Name: In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia w żywych myszach z wykorzystaniem soczewek GRIN do badania aktywności neuronów oliwy dolnej. Ten protokół chirurgiczny umożliwia rejestrację wzorców czasowo-przestrzennych bez uszkadzania krytycznych struktur mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Andrew Scottowi z centrum medialnego OIST za pomoc w nagrywaniu i edycji wideo. Dziękujemy również Hugo Hoedemakerowi za pomoc w opracowaniu operacji odsłonięcia pnia mózgu oraz dr Kevinowi Dorgansowi za pomoc w rysowaniu diagramów do rysunków. Ponadto wielkie podziękowania dla Salvatore Lacavy za jego narrację głosową, a także dla wszystkich członków nRIM i zwierząt domowych za nieustanne wsparcie na rzecz dobrego samopoczucia w trudnych czasach COVID-19.

<ol><li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+signals+in+vivo%3A+A+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. , (2011).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kilohertz+two-photon+brain+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice.</a> Nature Methods. , (2019).</li>
<li>Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+the+primary+somatosensory+cortex+using+Thy1-GCaMP6s+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).</li>
<li>Lee, H. S., Han, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+In+vivo+Calcium+Imaging+with+a+Head-Mount+Miniaturized+Microscope+in+the+Amygdala+of+Freely+Behaving+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse.</a> Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).</li>
<li>Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+the+light+that+we+can+see%3A+a+new+era+in+miniaturized+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy.</a> Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).</li>
<li>Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mouse+inferior+olive+neurons+exhibit+heterogeneous+subthreshold+oscillations+and+spiking+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).</li>
<li>Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).</li>
<li>Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerg%2C+L+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22">Journal of visualized experiments : JoVE</a>. , e61023(2020).</li>
<li>Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+alone+and+combined+with+diazepam+or+xylazine+in+laboratory+animals%3A+A+10+year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience.</a> Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).</li>
<li>Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+signs+monitoring+during+injectable+andn+inhalant+anesthesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice.</a> Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).</li>
<li>Vrieler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+directionality+of+inferior+olive+neuron+dendrites+revealed+by+detailed+3D+characterization+of+an+extensive+morphological+library%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library.</a> Brain Structure and Function. 0 (0), 1677-1695 (2019).</li>
<li>Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainstem+nucleus+MdV+mediates+skilled+forelimb+motor+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks.</a> Nature. , (2014).</li>
<li>Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+neuroanatomical+characterization+of+single+neurons+in+the+mouse+medullary+gigantocellular+reticular+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine%2FXylazine%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ketamine/Xylazine.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> eLife. 8, 1-45 (2019).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIN1PIPE%3A+A+Miniscope+1-Photon-Based+Calcium+Imaging+Signal+Extraction+Pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline.</a> Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).</li>
<li>Sciences S.U. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy">https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy</a> (2020).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+accurate+extraction+of+in+vivo+calcium+signals+from+microendoscopic+video+data%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data.</a> eLife. 7, 1-37 (2018).</li>
<li>Zhou, P., et al. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/zhoupc/CNMF_E">https://github.com/zhoupc/CNMF_E</a> (2020).</li>
<li>De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferior+olive%3A+All+ins+and+outs%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+the+Cerebellum+and+Cerebellar+Disorders%22%5BJournal%5D)">Inferior olive: All ins and outs.</a> Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).</li>
<li>Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Subthreshold+Voltage+Oscillation+With+Cellular+Resolution+in+the+Inferior+Olive+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ zabieg chirurgiczny obejmuje operacje wykonywane w okolicy gardła z wieloma niezwykle krytycznymi strukturami (tętnice, nerwy), ważne jest, aby był on przeprowadzany przez badacza o wysokich umiejętnościach chirurgicznych. Poniżej podkreślamy i komentujemy kilka kluczowych punktów procedury; Należy jednak pamiętać, że żadna ilość pisemnych porad nie zastąpi doświadczenia, umiejętności i intuicji badacza.
Najważniejszym etapem operacji jest tracheotomia. Polega na przecięciu tchawicy, przełączeniu izofluranu ze stożka nosowego na rurkę intubacyjną, przymocowaniu tchawicy do skóry klatki piersiowej i związaniu tchawicy i rurki intubacyjnej razem. Wszystkie te operacje muszą być wykonywane w sposób płynny i szybki, aby uniknąć wypadków, takich jak nieodpowiednie znieczulenie, napływ płynu do tchawicy lub zsunięcie się rurki intubacyjnej. Przed przecięciem tchawicy należy pamiętać o protokole.
