND, pozostawiając tylko sygnał jądra znajdujący się w membranach. 
			UWAGA: Kilka wtyczek na Fidżi może być używanych do określania pozycji X/Y kilku komórek w tym binarnym, wstępnie przetworzonym obrazie w tym samym czasie (patrz Tabela materiałów).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Korzystając z wcześniej opisanego makro13, oblicz wykres trajektorii, średnie przemieszczenie kwadratowe, współczynnik kierunkowości i średnią prędkość dla tych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Migracja sferoidów na macie neuronowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2Biv)
	<ol>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie Migracja, aby otworzyć odpowiednie okno dialogowe Opcje i dostosować ustawienia (np. Próg = Trójkąt, Li, Huang..., Rozmycie gaussowskie i Mediana filtrów = 1, 2, 3...), aby uzyskać precyzyjną segmentację obrazów. Następnie kliknij OK.</li>
		<li>Kliknij lewym przyciskiem myszy narzędzie do migracji, aby automatycznie aktywować następującą procedurę.
		<ol>
			<li>Usuń czerwony kanał.</li>
			<li>Podziel kanały zielony i szary.</li>
			<li>W przypadku kanału szarego narysuj ręcznie kontur maty neuronalnej i zmierz jej powierzchnię.</li>
			<li>W przypadku kanału zielonego przefiltruj stos dwukrotnie i przekonwertuj go na maskę. Usuń obszar poza wzorcem (BIN) i określ binaryzowany obszar komórki dla każdego obrazu. 
			UWAGA: Parametry opisane powyżej kalibruje się poprzez zmianę ich wartości poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy na interesującą nas ikonę. To przetwarzanie można wykonać ręcznie. Jednak w przypadku dużej liczby obrazów (około stu na akwizycję), kanałów (zwykle 3 kanały) i etapów przetwarzania preferowane byłoby narzędzie zautomatyzowane lub półautomatyczne.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li>
<li>Scherer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forms+of+growth+in+gliomas+and+their+practical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The forms of growth in gliomas and their practical significance.</a> Brain. 63, 1-35 (1940).</li>
<li>Zagzag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+stromal+cell-derived+factor-1%CE%B1%2FCXCR4+expression+in+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas.</a> American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573, 532-538 (2019).</li>
<li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573, 539-545 (2019).</li>
<li>Boyé, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Gritsenko, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li>
<li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li>
<li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiprotein+Printing+by+Light%3FInduced+Molecular+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li>
<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li>
<li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li>
<li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li>
<li>Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Advance+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519(2020).</li>
<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+the+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li>
<li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li>
<li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li>
<li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Glejaki intensywnie atakują miąższ za pomocą różnych trybów: kooptacji otaczających naczyń krwionośnych, inwazji śródmiąższowej lub inwazji na WMT18. Ten ostatni tryb nie jest dobrze scharakteryzowany w literaturze ze względu na trudności w znalezieniu odpowiednich modeli in vitro lub in vivo związanych z inwazją WMT. W tym przypadku zaproponowano uproszczony model, w którym hodowane neurony gryzoni wzorowano na powierzchniach pokrytych lamininą, a fluorescencyjne komórki macierz...

