Name: Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj metodę ilościowego pomiaru FRET w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej i algorytmów matematycznych. Technika ta umożliwia badanie interakcji białek w czasie rzeczywistym w fizjologicznych warunkach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Neuroscience Imaging Service w Stanford University School of Medicine za dostarczenie sprzętu i miejsca dla tego projektu. Badania te były wspierane przez finansowanie stacjonarne Instytutu Raka Stanforda i Oddziału Ginekologii Onkologicznej w Stanford, a także GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 z Narodowego Biura Badań, Rozwoju i Innowacji na Węgrzech.

1. Konstrukcja plazmidu
<ol>
	<li>W celu wygenerowania sondy fuzyjnej eGFP-mCherry1 należy użyć wektora ekspresyjnego dla komórek ssaków N1 (patrz Tabela materiałów) z wstawionym mCherry110 przy użyciu miejsc restrykcyjnych AgeI oraz BsrGI.</li>
	<li>Do amplifikacji eGFP11 bez kodonu stop jako fragmentu SalI-BamHI należy użyć następujących oligonukleotydów: starter N-końcowy 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' oraz starter C-końcowy 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.</li>
	<li>Wstaw ten fragment SalI-BamHI do miejsca wielokrotnego klonowania (MCS) wektora N1, aby wprowadzić linker RNPPV (pięcioaminokwasowy) pomiędzy zielone a czerwone białko fluorescencyjne. 
	UWAGA: Linker ten zapewnia średnią wydajność FRET dla pary donor-akceptor GFP-Cherry na poziomie około 0,25 - 0,3 (Rysunek 1A). Wybór linkerów sztywnych12 i helikalnych13 o różnej długości w celu skalowania zmierzonych wydajności FRET był omawiany w innych publikacjach, lecz nie jest on wymagany dla naszych celów dotyczących białka fuzyjnego. W dalszej części, dla uproszczenia, będziemy nazywać białka fluorescencyjne „GFP” i „Cherry”.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa i transfekcja
<ol>
	<li>Do eksperymentów FRET w pożywkach, np. pożywce DMEM (Dulbecco's modified Eagle's media), bez czerwieni fenolowej w celu zmniejszenia fluorescencji tła, można użyć dowolnej linii komórkowej, np. komórek NRK. Z tego samego powodu zaleca się stosowanie trypsyny wolnej od czerwieni fenolowej.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, należy je odczepić za pomocą 1 mL 0,05% trypsyny-EDTA, policzyć komórki w zawiesinie przy użyciu komory Neubauera i zasiać około 10 000 komórek na każdą studnię 8-studiennego szkiełka nakrywkowego z komorami; alternatywnie, z konfluentnej hodowli komórkowej w kolbie T25 można użyć 1 kropli zawiesiny komórkowej z pipety 2 mL lub 3 kropli z 5-mL zawiesiny komórkowej z konfluentnej hodowli w kolbie T12,5.</li>
	<li>Komórki należy hodować w 8-studiennych komorach (0,8 cm2/studnia) ze szkiełkiem nakrywkowym nr 1.0 do fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek w standardowych warunkach hodowli komórkowej (37°C i 5% CO2).</li>
	<li>24 h po wysiewaniu należy przeprowadzić transfekcję komórek, używając odpowiedniego, dostępnego komercyjnie medium do transfekcji (patrz Tabela materiałów), z GFP, Cherry, mieszaniną GFP/Cherry (mieszanina 1:1, tj. 0,8 μg i 0,8 μg plazmidowego DNA GFP i Cherry) oraz chimerą GFP-Cherry.