Krwotok jest jedną z głównych przyczyn śmierci zwierząt podczas tej operacji. Ponieważ obszar szyi jest gęsty od naczyń krwionośnych, cięcie powinno być wykonywane tylko wtedy, gdy linia wzroku jest czysta, aby uniknąć przecinania niewidocznych żył i tętnic. Dlatego mięśnie i tkanki łączne zasłaniające widzenie muszą zostać usunięte, a krew z popękanych naczyń włosowatych musi zostać oczyszczona przed przejściem.
Zwierzę może być utrzymywane przy życiu przez długi czas (ponad 8 godzin) od rozpoczęcia operacji. Jednak ważne jest, aby szybko zakończyć zabieg chirurgiczny, aby mieć więcej czasu na zbadanie neuronów pnia mózgu, gdy stan fizjologiczny zwierzęcia jest dobry. Doświadczony badacz może zakończyć całą procedurę w 70 minut.
Chociaż metoda zapewnia czysty widok brzusznych powierzchni mózgu, niestety nie jest to możliwe bez wykonania tracheotomii, a także usunięcia znacznej ilości tkanki w okolicy gardła. Dlatego nie można pozwolić, aby zwierzę obudziło się ze znieczulenia. Co więcej, nawet jeśli możliwe jest utrzymanie zwierzęcia przy życiu przez wiele godzin przy starannym dostosowaniu środka znieczulającego, utrzymaniu temperatury ciała i nawodnienia, nieuniknione jest, że długotrwałe eksperymenty ostatecznie doprowadzą do osłabienia stanu zwierzęcia. Do kompetencji badacza pozostawia się rozważenie maksymalnego czasu trwania stabilnych nagrań.
Innym potencjalnym ograniczeniem opisanej tutaj metody jest to, że ponieważ soczewka GRIN nie jest wprowadzana do miąższu mózgu, można badać tylko stosunkowo powierzchowne neurony (~150-200 μm). Podczas gdy chirurgiczne wszczepienie soczewki GRIN jest technicznie możliwe, metoda ostrej operacji nie daje neuronom wystarczająco dużo czasu na regenerację po stresie oksydacyjnym, a obecność krwi po implantacji prawdopodobnie pogorszy jakość obrazu ponad akceptowalność.
Pomimo powyższych obaw uważamy, że po raz pierwszy zaprezentowano metodę obrazowania in vivo neuronów IO. Pozwala na badanie aktywności czasoprzestrzennej neuronów IO w kontekście in vivo w obecności nienaruszonych aferentnych danych wejściowych z systemów sensorycznych, a także sygnałów z jąder móżdżku i połączenia międzymózgowiowego22, co do tej pory nie było możliwe. Dzięki tej metodzie funkcja IO może być teraz badana bardziej dogłębnie dzięki połączeniu stymulacji sensorycznej i optogenetycznej. W szczególności, wraz z ewolucją obrazowania napięciowego (takiego jak nasza niedawna metoda obrazowania napięcia w IO 23), mamy nadzieję, że przedstawiona metoda chirurgiczna zainspiruje wielu badaczy do podjęcia wyzwania zbadania, w jaki sposób IO przyczynia się do generowania kolców kompleksu móżdżku.

Głównym celem neuronauki systemowej jest zrozumienie, w jaki sposób czasoprzestrzenne wzorce aktywności sieci neuronowych przyczyniają się do generowania zachowań zwierząt. W związku z tym metodologia obrazowania fluorescencyjnego wykorzystująca sondy wrażliwe na wapń stała się w ciągu ostatniej dekady głównym narzędziem do badania aktywności sieci neuronalnej u żywych zwierząt1,2, ponieważ umożliwia wizualizację takiej dynamiki w skalach przestrzennych, od pojedynczych komórek po obwody mezoskalowe. W ostatnich latach powszechne podejście, w którym obwody neuronalne w powierzchownych strukturach mózgu (takich jak kora mózgowa lub móżdżkowa) są obrazowane przez przezroczyste okno czaszki3 zostało uzupełnione o użycie soczewek o indeksie gradientowo-refrakcyjnym (GRIN)4 umożliwiając badanie dynamiki sieci w głębokich strukturach mózgu. Obecnie dostępne soczewki GRIN pozwalają na dotarcie do struktur o głębokości kilku milimetrów, takich jak ciało migdałowate myszy, hipokamp i zwoje podstawy5. Jednak wiele obszarów zainteresowania, takich jak różne jądra w brzusznym rdzeniu, leży znacznie głębiej, co plasuje je na krańcu zasięgu soczewki GRIN.