Pierwotne złośliwe glejaki, w tym GBM, są wyniszczającymi nowotworami, ze średnim wskaźnikiem przeżycia od 12 do 15 miesięcy zgłaszanym u pacjentów z GBM. Obecna terapia opiera się na resekcji dużej masy guza i chemioterapii w połączeniu z radioterapią, co wydłuża wskaźnik przeżycia tylko o kilka miesięcy. Niepowodzenia terapeutyczne są ściśle związane ze słabym dostarczaniem leków przez barierę krew-mózg (BBB) oraz z inwazyjnym wzrostem w przestrzeniach okołonaczyniowych, oponach mózgowych i wzdłuż WMTs1. Inwazja okołonaczyniowa, zwana również kooptacją naczyniową, jest dobrze zbadanym procesem, a mechanizmy molekularne zaczynają być wyjaśniane; jednak proces inwazji komórek GBM wzdłuż WMT nie jest dobrze poznany. Komórki nowotworowe migrują do zdrowego mózgu wzdłuż drugorzędowych struktur Scherera2. Rzeczywiście, prawie sto lat temu Hans-Joachim Scherer opisał inwazyjne drogi GBM, które są obecnie określane jako satellitoza okołoneuronalna, satelltoza okołonaczyniowa, rozprzestrzenianie się subpialne i inwazja wzdłuż WMT (ryc. 1A).
Niektóre chemokiny i ich receptory, takie jak czynnik 1α pochodzenia komórek zrębu (SDF1α) i receptor chemokiny z motywem C-X-C 4 (CXCR4), ale nie czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), wydają się być związane z inwazją WMT3. Ostatnio wykazano, że transkomórkowa oś NOTCH1-SOX2 jest ważną ścieżką w inwazji WMT na komórki GBM4. Autorzy opisali, w jaki sposób komórki macierzyste GBM atakują miąższ mózgu na częściowo niezmielinizowanych neuronach, co sugeruje niszczenie osłonek mielinowych przez komórki GBM. Kamień milowy został osiągnięty w 2019 roku, kiedy to w czasopiśmie Nature opublikowano kolejno trzy artykuły, podkreślające rolę aktywności elektrycznej w rozwoju glejaka5,6. Przełomowe prace Monje i współpracowników rzucają światło na kluczową rolę aktywności elektrycznej w wydzielaniu neuroliginy-3, która sprzyja rozwojowi glejaka.
Winkler i współpracownicy opisali połączenia między komórkami GBM (mikrorurkami) jako kluczowe w etapach inwazyjnych, a ostatnio interakcje między komórkami GBM a neuronami za pośrednictwem nowo opisanych synaps glejaka. Struktury te sprzyjają glutaminergicznemu stymulowaniu receptorów kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego (AMPA) zlokalizowanych na błonie komórkowej GBM, co sprzyja rozwojowi i inwazji guza. Inwazja komórek nowotworowych jest centralnym procesem w rozprzestrzenianiu się przerzutów lub odległych ognisk wtórnych, obserwowanych u pacjentów z GBM. Zidentyfikowano kilka czynników ważnych w inwazji GBM, takich jak trombospondyna-1, transformujący czynnik wzrostu beta (białko matrikomórkowe regulowane przez TGFβ lub receptor chemokiny CXCR3)7,8.
Tutaj opisano uproszczony model biomimetyczny do badania inwazji GBM, w którym neurony są wzorowane na ścieżkach lamininy, a komórki GBM są na niej zasiewane, jako pojedyncze komórki lub jako sferoidy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Dwa eksperymentalne ustawienia mają na celu rekapitulację inwazji na neurony, którą obserwuje się w GBM9,10,11. Takie modele zostały opracowane w przeszłości jako wyrównane biomateriały z nanowłókien (elektroprzędzenie rdzeń-powłoka), które umożliwiają badanie migracji komórek poprzez modulację właściwości mechanicznych lub chemicznych12. Model kokultury opisany w tym artykule pozwala lepiej zrozumieć, w jaki sposób komórki GBM uciekają z neuronów, definiując nowe szlaki molekularne zaangażowane w ten proces.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropylo)trietoksysilan</td><td>Sigma</td><td>440140-100ML</td><td>Grupa aminowa jest przydatna do biokoniugacji mPEG-SVA</td></tr><tr><td>96-dołkowej płytki okrągłodennej</td><td>Sarstedt</td><td>2582624</td><td>Służy do przygotowania sferoid</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 &deg; C (długoterminowe) lub 4 &deg; C (krótkotrwały), enzym dysocjacji sferycznej</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 & deg; C, rozmrozić przed użyciem</td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 & deg; C, rozmrozić przed użyciem</td></tr><tr><td>Countess Cell Counting ChamberSlides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Służy do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Marienfeld</td><td>111580</td><td>Podłoże do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Wkłady eksykatora</td><td>Sigma</td><td>Z363456-6EA</td><td>Służy do redukcji mchusty podczas obróbki (3-aminopropylo) trietoksysilanu</td></tr><tr><td>DPBS 10x</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>Przechowywany w 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Fidżi, MTrack2 makro</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Służy do analizy zdjęć</td></tr><tr><td>Kolba 75 cm&sup2;</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Laminin</td><td></td><td>114956-81-9</td><td>Wspomaga adhezję neuronów</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> Leonardo <td>ładowanie przewidywanych mikrowzorów</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MetaMorph&nbsp;</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>NA Oprogramowanie</td><td>do automatyzacji mikroskopii</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>Rozcieńczony w NBM dla 2% stężenia końcowego</td></tr><tr><td>Pożywka neurobazalna</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0,75 NA)</td><td></td><td></td>mikroskop <td>odwrócony wyposażony w zmotoryzowany stolik&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina - Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>PLPP</td><td>Alveole</td><td>PLPPclassic_1ml</td><td>Fotoinicjator stosowany do degradacji szczotki PEG</td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy)-Walerianian sukcynimidylu (mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio</td><td>VA-PEG-VA-5000-5g</td><td>Stosowany jako powłoka przeciwporostowa</td></tr><tr><td>PRIMO</td><td>Alveole</td><td>PRIMO1</td><td>Cyfrowy aparat projekcyjny UV na bazie mikrolustra (DMD)</td></tr><tr><td>Trypan niebieski 0,4%</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>Służy do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td>Służy do odłączania przylegających komórek</td></tr></tbody></table>

wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Glejaki (GBM), glejaki złośliwe IV stopnia, są jednym z najbardziej śmiertelnych typów raka u ludzi ze względu na ich agresywne cechy. Pomimo znacznych postępów w genetyce tych nowotworów, sposób, w jaki komórki GBM atakują zdrowy miąższ mózgu, nie jest dobrze poznany. W szczególności wykazano, że komórki GBM atakują przestrzeń okołonowotworową różnymi drogami; Głównym przedmiotem zainteresowania niniejszej pracy jest trasa wzdłuż szlaków istoty białej (WMT). Interakcje komórek nowotworowych ze składnikami okołonowotworowych komórek nerwowych nie są dobrze scharakteryzowane. W niniejszym artykule opisano metodę, która ocenia wpływ neuronów na inwazję komórek GBM. W artykule przedstawiono zaawansowany test kohodowli in vitro, który naśladuje inwazję WMT, analizując migrację komórek macierzystych GBM na neurony. Zachowanie komórek GBM w obecności neuronów jest monitorowane za pomocą zautomatyzowanej procedury śledzenia za pomocą oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym i bezpłatnym dostępie. Metoda ta jest przydatna w wielu zastosowaniach, w szczególności w badaniach funkcjonalnych i mechanistycznych, a także do analizy wpływu środków farmakologicznych, które mogą blokować migrację komórek GBM na neurony.