	<ol>
		<li>Do transfekcji należy użyć 5 μL odczynnika do transfekcji w 45 μL DMEM oraz 1,6 μg plazmidowego DNA. Wymieszać, delikatnie stukując probówkę do mikrowirowania.</li>
		<li>Po 15 min inkubacji mieszaniny w temperaturze pokojowej, należy dodać 1-2 μL mieszaniny odczynnika do transfekcji do każdej studni 8-studiennego szkiełka z komorami. Szkiełko z komorami należy przenieść z powrotem do inkubatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed obrazowaniem żywych komórek należy odczekać 20 h od momentu transfekcji, aby umożliwić prawidłową ekspresję, zwijanie i dojrzewanie białek fluorescencyjnych, zwłaszcza fluoroforu czerwonego.</li>
</ol>
3. Obrazowanie FRET
<ol>
	<li>Obrazuj transfected cells w nawilżonej i podgrzewanej komorze inkubacyjnej w temperaturze 37 °C. Aby zbuforować medium hodowlane do fizjologicznego pH, zastosuj gaz CO2 przy przepływie 5% lub dodaj 20 mM HEPES, aby uczynić medium niezależnym od CO2.</li>
	<li>Użyj konfokalnego mikroskopu laserowego. Ustaw wzbudzenie i emisję w następujący sposób, aby zoptymalizować sygnał i zminimalizować przesłuch (cross-talk).
	<ol>
		<li>Do wzbudzenia GFP użyj linii 488-nm lasera argonowego, a do wzbudzenia Cherry lasera diodowego w stanie stałym 561-nm (lub lasera helowo-neonowego 543-nm, w zależności od dostępnych linii laserowych).</li>
		<li>W oprogramowaniu komercyjnego mikroskopu konfokalnego ustaw następujące parametry. Ustaw Lustro dichroiczne na 488/ 561, wybierając odpowiednią opcję z menu rozwijanego. Zbieraj fluorescencję, wykorzystując światło lasera 488-nm do wzbudzenia w kanale 1 poprzez pasmo emisji 505 - 530 nm (lub 505 - 550 nm), a w kanale 2 z filtrem długoprzepustowym &gt;585 nm; do wzbudzenia w kanale 3 użyj światła lasera 561-nm z filtrem długoprzepustowym &gt; 585 nm (wprowadź długości fal). Można również zastosować filtry pasmowe, np. 590 - 650 nm lub podobne, które mają zaletę wykluczania rozpraszania Ramanowskiego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzbudzaj sekwencyjnie oboma laserami i ustaw tryb obrazowania na Switch after each line (przełączanie po każdej linii), aby wzbudzenie obrazu o wymiarach 512 x 512 pikseli następowało naprzemiennie po każdej linii (a nie po każdej klatce, co uniemożliwiłoby wykrycie FRET ze względu na dyfuzję znakowanych białek podczas rejestracji obrazów z różnymi wzbudzeniami; kliknij odpowiedni przycisk).</li>
	<li>Za pomocą kliknięć przycisków ustaw krótką serię czasową trzech obrazów, aby sprawdzić, czy występuje istotny fotobleaching, a w razie potrzeby zmniejsz moc lasera. Optymalne jest fotobleaching poniżej 1%. Wysoka intensywność lasera może również prowadzić do nasycenia absorpcji, co zmniejsza pozorną wydajność FRET14. Bezpiecznie jest stosować moc lasera do 10-20 μW mierzona na soczewce obiektywu.</li>
	<li>W pierwszej kolejności obrazuj komórki wykazujące ekspresję konstruktu fuzyjnego GFP-Cherry. Ustaw parametry definiujące zintegrowaną w czasie intensywność lasera na piksel w obrazie konfokalnym, t.j. czas przebywania piksela (pixel dwell time) w mikrosekundach, transmisję akustooptycznego filtra strojonego (AOTF) w procentach oraz zoom.