Tutaj opisujemy, jak przezwyciężyć tę trudność, korzystając ze stosunkowo łatwej dostępności rdzenia przez brzuszną część mózgu. Korzystając z dorosłych myszy, u których dolna oliwka (IO), jądro w brzusznym rdzeniu, zostało wirusowo transfekowane za pomocą czujnika wapnia GCaMP6s, opisujemy kroki chirurgiczne (zmodyfikowane w stosunku do metody opisanej pierwotnie w Khosrovani et al. 20076) w celu umieszczenia soczewki GRIN na brzusznej powierzchni mózgu znieczulonej myszy. Za pomocą mikroskopu miniaturowego demonstrujemy możliwość rejestrowania aktywności neuronalnej w tak ekstremalnie brzusznych obszarach mózgu. Chociaż procedura jest z konieczności operacją niemającą na celu przeżycia i nie można przeprowadzić żadnych eksperymentów na przytomnych zwierzętach, metoda ta pozwala na zbadanie nienaruszonej dynamiki sieci w kontekście stymulacji czuciowej lub innej stymulacji szlaku aferentnego, zapewniając wyraźne korzyści w porównaniu z podejściami ex vivo, takimi jak stosowanie preparatów z ostrych plastrów.

<table><tbody><tr><td>AAV. CAG. GCaMP6s.WPRE.SV40</td><td>Addgene, USA</td><td>100844-AAV9</td><td></td></tr><tr><td>Szew wchłanialny z igłą półokrągłą 6 mm</td><td>Natume, Japonia</td><td>L6-60N2</td><td>igła haczykowa z gwintem</td></tr><tr><td>Trójkąty absorpcyjne</td><td>FST, Niemcy</td><td>18105-03</td><td>Gąbki chirurgiczne</td></tr><tr><td>Mikroskopy stereoskopowe</td><td>Leica, Niemcy</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo uchwyt igły z zakrzywioną końcówką z blokadą</td><td>FST, Niemcy</td><td>12061-01</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Waciki bawełniane</td><td>Sanyo, Japonia</td><td>HUBY-340</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne kleszczyki do wiązania szwów</td><td>FST, Niemcy</td><td>11063-07</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Delikatne kleszcze do wiązania szwów</td><td>FST, Niemcy</td><td>11063-07</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 kleszcze</td><td>FST, Niemcy</td><td>11251-35</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Nożyczki do cienkiej tęczówki</td><td>FST, Niemcy</td><td>14060-09</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeur zakrzywiona końcówka</td><td>FST, Niemcy</td><td>16221-14</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Wchłanialna gąbka żelatynowa</td><td>Pfizer, USA</td><td>0315-08</td><td>Hemostatyczna gąbka żelatynowa</td></tr><tr><td>Nanoiniekcja szklano-kapilarna</td><td>Neurostar, Niemcy</td><td>n/a</td><td>Do wstrzykiwania wektora wirusa</td></tr><tr><td>Graefe Kleszcze z ząbkowaną końcówką</td><td>FST, Niemcy</td><td>11052-10</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Pręt implantacyjny</td><td>Inscopix, USA</td><td>n/a</td><td>Jest częścią systemu nVoke2. Został zaprojektowany tak, aby nVoke2 miniaturowy microscpe i można na nim zamontować soczewkę GRIN</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis, Wielka Brytania</td><td>bez</td><td>Isoflurane</td></tr><tr><td>KETALAR DO WSTRZYKIWAŃ DOMIĘŚNIOWYCH</td><td>Daiichi Sankyo, Japonia</td><td>n/a</td><td>Ketamina</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark, USA</td><td></td><td>Chusteczki czyszczące</td></tr><tr><td>Laserowy ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta Beveler</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stereotaktyczny oparty na Kopf, model 900</td><td>Neurostar, Niemcy</td><td>nie dotyczy</td><td>Stereotaktyczna</td></tr><tr><td>mysz ramkowaOxPlus z czujnikiem temperatury w odbycie i pulsoksymetrem z zaciskiem uda</td><td>Starr