Name: Podwójne znakowanie immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał tego samego gatunku do badania interakcji gospodarz-patogen (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj protokół podwójnego znakowania immunofluorescencji przeciwciałami z tego samego gatunku do badania interakcji gospodarz-patogen z użyciem komórek LLC-MK2 zakażonych Trypanosoma cruzi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) do MMAB, przez Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA dla MMAB oraz przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brazylia (CAPES) - kod finansowy 001. CG-C otrzymał stypendium magisterskie i doktoranckie od CAPES, a LAMT-S otrzymał stypendium doktoranckie od CNPq. Dziękujemy Elizabete R. Milani za pomoc w mikroskopii konfokalnej i dr Dario Zamboni za dostarczenie komórek LLC-MK2 (Ribeirao Preto Medical School, USP).

1. Hodowle komórek i pasożytów
<ol>
	<li>Hoduj komórki LLC-MK2 (nabłonek nerki małpy rezus) z American Type Culture Collection (CCL-7) w kolbie do hodowli komórkowych o średnicy 25 cm2 zawierającej pożywkę RPMI uzupełnioną 10% inaktywowaną termicznie FBS (płodową surowicę bydlęcą) i antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 17.</li>
	<li>Zainfekuj komórki LLC-MK2 Trypanosoma cruzi (szczep Y) zgodnie z poprzednim protokołem 18.</li>
	<li>Zebrać supernatant zakażonych komórek LLC-MK2 (5 ml) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml do hodowli komórkowych i wirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 22 °C w celu obniżenia resztek komórek. Utrzymywać probówkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C, aby trypomastigoty mogły dopłynąć do supernatantu.</li>
	<li>Zebrać supernatant do nowej stożkowej probówki i odwirować przy 2500 x g przez 15 minut w temperaturze 22 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający pasożyty w kompletnym podłożu RPMI w celu określenia gęstości komórek poprzez zliczenie komórek w komorze Neubauera.</li>
</ol>
2. Protokół kontroli immunofluorescencji
UWAGA: Po utrwaleniu, możliwe jest przechowywanie płytek zawierających szkiełka nakrywkowe w temperaturze 4 °C w 1x PBS (pH 7,2) przez jeden tydzień. Aby można je było przechowywać, ważne jest, aby komórki nie przeszły etapu przepuszczalności.
<ol>
	<li>Umieść ogniwa LLC-MK2 (2 x 104) w 24-dołkowych płytkach zawierających zaokrąglone szkiełka nakrywkowe sterylizowane promieniami UV w pożywkach RPMI przez 16 godzin.</li>
	<li>W przypadku zakażonych komórek dodać supernatant zawierający T. cruzi (pozycja 1.4) do każdej studzienki proporcjonalnie (MOI 10:1) i pozostawić na 6 godzin infekcji. Przemyć szkiełka nakrywkowe zawierające zakażone i niezakażone komórki pięciokrotnie roztworem PBS i utrwalić 2% paraformaldehydem w 1x PBS (pH 7,2) przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS (pH 7,2).</li>
	<li>Przepuszczalność szkiełek nakrywkowych za pomocą 0,2% IGEPAL CA-630 w 1x PBS (PH 7,2) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym (2% BSA w 1x PBS, pH 7,2).</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej z mysimi monoklonalnymi przeciwciałami anty-hnRNPA1 (rozcieńczenie 1:200) lub z mysimi poliklonalnymi przeciwciałami anty-TcFAZ (rozcieńczenie 1:100) rozcieńczonymi w roztworze blokującym.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej z kozim anty-mysimi IgG F (ab')2 (H + L) sprzężonymi z Alexa Fluor 488 (1:600) wraz z falloidyną skoniugowaną z Alexa 594 (1:300) w celu wybarwienia włókien aktyny (F-aktyny) w komórce gospodarza rozcieńczonej w roztworze blokującym.</li>
