Name: Mikroskopia wielofotonowa w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzyków w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii wielofotonowej w czasie rzeczywistym do wizualizacji przepuszczalności bariery krew-mózg u myszy podczas zabiegów ultradźwiękowych z mikropęcherzykami. Technika ta umożliwia badanie dostarczania leków do mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pomieszczenia dla zwierząt zostały zapewnione przez Główny Ośrodek Medycyny Porównawczej (CoMed, NTNU). Rysunek 3 został utworzony w BioRender.com. Nagrywanie i montaż wideo został wykonany przez Pera Henninga, webmastera na Wydziale Nauk Przyrodniczych NTNU. Projekt został sfinansowany przez Norweski Uniwersytet Nauki i Technologii (NTNU, Trondheim, Norwegia), Norweską Radę ds. Badań Naukowych (RCN 262228), Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (FDN 154272), Narodowy Instytut Zdrowia (R01 EB003268) oraz Temerty Chair in Focused Ultrasound Research w Sunnybrook Health Sciences Centre.

Wszystkie poniższe procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z Norweskim Urzędem ds. Żywności i Bezpieczeństwa, Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami Instytutu Badawczego Sunnybrook oraz Kanadyjską Radą ds. Opieki nad Zwierzętami.
1. Przygotowanie materiału
<ol>
	<li>Przygotuj materiały potrzebne do operacji okna czaszkowego i zabiegów ultradźwiękowo-mikropęcherzykowych. W przypadku przewlekłych okien czaszkowych konieczne są wysterylizowane narzędzia i materiały, sterylna przestrzeń chirurgiczna oraz podawanie leków przed i po operacji23,24,25.</li>
	<li>Przygotowanie przetwornika i szkiełka nakrywkowego
	<ol>
		<li>Sprawdź integralność fizyczną przetwornika: poszukaj pęknięć i wgnieceń. Upewnij się, że elektrody na górze i z boku przetwornika są nienaruszone.</li>
		<li>Umieść klej cyjanoakrylowy w małym naczyniu. Za pomocą aplikatora rozprowadź cienką warstwę kleju na powierzchni przetwornika.</li>
		<li>Umieść przetwornik na szklanym szkiełku nakrywkowym. Mocno dociśnij przez 20-30 s. 
		UWAGA: Forma wydrukowana w 3D może być użyta do ułatwienia wyrównania szklanego szkiełka nakrywkowego z przetwornikiem pierścieniowym, zapewniając mocny i równomierny nacisk na szkiełko nakrywkowe i przetwornik pierścieniowy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Sprawdź, czy między przetwornikiem a szkiełkiem nakrywkowym nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli występują pęcherzyki, zdjąć szkiełko nakrywkowe i powtórzyć czynności od kroku 1.2.3, ponieważ powietrze utrudnia rozchodzenie się ultradźwięków. Utwardzać przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po przyklejeniu do szklanego szkiełka nakrywkowego dopasuj przetwornik (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
		UWAGA: Ten protokół wykorzystuje wyprodukowany przez siebie przetwornik pierścieniowy z tytanianu cyrkonianu ołowiu (średnica zewnętrzna 10 mm, grubość 1,4 mm, wysokość 1,2 mm) <klasa sup = "xref">35, dopasowany do impedancji 50 Ω i obciążenia fazowego 0° z niestandardowym obwodem dopasowującym. Przetwornik jest sterowany częstotliwością 0,82 MHz w trybie grubości, tworząc okrągłą plamkę ogniskową około 1 mm poniżej szkiełka nakrywkowego. Przetworniki pierścieniowe o podobnych właściwościach (średnica zewnętrzna 10 mm, grubość 1,5 mm, wysokość 1,1 mm) zostały scharakteryzowane26 i szeroko stosowane w eksperymentach z mikroskopią wielofotonową 27,28,29,31,32,36.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponowne użycie przetwornika i wymiana szkiełka nakrywkowego
	<ol>
		<li>Wymień szkiełko nakrywkowe, jeśli jest pęknięte lub ma zanieczyszczenia (np. futro, klej) z poprzedniego eksperymentu. Aby usunąć szkiełko nakrywkowe, rozpuść klej, zanurzając przetwornik i szkiełko nakrywkowe w acetonie na 20 min. 
		UWAGA: Aceton może wpływać na integralność przetwornika i/lub elektrod. Przed przystąpieniem do tego kroku skontaktuj się z producentem.</li>
		<li>Sprawdź, czy aceton rozpuścił klej, delikatnie pociągając za szkiełko nakrywkowe kleszczykami. Sprawdzaj raz na 10 minut, aby uniknąć długotrwałej ekspozycji na aceton.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę za pomocą mieszanki powietrza medycznego, tlenu i izofluranu w komorze indukcyjnej. 
	UWAGA: Doniesiono, że użycie tlenu jako gazu nośnego wpływa na okres półtrwania mikropęcherzyków37,38 i zmniejsza wielkość wzrostu przepuszczalności BBB wywołanego przez mikropęcherzyki ultradźwiękowe27, ale może również zmniejszyć ryzyko niedotlenienia i śmiertelności39. Wybór gazów nośnych w oparciu o cele projektu i porady lekarza weterynarii. Można również stosować środki znieczulające do wstrzykiwań, takie jak koktajl ketaminy/ksylazyny; Jednak łatwiej jest kontrolować płaszczyznę znieczulenia i poziom tlenu we krwi podczas stosowania wziewnych środków znieczulających.</li>
	<li>Sprawdź, czy zwierzę osiągnęło wystarczającą płaszczyznę znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi. Zważ zwierzę, aby określić dawkę dekstranu, mikropęcherzyków i leków do podawania. Usuń sierść z głowy zwierzęcia i umieść zwierzę na ramie stereotaktycznej.</li>
	<li>W przypadku ostrych doświadczeń należy zapewnić dostęp do krążenia ogólnoustrojowego dla wstrzyknięć dekstranu i mikropęcherzyków. Aby to osiągnąć, należy wprowadzić cewnik o masie 27 g do żyły ogonowej. 
	UWAGA: Chociaż możliwe są również iniekcje zaoczodołowe, zaleca się stosowanie żył ogonowych ze względu na ograniczoną przestrzeń roboczą w obszarze głowy podczas obrazowania wielofotonowego.</li>
	<li>Przenieś zwierzę na ramkę stereotaktyczną i przełącz znieczulenie na stożek nosowy. Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 °C za pomocą źródła ciepła, takiego jak poduszka grzewcza lub rękawica wypełniona ciepłą wodą.</li>
	<li>Monitoruj temperaturę zwierząt za pomocą sondy doodbytniczej i fizjologię zwierząt za pomocą pulsoksymetru. Zastosuj maść okulistyczną. Wstrzyknąć odpowiednie przedoperacyjne leki przeciwbólowe i/lub przeciwzapalne (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przed rozpoczęciem operacji okna czaszkowego należy sprawdzić płaszczyznę znieczulenia i tętno zwierzęcia, saturacjęO2, częstość oddechów i temperaturę.</li>
	<li>Aby rozpocząć operację okna czaszki, usuń sierść na głowie, nakładając krem do depilacji i/lub używając maszynki do strzyżenia futra. Usuń sierść spomiędzy oczu do przedniej połowy szyi (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A). 
	UWAGA: Długotrwały kontakt z kremem do depilacji spowoduje spalenie skóry. W przypadku przewlekłych operacji okien czaszkowych po usunięciu sierści należy umyć skórę głowy naprzemiennymi chusteczkami z betadyną i 70% EtOH. Przygotuj przestrzeń operacyjną do sterylnej operacji. Sterylność musi być utrzymana do kroku 2.15.</li>
	<li>Aby usunąć skórę głowy, unieś skórę między oczami za pomocą kleszczy trzymanych w niedominującej ręce, wzdłuż szwu strzałkowego. Za pomocą zakrzywionych nożyczek usuń skórę, aby odsłonić kości ciemieniowe (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B). Mocno dociśnij bawełnianym wacikiem, jeśli występuje krwawienie z czaszki lub skóry głowy; Krwawienie należy zatrzymać przed przejściem do następnego kroku. 
	UWAGA: W przypadku ostrych operacji skórę można odepchnąć i przykleić do czaszki za pomocą płynnego kleju cyjanoakrylowego lub kleju tkankowego.</li>
	<li>Usuń okostną pokrywającą zewnętrzną powierzchnię czaszki za pomocą bawełnianych wacików.</li>
	<li>Używając mikroskopu operacyjnego (6-25x) i wiertła dentystycznego (frez 0,5 mm, średnia prędkość), narysuj okrąg na kości ciemieniowej, aby zaznaczyć pożądane miejsce okna czaszki na czaszce (<silna klasa = "xfig">Ryc. 5). Unikaj szwu strzałkowego, lambdy i bregmy, ponieważ obszary te są cieńsze i pokrywają duże naczynia krwionośne. 
	UWAGA: Aby ułatwić wiercenie, kontur okna czaszki można narysować na czaszce za pomocą markera i szablonu (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A). W przypadku szczurów może być łatwiej wywiercić prostokątne okno zamiast okrągłego okna czaszkowego. Ze względu na grubość kości czaszki szczura, użyj wiertła 0,7 mm, aby obrysować okno czaszki w zwartej kości przed użyciem wiertła 0,5 mm, aby zakończyć proces wiercenia.</li>
	<li>Delikatnie dociskaj wiertłem; nadmierny nacisk zwiększa ryzyko uszkodzenia tkanki mózgowej. Aby zapobiec przegrzaniu czaszki podczas wiercenia, należy wlać sól fizjologiczną na czaszkę za pomocą strzykawki lub nałożyć kawałek gąbki chirurgicznej nasączonej solą fizjologiczną.</li>
	<li>Na przemian wiercić i schładzać czaszkę, aż powstała wyspa kostna oddzieli się od reszty czaszki. Sprawdź postęp wiercenia, delikatnie uciskając wyspę kostną za pomocą kleszczy lub wiertła. Kontynuuj wiercenie, aż wyspa kostna oddzieli się od reszty czaszki. 
	UWAGA: Małe pęknięcia w najcieńszych obszarach czaszki są dobrą wskazówką, że wiercenie jest prawie zakończone. Próba przedwczesnego usunięcia wyspy kostnej może spowodować, że kawałki kości wnikną w tkankę mózgową, uszkadzając oponę twardą i powodując stan zapalny i krwawienie.</li>