Life Sciences, PA, USA</td><td>MouseOxPlus</td><td>Mierzy tętno zwierząt, nasycenie tlenem tętniczym (SpO2), częstość oddechów i temperaturę</td></tr><tr><td>nVoke2 integrarted System mikrokamer do obrazowania wapnia</td><td>Inscopix, USA</td><td>1000-003026</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>miniaturowy Wagi kompaktowe Ohaus</td><td>Ohaus, USA</td><td>CS 200</td><td>Waga służąca do ważenia zwierząt</td></tr><tr><td>Otsuka Sól fizjologiczna</td><td>Normalna Otsuka Pharmaceutical Factory, Japonia</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Fizjologiczno-biologiczny system regulatora temperatury</td><td>SuperTech Instruments, Węgry</td><td>TMP-5b</td><td>Podkładka termiczna do myszy</td></tr><tr><td>ProView Lens Probe Średnica 1,0 mm, długość 9,0 mm</td><td>Inscopix, USA</td><td>1050-002214</td><td>Soczewka z gradientowym indeksem załamania światła (GRIN)</td></tr><tr><td>Q114-53-10NP szklane kapilary</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>112017</td><td>Dostosowane&nbsp; kapilary ze szkła kwarcowego</td></tr><tr><td>Bezpieczny cewnik dożylny 20G</td><td>B. Braun, Niemcy</td><td>4251652-03</td><td>Cewnik Gauage 20 używany do przygotowania rurki</td></tr> <tr>intubacyjnej<td>Papier ścierny</td><td>ESCO, Japonia</td><td>EA366MC</td><td>Służy do polerowania końcówki igły 25G w celu przygotowania zakrzywionej i igły</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Muromachi Kikai, Japonia</td><td>10010-00</td><td>Służy do cięcia końcówki pipety ze szkła kwarcowego</td></tr><tr><td>System do znieczulenia wziewnego SomnoSuite o niskim przepływie</td><td>Kent Scientific, USA</td><td>SOMNO</td><td>Zapewnia precyzyjną kontrolę przepływu izofluranu</td></tr><tr><td>Wiertarka Surgic XT Plus</td><td>NSK</td><td>Y1002774</td><td>Do wstrzykiwań wektorów wirusowych</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Terumo, Japonia</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa 25G</td><td>Top, Japonia</td><td>00819</td><td>Służy do produkcji i zgiętej igły</td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa 26G</td><td>Terumo, Japonia</td><td>NN-2613S</td><td></td></tr><tr><td>Thrive 2100 Profesjonalny trymer</td><td>Thrive, Japonia</td><td>bez</td><td>golarki</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; Nożyczki sprężynowe bingen</td><td>FST, Niemcy</td><td>15004-08</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Hayashi Pure Chemical, Japonia</td><td>22000255</td><td></td></tr><tr><td>Veet skóra wrażliwa</td><td>Veet, Kanada</td><td>n/a</td><td>Krem do depilacji</td></tr><tr><td>Xylocaine Jelly 2 % 30ml</td><td>Aspen Japan,&nbsp; Japonia</td><td>871214</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Oliwka dolna (IO), jądro w brzusznym rdzeniu, jest jedynym źródłem włókien pnących, które tworzą jedną z dwóch ścieżek wejściowych do móżdżku. Od dawna uważa się, że IO ma kluczowe znaczenie dla kontroli motorycznej, a jego aktywność jest obecnie uważana za centrum wielu hipotez dotyczących zarówno motorycznych, jak i poznawczych funkcji móżdżku. Podczas gdy jego fizjologia i funkcja zostały stosunkowo dobrze zbadane na poziomie pojedynczej komórki in vitro, obecnie nie ma doniesień na temat organizacji aktywności sieci IO u żywych zwierząt. Wynika to w dużej mierze z niezwykle trudnego położenia anatomicznego soczewki wewnątrzgałkowej, co utrudnia poddanie jej konwencjonalnym metodom obrazowania fluorescencyjnego, w których należy utworzyć ścieżkę wzrokową przez cały mózg zlokalizowaną grzbietowo do obszaru zainteresowania.