	<ol>
		<li>Obrazuj komórki, używając obiektywu olejowego 63x i ustawiając Zoom na 3x. Zapewnia to wystarczające powiększenie i rozdzielczość do obrazowania komórek w całości. Dąż do uzyskania rozmiaru piksela 70-80 nm.</li>
		<li>Ustaw Pixel dwell time na 2-4 μs oraz transmisję AOTF dla laserów 488-nm i 561-nm w taki sposób, aby obrazy miały dobry stosunek sygnału do szumu, bez fotobleachingu i bez pikseli wykazujących nasycenie intensywności fluorescencji. Wskazane jest dostrojenie mocy laserów 488 i 561 tak, aby poziomy sygnału w kanale 1 i kanale 3 były zbliżone.</li>
		<li>Ustaw Wzmocnienie fotopowielacza (tryb uśredniania) na 600-800.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przy tych ustawieniach obrazuj 15-20 komórek wykazujących ekspresję białka fuzyjnego GFP-Cherry. 15-20 komórek zapewnia dobrą statystykę, ograniczając jednocześnie całkowity czas sesji pomiarowej FRET do kilku godzin, co pomaga zapewnić stabilność ustawień mikroskopowych.</li>
	<li>Z tymi samymi ustawieniami obrazuj komórki wykazujące ekspresję GFP, Cherry, GFP i Cherry oraz komórki nietransfekowane. Szukaj komórek wykazujących ekspresję odpowiednio w kanale zielonym lub czerwonym.</li>
	<li>Następnie obrazuj 15-20 komórek koekspresujących białka zainteresowania sprzężone odpowiednio z GFP i Cherry. Podczas poszukiwania komórek wykazujących ekspresję unikaj długiej ekspozycji, aby nie doprowadzić do fotobleachingu białek fluorescencyjnych. Cherry wykazuje niższą fotostabilność niż GFP, a fotobleaching Cherry (akceptora) utrudnia analizę FRET. 
	UWAGA: Widma absorpcji i emisji GFP i Cherry przedstawiono na Supplementary Figure 1. Po pomiarach trwających 5-6 h zaleca się ponowne obrazowanie kilku komórek wykazujących ekspresję chimery GFP-Cherry na koniec sesji, aby udokumentować, że ustawienia pozostały stabilne, a wykryte wydajności FRET białka fuzyjnego GFP-Cherry nie zmieniły się znacząco w trakcie sesji obrazowania.</li>
</ol>
4. Analiza obrazu w celu wykrycia bezwzględnych wydajności FRET z wykorzystaniem gaszenia donora i emisji indukowanej
UWAGA: Poniżej przedstawiono praktyczny przewodnik krok po kroku, dotyczący sposobu wyznaczania wydajności FRET z wykorzystaniem dołączonego arkusza kalkulacyjnego (Supplementary File 2). Teorię oraz wyprowadzenie przedstawionych równań można znaleźć szczegółowo w poprzednich publikacjach4,15,16,17. Przy opisanych ustawieniach zbierane są następujące intensywności fluorescencji.
<ol>
	<li>Zmierz sygnał donora I1 w kanale 1 (kanale donora), przy wzbudzeniu 488 nm i pasmie emisji 505-530 nm. 
	<img alt="Równanie dla pomiaru intensywności fluorescencji w analizie spektroskopowej." src="/files/ftp_upload/62241/62241eq02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> 
	gdzie ID to nieugaszony sygnał donora w kanale 1, który zostałby zmierzony w obecności akceptora, średnia wydajność FRET oraz B1 to średni sygnał tła w kanale 1.</li>
	<li>Zmierz sygnał akceptora I3 w kanale 3 (kanale akceptora), przy wzbudzeniu 561 nm i emisji &gt;585 nm. 
	<img alt="Równanie spektroskopii optycznej na schemacie, skupiające się na analizie absorpcji i emisji." src="/files/ftp_upload/62241/62241eq03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3"> 
	gdzie IA to sygnał akceptora, a B3 to tło w kanale 3.</li>
	<li>Zmierz sygnał FRET w kanale 2 (kanale transferu), przy wzbudzeniu 488 nm i emisji &gt;585 nm. 
	<img alt="Równanie fizyczne dla badań fotonicznych, formuła analizy emisji, metoda spektroskopii optycznej." src="/files/ftp_upload/62241/62241eq04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 4"> 
	Sygnał w kanale 2 jest sumą czterech różnych komponentów: (i) ID(1 - E)S1 to prześwit widmowy (spectral spill over) z ugaszonego sygnału donora do kanału detekcji &gt;585 (z współczynnikiem przenikania S1), (ii) IAS2 to sygnał akceptora wynikający z bezpośredniego wzbudzenia światłem 488 nm (z współczynnikiem przenikania S2), (iii) IDEα to emisja sensybilizowana akceptora przez FRET z wzbudzonej cząsteczki donora (α zostanie szczegółowo omówione w sekcjach 4.8. - 4.10.), oraz (iv) B2 to sygnał tła.</li>
	<li>Zmierz średnie intensywności tła w kanałach 1, 2, 3 w komórkach nietransfekowanych lub poddanych transfekcji pozornej (mock); oba warianty są dopuszczalne przy pomijalnej różnicy. Dla wszystkich pomiarów komórkowych użyj narzędzia do rysowania ręcznego, aby wyznaczyć obszary zainteresowania (ROI) i unikać pęcherzyków perynuklearnych o zwiększonej autofluorescencji. Ważne jest uniknięcie znacznej autofluorescencji pochodzącej z tych pęcherzyków perynuklearnych.