	<li>Usuń wyspę kostną za pomocą pary cienkich kleszczy, aby chwycić krawędzie lub górną, zwartą warstwę kości wyspy kostnej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6A). Upewnij się, że mózg jest wilgotny, nakładając kawałek gąbki chirurgicznej, która została wstępnie nasączona solą fizjologiczną. Jeśli zaobserwuje się krwawienie, umieść gąbkę chirurgiczną w obszarze, który krwawi. Nie przechodź do następnego kroku, dopóki krwawienie nie ustąpi. 
	UWAGA: Jeśli krwawienie utrzymuje się po 5 minutach, zwierzę nie może być wykorzystywane do eksperymentów z obrazowaniem wielofotonowym. W przypadku szczurów może być konieczne usunięcie opony twardej, jeśli jest gruba. Aby usunąć oponę twardą, użyj dużego powiększenia mikroskopu operacyjnego i pary cienkich kleszczyków.</li>
	<li>Aby umieścić okienko czaszki, podnieś szklane szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy, umieść kroplę soli fizjologicznej po jednej stronie i manewruj nią nad otworem w czaszce. Upewnij się, że pod szkiełkiem nakrywkowym nie ma pęcherzyków powietrza. 
	UWAGA: Użyj szkiełka nakrywkowego o grubości 5 mm dla myszy i 8 mm dla szczurów. W przypadku szczurów, ze względu na grubość kości czaszki, użyj roztworu agarozy zamiast soli fizjologicznej, aby wypełnić przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a mózgiem. Przetwornik i jego szkiełko nakrywkowe można również przykleić bezpośrednio do czaszki, zamiast używać oddzielnego szkiełka nakrywkowego do okienka czaszki. Aby skorzystać z tej opcji, przejdź do kroku 3.1. Szczegółowe informacje można znaleźć w Rysunek 1.</li>
	<li>Rozprowadź warstwę kleju cyjanoakrylowego na obwodzie szkiełka nakrywkowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B), aby przymocować go do czaszki. Upewnij się, że pod szkiełkiem nakrywkowym nie ma kleju. Wywieraj nacisk na szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że klej nie wejdzie w kontakt z mózgiem.</li>
	<li>Gdy klej całkowicie wyschnie, wyrównaj powierzchnię kleju za pomocą wiertła dentystycznego. Upewnij się, że wszystkie resztki kleju zostały usunięte z obszaru operacyjnego. 
	UWAGA: W przypadku przewlekłych okien czaszkowych wstrzyknij niezbędne leki pooperacyjne (patrz Tabela materiałów), zapewnij maść do pielęgnacji ran i miękkich pokarmów, a następnie odzyskaj zwierzę pod lampą grzewczą.</li>
</ol>
3. Umiejscowienie przetwornika pierścieniowego
<ol>
	<li>Przygotować 1% (w/v) roztwór agarozy. Do małej zlewki lub kolby Erlenmeyera dodać 0,1 g agarozy i 10 ml PBS (1x) lub soli fizjologicznej. Gotuj roztwór, aż agaroza całkowicie się rozpuści, umieszczając zlewkę na płycie grzejnej lub podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej (30-45 s).</li>
	<li>Kroki 3.2-3.5 są wrażliwe na czas, ponieważ roztwór agarozy szybko się ochładza. Pobrać ~ 0,5 ml agarozy do strzykawki o pojemności 1 ml. 
	UWAGA: Aby chronić integralność mózgu, przed użyciem upewnij się, że temperatura agarozy jest zbliżona do temperatury ciała.</li>
	<li>Umieść agarozę obficie na szkiełku nakrywkowym okna czaszki. 
	UWAGA: Jeśli tkanka blednie, oznacza to, że temperatura agarozy była zbyt wysoka; Zwierzę musi zostać poddane eutanazji. Jeśli nie ma oddzielnego szkiełka nakrywkowego pokrywającego mózg (tj. przetwornik i jego szkiełko nakrywkowe są umieszczone bezpośrednio na mózgu, patrz krok 2.14), wówczas agaroza powinna zostać osadzona na powierzchni mózgu na tym etapie.</li>
	<li>Umieść przetwornik nad oknem czaszki (<silna klasa="xfig">Rysunek 6C). Zastosuj mocny nacisk, tak aby między przetwornikiem a okienkiem czaszki była minimalna agaroza. Upewnij się, że przetwornik jest wyśrodkowany (płaszczyzna XY) i równoległy (płaszczyzna Z) do okna czaszki oraz że w agarozie nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Gdy agaroza ostygnie do konsystencji galaretki, odetnij nadmiar agarozy z obwodu szkiełka nakrywkowego przetwornika za pomocą szpatułki lub skalpela. Upewnij się, że pod szkiełkiem nakrywkowym przetwornika nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki rozprowadź warstwę kleju cyjanoakrylowego na obwodzie szkiełka nakrywkowego przetwornika, rozciągając się do czaszki, tak aby przetwornik mocno przylegał do czaszki.</li>
	<li>Utrzymuj mocny nacisk na przetwornik, aż klej całkowicie wyschnie (10-15 min).</li>
</ol>
4. Obrazowanie za pomocą mikroskopii wielofotonowej
<ol>
	<li>Umieść zwierzę pod soczewką obiektywu (<silna klasa="xfig">Rysunek 7A). Upewnij się, że soczewka obiektywu jest wyśrodkowana w przetworniku pierścieniowym i równolegle do przetwornika (<silna klasa="xfig">Rysunek 7B). Jeśli używana jest soczewka obiektywowa zanurzona w wodzie, napełnij środek przetwornika pierścieniowego wodą zdejonizowaną i odgazowaną. 
	UWAGA: Odgazowana woda jest ważna dla prawidłowego rozchodzenia się ultradźwięków.</li>
	<li>Zacznij od soczewki obiektywu w jej najwyższej pozycji, a następnie powoli opuść soczewkę obiektywu, aż znajdzie się w przetworniku pierścieniowym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 7A, B). Upewnij się, że soczewka obiektywu nie koliduje z przetwornikiem lub szkiełkiem nakrywkowym. 
	UWAGA: Przełączaj się między okularem, aby sprawdzić, czy pozycja Z soczewki obiektywu znajduje się w płaszczyźnie z powierzchnią mózgu, oraz na oko, aby upewnić się, że soczewka obiektywu nie koliduje z przetwornikiem lub szkiełkiem nakrywkowym. Wizualizacja naczyń krwionośnych przez okular może być łatwiejsza po wstrzyknięciu fluorescencyjnego dekstranu przez żyłę ogonową (<silna klasa="xfig">Rysunek 7C).</li>
	<li>Przygotuj mikroskop wielofotonowy do obrazowania. 
	UWAGA: W protokole tym wykorzystuje się pionowy mikroskop wielofotonowy i soczewkę obiektywową 20-25x, która ma odległość roboczą 2 mm, która jest wystarczająca, aby skupić się poza szkiełkiem nakrywkowym (szkiełkami) w miąższu mózgu.</li>
	<li>Przygotować dekstran. Dodaj odpowiednią ilość PBS do fiolki z dekstranem, zgodnie z instrukcjami producenta. Wirować roztwór dekstranu przez 1-3 minuty, aby upewnić się, że proszek dekstranu jest całkowicie rozpuszczony. Wstrzyknąć roztwór dekstranu do żyły ogonowej.</li>
	<li>Konfigurowanie skanowania obrazu
	<ol>
		<li>Używając okularów, upewnij się, że soczewka obiektywu jest równoległa do mózgu. Przechyl zwierzę, aby skorygować niewspółosiowość XZ i YZ.</li>
		<li>Wybierz pole widzenia w mikroskopie wielofotonowym. Skonfiguruj skan XYZ przed ekspozycją na ultradźwięki, aby uzyskać podstawowy obraz układu naczyniowego przed ekspozycją na ultradźwięki. 
		UWAGA: Typowe parametry obrazowania są następujące: głębokość 300-800 μm, rozmiar kroku 2-5 μm i stosy czasowe 10-20. Upewnij się, że soczewka obiektywu nie styka się z przetwornikiem lub szkiełkiem nakrywkowym w najniższym punkcie podczas sekwencji obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ekspozycja na ultradźwięki
<ol>
	<li>Upewnij się, że wszystkie BNC są prawidłowo podłączone (Rysunek 3).</li>
	<li>Skonfiguruj skan obrazu XYZT, który jest wystarczająco długi, aby uchwycić stosy obrazów przed, w trakcie i po zabiegach ultradźwiękowych z mikropęcherzykami.</li>
	<li>Przygotuj mikropęcherzyki, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Wstrzyknąć mikropęcherzyki do żyły ogonowej i rozpocząć obrazowanie. 
	UWAGA: Wstrzyknięcia mikropęcherzyków można wykonać za pomocą pompy infuzyjnej, aby zapewnić stałą szybkość wstrzykiwania i umożliwić jednoczesne wstrzykiwanie mikropęcherzyków i obrazowanie. Jeśli mikropęcherzyki mają być wstrzykiwane podczas obrazowania, należy upewnić się, że żyła ogonowa jest łatwo dostępna bez wystawiania detektorów na działanie światła otoczenia.</li>
	<li>Rozpocznij sonikację. 
	UWAGA: Typowe parametry sonikacji są następujące: cykle 10 ms, indeks mechaniczny 0,2-0,4 i częstotliwości powtarzania impulsów w zakresie 1-4 Hz. Parametry sonikacji i mikropęcherzyków stosowane w przedklinicznych badaniach ultradźwiękowych z mikropęcherzykami zostały szeroko zbadane i są dobrze udokumentowane w literaturze (np. patrz przegląd 40).</li>
	<li>Obrazowanie wielofotonowe należy kontynuować przez cały czas trwania sonikacji i po jej zakończeniu. Należy zwrócić uwagę na wynaczynienie dekstranu z naczyń krwionośnych, ponieważ wskazuje to na wzrost przepuszczalności BBB. 
	UWAGA: Jeśli dekstran zostanie wykryty w przestrzeni pozanaczyniowej, ale na obrzeżach pola widzenia, może to oznaczać, że poza polem widzenia mogą znajdować się dotknięte naczynia krwionośne. Może to wynikać z niewspółosiowości przetwornika z ostrością soczewki obiektywu. W tym scenariuszu łatwiej jest wyregulować pole widzenia, przesuwając soczewkę obiektywu lub zmieniając położenie zwierzęcia, niż ponownie ustawić przetwornik.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania należy poddać eutanazji zwichnięcie szyjki macicy zwierzęcia w głębokim znieczuleniu lub uduszeniuCO2. W przypadku przewlekłych okien czaszki rozprowadź warstwę cementu dentystycznego na odsłoniętej czaszce. 
	UWAGA: W przypadku przewlekłych okien czaszkowych skórę otaczającą okno można zszyć, chociaż nie jest to konieczne, ze względu na usunięcie skóry głowy w kroku 2.8.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Eksportuj stosy obrazów.</li>
	<li>Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (np. Olympus Fluoview, ImageJ/FIJI, Bitplane Imaris, ThermoFisher Scientific Amira) i/lub narzędzi programistycznych (np. Python, MATLAB).</li>
</ol>