Tutaj opisujemy alternatywną metodę uzyskiwania najnowocześniejszych danych obrazowania wapnia na poziomie technologicznym z sieci IO. Metoda wykorzystuje skrajne brzuszne położenie IO i obejmuje zabieg chirurgiczny polegający na wprowadzeniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym (GRIN) przez wnętrzności szyi w celu zetknięcia się z brzuszną powierzchnią czujnika wapnia IGaMP6s wyrażającego IO u znieczulonych myszy. Przedstawiono reprezentatywny zapis obrazowania wapnia, aby wykazać możliwość rejestrowania aktywności neuronów IO po operacji. Chociaż jest to operacja niepozwalająca na przeżycie, a zapisy muszą być prowadzone w znieczuleniu, pozwala to uniknąć uszkodzenia krytycznych dla życia jąder pnia mózgu i pozwala na przeprowadzanie wielu różnych eksperymentów badających wzorce aktywności czasoprzestrzennej i integrację danych wejściowych w IO. Ta procedura z modyfikacjami może być stosowana do nagrań w innych, sąsiednich obszarach brzusznego pnia mózgu.

W tej części przedstawiamy reprezentatywny zapis uzyskany za pomocą opisanego sposobu. Rycina 6a pokazuje lokalizację silnie znakowanych komórek IO wizualizowanych podczas eksperymentu. Ciemne diagonalne prążki to naczynia krwionośne. Należy zwrócić uwagę na zmienną jasność poszczególnych komórek, wynikającą ze zmiennej wydajności transfekcji. Na panelu Rycina 6b przedstawiamy przebiegi średnio znormalizowanej intensywności fluorescencji (deltaF/F) uzyskane z somat wskazanych kolorami i numerami na panelu a. Odchylenia w górę reprezentują przejściowe wzrosty stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego. Zauważmy, jak różny poziom ekspresji GCaMP6s (odzwierciedlony w jasności komórek na panelu a) prowadzi do zmiennych stosunków sygnału do szumu (SNR).
<img alt="Obrazowanie aktywności neuronalnej, wykres przejść wapniowych, analizowane sześć obszarów, pomiar deltaF/F w ciągu 10 s." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62222/62222fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
Rycina 6: Przykład zapisu aktywności neuronów IO u znieczulonej myszy. (a) Reprezentatywna klatka obrazu z zapisu po filtrowaniu przestrzennym. Jasne punkty to somata neuronów IO, z których kilka wskazano jako obszary zainteresowania (ROI, kolorowe numery). Ciemne pasy to naczynia krwionośne. (b) Przykład przebiegów deltaF/F uzyskanych z obszarów ROI wskazanych na panelu a. Odchylenia w górę odzwierciedlają wzrost sygnału wapniowego. Pasek skali na a=10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62222/62222fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Oliwka dolna jest najbardziej brzuszną częścią rdzenia, a zatem jest niezwykle trudna do osiągnięcia u żywego zwierzęcia. Tutaj wprowadzamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej i używamy soczewek GRIN do rejestrowania aktywności neuronalnej w dolnych neuronach oliwkowych wyrażających czujniki wapnia. Metoda ta pozwala uniknąć uszkodzeń pnia mózgu o krytycznym znaczeniu dla życia i umożliwia badania wzorców aktywności przestrzenno-czasowej oraz integracji danych wejściowych w dolnej oliwce.Ponieważ operacja jest wykonywana w złożonym obszarze gardła z wieloma istotnymi strukturami, ważne jest, aby był przeprowadzany przez badacza o wysokich umiejętnościach chirurgicznych. Przygotuj rurkę intubacyjną, wycinając szczelinę o długości od 5 do 6 milimetrów i szerokości 0,8 milimetra od końcówki cewnika o rozmiarze 20. Przygotuj i zakrzywioną igłę, odcinając końcówkę, przeszlifuj powierzchnię pęknięcia i zegnij ją szczypcami.Zostanie on wykorzystany do podparcia tchawicy podczas tracheotomii. Rozcieńczyć 15 miligramów na mililitr ketaminy solą fizjologiczną do 15%Zmontuj narzędzia chirurgiczne i