	<li>Umyj trzy razy 1x PBS (pH 7,2) przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Nanieś niewielką ilość odczynnika montażowego zapobiegającego blaknięciu ProLong Gold z podłożem DAPI na powierzchnię szkiełka.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków delikatnie przechyl szkiełko nakrywkowe w podłożu montażowym, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Po wyschnięciu w razie potrzeby uszczelnij szkiełko nakrywkowe.</li>
</ol>
3. Podwójne znakowanie protokołu immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych wyhodowanych na tym samym gospodarzu
<ol>
	<li>Powtórz kroki od 2.1 do 2.6 opisane powyżej.</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe zawierające zakażone i niezakażone komórki z własnym mysim przeciwciałem poliklonalnym anty-TcFAZ (1:100) rozcieńczonym w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej z kozimi anty-mysimi IgG F (ab')2 (H+L) sprzężonymi z Alexa Fluor 647 (1:600) rozcieńczonymi w roztworze blokującym.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Drugi etap blokowania należy wykonać za pomocą AffiniPure króliczej przeciw mysim IgG (H+L) rozcieńczonej (0,12 mg/ml) w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy 1x PBS (pH 7,2) przez 5 minut każde. Następnie inkubować z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-hnRNP A1 IgG2b (1:200) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut z kozim przeciwciałem anty-mysim IgG2b sprzężonym z Alexa Fluor 488 (1:600) i z falloidyną sprzężoną z Alexa 594 (1:300) rozcieńczonym w roztworze blokującym.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Powtórz kroki od 2.8 do 2.10 opisane powyżej.</li>
</ol>
4. Protokół immunofluorescencji potrójnego znakowania z dodatkiem trzeciego przeciwciała poliklonalnego od różnych gatunków gospodarzy
UWAGA: Dla dodatkowego oznakowania, zwróć uwagę na podklasy IgG, izotypy przeciwciał i postępuj zgodnie z kolejnością przeciwciał: 1. mysie poliklonalne, 2. królicze poliklonalne, 3. drugi blok i 4. mysie monoklonalne. Weź pod uwagę rodzaj laserów dostępnych w mikroskopie konfokalnym, aby wybrać właściwe przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem.
<ol>
	<li>Powtórz kroki od 2.1 do 2.6 opisane powyżej.</li>
	<li>Po krokach od 3,2 do 3,5 (etap mycia) rozpocząć nową inkubację z króliczym przeciwciałem poliklonalnym w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy 1x PBS (pH 7,2) przez 5 minut każde.</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe z kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG sprzężonym z Alexa 647 (1:600) w roztworze blokującym przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Wykonać etap blokowania za pomocą AffiniPure króliczej przeciw mysim IgG (H+L) rozcieńczonej (0,12 mg/ml) w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1x PBS (pH 7,2) przez 5 minut każdy i inkubować z dowolnym mysim przeciwciałem monoklonalnym podklasy IgG rozcieńczonym w roztworze blokującym przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut ze specyficzną parą kozich przeciwciał anty-mysich podklasy IgG sprzężonych z Alexa 594 (1:600) w roztworze blokującym przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.</li>
</ol>
5. Akwizycja obrazowania konfokalnego
<ol>
	<li>Analizuj próbki immunofluorescencyjne za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem zanurzeniowym 63X i wykrywaj fluorescencję za pomocą lampy fotopowielacza (PMT) i detektora hybrydowego (HyD). 
	UWAGA: Użyliśmy konfiguracji z Laboratorium Mikroskopii Konfokalnej dla wielu użytkowników - LMMC, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo.</li>
	<li>Uchwyć wszystkie obrazy konfokalne z oddzielnymi kanałami. Wykonaj przetwarzanie obrazu za pomocą programu Adobe Photoshop.</li>
</ol>