Charissa Poon, Melina Mühlenpfordt, Marieke Olsman i Catharina de Lange Davies deklarują, że nie występują w nich finansowe ani niefinansowe konflikty interesów. Spiros Kotopoulis jest pełnoetatowym pracownikiem i posiada udziały w EXACT Therapeutics AS, firmie zajmującej się opracowywaniem ultradźwięków i dostarczania leków wspomaganych mikropęcherzykami/klastrami. Kullervo Hynynen jest założycielem FUS Instruments, od którego otrzymuje wsparcie niezwiązane z badaniami.

Monitorowanie mózgu za pomocą mikroskopii wielofotonowej jest cennym narzędziem do badania reakcji mózgu podczas ekspozycji na ultradźwięki. Według naszej wiedzy opisany tutaj protokół jest jedyną metodą prowadzenia obrazowania miąższu mózgu za pomocą mikroskopii wielofotonowej podczas zabiegów ultrasonograficznych z mikropęcherzykami. Stworzenie okien czaszkowych i zastosowanie przetworników pierścieniowych umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym reakcji naczyniowych, komórkowych i innych dalszych reakcji na zabiegi ultradźwiękowe mikropęcherzykami w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Inne grupy przeprowadziły obrazowanie za pomocą mikroskopii wielofotonowej po zakończeniu zabiegów ultradźwiękowych z mikropęcherzykami, tracąc w ten sposób reakcję miąższu mózgu w czasie rzeczywistym na leczenie19. Opisana procedura zapewnia lepszą kontrolę czasową, umożliwiając gromadzenie danych, które mogą pomóc w wyjaśnieniu ostrych mechanizmów stojących za terapią ultradźwiękową mikropęcherzykami. Dane ilościowe i jakościowe można wyodrębnić i przeanalizować z uzyskanych stosów obrazów, takich jak kinetyka wynaczynienia27,29,30, zmiany w objętości blaszki β-amyloidowej31 i dynamika komórek32.
W całym protokole podkreślono kilka kroków rozwiązywania problemów. W pierwszej kolejności położono nacisk na czynności chirurgiczne, które są szczególnie podatne na błędy operatora, takie jak zastosowanie agarozy podczas operacji okna czaszkowego i umiejscowienie głowicy. Podjęto również kroki mające na celu zapobieganie dyskomfortowi i śmierci zwierząt, w tym monitorowanie fizjologii zwierząt podczas operacji i dokładne wirowanie dekstranu przed wstrzyknięciem. Po drugie, zwrócono również uwagę na fizyczne parametry przetwornika oraz ustawienie soczewki obiektywu, przetwornika i okna czaszkowego. Specyfikacje przetwornika pierścieniowego i jego właściwości akustyczne muszą być określone z uwzględnieniem zastosowanej soczewki obiektywu, jak również modelu zwierzęcego. W szczególności wewnętrzna średnica przetwornika pierścieniowego musi być wystarczająco duża, aby otaczać soczewkę obiektywu, ale wystarczająco mała, aby można ją było bezpiecznie zamontować na czaszce zwierzęcia. Ponadto obszar ogniskowy przetwornika musi pokrywać się z zakresem używanej soczewki obiektywu.
Częstym wyzwaniem jest to, że okienko czaszki i przetwornik pierścieniowy są ustawione pod kątem w stosunku do soczewki obiektywu. Prawidłowe wyśrodkowanie (XY) i wyrównanie (Z) soczewki obiektywu z okienkiem czaszki i przetwornikiem zapewnia, że obszar ogniskowy głowicy, a tym samym obszar leczonej tkanki mózgowej, pokrywa się z polem widzenia obrazowania i zmniejsza ryzyko kolizji między soczewką obiektywu a przetwornikiem podczas obrazowania. Wyrównanie można osiągnąć, dostosowując pozycję głowy zwierzęcia i/lub obracając ramę stereotaktyczną, w której jest zamocowane.
Elementy mikroskopu (np. detektory, rozdzielacze wiązki) oraz parametry akwizycji obrazu powinny być dobrane w oparciu o cel badania. W tym przypadku stosuje się soczewkę obiektywową o długiej ogniskowej (> 2 mm) ze względu na obecność szkiełka nakrywkowego (szkieł) nakrywkowego i przetwornika pierścieniowego umieszczonego między soczewką obiektywu a mózgiem. Zalecany jest również mikroskop pionowy, ponieważ zapewnia on więcej miejsca do manewrowania zwierzęciem, szczególnie w przypadku eksperymentów na mózgu. Aby uchwycić kinetykę wycieku barwnika wewnątrznaczyniowego wywołanego mikropęcherzykami ultradźwiękowymi, korzystna jest wysoka rozdzielczość czasowa, którą można osiągnąć za pomocą systemu skanowania rezonansowego. Połączenie tego z systemem detekcji o wysokiej czułości, takim jak detektory fosforku arsenku galu (GaAsP), również zaowocuje korzystniejszymi obrazami.
Przedstawiona procedura eksperymentalna ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, zabieg chirurgiczny jest dość inwazyjny i doniesiono, że powoduje stan zapalny45, chociaż stan zapalny można zminimalizować46. Ponadto zaobserwowano, że odpowiedzi immunologiczne wywołane operacjami okien czaszkowych ustępują w ciągu 2-4 tygodni po operacji 23,24,25. Ponadto proces wiercenia, szczególnie gdy jest prowadzony z nadmierną siłą lub prędkością, może spowodować uszkodzenie leżącej pod spodem tkanki z powodu wytwarzania ciepła, wibracji i przyłożonego ciśnienia. Zaobserwowano również, że operacje okienka czaszkowego i obrazowanie wielofotonowe wpływają na temperaturę mózgu47. Ograniczenia te można do pewnego stopnia zmniejszyć poprzez staranne stworzenie nieskazitelnych okien czaszkowych, odpowiednią regenerację zwierząt z przewlekłymi oknami czaszkowymi oraz utrzymanie normotermicznej temperatury ciała za pomocą źródła ciepła ze sterowaniem zwrotnym. Po drugie, głębokość obrazowania jest ograniczona przez zastosowany mikroskop i soczewkę obiektywu. Na przykład wpływ leczenia mikropęcherzykami ultradźwiękowymi w głębszych strukturach mózgu, takich jak hipokamp, nie może być badany bez bardziej inwazyjnych środków, takich jak usunięcie leżącej nad nimi tkanki korowej48 lub zastosowanie mikrosoczewek w połączeniu z penetracją kory mózgowej49. Użycie soczewki obiektywowej o dużej odległości roboczej może w pewnym stopniu rozwiązać ten problem, ale penetracja światła jest również ograniczona na większych głębokościach.