materiały eksploatacyjne. Ustaw poduszkę grzewczą na 38 stopni Celsjusza.Obróć nos o 180 stopni w poziomie w ramce stereotaktycznej. Zważyć mysz, której dolna oliwka została wcześniej przetransfekowana przez przenoszące wirusa GCaMP6 i obliczyć ilość rozcieńczonej ketaminy do wstrzyknięcia. Wstępnie napełnij pudełko indukcyjne 5% izofluranem i znieczul mysz.Zamontuj mysz w ramce stereotaktycznej, brzuszną stroną do góry. Ogol okolice gardła i ud myszy. Usuń resztki włosów za pomocą kremu do depilacji.Galaretkę ksylocainy nakładać miejscowo na skórę gardła. Monitoruj temperaturę myszy za pomocą doodbytniczego czujnika termicznego. Wstrzyknąć dootrzewnowo jeden mililitr wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej.Oceń głębokość znieczulenia poprzez silne uszczypnięcie palców kończyn tylnych. Nie należy wywoływać żadnej wykrywalnej reakcji. Wykonaj pionowe nacięcie w skórze gardła wzdłuż linii środkowej.Oddziel skórę szyi od wnętrzności pod nią za pomocą metody preparacji i odetnij skórę. Uwolnij ślinianki od tkanki łącznej i odwróć je na boki, aby odsłonić tchawicę pokrytą mięśniem mostkowo-tarczowym. Pierwszą dawkę rozcieńczonej ketaminy wstrzyknąć dootrzewnowo w ilości pięciu mililitrów na kilogram masy ciała zwierzęcia.Ostrożnie rozłup mięsień mostkowo-tarczowy wzdłuż linii środkowej końcówką cienkich kleszczy, aby odsłonić tchawicę. Odłącz tchawicę od naczyń krwionośnych i przełyku kleszczami metodą rozwarstwienia. Wstrzyknąć drugą dawkę rozcieńczonej ketaminy w ilości 2,5 mililitra na kilogram masy ciała zwierzęcia.Na krzyż wbij igłę pod tchawicę. Podnieś tchawicę igłą. Spraw, aby nić szwu owinęła się wokół trzeciego pierścienia tchawicy, ogonowego tarczycy, za pomocą igły półkola.Zrób cztery krawaty na instrumenty na tym pierścieniu. Przekłuj skórę klatki piersiowej tą samą półokrągłą igłą i przeprowadź nić przez skórę. Delikatnie podnieś tchawicę nitką i przetnij tchawicę ogonową do tarczycy.Pociągnij tchawicę w kierunku skóry klatki piersiowej. Podnieś otwór tchawicy, dodając pod nią mały kawałek gąbki chirurgicznej. Usuń pozostały płyn wewnątrz otwierającej się końcówki tchawicy cienkim paskiem chusteczki czyszczącej.Przełączyć przepływ izofluranu ze stereotaktycznego nosa do rurki intubacyjnej. Włóż rurkę intubacyjną do tchawicy. Upewnij się, że część szczeliny w rurce pozostaje poza tchawicą, aby umożliwić oddychanie.Przymocuj tchawicę do skóry klatki piersiowej myszy, wykonując trzy do czterech opasek na instrumenty. Zawiąż tchawicę nitką do szwu, aby zabezpieczyć rurkę intubacyjną. Rozetnij mięsień mostkowo-tarczowy wzdłuż włókien mięśniowych za pomocą cienkich kleszczy.Odetnij izolowaną część nożyczkami sprężynowymi. Ostrożnie uwolnij resztki tchawicy i krtani z mięśni, aby zminimalizować uszkodzenia naczyń krwionośnych w mięśniach. Usuń resztki tchawicy i krtani.Uwolnij przełyk z przyczepionej tkanki za pomocą kleszczy i odetnij go nożyczkami sprężynowymi. Usuń mięsień podłużny pokrywający pień mózgu i łuk brzuszny atlasu. Usuń mięsień pokrywający łuk brzuszny atlasa i guzek przedni.Wytnij łuki brzuszne atlasu za pomocą rongeur. Usuń przedni guzek atlasu. Usuń krew i płyn, aby zobaczyć otwór wielki i pień mózgu.Rozszerz otwór wielki, usuwając kość potyliczną za pomocą rongeur. Usuń chrząstkę i ostrożnie oderwij warstwę okostnej opony twardej za pomocą cienkich kleszczy, aby mieć wyraźny widok na brzuszny pień mózgu. Zaciśnij czujnik SpO2 na udzie myszy, aby monitorować parametry życiowe, takie jak tętno, saturacja tlenem i częstość oddechów.Zamontuj soczewkę GRIN na pręcie implantacyjnym. Ostrożnie wyczyść soczewkę chusteczką czyszczącą nasączoną 70% etanolem. Zamocuj pręt implantacyjny na ramie stereotaktycznej i zamontuj