	<ol>
		<li>Wprowadź pomiary do kolumn X, Y i Z dostarczonego arkusza kalkulacyjnego. Średnie intensywności tła w 3 kanałach wpisz do komórek A2, B2 i C2 arkusza excel (Plik uzupełniający 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz średnie intensywności w kanałach 1, 2, 3 komórek eksponujących wyłącznie GFP lub Cherry i wprowadź pomiary do kolumn C, D, E oraz N, O, P. Odpowiednie intensywności tła należy odjąć (w kolumnach F, G, H oraz Q, R, S).</li>
	<li>Aby obliczyć wydajność FRET E, wyznacz współczynniki przenikania S1 i S2. Widmowy współczynnik przenikania S1 oblicza się z komórek eksponujących tylko GFP 
	<img alt="Równanie pokazujące stosunek równowagi statycznej; formuła matematyczna S₁=(I₂-B₂)/(I₁-B₁); użytek edukacyjny." src="/files/ftp_upload/62241/62241eq6v5.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 6"> 
	w kolumnie I. Wprowadź średnią wartość dla S1 do komórki D2 w arkuszu excel.</li>
	<li>Oblicz widmowy współczynnik przenikania S2 z komórek eksponujących tylko Cherry 
	<img alt="S2=I2-B2/I3-B3, równanie, obliczanie stosunku sygnału, fizyka, analiza danych, użytek edukacyjny" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 7"> 
	w kolumnie T. Wprowadź średnią wartość dla S2 do komórki E2 w arkuszu excel.</li>
	<li>Upewnij się, że czynnik α wiąże sygnał z dowolnej liczby wzbudzonych cząsteczek GFP w kanale 1 z sygnałem równej liczby wzbudzonych cząsteczek Cherry w kanale 2 i jest definiowany jako 
	<img alt="Równanie dla stosunku wydajności; formuła ułamkowa; koncepcja równowagi statycznej." src="/files/ftp_upload/62241/62241eq08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 8">   <img alt="Równanie dla kwantyfikacji fluorescencji; formuła obliczania wydajności kwantowej, Q." src="/files/ftp_upload/62241/62241eq13v5.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 13"> 
	gdzie QA i QD to kwantowe wydajności fluorescencji Cherry i GFP; ηA oraz ηD to wydajności detekcji fluorescencji akceptora i donora odpowiednio w kanałach 2 i 1. 
	UWAGA: Czynnik α można by wyznaczyć z dwóch próbek eksponujących znane bezwzględne ilości GFP i Cherry. Niemożliwe jest jednak poznanie dokładnej ilości GFP i Cherry eksponowanych w pojedynczej komórce. Dlatego obliczyliśmy ten czynnik, wykorzystując komórki eksponujące białko fuzyjne GFP-Cherry. W tym przypadku, mimo że bezwzględna ilość nadal jest nieznana, wiadomo, że stosunek cząsteczek donora do akceptora wynosi jeden.</li>
	<li>Zmierz średnie intensywności w kanałach 1, 2, 3 komórek eksponujących białko fuzyjne GFP-Cherry i wprowadź pomiary do kolumn AE, AF, AG. Intensywności tła należy odjąć (w kolumnach AH, AI, AJ).</li>
	<li>Oblicz czynnik α (kolumna AJ) z intensywności fluorescencji w kanałach 1, 2 i 3 białka fuzyjnego GFP-Cherry w następujący sposób: 
	<img alt="Równanie równowagi statycznej, zawierające współczynnik korekcji absorpcji, kluczowe w analizie fotometrycznej." src="/files/ftp_upload/62241/62241eq10v6.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 10"></li>
	<li>Skorygowane o tło intensywności zmierzone odpowiednio w kanale 1 (I1 - B1), 2 (I2 - B2) i 3 (I3 - B3) są mierzone z użyciem chimery GFP-Cherry. Widmowy współczynnik przenikania S1 został wyznaczony przy użyciu komórek eksponujących tylko GFP (patrz pkt 4.7.). εD i εA to współczynniki ekstynkcji GFP (donora) i Cherry (akceptora) przy 488 nm, które można wyznaczyć z literatury (εGFP = 53 000 M-1cm-1)18 oraz z krzywej absorpcji Cherry (εCherry ≈ 5560 M-1cm1). Stosunek <img alt="Stosunek molowych współczynników ekstynkcji; formuła, analiza absorpcyjna, porównanie danych spektroskopowych." src="/files/ftp_upload/62241/62241eq11.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 11"> został wpisany do komórki G2 arkusza excel. Wprowadź średnią wartość dla czynnika α do komórki J2.</li>
	<li>Użyj wyznaczonego czynnika α do obliczenia wydajności FRET, E, w następujący sposób (kolumna AK): 
	<img alt="Równanie wydajności energetycznej z intensywnością i tłem, formuła dla analizy optycznej." src="/files/ftp_upload/62241/62241eq12v6.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 12"></li>