Podczas gdy reprezentatywne obrazy tego protokołu zostały uzyskane od gryzoni typu dzikiego, przedstawiona procedura eksperymentalna może być również zastosowana do zwierząt transgenicznych i modeli chorób, takich jak choroba Alzheimera31. Eksperymenty ultrasonograficzne niezwiązane z modulacją BBB, takie jak neuromodulacja indukowana ultradźwiękami, mogą być również monitorowane przy użyciu tego protokołu33,34. Inne możliwe zastosowania można osiągnąć, stosując różne konfiguracje mikroskopu lub detektora, takie jak połączenie mikroskopu konfokalnego z ultraszybką kamerą50. Podczas gdy fotobielenie i fototoksyczność są stosunkowo gorsze w mikroskopach konfokalnych ze względu na dużą objętość wzbudzenia, ultraszybkie obrazowanie może umożliwić wizualizację interakcji komórek śródbłonka kapilarnego mózgu z mikropęcherzykami z wysoką rozdzielczością czasową, co może dodatkowo rzucić światło na mechanizmy kierujące zabiegami ultradźwiękowo-mikropęcherzykowymi BBB. Podsumowując, opisany protokół zapewnia metodę monitorowania efektów naczyniowych i komórkowych indukowanych przez eksperymenty ultradźwiękowe z mikropęcherzykami BBB w czasie rzeczywistym, dostarczając narzędzia do dalszego określania mechanizmów napędzających te zabiegi, a także rzucając światło na dalsze reakcje miąższu mózgu na zabiegi ultradźwiękowe z mikropęcherzykami.

Kluczowym wyzwaniem w leczeniu zaburzeń neurologicznych jest obecność bariery krew-mózg (BBB). BBB ogranicza hydrofilowe, naładowane, polarne i duże (> 400 Da) cząsteczki przed dostaniem się do miąższu mózgu1. Jedną z metod stosowanych obecnie do dostarczania leków przez barierę krew do miąższu mózgu jest stosowanie stereotaktycznych wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych2. Inne, mniej inwazyjne metody są utrudnione ze względu na złożoność stosowanych technik, takich jak projektowanie leków do dostarczania za pośrednictwem receptora przez BBB3, lub są ograniczone pod względem precyzji przestrzennej docelowych obszarów, takich jak wstrzyknięcia donosowe4 lub podawanie roztworów hiperosmotycznych5.
Zastosowanie ultradźwięków w połączeniu z ogólnoustrojowo wstrzykiwanymi mikropęcherzykami, ultradźwiękowym środkiem kontrastowym, zostało opracowane jako nieinwazyjny sposób na przejściowe zwiększenie przepuszczalności BBB6. Korzystając z przetwornika skoncentrowanego7 lub sterowalnego phased array of transducers8,9, ultradźwięki mogą być kierowane na wybrane obszary mózgu z dokładnością do milimetra, minimalizując efekty niezgodne z celem. Zabiegi ultradźwiękowo-mikropęcherzykowe można dostosować do anatomii mózgu każdego pacjenta, korzystając ze wskazówek dotyczących obrazowania metodą rezonansu magnetycznego7,10,11,12,13,14 lub stereotaktyczne frames15. Co więcej, zakres wzrostu przepuszczalności BBB może być kontrolowany w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie emisji akustycznej z mikropęcherzyków16,17,18. Obecnie na całym świecie prowadzone są badania kliniczne badające bezpieczeństwo i wykonalność zabiegów ultradźwiękowych z wykorzystaniem mikropęcherzyków (np. ClinicalTrials.gov identyfikator NCT04118764).
Ultradźwiękowe zabiegi mikropęcherzykowe BBB są zazwyczaj oceniane poprzez potwierdzenie wywołanego leczeniem wzrostu przepuszczalności BBB, wizualizację w obrazowaniu rezonansu magnetycznego wzmocnionego kontrastem, lub przez wynaczynienie barwnika w obrazowaniu in vivo lub histologii ex vivo. Jednak większość analiz mikroskopowych została przeprowadzona ex vivo, po zakończeniu zabiegów ultradźwiękowo-mikropęcherzykowych11,19, pomijając w ten sposób dynamiczne reakcje biologiczne podczas i bezpośrednio po ekspozycji na ultradźwięki. Obrazowanie w czasie rzeczywistym przeprowadzane podczas ekspozycji na ultradźwięki może pomóc w zrozumieniu mechanizmów kierujących leczeniem ultradźwiękami i mikropęcherzykami krwi, a także dalszych reakcji, co może zwiększyć naszą wiedzę na temat ich zastosowań terapeutycznych. Co więcej, zastosowanie przewlekłych okien czaszkowych z technikami obrazowania in vivo umożliwiłoby przeprowadzenie badań podłużnych w celu oceny czasowych aspektów leczenia mikropęcherzykami ultradźwiękowymi.
Celem tego protokołu jest opisanie procedur chirurgicznych i technicznych wymaganych do przeprowadzenia w czasie rzeczywistym wielofotonowego obrazowania ultradźwiękami-mikropęcherzykami dla ostrych i przewlekłych badań na gryzoniach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Osiąga się to w dwóch częściach: po pierwsze, stworzenie okna czaszkowego, aby umożliwić obrazowanie in vivo, a po drugie, zamontowanie przetwornika pierścieniowego na górze, aby umożliwić jednoczesną sonikację i obrazowanie. Okna czaszkowe są szeroko wykorzystywane przez neurobiologów do obrazowania in vivo sprzężenia nerwowo-naczyniowego20, patogenezy β-amyloidu21 i neuroimmunologii22. W tym protokole opisano procedury chirurgiczne mające na celu tworzenie ostrych (nieregeneracyjnych) i przewlekłych (regeneracyjnych) okien czaszkowych w czaszce myszy i szczura. Metodologie okien czaszkowych, szczególnie w przypadku eksperymentów przewlekłych, zostały dobrze udokumentowane23,24,25. Aby zachować spójność z istniejącą literaturą, terminy "ostry" i "przewlekły" będą używane w całym protokole. Konstrukcja przetworników pierścieniowych do obrazowania in vivo została również wcześniej opisana26. Pomimo dostępności tych technik i wglądu, który można uzyskać dzięki obrazowaniu w czasie rzeczywistym zabiegów ultradźwiękowych mikropęcherzyków, istnieje bardzo niewiele laboratoriów badawczych, które z powodzeniem opublikowały literaturę wykorzystującą tę technikę26,27,28,29,30,31,32. W związku z tym, w tym protokole, opisane są chirurgiczne i techniczne szczegóły przeprowadzania tych eksperymentów z mikrodźwiękami w czasie rzeczywistym. Podczas gdy określone parametry sonikacji i obrazowania zostały zoptymalizowane pod kątem eksperymentów z BBB, inne efekty ekspozycji ultradźwiękowej na mózg, takie jak neuromodulacja33,34, monitorowanie blaszek β-amyloidowych31 i odpowiedzi komórek odpornościowych32, można również badać za pomocą tej techniki.

