Mikroskopia wielofotonowa w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzyków w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg
5 lutego 2022
Ten protokół opisuje procedury chirurgiczne i techniczne, które umożliwiają w czasie rzeczywistym wielofotonowe obrazowanie fluorescencyjne mózgu gryzonia podczas skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzykowych w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg.
Ekspozycja na ultradźwięki w obecności mikropęcherzyków stała się skuteczną metodą przejściowego i miejscowego zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg. Zwykle bariera krew-mózg utrudnia dostarczanie potencjalnych leków na kilka chorób mózgu. Po sonikacji wstrzyknięte mikropęcherzyki zaczynają oscylować i indukować napięcie na ścianie naczynia, otwierając ciasne połączenia i ostatecznie umożliwiając lekom przejście przez barierę krew-mózg W modelach przedklinicznych efekt ultradźwięków i leczenia mikropęcherzykami jest często badany za pomocą rezonansu magnetycznego wzmocnionego kontrastem lub przez badanie wynaczynienia barwników ex vivo.
Wadą tego podejścia jest to, że nie można uzyskać odpowiedzi w czasie rzeczywistym podczas i bezpośrednio po ekspozycji na ultradźwięki. Przyżyciowe obrazowanie wielofotonowe mózgu daje możliwość badania tych efektów w czasie rzeczywistym. W poniższym filmie przedstawimy krok po kroku, jak umieścić okienko czaszkowe u myszy i wykonać zabieg ultradźwiękowy mikropęcherzyków za pomocą przetwornika pierścieniowego zamontowanego na czaszce.
Procedura ta umożliwia jednoczesną sonikację i obrazowanie wielofotonowe in vivo. Na początek przygotuj materiały potrzebne do operacji okna czaszkowego i zabiegów mikropęcherzyków ultradźwiękowych. W tym filmie pokazujemy ostrą operację okna czaszkowego, która nie daje się zregenerować.
Do przewlekłej rekonwalescencji po operacji okna czaszkowego niezbędne są wysterylizowane narzędzia i materiały, sterylna przestrzeń chirurgiczna i odpowiednie leki. Przed zabiegiem należy podać znieczulenie i środek przeciwbólowy. Usuń futro z głowy.
Umieść zwierzę w stereotaktycznej ramce. Wprowadzić cewnik do żyły ogonowej w celu wstrzyknięć dekstranu i mikropęcherzyków. Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 stopni, korzystając ze źródła ciepła.
Tutaj używamy rękawicy wypełnionej ciepłą wodą. Aby usunąć skórę głowy, unieś skórę między oczami za pomocą kleszczy i przetnij wzdłuż szwu strzałkowego. Usuń okostną pokrywającą zewnętrzną powierzchnię czaszki bawełnianym wacikiem.
Następnie zaznacz żądane położenie okna czaszki na czaszce i rozpocznij wiercenie wzdłuż konturu. Aby zapobiec przegrzaniu czaszki podczas wiercenia, należy wlać sól fizjologiczną na czaszkę za pomocą strzykawki lub nałożyć kawałek gąbki chirurgicznej nasączonej solą fizjologiczną. Na przemian wiercić i schładzać czaszkę.
Sprawdź postęp wiercenia, delikatnie uciskając wyspę kostną. Usuń wyspę kostną za pomocą kleszczy. Upewnij się, że mózg jest wilgotny, używając kawałka gąbki chirurgicznej, która została wstępnie nasączona solą fizjologiczną.
Aby umieścić okienko czaszki, umieść kroplę soli fizjologicznej po jednej stronie szkiełka nakrywkowego i manewruj nią nad otworem w czaszce. Rozprowadź warstwę kleju na obwodzie szkiełka nakrywkowego, aby przymocować go do czaszki. Gdy klej całkowicie wyschnie, nałóż roztwór agarozy na okienko i umieść przetwornik na górze.
Zastosuj mocny nacisk, aby między przetwornikiem a okienkiem czaszki była minimalna agaroza. Gdy agaroza ostygnie do konsystencji przypominającej galaretkę, odetnij nadmiar agarozy z obwodów szkiełka nakrywkowego przetwornika. Rozprowadź warstwę kleju wzdłuż obwodu szkiełka nakrywkowego przetwornika, aby przykleić go do czaszki.