	<li>Alternatywnie wyznacz wydajność FRET, E, dla kontroli negatywnych, t.j. koekspresji GFP i Cherry oraz ekspresji samego GFP, dodając pomiary kanałów 1, 2 i 3 do arkusza excel w kolumnach AD, AE i AF pod pomiarami białka fuzyjnego GFP-Cherry. W ten sam sposób wyznacz wydajności FRET pomiędzy białkami o zainteresowaniu znakowanymi GFP i Cherry.</li>
	<li>Wyznacz nieugaszoną intensywność donora, ID, jako (I1 - B1)/(1 - E), a intensywność akceptora jako IA = I3 - B3; wartości te są proporcjonalne do poziomów ekspresji białek z markerami.</li>
	<li>Wyznacz skorygowany stosunek intensywności akceptora do donora (Q) białka fuzyjnego GFP-Cherry w następujący sposób (kolumna AL): 
	<img alt="Równanie dla kwantyfikacji fluorescencji; formuła obliczania wydajności kwantowej, Q." src="/files/ftp_upload/62241/62241eq13v5.png" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 13"></li>
	<li>Dla pozostałych komórek kotransfekowanych oblicz molekularny stosunek akceptora do donora NA/ND w następujący sposób: 
	<img alt="Schemat formuły równania równowagi statycznej dla analizy i interpretacji danych spektroskopowych." src="/files/ftp_upload/62241/62241eq14.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 14"> 
	UWAGA: Uzasadnienie dla wyznaczenia stosunku NA/ND i wykreślenia średniej komórkowej wydajności FRET E w funkcji NA/ND wynika z tego, że jedna cząsteczka donora może przekazać energię wielu akceptorom, podczas gdy cząsteczka akceptora może przyjąć energię tylko od jednego donora w danej chwili. Nawet jeśli ze względu na stechiometrię oddziaływania tylko jeden akceptor może oddziaływać z donorem, oczekuje się, że zwiększenie stężenia akceptora zwiększy frakcję donorów w kompleksie z akceptorem zgodnie z prawem działania mas. Zatem przy stałej (lub w wąskim zakresie) ekspresji donora, wydajność FRET powinna rosnąć wraz ze wzrostem NA/ND. Jednak przy wykreślaniu wydajności FRET E w funkcji NA/ND dla koekspresji GFP i Cherry, t.j. dla sondy negatywnej, wzrost NA/ND nie powinien skutkować wzrostem wydajności FRET (przynajmniej przy wystarczająco niskich stężeniach akceptora, gdzie nie występuje losowy FRET wynikający z bliskości barwników akceptorowych i donorskich).</li>
</ol>

<ol><li>Förster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz%5BTitle%5D)+AND+%22Annal+der+Physik%22%5BJournal%5D)">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li>
<li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence+digital+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li>
<li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li>
<li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+the+c-Fos%2Fc-Jun+complex+in+vivo%3A+A+combined+FRET%2C+FCCS%2C+and+MD-modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li>
<li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li>
<li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li>
<li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413(2013).</li>
<li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quality%2C+reproducibility%2C+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li>
<li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+measured+by+the+sensitized+emission+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194(2020).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+%28GFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 1 Spec No 33-38 (1996).</li>
<li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li>
<li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%22%5BJournal%5D)">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li>
<li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li>
<li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li>
<li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li>
<li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li>
<li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+EGFP%2C+EYFP%2C+and+ECFP+with+high+yield+and+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li>
<li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness%2C+protein+folding%2C+and+FRET+Forster+radius%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li>
<li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li>