<ol><li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li>
<li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions%3A+basic+concepts+of+microbial+commensalism%2C+colonization%2C+infection%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li>
<li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585(2015).</li>
<li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li>
<li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+natural+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li>
<li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551(2015).</li>
<li>Tóth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545(2007).</li>
<li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243(2006).</li>
<li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143(2005).</li>
<li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67(2004).</li>
<li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197(1999).</li>
<li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331(1996).</li>
<li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47(1985).</li>
<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li>
<li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. dS., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreira%2C+BP+%22Microscopy+and+Imaging+Science%3A+Practical+Approaches+to+Applied+Research+and+Education%22">Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education</a>. Méndez-Vilas, A. 7, 374-378 (2016).</li>
<li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1%2C+LLC-MK2%2C+and+LLC-MK2+%28NCTC-3196%29+and+their+utility+in+virus+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li>
<li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Mem%C3%B3rias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li>
<li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+Trypanosoma+cruzi%3A+Host+Cell+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394(2010).</li>
<li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li>
<li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li>
<li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li>
<li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li>
<li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hnRNP+A1%3A+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li>
<li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+subclasses+and+allotypes%3A+from+structure+to+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520(2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych lub finansowych interesów.

W tym miejscu przedstawiamy protokół wykonywania podwójnego znakowania immunologicznego w komórkach zakażonych Trypanosoma cruzi przy użyciu dwóch różnych przeciwciał od tego samego gatunku gospodarza. Aby bardziej szczegółowo zbadać implikacje infekcji, struktury w komórce gospodarza, takie jak jądro lub organelle cytozolowe, można oznaczyć za pomocą tego protokołu. Może być również stosowany w metodzie znakowania cienkich sekcji immunogold po osadzeniu. Takie podejście pomaga przezwyciężyć przeszkodę polegając...

Badanie interakcji patogenu z komórką gospodarza na poziomie komórkowym dostarcza istotnych informacji na temat przyczyn leżących u podstaw choroby, ponieważ różne grupy, takie jak wirusy, bakterie i pierwotniaki, mogą infekować większość typów komórek gospodarza1,2,3,4. Może również pomóc w opracowaniu i identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych, które mogą spowolnić lub zahamować wzrost patogenu. W warunkach życia wytworzone przeciwciała są odpowiedzialne za rozpoznawanie własnych składników, antygenów wirusów, składników lub produktów bakteryjnych, grzybów, pasożytów i innych5.
Do tego celu, przeciwciała są powszechnie używanymi narzędziami, głównie do zrozumienia lokalizacji i funkcji struktur komórkowych i białek. Kilka badań wykorzystujących wielokrotne znakowanie przeciwciał pokazuje, że dodatkowe etapy blokowania przyczyniają się do swoistości immunolokalizacji. Ponadto większość opisanych protokołów wykorzystuje specyficzne komercyjne przeciwciała monoklonalne, w tym przeciwciała tego samego gatunku gospodarza6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Zazwyczaj, podwójne znakowanie immunofluorescencji wykorzystuje dwa przeciwciała wyhodowane w różnych gatunkach do barwienia interesujących struktur komórkowych lub patogenów i komórek gospodarza, aby zobaczyć interakcję między nimi. Może to jednak stanowić problem, gdy nie są dostępne komercyjne przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne specyficzne dla niektórych patogenów, które mogłyby przeprowadzić podwójne znakowanie. Istnieją również dostępne na rynku zestawy do koniugacji przeciwciał i możliwe jest koniugowanie pierwotnych przeciwciał bezpośrednio z fluoroforem za pomocą reakcji estru sukcynimidylu15. Problem polega na tym, że zestawy te są często drogie i konieczne jest posiadanie wystarczającej ilości przeciwciał, aby je oznaczyć. Wiedząc o tym, z powodzeniem opracowaliśmy metodę podwójnej immunofluorescencji przy użyciu dwóch różnych przeciwciał wyhodowanych u tego samego gatunku w celu zbadania lokalizacji białka w Trypanosoma brucei16. Jednak w przypadku pasożytów wewnątrzkomórkowych, w tym Trypanosoma cruzi, podejście to nie zostało wykazane. Tutaj pokazujemy, jak przeprowadzić immunofluorescencję podwójnego znakowania w celu zbadania wewnątrzkomórkowych pasożytów T. cruzi i komórki gospodarza przy użyciu pierwotnych przeciwciał wyhodowanych u tego samego gatunku bez reakcji krzyżowych. Oprócz tej metody ustalono potrójne znakowanie immunofluorescencyjne z dodatkiem trzeciego przeciwciała innego gatunku. Podejścia te pomagają, gdy źródło przeciwciał jest ograniczone i mogą być stosowane w każdym typie komórek.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 - Przeciwciało IgG2b</td><td>Life technologies, USA</td><td>A21141</td><td>Kozioł anty-mysi</td></tr><tr><td>AffiniPure Rabbit anty-mysie IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch, USA</td><td>315-005-003</td><td>Przeciwciało anty-mysie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 - Przeciwciało IgG F (ab')2 (H+L)</td><td>Life technologies, USA</td><td>A11017</td><td>Kozioł anty mysz</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Przeciwciało IgG1</td><td>Life technologies, USA</td><td>A21125</td><td>Kozioł anty-mysie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 - Przeciwciało IgG F (ab')2 (H+L)</td><td>Life technologies, USA</td><td>A21237</td><td>Koza anty-mysie</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-hnRNPA1 IgG2b</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>R4528</td><td>Mysie przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-TcFAZ (białko T. cruzi FAZ)</td><td>Nasze laboratorium</td><td></td><td>Własne przeciwciało mysie</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A2153-10G</td><td>Detergent białkowy albuminowy</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>I3021</td><td>Niejonowy detergent</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td><td>12657-029</td><td>Surowica</td></tr><tr><td>penicylina Streptomycyna</td><td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td><td>15140-122</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td><td>Life technologies, USA</td><td>A12381</td><td>Marker aktynowy</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade z technologiami DAPI</td><td>Life, USA</td><td>P36935</td><td>Odczynnik do podłoża montażowego</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1X z L-glutaminą</td><td>Corning, USA</td><td>10-040-CV</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T4049-100ML</td><td>Bioreagent</td></tr></tbody></table>