Po całkowitym wyschnięciu kleju umieść zwierzę pod soczewką obiektywu mikroskopu. Upewnij się, że obiektyw nie koliduje z przetwornikiem lub szkiełkiem nakrywkowym. Wybierz pole widzenia w mikroskopie wielofotonowym.
Wykonaj badanie obrazowe układu krwionośnego i rozpocznij sonikację. Do tego protokołu używamy przetwornika pierścieniowego, który działa z częstotliwością sterowania 0,82 megaherca, 10-milisekundowymi cyklami indeksowanymi mechanicznie od 0,2 do 0,4 oraz częstotliwościami powtarzania impulsów od jednego do czterech herców. Mikropęcherzyki Sonovue wstrzykuje się w dawce jednego mililitra na kilogram.
Skuteczne zabiegi mikropęcherzyków ultradźwiękowych można wykryć poprzez wynaczynienie fluorescencyjnego dekstranu z przestrzeni wewnątrznaczyniowej do przestrzeni pozanaczyniowej, co wskazuje na wzrost przepuszczalności BBB. Aby ocenić kinetykę wycieku dekstranu jako reprezentatywny model dostarczania leków, intensywność sygnału między przestrzenią wewnątrz- i zewnątrznaczyniową można ocenić za pomocą narzędzi takich jak MATLAB. Aby ocenić zmiany naczyniowe wywołane zabiegami mikropęcherzyków ultradźwiękowych, można zmierzyć średnicę naczynia będącego przedmiotem zainteresowania przed, w trakcie i po zabiegu mikropęcherzykami ultradźwiękowymi.
Analizę obrazu można przeprowadzić za pomocą oprogramowania takiego jak ImageJ, FIJI lub narzędzi programistycznych. Tutaj Imaris był używany do segmentacji i klasyfikacji naczyń krwionośnych. Przyżyciowa mikroskopia wielofotonowa mózgu w połączeniu z przetwornikami pierścieniowymi zapewnia metodę monitorowania efektów wywołanych przez leczenie mikropęcherzykami ultradźwiękowymi w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.
Dane ilościowe i jakościowe można uzyskać w celu zbadania np. kinetyki wynaczynienia i zmian naczyniowych. Przedstawiona tu metoda eksperymentalna może być zastosowana do kilku modeli badawczych oraz do różnych zastosowań ultrasonograficznych.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje procedury obrazowania fluorescencyjnego wielofotonowego in vivo w czasie rzeczywistym w mózgu gryzoni podczas zabiegów z użyciem skoncentrowanego ultradźwięku i mikropęcherzyków. Technika ta ma na celu zwiększenie przepuszczalności bariery krew-mózg, co ułatwia dostarczanie leków w chorobach mózgu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Inżynieria biomedyczna
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Ultradźwięki i mikropęcherzyki mogą przejściowo zwiększać przepuszczalność bariery krew-mózg.
- Metoda ta umożliwia lepsze dostarczanie leków do mózgu.
- Tradycyjne metody obrazowania nie pozwalają na rejestrację odpowiedzi w czasie rzeczywistym podczas leczenia.
- Intrawitalne obrazowanie wielofotonowe stanowi rozwiązanie umożliwiające obserwację w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- W celu zademonstrowania protokołu jednoczesnego zastosowania ultrasonografii i obrazowania wielofotonowego.
- W celu umożliwienia monitorowania w czasie rzeczywistym zmian przepuszczalności bariery krew-mózg.
- W celu oceny skuteczności metod dostarczania leków w modelach przedklinicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie okna czaszkowego u myszy do obrazowania.
- Zastosowanie przetwornika pierścieniowego do aplikacji ultradźwięków.
- Iniekcja mikropęcherzyków i fluroscencyjnego dekstranu do obrazowania.
- Obrazowanie zmian naczyniowych w czasie rzeczywistym podczas leczenia.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie zmian przepuszczalności bariery krew-mózg.
- Ilościowa analiza wycieku dekstranu jako modelu dostarczania leków.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym reakcji naczyniowych na zabieg ultradźwiękowy.
- Osiągnięcie wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w obrazowaniu.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia efektywne obrazowanie mózgu gryzoni w czasie rzeczywistym.
- Zastosowanie mikrobąbelków ultradźwiękowych może zwiększyć dostarczanie leków przez barierę krew-mózg.