<li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270(2015).</li>
<li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li>
<li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes%3A+Simulations+and+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony protokół szczegółowo opisuje zastosowanie genetycznie sprzężonej sondy kalibracyjnej białka fluorescencyjnego jeden do jednego do jednego do ilościowego oznaczania FRET przy użyciu wykrywania uczulonej emisji akceptora i wygaszania cząsteczki donorowej za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może być stosowana do oceny interakcji białek w kontekście fizjologicznym żywej komórki w różnych przedziałach subkomórkowych. Rozdzielczość przestrzenną można dodatkowo poprawić, stosując przedstawiony algorytm do...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Analiza rezonansu Förstera (FRET) oparta na mikroskopii pozwala na ocenę interakcji między białkami w żywych komórkach. Dostarcza informacji przestrzennych i czasowych, w tym informacji o tym, gdzie w komórce i w którym przedziale subkomórkowym zachodzi interakcja i czy ta interakcja zmienia się w czasie.
Theodor Förster położył teoretyczne podstawy FRET w 1948 roku1. FRET to bezpromieniowy transfer energii od wzbudzonego donora do cząsteczki akceptora i zależy od odległości cząsteczek i względnej orientacji ich dipoli przejściowych, a także nakładania się widm emisji donorowej i absorpcji akceptora. Szybkość transferu energii jest odwrotnie proporcjonalna do szóstej potęgi odległości donor-akceptor. Dzięki temu FRET może być używany do pomiaru bliskości molekularnej w zakresie 1-10 nm.
FRET konkuruje z innymi procesami de-wzbudzenia cząsteczki donorowej i powoduje tzw. wygaszanie donorów i uwrażliwianie emisji akceptora. Wygaszanie donorów to zmniejszenie liczby emitowanych fotonów donorowych, podczas gdy emisja uwrażliwiona to wzrost emitowanych fotonów akceptorowych. Wiele mikroskopowych analiz FRET wykorzystuje pomiary intensywności fluorescencji, w tym fotowybielanie akceptorowe2, fotowybielanie przez dawcę2 lub fotowybielanie uwrażliwione na FRET dla acceptor3.
Tutaj przedstawiono krok po kroku eksperymentalny protokół i algorytm matematyczny do ilościowego oznaczania FRET za pomocą hartowania donorów i emisji uwrażliwionej na akceptor4,5, metoda często określana jako ratiometryczny FRET. Opublikowano wiele protokołów dotyczących przybliżania emisji uczulonej, ale niewiele z nich określiło ilościowo bezwzględną wydajność FRET6,7,8,9. Kwantyfikacja wydajności FRET w żywej komórce wymaga określenia (i) przesłuchu (rozlanie spektralne lub krwawienie) białek fluorescencyjnych, a także (ii) skuteczności wykrywania układu mikroskopowego. Podczas gdy przesłuchy można ocenić poprzez obrazowanie komórek wyrażających tylko jeden z fluoroforów, ocena względnej skuteczności wykrywania fluorescencji dawcy i akceptora jest bardziej skomplikowana. Wymaga to znajomości co najmniej stosunku liczby cząsteczek donorowych i akceptorowych powodujących powstanie mierzonych sygnałów. Liczba fluoroforów ulegających ekspresji w żywych komórkach różni się jednak w zależności od komórki i jest nieznana. Tak zwany czynnik α charakteryzuje względną siłę sygnału z pojedynczej wzbudzonej cząsteczki donora i akceptora. Znajomość tego czynnika jest warunkiem wstępnym ilościowych pomiarów ratiometrycznych FRET w próbkach o zmiennym stosunku cząsteczek akceptorowych do donorowych, jakie występują podczas obrazowania żywych komórek za pomocą białek fluorescencyjnych. Użycie białka fuzyjnego 1 do 1 donor-akceptor jako sondy kalibracyjnej pozwala na określenie czynnika α, a także służy jako kontrola pozytywna. Ta genetycznie sprzężona sonda ulega ekspresji przez komórki w nieznanych ilościach całkowitych, ale w stałej i znanej względnej ilości jeden do jednego. Poniższy protokół określa, jak skonstruować sondę 1 do 1 i jak jej używać do ilościowego określania wydajności FRET. Arkusz kalkulacyjny, który zawiera wszystkie formuły, znajduje się w suplemencie i może być używany przez czytelników do wprowadzania własnych pomiarów w odpowiednich kolumnach, jak opisano poniżej.