podwójne znakowanie immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał tego samego gatunku do badania interakcji gospodarz-patogen

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Obecnie można znaleźć szeroki zakres narzędzi molekularnych do badania interakcji między komórkami pasożyta i gospodarza. Istnieją jednak pewne ograniczenia w uzyskiwaniu komercyjnych przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych, które rozpoznają określone struktury komórkowe i białka pasożytów. Poza tym dostępnych jest niewiele komercyjnych przeciwciał do oznaczania trypanosomatydów. Zazwyczaj przeciwciała poliklonalne przeciwko pasożytom są przygotowywane we własnym zakresie i mogą być trudniejsze do użycia w połączeniu z innymi przeciwciałami wytwarzanymi u tego samego gatunku. W tym przypadku protokół pokazuje, jak wykorzystać przeciwciała poliklonalne i monoklonalne wyhodowane u tego samego gatunku do przeprowadzenia immunofluorescencji podwójnego znakowania w celu zbadania interakcji komórek gospodarza i patogenu. Aby osiągnąć immunofluorescencję podwójnego znakowania, ważne jest, aby najpierw inkubować mysie przeciwciało poliklonalne, a następnie kontynuować inkubację z wtórnym mysim przeciwciałem IgG skoniugowanym z dowolnym fluorochromem. Następnie konieczny jest dodatkowy etap blokowania, aby zapobiec rozpoznaniu jakichkolwiek śladów przeciwciała pierwszorzędowego przez następne przeciwciało drugorzędowe. Następnie mysie przeciwciało monoklonalne i jego specyficzne przeciwciało drugorzędowe podklasy IgG sprzężone z innym fluorochromem są dodawane do próbki w odpowiednim czasie. Dodatkowo możliwe jest przeprowadzenie immunofluorescencji z potrójnym znakowaniem przy użyciu trzeciego przeciwciała wyhodowanego u innego gatunku. Ponadto struktury takie jak jądra i aktyna mogą być następnie barwione ich specyficznymi związkami lub etykietami. W związku z tym przedstawione tutaj podejścia można dostosować do każdej komórki, której źródła pierwotnych przeciwciał są ograniczone.