<table><tbody><tr><td><mocny>Umiejscowienie przetwornika pierścieniowego</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza (proszek)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka lub kolba Erlenmeyera (50 ml)</td><td>VWR</td><td>213-0462 lub 214-1130</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy (żel)</td><td>Loctite</td><td>1363589</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane (13 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CB00130RA120MNT0</td><td>Szkiełko nakrywkowe do przetwornika pierścieniowego.</td></tr><tr><td>Płyta grzejna lub kuchenka mikrofalowa</td><td>Corning</td><td>PC-400D</td><td>Do podgrzewania roztworu agarozy.</td></tr><tr><td>PBS (1X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik pierścieniowy</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>Wykonany</td> na <td>zamówienie Wykonany na zamówienie. Np. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518</td></tr><tr><td>Korek gumowy</td><td>VWR</td><td>217-0867</td><td></td></tr><tr><td>Preparaty i leki dla zwierząt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine*A</td><td>Aspen</td><td>169912</td><td>Dawka: 1 mg/kg mc., wstrzyknięta miejscowo w miejsce nacięcia.</td></tr><tr><td>Buprenorfina*A</td><td>Indywidualna</td><td>521634</td><td>Dawka myszy: 0,05-0,1 mg/kg s.c., opioid, podawać przed operacją.</td></tr><tr><td>Buprenorfina*A</td><td>Indivior</td><td>521634</td><td>Dawka dla szczurów: 0,01-0,05 mg/kg, s.c.</td></tr><tr><td>Carprofen*C</td><td>Pfizer</td><td>DIN 02255693</td><td>Dawka: 5 mg/kg s.c., NLPZ, administracja po operacji.</td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Veet</td><td>N/A</td><td>Do całkowitego usuwania sierści po strzyżeniu.</td></tr><tr><td>Deksametazon*C</td><td>Sandoz</td><td>DIN 00664227, 2301</td><td>Dawka: 3 mg/kg, domięśniowo, kortykosteroid, zmniejsza obrzęk mózgu, podawać przed operacją.</td></tr><tr><td>Enrofloksacyna*C</td><td>Bayer</td><td>DIN: 02249243</td><td>Dawka: 5 mg/kg, i.p., antybiotyk, podawać po operacji.</td></tr><tr><td>Maszynki do strzyżenia futer</td><td>Aesculap</td><td>90200714</td><td>Exacta/Isis.</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Physitemp Instruments INC</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>ESDG9623C</td><td>Dawka: 3% indukcji, 1% konserwacji; znieczulenie.</td></tr><tr><td>Meloksykam*A</td><td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td><td>25388</td><td>Dawka myszy: 2-3 mg/kg, s.c., NLPZ, podać przed zabiegiem chirurgicznym.</td></tr><tr><td>Meloksykam*A</td><td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td><td>25388</td><td>Dawka dla szczurów: 1 mg/kg s.c.</td></tr><tr><td>Pulsoksymetr</td><td>STARR Life Sciences Corp</td><td>N/A</td><td>MouseOx.</td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna</td><td>Kopf</td><td>Kopf 900</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna maść okulistyczna</td><td>Th&eacute; a</td><td>597562</td><td>Viscotears.</td></tr><tr><td>Cewnik do żył ogonowych (24 G)</td><td>BD Neoflon</td><td>391350</td><td></td></tr><tr><td>* Przed użyciem należy omówić dawkowanie i rodzaj podawania z lekarzem weterynarii. A W przypadku ostrych operacji okiennych, C Do przewlekłych operacji okiennych. Dawki dla myszy i szczurów są takie same, chyba że określono inaczej.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><mocny>Materiał i sprzęt do umieszczania okien czaszkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waciki nasączone alkoholem</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione cienkie nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Waciki bawełniane lub bez włókien</td><td>Chemtronics</td><td>CX50</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy (żel)</td><td>Loctite</td><td>1594457 (żel), 230992 (płyn)</td><td>Jeśli nie jest dostępny, płynny klej cyjanoakrylowy można zmieszać z bardzo drobnym proszkiem akrylowym.</td></tr><tr><td>Cement dentystyczny</td><td>Lang Dental</td><td>Jet Set-4 Pakiet</td><td></td>do naprawy protez</tr><tr><td>Wiertarka ręczna z mikrosilnikiem dentystycznym</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070-2</td><td>Zestaw mikrosilnika obrotowego o dużej prędkości z tuleją zaciskową 2,35 mm.</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10, 11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CB00050RA120MNT0 (5 mm)</td><td>Okna czaszkowe myszy.</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CB00080RA120MNT0 (8 mm)</td><td>Okna czaszkowe dla szczurów.</td></tr><tr><td>Mikro frezy (0,5 mm)</td><td>Meisinger</td><td>HM71005 (0,5 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofrezy (0,7 mm)</td><td>Meisinger</td><td>HM71007 (0,7 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgiczna gąbka żelatynowa</td><td>Ethicon</td><td>MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond Klej tkankowy</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Łodzie wagowe / tace</td><td>VWR</td><td>10803-148</td><td></td></tr><tr><td>* W przypadku przewlekłych operacji okna czaszkowego należy stosować obłożenia, narzędzia, materiały i fartuchy w autoklawie, a także sterylne rękawice chirurgiczne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silna>mikroskopia wielofotonowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x obiektyw do zanurzenia w wodzie</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN20 XW</td><td>Apertura numeryczna 1,0, odległość robocza 2,0 mm.</td></tr><tr><td>Dekstran fluorescencyjny (np. FITC 70 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46945</td><td>Zalecany 10 kDa-2 MDa.</td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee Ti:Szafirowy oscylator laserowy</td><td>Spectra-Physics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop SliceScope</td><td>Scientifica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Leczenie ultradźwiękowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 dB Wzmacniacz RF</td><td>E& I</td><td>2100L</td><td></td></tr><tr><td>Obwód pasujący</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>Wykonany</td> na <td>zamówienie.</td></tr><tr><td>Mikropęcherzyki</td><td>Bracco Imaging</td><td>N/A</td><td>SonoVue (Bracco Imaging, Europa). Dawka 1 ml/kg.</td></tr><tr><td>Mikropęcherzyki</td><td>Lantheus</td><td>N/A</td><td>Definity (Lantheus Medical Imaging, Ameryka Północna). Dawka 0,02-0,04 ml/kg.</td></tr><tr><td>Generator sygnału</td><td>Agilent Technologies</td><td>33500B</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia wielofotonowa w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzyków w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