Podczas gdy protokół wykorzystuje parę dawca/akceptor GFP-Cherry, przedstawione podejście można wykonać z dowolną inną parą FRET. Plik uzupełniający 1 zawiera szczegółowe informacje na temat par niebieskozielo-żółtych.

<table><tbody><tr><td>0,5% Trypsyna-EDTA bez czerwieni fenolowej (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Clontech mCherry N1 wektor</td><td>Addgene</td><td>3553</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>LabTek 8-dołkowe komory #1.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565470</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na fret

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) to bezradiacyjny transfer energii od wzbudzonego donora do cząsteczki akceptora i zależy od odległości i orientacji molekuł, jak również od stopnia nakładania się widm emisji donorowej i absorpcji akceptora. FRET pozwala badać interakcje białek w żywej komórce w czasie i w różnych przedziałach subkomórkowych. W literaturze opisano różne algorytmy oparte na intensywności do pomiaru FRET za pomocą mikroskopii. W tym miejscu zapewniony jest protokół i algorytm do ilościowego określenia wydajności FRET w oparciu o pomiar zarówno uczulonej emisji akceptora, jak i wygaszania cząsteczki donora. Kwantyfikacja ratiometrycznego FRET w żywej komórce wymaga nie tylko określenia przesłuchu (spektralnego rozlewania się lub krwawienia) białek fluorescencyjnych, ale także skuteczności wykrywania układu mikroskopowego. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje, jak ocenić te krytyczne parametry.

Rycina 1 przedstawia odpowiednio obrazy uzyskane w kanale donora, kanale 1 (488, 505-530 nm), kanale transferu, kanale 2 (488, &gt;585 nm) oraz kanale akceptora, kanale 3 (561, &gt;585 nm). Reprezentatywne obrazy komórek wykazujących ekspresję wyłącznie GFP, wyłącznie Cherry, koekspresję GFP i Cherry oraz ekspresję białka fuzyjnego GFP-Cherry. Średnie komórkowe wydajności FRET obliczone dla komórek NRK wykazujących ekspresję białka fuzyjnego GFP-Cherry (kontr...

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Protokół ten opisuje krok po kroku proces eksperymentalny i algorytm matematyczny do ilościowego oznaczania FRET przy użyciu wygaszania donorów i emisji uwrażliwionej na akceptor. Kwantyfikacja wydajności FRET w żywej komórce wymaga określenia przesłuchu białek fluorescencyjnych oraz względnej wydajności emisji i detekcji fluoroforów w układzie mikroskopowym. Przesłuchy można ocenić, obrazując komórki wykazujące ekspresję tylko jednego fluoroforu.Ocena skuteczności wykrywania cząsteczki donorowej lub akceptorowej wymaga znajomości stosunku liczby cząsteczek donorowych i akceptorowych powodujących powstanie sygnału pomiarowego. Liczba fluoroforów ulegających ekspresji w żywych komórkach różni się w zależności od komórki i jest nieznana. Zastosowana w tej metodzie sonda kalibracyjna, białko fuzyjne donor-akceptor jeden do jednego, umożliwia określenie względnej skuteczności wykrywania cząsteczek donorowych i akceptorowych.Aby rozpocząć, użyj wektora ekspresji komórek ssaków N1 z mCherry 1 do wygenerowania sondy fuzyjnej EGFP mCherry 1. Zaprojektuj oligonukleotydy do amplifikacji EGFP bez kodonu stop jako fragmentu BAM h1 w komórce. Łącznik pięciu aminokwasów między zielonym i czerwonym białkiem fluorescencyjnym powinien dać średni niedobór FRET dla pary dawca-akceptor wiśni GFP wynoszący od 0,25 do 0,3.Użyj dowolnej linii komórkowej i pożywki bez czerwieni fenolowej, aby zmniejszyć fluorescencję tła. Gdy komórki zlewają się w 80%, odłącz je jednym mililitrem 0,05% trypsyny EDTA i umieść około 10 000 komórek w każdym dołku ośmiodołkowej płytki, dodając trzy krople z pięciomililitrowej zawiesiny komórek. 