W niniejszej pracy pokazujemy, jak badać interakcje gospodarz-pasożyt metodą immunofluorescencji w sytuacjach, gdy źródło przeciwciał jest ograniczone ze względu na niedostępność komercyjnych przeciwciał rozpoznających specyficzne struktury i białka u trypanosomatydów.
Wśród trypanosomatydów T. cruzi posiada jeden z najbardziej złożonych cykli życiowych, obejmujący różne stadia rozwojowe między gospodarzami kręgowcami a bezkręgowcami 19. W cyklu życiowym T....

Tutaj protokół opisuje, jak przeprowadzić podwójne znakowanie immunofluorescencji przy użyciu pierwotnych przeciwciał wyhodowanych u tego samego gatunku w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen. W tym protokole może również zawierać trzecie przeciwciało od innego gospodarza. Takie podejście można zastosować w każdym typie komórek i patogenach.

Podwójne znakowanie immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał tego samego gatunku do badania interakcji gospodarz-patogen

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

W tym protokole dwa przeciwciała od tego samego gospodarza mogą być używane razem w teście immunofluorescencyjnym w celu zbadania interakcji komórek gospodarza i patogenu. Ponieważ dostępnych jest tylko kilka komercyjnych przeciwciał do rozpoznawania określonych struktur komórkowych i białek pasożytów, protokół ten może być bardzo przydatny. Jest to łatwy do wykonania protokół immunofluorescencji z podwójnym znakowaniem, który wykorzystuje przeciwciała poliklonalne i monoklonalne wyhodowane u tego samego gatunku.Wielu badaczy może nie zdawać sobie sprawy, że jest to możliwe. Takie podejście pomaga, gdy źródło przeciwciał jest ograniczone. Może być stosowany do wykrywania patogenów w białkach komórek gospodarza w zakażonych komórkach gospodarza, a także może być stosowany do organizmów wolno żyjących.Jest to prosty protokół, wymaga jednego kroku blokującego między pierwszą a drugą parą przeciwciał. Procedura zostanie zademonstrowana przez dr Camilę Gachet-Castro i doktorantkę Lays Trajano-Silva z mojego laboratorium. Trzy dni po zakażeniu komórek LLC-MK2 Trypanosoma cruzi należy pobrać supernatant z zakażonych komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów do hodowli komórkowej.Odwirować próbkę, aby obniżyć resztki komórek, a następnie umieścić probówkę w temperaturze pokojowej, aby trypomastigoty mogły przepłynąć do supernatantu. Po 10 minutach zebrać supernatant do nowej stożkowej probówki, następnie odwirować próbkę i wyrzucić supernatant przed ponownym podwieszeniem osadu zawierającego pasożyty w pełnym pożywce RPMI. Dodaj komórki LLC-MK2 do 24-dołkowych płytek zawierających zaokrąglone szkiełka nakrywkowe sterylizowane promieniami UV i pozwól &m osiąść przez 16 godzin.Następnie, aby zainfekować komórki, dodaj supernatant zawierający T. Cruzi do każdej studzienki i inkubuj przez sześć godzin. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe zawierające zakażone i niezakażone komórki pięciokrotnie PBS, a następnie utrwal komórki 2% paraformaldehydem w PBS. Po 10 minutach umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po pięć minut za pomocą PBS, a następnie przepuszczaj szkiełka nakrywkowe niejonowym detergentem przez 10 minut.Po trzech pięciominutowych płukaniach PBS inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze blokującym przez 30 minut, a następnie kolejną 30-minutową inkubację z mysim przeciwciałem monoklonalnym lub poliklonalnym. Po przepłukaniu PBS inkubuj szkiełka nakrywkowe przez 30 minut z przeciwciałem drugorzędowym w roztworze blokującym i falloidyną, aby zabarwić włókna aktyny w komórce gospodarza. Następnie ponownie umyj szkiełka nakrywkowe PBS trzy razy przed nałożeniem niewielkiej ilości odczynnika montażowego