Podwójne znakowanie immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał tego samego gatunku do badania interakcji gospodarz-patogen

W tym protokole dwa przeciwciała od tego samego gospodarza mogą być używane razem w teście immunofluorescencyjnym w celu zbadania interakcji komórek gospodarza i patogenu. Ponieważ dostępnych jest tylko kilka komercyjnych przeciwciał do rozpoznawania określonych struktur komórkowych i białek pasożytów, protokół ten może być bardzo przydatny. Jest to łatwy do wykonania protokół immunofluorescencji z podwójnym znakowaniem, który wykorzystuje przeciwciała poliklonalne i monoklonalne wyhodowane u tego samego gatunku.

Wielu badaczy może nie zdawać sobie sprawy, że jest to możliwe. Takie podejście pomaga, gdy źródło przeciwciał jest ograniczone. Może być stosowany do wykrywania patogenów w białkach komórek gospodarza w zakażonych komórkach gospodarza, a także może być stosowany do organizmów wolno żyjących.

Jest to prosty protokół, wymaga jednego kroku blokującego między pierwszą a drugą parą przeciwciał. Procedura zostanie zademonstrowana przez dr Camilę Gachet-Castro i doktorantkę Lays Trajano-Silva z mojego laboratorium. Trzy dni po zakażeniu komórek LLC-MK2 Trypanosoma cruzi należy pobrać supernatant z zakażonych komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów do hodowli komórkowej.

Odwirować próbkę, aby obniżyć resztki komórek, a następnie umieścić probówkę w temperaturze pokojowej, aby trypomastigoty mogły przepłynąć do supernatantu. Po 10 minutach zebrać supernatant do nowej stożkowej probówki, następnie odwirować próbkę i wyrzucić supernatant przed ponownym podwieszeniem osadu zawierającego pasożyty w pełnym pożywce RPMI. Dodaj komórki LLC-MK2 do 24-dołkowych płytek zawierających zaokrąglone szkiełka nakrywkowe sterylizowane promieniami UV i pozwól &m osiąść przez 16 godzin.

Następnie, aby zainfekować komórki, dodaj supernatant zawierający T. Cruzi do każdej studzienki i inkubuj przez sześć godzin. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe zawierające zakażone i niezakażone komórki pięciokrotnie PBS, a następnie utrwal komórki 2% paraformaldehydem w PBS. Po 10 minutach umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po pięć minut za pomocą PBS, a następnie przepuszczaj szkiełka nakrywkowe niejonowym detergentem przez 10 minut.

Po trzech pięciominutowych płukaniach PBS inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze blokującym przez 30 minut, a następnie kolejną 30-minutową inkubację z mysim przeciwciałem monoklonalnym lub poliklonalnym. Po przepłukaniu PBS inkubuj szkiełka nakrywkowe przez 30 minut z przeciwciałem drugorzędowym w roztworze blokującym i falloidyną, aby zabarwić włókna aktyny w komórce gospodarza. Następnie ponownie umyj szkiełka nakrywkowe PBS trzy razy przed nałożeniem niewielkiej ilości odczynnika montażowego zapobiegającego blaknięciu z medium DAPI na powierzchnię szkiełka.

Za pomocą kleszczy delikatnie przechyl szkiełko nakrywkowe w podłożu, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. W przypadku podwójnego znakowania, po inkubacji szkiełek nakrywkowych w roztworze blokującym, jak wykazano wcześniej, należy je inkubować w mysim przeciwciałie poliklonalnym przez 30 minut. Następnie przemyj szkiełka nakrywkowe trzy razy przez pięć minut za pomocą PBS przed inkubacją z przeciwciałem drugorzędowym przez 30 minut.

Następnie, po trzech płukaniach PBS, wykonaj drugi etap blokowania za pomocą AffiniPure króliczej anty-mysiej IgG rozcieńczonej w roztworze blokującym. Po 30 minutach ponownie przemyj szkiełka nakrywkowe PBS, a następnie inkubuj je z mysim przeciwciałem monoklonalnym przez kolejne 30 minut. Następnie, po trzech płukaniach PBS, inkubuj szkiełka nakrywkowe z kozim przeciwciałem anty-mysim IgG 2B i falloidyną.

Następnie, po trzech płukaniach PBS, nałóż odczynnik montażowy zapobiegający blaknięciu, jak pokazano wcześniej. W przypadku potrójnego znakowania, po zablokowaniu szkiełek nakrywkowych i inkubacji z mysim przeciwciałem poliklonalnym, a następnie z kozim przeciwciałem anty-mysim, należy rozpocząć nową inkubację z króliczym przeciwciałem poliklonalnym w roztworze blokującym przez 30 minut. Następnie, po trzech płukaniach PBS, inkubować szkiełka nakrywkowe z kozim przeciwciałem anty-króliczym przez 30 minut.

Następnie, po trzech płukaniach PBS, wykonaj etap blokowania z przeciwciałem przeciw myszom królika AffiniPure rozcieńczonym w roztworze blokującym przez 30 minut. Następnie ponownie umyj szkiełka nakrywkowe przed inkubacją z dowolnym mysim przeciwciałem monoklonalnej podklasy IgG przez 30 minut. Po trzech płukaniach PBS inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut ze specyficzną parą kozich przeciwciał anty-mysich podklasy IgG.

Po inkubacji przemyć szkiełka nakrywkowe trzy razy przez pięć minut każdy za pomocą PBS. Analizuj próbki immunofluorescencyjne za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem zanurzeniowym 63X i wykrywaj fluorescencję za pomocą lampy fotopowielacza i detektora hybrydowego. Następnie uzyskaj wszystkie obrazy konfokalne z oddzielnymi kanałami i przeprowadź przetwarzanie obrazu za pomocą programu Adobe Photoshop.

Te obrazy z mikroskopii konfokalnej pokazują wyniki eksperymentów kontrolnych na zakażonych i niezakażonych komórkach, podkreślając specyficzność przeciwciał w komórce gospodarza i zinternalizowanego pasożyta. Mysie przeciwciało poliklonalne anty-Trypanosoma cruzi FAZ rozpoznało gigantyczne białko T. cruzi w strefie przyczepu wici w wici pasożyta, ale nie w komórce gospodarza. Rozmieszczenie heterogenicznej jądrowej rybonukleoproteiny A1 w jądrach zaobserwowano przy użyciu komercyjnego mysiego przeciwciała monoklonalnego, które rozpoznaje tylko komórki ssaków gospodarza, ale nie pasożyta.

Ponadto jądra gospodarza i pasożyta oraz kinetoplasty pasożyta zostały wybarwione DAPI, a F-aktyna gospodarza została wybarwiona falloidyną skoniugowaną z Alexa 594, potwierdzając specyficzność przeciwciał. Podwójnie znakowana immunofluorescencja pokazuje rozmieszczenie białek w żywicielu i pasożytzie analizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Oznakowanie sugerowało brak reakcji krzyżowej między przeciwciałami przy użyciu tej metodologii.

Podsumowując, opisany tutaj protokół badania interakcji gospodarz-patogen przedstawia podstawową i wyszukaną technikę, którą można dostosować do dowolnej kombinacji przeciwciał. Takie podejście sprawia, że immunofluorescencja jest opłacalna i może pomóc w badaniu lokalizacji dwóch lub więcej białek będących przedmiotem zainteresowania, gdy dostępnych jest niewiele przeciwciał.