Uzorowane neurony współhodowane z fluorescencyjnymi komórkami GBM przygotowano zgodnie z opisem w sekcji protokołu, a następnie przeprowadzono eksperymenty z monitorowaniem ruchu. Komórki GBM szybko zmieniały swój kształt podczas migracji na neuronach (Rycina 1B: panel 6 oraz Wideo 1). Komórki migrowały wzdłuż wypustek neuronalnych w ruchu chaotycznym (Wideo 1). Fluorescencyjne komórki GBM i niefluorescencyjne neurony można łatwo od siebie o...

Tutaj prezentujemy łatwy w użyciu test do analizy migracji glejaka (GBM) na neuronach o wzorcach. Opracowaliśmy makro w oprogramowaniu FiJi do łatwego ilościowego określania migracji komórek GBM na neuronach i zaobserwowaliśmy, że neurony modyfikują zdolność inwazyjną komórek GBM.

Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Glejaki to wyniszczające guzy mózgu o wysokim profilu inwazyjnym. Ten system kohodowli naśladuje migrację komórek glejaka na neurony, aby podsumować jedną z inwazyjnych tras obserwowanych u pacjentów. Geometria i skład naszego modelu współkultur jest precyzyjnie kontrolowana.Ułatwia to lepszą odtwarzalność, a także prostą kwantyfikację złożonych procesów biologicznych. Metodę tę można dostosować do diagnozy klinicznej poprzez kohodowlę świeżo zdysocjowanych komórek glejaka i neuronów. Określa indeks kliniczny, który jest bardzo ważny jako wynik kliniczny.Nasza metoda może być również wykorzystana do ilościowego oznaczania innych migrujących komórek, takich jak fibroblasty lub komórki odpornościowe. Procedurę zademonstruje Joris Guyon, doktorant z mojego zespołu. Aby przygotować podłoże do mikrowzorów, należy traktować 18-milimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe aktywacją powietrzną lub plazmową przez pięć minut przed umieszczeniem szkiełek nakrywkowych w eksykatorze ze 100 mikrolitrami trietoksysilanu przez jedną godzinę, a następnie inkubować roztwór PEG-SVA w stężeniu 100 miligramów na mililitr przez jedną godzinę.W przypadku osadzania żelu, pod koniec inkubacji, dodaj trzy mikrol

co-culture-glioblastoma-stem-like-cells-on-patterned-neurons-to-study

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Ten film opisuje test wspólnej hodowli komórek glejaka na mikrowzorcach neuronów, które naśladują inwazję mielinowanych dróg neuronowych przez komórki macierzyste glejaka podczas migracji na neurony w przestrzeniach okołonowotworowych. Ten test może pomóc w analizie wpływu leków farmakologicznych, które hamują migrację komórek glejaka na neurony w glejaku.

Współhodowla komórek glejaka na neuronach wzorcowych: technika monitorowania migracji komórek glejaka na neuronach hipokampa szczura in vitro

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Obecne modele ex vivo glejaka (GBM) nie są zoptymalizowane pod kątem fizjologicznie istotnych badań nad inwazją nowotworów u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i utrzymywania organotypowych kultur warstwowych ze świeżej tkanki ludzkiej GBM. Przedstawiono opis technik mikroskopii poklatkowej i ilościowej analizy migracji komórek.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

Zrozumienie złośliwego zachowania raka wymaga stworzenia dokładnych modeli interakcji komórek nowotworowych z elementami mikrośrodowiska guza, takimi jak makrofagi. W tym miejscu opisujemy dwie metody badania interakcji komórek glejaka z makrofagami związanymi z nowotworem i mikroglejem, w których oceniany jest wpływ na inwazję glejaka.

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Tutaj prezentujemy system mieszanych hodowli jednowarstwowych ex-vivo do badania migracji ludzkich komórek glejaka (hGC) w czasie rzeczywistym. Model ten zapewnia możliwość obserwowania interakcji między hGC a aksonami mielinizowanymi i niemielinizowanymi w obrębie komory z przedziałami.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek ludzkiego glejaka w kokulturach aksonów i oligodendrocytów w zwoju korzenia grzbietowego

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Poznaj metodę wspólnej hodowli komórek glejaka z neuronami w celu badania migracji i interakcji komórkowych. System ten umożliwia precyzyjną analizę inwazyjności guzów mózgu.

Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych (Wideo) | JoVE Journal

Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych

Przeglądaj więcej filmów