- Metoda ta może być stosowana w różnych modelach badawczych i zastosowaniach ultradźwiękowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Multiphotonowa mikroskopia intravitalna w czasie rzeczywistym umożliwia bezpośrednią wizualizację zmian przepuszczalności bariery krew-mózg indukowanych przez skupioną wiązkę ultradźwięków i mikropęcherzyki, rozwiązując tym samym krytyczny problem w dostarczaniu leków do ośrodkowego układu nerwowego. Podejście to zapewnia ilościowe, dynamiczne odczyty przepuszczalności naczyniowej oraz kinetyki ekstrawazacji, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w strategiach dostarczania wspomaganego ultradźwiękami. Dzięki jednoczesnemu prowadzeniu terapii i obrazowania, metoda ta zwiększa wiarygodność prognostyczną w przedklinicznych procesach walidacji celów oraz optymalizacji wiodących związków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezpośrednią obserwację mechanizmów oddziaływania ultradźwięków i mikropęcherzyków na integralność naczyniową in vivo.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez korelację parametrów sonikacji z wynikami przepuszczalności bariery w czasie rzeczywistym.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez kwantyfikację wycieku dekstranu jako wskaźnika wydajności dostarczania leków w modelach BBB.
Przesiew i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zestandaryzowanych systemów biologicznych do dalszej oceny związków poprzez ustalenie bazowych profili odpowiedzi naczyniowej.
- Wyniki ilościowe: Umożliwienie pomiaru kinetyki przecieku oraz zmian średnicy naczyń, co zapewnia powtarzalne i skalowalne odczyty służące do optymalizacji analizy.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Wsparcie dla wielokrotnych sesji obrazowania w odstępach tygodniowych, co pozwala na podłużne przesiewanie środków dostarczania w spójnych warunkach fizjologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modeluje istotne dla ludzi wyzwania związane z przepuszczalnością BBB w systemach przedklinicznych, zgodnie z translacyjnymi strategiami biomarkerów dla wskazań CNS.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia dynamikę czasowo-przestrzenną otwierania bariery, zmniejszając niepewność w ocenach zależności dawka-odpowiedź oraz bezpieczeństwa.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy etap odkrywania z walidacją przedkliniczną, dostarczając danych o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym na temat zmian naczyniowych podczas leczenia.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z continuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, zapewniając w czasie rzeczywistym biofizyczną informację zwrotną na temat skuteczności mechanizmu dostarczania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących parametrów ultradźwięków i charakterystyki mikropęcherzyków w kontekście przepuszczalności naczyniowej w nienaruszonej tkance nerwowej.
- Przesiewanie: Dostarcza systemy gotowe do analizy ze zestandaryzowanym dostępem naczyniowym i odczytami przepuszczalności w czasie rzeczywistym w celu oceny związków.
- Analityka: Generuje ilościowe dane dotyczące ekstrawazacji dekstranu i morfometrii naczyniowej, umożliwiając porównania między różnymi warunkami oraz modelowanie zależności dawka-odpowiedź.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez rejestrację dynamicznych odpowiedzi BBB, które są predykcyjne dla dystrybucji leków in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania do iteracyjnego udoskonalania protokołów skupionego ultradźwięku w ramach wielu projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w procesie otwierania BBB za pomocą ultradźwięków.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanemu oknu czaszkowemu, sprzężeniu przetwornika oraz parametrom obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go, dostarczając bezpośrednich dowodów w czasie rzeczywistym na efektywność dostarczania, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację strategii dostarczania z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ilościowe wskaźniki przepuszczalności i odpowiedzi naczyniowej.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w przeprowadzaniu operacji okna czaszkowego u myszy, mikroskopii wielofotonowej oraz w fizyce ultradźwięków.
- Zależne od specjalistycznej aparatury, w tym przetworników pierścieniowych, obiektywów o wysokiej aperturze numerycznej (NA) oraz impulsowych skaningowych mikroskopów laserowych.
- Wymaga standaryzacji parametrów sonikacji, dawkowania środków kontrastowych oraz potoków analizy obrazu pomiędzy zespołami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody do różnych szczepów zwierząt, rozmiarów okien czaszkowych i częstotliwości ultradźwięków.
- Ograniczone przez czas rekonwalescencji pooperacyjnej oraz potencjalny stan zapalny wynikający z powtarzania procedur okna czaszkowego, zgodnie z opisem w protokole.