zapobiegającego blaknięciu z medium DAPI na powierzchnię szkiełka.Za pomocą kleszczy delikatnie przechyl szkiełko nakrywkowe w podłożu, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. W przypadku podwójnego znakowania, po inkubacji szkiełek nakrywkowych w roztworze blokującym, jak wykazano wcześniej, należy je inkubować w mysim przeciwciałie poliklonalnym przez 30 minut. Następnie przemyj szkiełka nakrywkowe trzy razy przez pięć minut za pomocą PBS przed inkubacją z przeciwciałem drugorzędowym przez 30 minut.Następnie, po trzech płukaniach PBS, wykonaj drugi etap blokowania za pomocą AffiniPure króliczej anty-mysiej IgG rozcieńczonej w roztworze blokującym. Po 30 minutach ponownie przemyj szkiełka nakrywkowe PBS, a następnie inkubuj je z mysim przeciwciałem monoklonalnym przez kolejne 30 minut. Następnie, po trzech płukaniach PBS, inkubuj szkiełka nakrywkowe z kozim przeciwciałem anty-mysim IgG 2B i falloidyną.Następnie, po trzech płukaniach PBS, nałóż odczynnik montażowy zapobiegający blaknięciu, jak pokazano wcześniej. W przypadku potrójnego znakowania, po zablokowaniu szkiełek nakrywkowych i inkubacji z mysim przeciwciałem poliklonalnym, a następnie z kozim przeciwciałem anty-mysim, należy rozpocząć nową inkubację z króliczym przeciwciałem poliklonalnym w roztworze blokującym przez 30 minut. Następnie, po trzech płukaniach PBS, inkubować szkiełka nakrywkowe z kozim przeciwciałem anty-króliczym przez 30 minut.Następnie, po trzech płukaniach PBS, wykonaj etap blokowania z przeciwciałem przeciw myszom królika AffiniPure rozcieńczonym w roztworze blokującym przez 30 minut. Następnie ponownie umyj szkiełka nakrywkowe przed inkubacją z dowolnym mysim przeciwciałem monoklonalnej podklasy IgG przez 30 minut. Po trzech płukaniach PBS inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut ze specyficzną parą kozich przeciwciał anty-mysich podklasy IgG.Po inkubacji przemyć szkiełka nakrywkowe trzy razy przez pięć minut każdy za pomocą PBS. Analizuj próbki immunofluorescencyjne za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem zanurzeniowym 63X i wykrywaj fluorescencję za pomocą lampy fotopowielacza i detektora hybrydowego. Następnie uzyskaj wszystkie obrazy konfokalne z oddzielnymi kanałami i przeprowadź przetwarzanie obrazu za pomocą programu Adobe Photoshop.Te obrazy z mikroskopii konfokalnej pokazują wyniki eksperymentów kontrolnych na zakażonych i niezakażonych komórkach, podkreślając specyficzność przeciwciał w komórce gospodarza i zinternalizowanego pasożyta. Mysie przeciwciało poliklonalne anty-Trypanosoma cruzi FAZ rozpoznało gigantyczne białko T. cruzi w strefie przyczepu wici w wici pasożyta, ale nie w komórce gospodarza. Rozmieszczenie heterogenicznej jądrowej rybonukleoproteiny A1 w jądrach zaobserwowano przy użyciu komercyjnego mysiego przeciwciała monoklonalnego, które rozpoznaje tylko komórki ssaków gospodarza, ale nie pasożyta.Ponadto jądra gospodarza i pasożyta oraz kinetoplasty pasożyta zostały wybarwione DAPI, a F-aktyna gospodarza została wybarwiona falloidyną skoniugowaną z Alexa 594, potwierdzając specyficzność przeciwciał. Podwójnie znakowana immunofluorescencja pokazuje rozmieszczenie białek w żywicielu i pasożytzie analizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Oznakowanie sugerowało brak reakcji krzyżowej między przeciwciałami przy użyciu tej metodologii.Podsumowując, opisany tutaj protokół badania interakcji gospodarz-patogen przedstawia podstawową i wyszukaną technikę, którą można dostosować do dowolnej kombinacji przeciwciał. Takie podejście sprawia, że immunofluorescencja jest opłacalna i może pomóc w badaniu lokalizacji dwóch lub więcej białek będących przedmiotem zainteresowania, gdy dostępnych jest niewiele przeciwciał.