Bariera krew-mózg (BBB) jest kluczowym wyzwaniem dla skutecznego dostarczania leków do mózgu. Ekspozycja na ultradźwięki w obecności mikropęcherzyków stała się skuteczną metodą przejściowego i miejscowego zwiększania przepuszczalności bariery krew-mózg, ułatwiając para- i transkomórkowy transport leków przez barierę krew-mózg. Obrazowanie układu krwionośnego podczas leczenia ultradźwiękami i mikropęcherzykami dostarczy cennych i nowatorskich informacji na temat mechanizmów i dynamiki zabiegów ultradźwiękowych z mikropęcherzykami w mózgu.
Tutaj prezentujemy eksperymentalną procedurę dla przyżyciowej mikroskopii wielofotonowej przy użyciu okna czaszki ustawionego w jednej linii z przetwornikiem pierścieniowym i soczewką obiektywową o powiększeniu 20x. Taka konfiguracja umożliwia obrazowanie mózgu w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej podczas zabiegów ultradźwiękowych z mikropęcherzykami. Dostęp optyczny do mózgu uzyskuje się przez otwarte okno czaszkowe. Na krótko usuwa się fragment czaszki o średnicy 3-4 mm, a odsłonięty obszar mózgu uszczelnia się szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Przetwornik pierścieniowy 0,82 MHz, który jest przymocowany do drugiego szklanego szkiełka nakrywkowego, jest zamontowany na górze. Agaroza (1% w/v) jest stosowana między szkiełkiem nakrywkowym przetwornika a szkiełkiem nakrywkowym zakrywającym okienko czaszki, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, które utrudniają propagację ultradźwięków. W przypadku stosowania sterylnych zabiegów chirurgicznych i środków przeciwzapalnych, zabiegi ultradźwiękowo-mikropęcherzykowe i sesje obrazowania mogą być wykonywane wielokrotnie przez kilka tygodni. Fluorescencyjne koniugaty dekstranu są wstrzykiwane dożylnie w celu uwidocznienia układu naczyniowego i ilościowego określenia efektów wywołanych mikropęcherzykami ultradźwiękowymi (np. kinetyka wycieku, zmiany naczyniowe). W tym artykule opisano umiejscowienie okienka czaszkowego, umiejscowienie przetwornika pierścieniowego, procedurę obrazowania, typowe kroki rozwiązywania problemów, a także zalety i ograniczenia tej metody.

Skuteczność zabiegów z użyciem ultradźwięków i mikropęcherzyków można wykryć poprzez ekstrawasację fluorescencyjnego dekstranu z przestrzeni wewnątrznaczyniowej do pozanaczyniowej (Rysunek 8), co wskazuje na zwiększenie przepuszczalności bariery krew-mózg (BBB). W zależności od pola ciśnienia przetwornika pierścieniowego, oddziaływanie obejmie naczynia oponowe i/lub naczynia włosowate.
Aby ocenić zmiany naczyniowe wywołane zabiegami z użyciem ultradźwięków i mikropęcherzyków, można zmierzyć średnicę badanego naczynia przed, w trakcie i po zabiegu (Rysunek 9). Można to wykonać ręcznie w komercyjnie dostępnym oprogramowaniu (np. oprogramowaniu Olympus Fluoview). Podczas akwizycji obrazów można również zastosować bolusowe iniekcje dekstranu oraz skanowanie liniowe w celu oceny przepływu krwi30,41. Aby ocenić kinetykę wycieku dekstranu jako reprezentatywny model dostarczania leków, można przeanalizować intensywność sygnału pomiędzy przestrzenią wewnątrznaczyniową a pozanaczyniową, korzystając z narzędzi takich jak MATLAB26,27,29,41 (Rysunek 10).
Dalsze przetwarzanie obrazów można przeprowadzić przy użyciu programu ImageJ/FIJI. ImageJ/FIJI to oprogramowanie open-source kompatybilne z MATLAB, które doskonale nadaje się do przeprowadzania powszechnych analiz w obrazowaniu biologicznym, takich jak pomiar zmian naczyniowych, długości obiektów fluorescencyjnych lub odległości między nimi (np. od blaszek β-amyloidu do naczyń krwionośnych). Potoki przetwarzania obrazów utworzone w ImageJ/FIJI można zautomatyzować poprzez pisanie własnych makr.
Bardziej złożone analizy, takie jak segmentacja 3D naczyń krwionośnych i śledzenie komórek, można przeprowadzić przy użyciu bardziej zaawansowanego oprogramowania półautomatycznego (Rysunek 11). Po segmentacji można przeprowadzić bardziej szczegółowe analizy, takie jak klasyfikacja naczyń krwionośnych jako tętniczek, żyłek lub naczyń włosowatych, w oparciu o średnicę, rozgałęzienia, wzorce krętości i kierunek przepływu42,43. Opracowano również algorytmy uczenia maszynowego w celu automatyzacji segmentacji naczyń krwionośnych22,44.
<img alt="Przygotowanie zwierząt i proces obrazowania u myszy i szczurów, w tym iniekcje dekstranu i mikropęcherzyków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ogólny schemat intravitalnych eksperymentów obrazowania wielofotonowego z wykorzystaniem ultradźwięków i mikropęcherzyków w mózgu. Przedstawiono ogólny schemat intravitalnych eksperymentów obrazowania wielofotonowego z wykorzystaniem ultradźwięków i mikropęcherzyków w mózgu opisanych w niniejszym protokole. Proces składa się z 6 etapów: (A) przygotowanie zwierząt dla (A1) myszy i (A2) szczurów, (B) iniekcja dekstranu, (C) iniekcja mikropęcherzyków, (D) obrazowanie przed zabiegiem, (E) zabieg i obrazowanie, (F) obrazowanie po zabiegu i analiza danych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat układu detekcji ultradźwiękowej z formą wydrukowaną w technologii 3D, przetwornikiem pierścieniowym, szkiełkiem podstawowym i elementami klejącymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przekrój i widok z góry formy wydrukowanej w technologii 3D. (A) Przekrój formy. Cienka warstwa kleju cyjanoakrylowego jest nakładana na górną powierzchnię przetwornika pierścieniowego, a na wierzchu umieszczane jest szkiełko podstawowe. Do wywarcia silnego, równomiernego nacisku na szkiełko podstawowe i przetwornik pierścieniowy można użyć stempla. (B) Widok z góry formy. W formie można dodać wycięcie, aby ułatwić wyjęcie przygotowanego przetwornika. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat układu modulacji ultradźwiękowej; przetwornik pierścieniowy, generator sygnałowy, wzmacniacz, model mysi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Układ ultradźwiękowy. Przedstawiono typowy sprzęt stosowany w eksperymentach ultradźwiękowych. Parametry ultradźwięków są ustawiane i wyzwalane przez generator sygnałowy, a następnie wzmacniane przez wzmacniacz. Do rejestracji mocy przedniej i odbitej przed przesłaniem sygnału do dopasowującego pudełka (matching box), które jest dopasowane do przetwornika, można użyć miernika mocy. Wszystkie połączenia są realizowane za pomocą kabli BNC, chyba że wskazano inaczej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie eksperymentalne ekspozycji tkanek w metodach chirurgicznych, wyniki przed i po operacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obszar usuwania futra i usuwania skóry głowy. (A) Usuwanie futra należy rozpocząć pomiędzy oczami i kontynuować aż do przedniej połowy szyi. (B) Usuwanie skóry głowy powinno być wystarczające, aby odsłonić kości ciemieniowe. Przed kontynuowaniem należy zatamować krwawienie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Procedura operacji czaszkowej u gryzonia; konfiguracja eksperymentalna, porównanie metodologii chirurgicznej A vs B." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Schemat okna czaszkowego. Okno czaszkowe znajduje się na kości ciemieniowej. (A) Na czaszce można narysować obrys okna czaszkowego, aby ułatwić proces wiercenia. (B) Obrys okna czaszkowego jest widoczny po wywierceniu otworu w kości zbitej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Procedura chirurgiczna na czaszce szczura, schemat pokazujący etapy rozmieszczenia urządzenia do badań mózgu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Okno czaszkowe i wyrównanie przetwornika. (A) Okno czaszkowe zostaje utworzone na kości ciemieniowej. Wycięto wysepkę kostną, odsłaniając znajdujący się pod nią mózg. (B) Okno czaszkowe jest gotowe po uszczelnieniu szkiełka podstawowego na czaszce za pomocą kleju cyjanoakrylanowego. (C) Przetwornik zostaje wycentrowany względem okna czaszkowego i przyklejony za pomocą kleju cyjanoakrylanowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie mózgu myszy; mikroskopia fluorescencyjna; wzbudzenie optyczne; model gryzoni; układ eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Pozycjonowanie obiektywu i przetwornika. (A,B) Obiektyw jest wycentrowany względem pierścieniowego przetwornika. (C) Naczynia krwionośne wypełnione fluorescencyjnym dekstranem są widoczne przez okulary w trybie epifluorescencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopowe obrazowanie naczyniowe, porównanie A-B, oświetlenie w polu jasnym, obserwacja strukturalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Obrazy wielofotonowe z maksymalną projekcją ukazujące wzrost przepuszczalności BBB indukowany ultradźwiękami i mikropęcherzykami. Obrazy z maksymalną projekcją naczyń krwionośnych (A) przed i (B) po zabiegach z użyciem ultradźwięków i mikropęcherzyków. Skuteczność zabiegów z użyciem ultradźwięków i mikropęcherzyków można potwierdzić, obserwując wzrost przepuszczalności BBB po zabiegu, widoczny jako ekstrawasacja fluorescencyjnego dekstranu (strzałki). Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wpływ ultradźwięków na sieć włókien; wykres przekroju intensywności w funkcji średnicy; wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9: Analiza wasomodulacji wywołanej zabiegami z użyciem ultradźwięków i mikropęcherzyków. Obrazy maksymalnej projekcji naczyń krwionośnych mózgu przed, w trakcie i po zabiegach z użyciem ultradźwięków i mikropęcherzyków. Mikropęcherzyki są obecne na wszystkich obrazach. W porównaniu do warunków przed zabiegiem (A), wyraźną wasomodulację można zaobserwować (B) w trakcie zabiegów z użyciem ultradźwięków i mikropęcherzyków (czerwone strzałki). Zwiększenie przepuszczalności BBB zapośredniczone przez ultradźwięki i mikropęcherzyki jest również widoczne po zabiegu w postaci wycieku fluorescencyjnego dekstranu z przestrzeni wewnątrznaczyniowej do przestrzeni zewnątrznaczyniowej (żółte strzałki). (C) Po wyłączeniu ultradźwięków średnice naczyń wracają do wartości bazowych sprzed zabiegu. (D) Zmiany naczyniowe można analizować, wykreślając średnicę interesującego naczynia przed, w trakcie i po zabiegu z użyciem ultradźwięków i mikropęcherzyków. Pasek skali: 100 µm. (Praca niepublikowana). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia naczyń krwionośnych z kinetyką ekstrawazacji; wykres przedstawia intensywność szybką, trwałą i wolną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10: Analiza kinetyki przecieku po zabiegach z użyciem ultradźwięków i mikropęcherzyków. Zwiększenie przepuszczalności BBB jest wizualizowane jako przeciek fluorescencyjnego dekstranu z przestrzeni wewnątrznaczyniowej do przestrzeni zewnątrznaczyniowej. Zmiany w przepuszczalności BBB są widoczne przy porównaniu stosów obrazów uzyskanych (A) przed i (B) po zabiegach z użyciem ultradźwięków i mikropęcherzyków. (C) Kinetykę przecieku można analizować poprzez śledzenie intensywności, objętości i prędkości dekstranu w przedziałach zewnątrznaczyniowych (żółty prostokąt). Pasek skali: 50 µm. (Praca niepublikowana.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej porównujące struktury naczyniowe w tkance; schemat przedstawia sieć 3D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig11.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 11"> 
Rysunek 11: Segmentacja naczyń krwionośnych ze stosu XYZ mikroskopii wielofotonowej. (A) Stos głębokości (XYZ) naczyń krwionośnych u transgenicznego szczura EGFP. Naczynia krwionośne są wizualizowane poprzez dożylne wstrzyknięcie fluorescencyjnego dekstranu Texas Red 70 kDa (czerwony). Kanał zielony pokazuje fluorescencyjne komórki oraz autofluorescencję tkanki. (B) Utworzono rekonstrukcje 3D naczyń krwionośnych, a następnie zakodowano je kolorami w zależności od typu naczynia, aby ułatwić analizy specyficzne dla danego typu. Żyły/żyłki są niebieskie, tętnice/tętniczki są czerwone, a kapilary są cyjanowe. Pasek skali: 50 µm. Rekonstrukcje wykonane przy użyciu Bitplane Imaris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje procedury chirurgiczne i techniczne, które umożliwiają w czasie rzeczywistym wielofotonowe obrazowanie fluorescencyjne mózgu gryzonia podczas skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzykowych w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg.