miniaturowy mikroskop na pręcie implantacyjnym.Dodaj kilka kropli soli fizjologicznej w obszarze pnia mózgu, aby zanurzyć się w soczewce GRIN. Podejdź do pnia mózgu z soczewką GRIN. GCaMP6 wyrażające dolne neurony oliwkowe w obszarze powierzchownym można znaleźć w obszarze w kształcie prostokąta, około 0,5 do 1,7 milimetra rostralnego do pozostałego atlasu i około 2,6 do 1,1 milimetra bocznie do linii środkowej.Włącz niebieską diodę LED wzbudzenia w miniaturowym mikroskopie, aby zlokalizować transfekowane dolne neurony oliwkowe GCaMP6. Neurony wykazują różną wyjściową intensywność fluorescencji ze względu na różny poziom ekspresji GCaMP6s. Zmiana poziomu wapnia w zakreślonych dolnych somatach neuronów oliwnych na filmie po lewej pokaże nam deltę F podzieloną przez ślady F po prawej.Chociaż mysz jest utrzymywana w cieple i nawodnieniu, nieuchronnie zostanie osłabiona przez długotrwałe znieczulenie i operację. Ważne jest, aby czas trwania operacji był krótki, aby stan fizyczny myszy był dobry do nagrywania. Wykwalifikowany badacz może zakończyć operację w ciągu 70 minut.Ta metoda, z modyfikacjami, może być stosowana do badania innych sąsiednich obszarów brzusznego pnia mózgu.

in-vivo-calcium-imaging-in-mouse-inferior-olive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Źródło: Shannonhouse, J., et al. In vivo Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego. J. Vis. Exp. (2023). Film przedstawia technikę obrazowania wapnia in vivo w celu monitorowania aktywności neuronalnej w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) myszy transgenicznej. Neurony DRG wyrażają wskaźnik wapnia, który zwiększa intensywność fluorescencji po związaniu się z wapniem. Bodźce mechaniczne lub termiczne...

Obrazowanie in vivo wapnia zespołów neuronalnych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego myszy

Źródło: Lee, H. et. al., Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje obrazowanie wapnia in vivo u myszy przy użyciu gradientowego współczynnika załamania światła lub soczewki GRIN i zminiaturyzowanego mikroskopu. Konfiguracja łączy mocowanie głowy w beztarciowym mobilnym systemie klatek, stymulując neurony i wyzwalając napływ jonów wapnia. Soczewka GRIN...

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszającej się myszy

Ten protokół przedstawia kroki do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Techniki te są przydatne do badań nad fizjologią komórek szkieletowych i mogą być dostosowane do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki.

Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Zakręt zębaty hipokampa pełni podstawowe i odrębne funkcje w uczeniu się i pamięci. Protokół ten opisuje zestaw solidnych i skutecznych procedur obrazowania in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym u swobodnie poruszających się myszy.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo neuronów podwzgórza za pomocą miniaturyzowanego mikroskopu (miniscope) u swobodnie zachowujących się myszy podczas manipulacji stanem społecznym (izolacja społeczna i spotkanie społeczne). Metoda ta umożliwia obrazowanie aktywności podwzgórza w rozdzielczości pojedynczych neuronów, reprezentując potrzeby społeczne i nasycenie, umożliwiając mechanistyczne badania homeostazy społecznej.

In Vivo Obrazowanie wapnia mikroskopem miniaturowym w podwzgórzu w celu zrozumienia zachowań społecznych u myszy

Poznaj metodę obrazowania wapnia w żywych myszach z wykorzystaniem soczewek GRIN do badania aktywności neuronów oliwy dolnej. Ten protokół chirurgiczny umożliwia rejestrację wzorców czasowo-przestrzennych bez uszkadzania krytycznych struktur mózgu.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Przeglądaj więcej filmów