double-labeling-immunofluorescence-using-antibodies-from-same-species

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film prezentuje podwójne znakowanie immunologiczne za pomocą dwóch różnych pierwotnych przeciwciał wyhodowanych u tego samego gatunku, wiążących się specyficznie z białkami pasożyta i gospodarza. Co więcej, znakowane przeciwciała drugorzędowe skierowane przeciwko tym pierwotnym przeciwciałom umożliwiają wyraźną wizualizację białek gospodarza i pasożyta, ułatwiając badanie interakcji gospodarz-patogen.

Technika immunofluorescencji z podwójnym znakowaniem do wizualizacji białek gospodarza i patogenu w zakażonej komórce

Ten film demonstruje test do przeprowadzania multipleksowego barwienia immunologicznego przy użyciu pierwotnych przeciwciał od tego samego gatunku gospodarza. W tej metodzie wycinek tkanki nadnerczy poddawany jest dwuetapowemu procesowi barwienia immunologicznego. Początkowo wycinek jest barwiony przeciwciałami specyficznymi dla markerów w korze, a następnie usuwa się związane przeciwciało i ponownie barwi przeciwciałami specyficznymi dla markerów w rdzeniu.

Multipleksowa metoda barwienia immunologicznego przy użyciu pierwszorzędowych przeciwciał od tego samego gatunku gospodarza

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Ruch receptorów moduluje sygnalizację i reakcję komórki na ligandy i sam reaguje na warunki komórkowe, w tym sygnalizację indukowaną przez ligand. W tym miejscu opisujemy potężną i elastyczną technikę ilościowej oceny transportu receptorów indukowanego przez lek za pomocą znakowania immunologicznego i analizy kolokalizacyjnej.

Śledzenie zmian wywołanych przez leki w transporcie receptorów po internalizacji za pomocą analizy kolokalizacyjnej

Ustalono kilka różnych metod barwienia immunologicznego przy użyciu pierwotnych przeciwciał od tego samego gatunku gospodarza. W tym miejscu opisujemy zastosowanie usuwania przeciwciał za pośrednictwem mikrofal i tyramidu fluoroforowego do blokowania reaktywności krzyżowej przeciwciał podczas multipleksowego barwienia immunologicznego na utrwalonych w formalinie odcinkach nadnerczy myszy zatopionych w parafinie.

Podgrzewanie w kuchence mikrofalowej i fluorofor-tyramamid do multipleksowego barwienia immunologicznego nadnerczy myszy − przy użyciu niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Ten protokół opisuje wielobarwną technikę immunofluorescencji do oceny szczurzego modelu alergicznego nieżytu nosa.

Znakowanie immunofluorescencyjne w skrawkach tkanki błony śluzowej nosa alergicznych szczurów z nieżytem nosa za pomocą wielokolorowego testu immunologicznego

Opisano metodę indywidualnego wyboru, manipulowania i obrazowania żywych patogenów przy użyciu pułapki optycznej sprzężonej z mikroskopem dyskowym (spinning disk). Pułapka optyczna zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę nad organizmami i pozwala na umieszczenie ich w bezpośrednim sąsiedztwie komórek gospodarza. Mikroskopia fluorescencyjna pozwala na rejestrację dynamicznych interakcji międzykomórkowych przy minimalnym zaburzeniu stanu komórek.

Wykorzystanie pułapki optycznej do badania oddziaływań gospodarz-patogen w dynamicznym obrazowaniu żywych komórek

Poznaj protokół podwójnego znakowania immunofluorescencji przeciwciałami z tego samego gatunku do badania interakcji gospodarz-patogen z użyciem komórek LLC-MK2 zakażonych Trypanosoma cruzi.

Podwójne znakowanie immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał tego samego gatunku do badania interakcji gospodarz-patogen

Przeglądaj więcej filmów