Mikroskopia wielofotonowa w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzyków w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Ekspozycja na ultradźwięki w obecności mikropęcherzyków stała się skuteczną metodą przejściowego i miejscowego zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg. Zwykle bariera krew-mózg utrudnia dostarczanie potencjalnych leków na kilka chorób mózgu. Po sonikacji wstrzyknięte mikropęcherzyki zaczynają oscylować i indukować napięcie na ścianie naczynia, otwierając ciasne połączenia i ostatecznie umożliwiając lekom przejście przez barierę krew-mózg W modelach przedklinicznych efekt ultradźwięków i leczenia mikropęcherzykami jest często badany za pomocą rezonansu magnetycznego wzmocnionego kontrastem lub przez badanie wynaczynienia barwników ex vivo.Wadą tego podejścia jest to, że nie można uzyskać odpowiedzi w czasie rzeczywistym podczas i bezpośrednio po ekspozycji na ultradźwięki. Przyżyciowe obrazowanie wielofotonowe mózgu daje możliwość badania tych efektów w czasie rzeczywistym. W poniższym filmie przedstawimy krok po kroku, jak umieścić okienko czaszkowe u myszy i wykonać zabieg ultradźwiękowy mikropęcherzyków za pomocą przetwornika pierścieniowego zamontowanego na czaszce.Procedura ta umożliwia jednoczesną sonikację i obrazowanie wielofotonowe in vivo. Na początek przygotuj materiały potrzebne do operacji okna czaszkowego i zabiegów mikropęcherzyków ultradźwiękowych. W tym filmie pokazujemy ostrą operację okna czaszkowego, która nie daje się zregenerować.Do przewlekłej rekonwalescencji po operacji okna czaszkowego niezbędne są wysterylizowane narzędzia i materiały, sterylna przestrzeń chirurgiczna i odpowiednie leki. Przed zabiegiem należy podać znieczulenie i środek przeciwbólowy. Usuń futro z głowy.Umieść zwierzę w stereotaktycznej ramce. Wprowadzić cewnik do żyły ogonowej w celu wstrzyknięć dekstranu i mikropęcherzyków. Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 stopni, korzystając ze źródła ciepła.Tutaj używamy rękawicy wypełnionej ciepłą wodą. Aby usunąć skórę głowy, unieś skórę między oczami za pomocą kleszczy i przetnij wzdłuż szwu strzałkowego. Usuń okostną pokrywającą zewnętrzną powierzchnię czaszki bawełnianym wacikiem.Następnie zaznacz żądane położenie okna czaszki na czaszce i rozpocznij wiercenie wzdłuż konturu. Aby zapobiec przegrzaniu czaszki podczas wiercenia, należy wlać sól fizjologiczną na czaszkę za pomocą strzykawki lub nałożyć kawałek gąbki chirurgicznej nasączonej solą fizjologiczną. Na przemian wiercić i schładzać czaszkę.Sprawdź postęp wiercenia, delikatnie uciskając wyspę kostną. Usuń wyspę kostną za pomocą kleszczy. Upewnij się, że mózg jest wilgotny, używając kawałka gąbki chirurgicznej, która została wstępnie nasączona solą fizjologiczną.Aby umieścić okienko czaszki, umieść kroplę soli fizjologicznej po jednej stronie szkiełka nakrywkowego i manewruj nią nad otworem w czaszce. Rozprowadź warstwę kleju na obwodzie szkiełka nakrywkowego, aby przymocować go do czaszki. Gdy klej całkowicie wyschnie, nałóż roztwór agarozy na okienko i umieść przetwornik na górze.Zastosuj mocny nacisk, aby między przetwornikiem a okienkiem czaszki była minimalna agaroza. Gdy agaroza ostygnie do konsystencji przypominającej galaretkę, odetnij nadmiar agarozy z obwodów szkiełka nakrywkowego przetwornika. Rozprowadź warstwę kleju wzdłuż obwodu szkiełka nakrywkowego przetwornika, aby przykleić go do czaszki.Po całkowitym wyschnięciu kleju umieść zwierzę pod soczewką obiektywu mikroskopu. Upewnij się, że obiektyw nie koliduje z przetwornikiem lub szkiełkiem nakrywkowym. Wybierz pole widzenia w mikroskopie wielofotonowym.Wykonaj badanie obrazowe układu krwionośnego i rozpocznij sonikację. Do tego protokołu używamy przetwornika pierścieniowego, który działa z częstotliwością sterowania 0,82 megaherca, 10-milisekundowymi cyklami indeksowanymi mechanicznie od 0,2 do 0,4 oraz częstotliwościami powtarzania impulsów od jednego do czterech herców. Mikropęcherzyki Sonovue wstrzykuje się w dawce jednego mililitra na kilogram.Skuteczne zabiegi mikropęcherzyków ultradźwiękowych można wykryć poprzez wynaczynienie fluorescencyjnego dekstranu z przestrzeni wewnątrznaczyniowej do przestrzeni pozanaczyniowej, co wskazuje na wzrost przepuszczalności BBB. Aby ocenić kinetykę wycieku dekstranu jako reprezentatywny model dostarczania leków, intensywność sygnału między przestrzenią wewnątrz- i zewnątrznaczyniową można ocenić za pomocą narzędzi takich jak MATLAB. Aby ocenić zmiany naczyniowe wywołane zabiegami mikropęcherzyków ultradźwiękowych, można zmierzyć średnicę naczynia będącego przedmiotem zainteresowania przed, w trakcie i po zabiegu mikropęcherzykami ultradźwiękowymi.Analizę obrazu można przeprowadzić za pomocą oprogramowania takiego jak ImageJ, FIJI lub narzędzi programistycznych. Tutaj Imaris był używany do segmentacji i klasyfikacji naczyń krwionośnych. Przyżyciowa mikroskopia wielofotonowa mózgu w połączeniu z przetwornikami pierścieniowymi zapewnia metodę monitorowania efektów wywołanych przez leczenie mikropęcherzykami ultradźwiękowymi w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.Dane ilościowe i jakościowe można uzyskać w celu zbadania np. kinetyki wynaczynienia i zmian naczyniowych. Przedstawiona tu metoda eksperymentalna może być zastosowana do kilku modeli badawczych oraz do różnych zastosowań ultrasonograficznych.

real-time-intravital-multiphoton-microscopy-to-visualize-focused

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Insonacja mikropęcherzyków jest obiecującą strategią ablacji guzów przy zredukowanej średniej mocy akustycznej, a także ukierunkowanego dostarczania leków. Celem niniejszego badania jest opracowanie strategii impulsowania ultradźwiękami o niskim cyklu pracy oraz nanonośników w celu maksymalizacji nietermicznej ablacji mikro naczyniowej i dostarczania ładunku do podskórnych glejaków C6.

Porównanie ukierunkowanego leczenia glejaków u myszy z wykorzystaniem ultradźwięków poprzez dostarczanie nanocząsteczek z lekiem oraz ablację mikro naczyniową

Wywoływanie przerwania bariery krew-mózg (BBB) za pomocą skupionego ultradźwięku z wykorzystaniem mikropęcherzyków jest obiecującą techniką nieinwazyjnego, celowanego dostarczania leków do mózgu1-3. Niniejszy protokół opisuje procedurę eksperymentalną dla transkranialnego przerwania BBB pod kontrolą MRI w modelu szczura.

Przełamywanie bariery krew-mózg pod kontrolą MRI z użyciem przezczaszkowego ultradźwiękowego ogniskowania w modelu szczura

Ten film opisuje metodę tymczasowego zakłócania bariery krew-mózg (BBB) poprzez tworzenie przejściowych otworów za pomocą zogniskowanych ultradźwięków za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS). Te przejściowe lokalne otwory BBB mogą ostatecznie zostać wykorzystane do dostarczania większych cząsteczek leku bezpośrednio do miąższu mózgu.

Focus Ultrasounds Mikropęcherzykowe otwieranie bariery krew-mózg: technika tworzenia zlokalizowanych przejściowych otworów w barierze krew-mózg myszy za pomocą sonoporacji

Obecna praca opisuje nowy protokół do wykonywania nieinwazyjnych ultradźwięków o wysokiej częstotliwości i obrazowania fotoakustycznego na mózgu szczura, aby efektywnie wizualizować głębokie obszary podkorowe i ich wzorce naczyniowe poprzez kierowanie sygnałów na otwór czaszki naturalnie występujący na zwierzęcej czaszce.

Nieinwazyjne miąższowe, naczyniowe i metaboliczne ultrasonografie wysokiej częstotliwości i fotoakustyczne obrazowanie głębokiego mózgu szczura

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Skoncentrowane ultradźwięki z mikropęcherzykami mogą otworzyć barierę krew-mózg punktowo i przejściowo. Technika ta została wykorzystana do dostarczania szerokiej gamy środków przez barierę krew-mózg. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół miejscowego dostarczania do mózgu gryzonia z lub bez wskazówek MRI.

Podejście laboratoryjne do specyficznego dla lokalizacji otworu bariery krew-mózg przy użyciu zogniskowanych ultradźwięków w modelu szczurzym

Bariera krew-mózg (BBB) może być tymczasowo przerwana za pomocą skoncentrowanych ultradźwięków za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS). W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół wysokoprzepustowego otwierania BBB in vivo przy użyciu modułowego systemu FUS dostępnego dla ekspertów niebędących ekspertami w dziedzinie ultrasonografii.

Wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni

Ten protokół określa kroki niezbędne do dostarczenia genu poprzez skoncentrowanie ultradźwięków na otwarciu bariery krew-mózg (BBB), ocenę wynikowej ekspresji genu oraz pomiar aktywności neuromodulacyjnej receptorów chemogenetycznych za pomocą testów histologicznych.

Zogniskowane ultradźwięki indukowane otwieraniem bariery krew-mózg w celu celowania w struktury mózgu i oceny neuromodulacji chemogenetycznej

Przedstawione protokoły mogą być użyte do scharakteryzowania reakcji znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków przeznaczonych do zastosowań związanych z dostarczaniem leków wyzwalanych ultradźwiękami, w tym ich mechanizmów aktywacji, jak również ich efektów biologicznych. W artykule omówiono szereg technik mikroskopii in vitro i in vivo wykonanych w celu uchwycenia odpowiednich długości i skal czasowych.

Wieloczasowe metody mikroskopowe do charakterystyki mikropęcherzyków znakowanych fluorescencyjnie do uwalniania leków wywołanego ultradźwiękami

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

To badanie opisuje połączone obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i protokół ultradźwięków o niskiej intensywności (FUS), wykorzystujący żywe szczury z cewnikowaniem żyły szyjnej do monitorowania otwarcia bariery krew-mózg (BBB).

Monitorowanie otwarcia bariery krew-mózg u szczurów za pomocą przedklinicznego systemu ultrasonograficznego

Poznaj metodę mikroskopii wielofotonowej w czasie rzeczywistym do wizualizacji przepuszczalności bariery krew-mózg u myszy podczas zabiegów ultradźwiękowych z mikropęcherzykami. Technika ta umożliwia badanie dostarczania leków do mózgu.

Mikroskopia wielofotonowa w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzyków w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg (Wideo) | JoVE Journal

Mikroskopia wielofotonowa w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzyków w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg

Przeglądaj więcej filmów