24 godziny po posiewie przeprowadzić transfekcję komórek przy użyciu odpowiedniej pożywki do transfekcji.Inkubuj komórki przez 20 godzin przed obrazowaniem żywych komórek, aby umożliwić prawidłową ekspresję białek fluorescencyjnych, fałdowanie i dojrzewanie. Zobrazuj komórki w nawilżonej i ogrzewanej komorze środowiskowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego. Aby zbuforować pożywkę komórkową w fizjologicznym pH, dodaj 20 milimolowych HEPES, aby uczynić pożywkę komórkową niezależną od dwutlenku węgla.Następnie zamontuj szkiełko na mikroskopie. Użyj 488-nanometrowej linii lasera jonowego argonu, aby wzbudzić GFP i 561-nanometrowego lasera diodowego, aby wzbudzić wiśnię. Ustaw laser 488 nm do wzbudzenia w kanale pierwszym w paśmie emisji od 505 do 530 nanometrów oraz w kanale drugim z filtrem długoprzepustowym o długości ponad 585 nanometrów.Użyj lasera 561 nanometrów do wzbudzenia w kanale trzecim z filtrem długoprzepustowym o długości ponad 585 nanometrów. Wzbudzaj dwa lasery sekwencyjnie i ustaw tryb obrazowania tak, aby przełączał się po każdej linii, tak aby wzbudzenie obrazu o wymiarach 512 na 512 pikseli zmieniało się po każdej linii. Ustaw mini serię czasową składającą się z trzech obrazów, aby wykryć, czy występuje znaczne fotowybielanie i w razie potrzeby zmniejszyć moc lasera.Po pierwsze, komórki obrazowe wyrażające konstrukt fuzji wiśni GFP. Ustawia parametry, które definiują zintegrowane w czasie natężenie lasera na piksel w obrazie konfokalnym. Użyj 63-krotnego obiektywu olejowego i zoomu ustawionego na 3x, aby sfotografować komórkę w całości z wystarczającym powiększeniem i rozdzielczością.Celuj w rozmiar piksela od 70 do 80 nanometrów. Ustaw czas przebywania pikseli na dwie do czterech mikrosekund i transmisję AOTF dla lasera 488 nanometrów i 561 nanometrów tak, aby obrazy pokazywały dobry stosunek sygnału do szumu bez wybielania i bez pikseli wskazujących na nasycenie intensywności fluorescencji. Dostosuj moc lasera 488 i 561 tak, aby poziomy sygnału w kanale pierwszym i trzecim były podobne.Ustaw przyrost mnożnika zdjęcia na 600 do 800. Obraz od 15 do 20 komórek wykazujących ekspresję białka fuzyjnego wiśni GFP, komórek wykazujących ekspresję GFP, wiśni, GFP i wiśni oraz komórek bez transektu. Następnie zobrazuj komórki koeksprymujące interesujące białka sprzężone odpowiednio z GFP i wiśnią.Aby obliczyć FRET, zmierz sygnał dawcy w kanale pierwszym, kanale donorowym z wzbudzeniem 488 nanometrów i pasmem emisji od 505 do 530 nanometrów. Następnie zmierz sygnał akceptorowy w kanale trzecim, kanale akceptorowym o wzbudzeniu i emisji 561 nanometrów na poziomie powyżej 585 nanometrów. Na koniec zmierz sygnał FRET w kanale drugim, kanale transferowym o wzbudzeniu i emisji 488 nanometrów na poziomie powyżej 585 nanometrów.Sygnał w kanale drugim jest sumą czterech różnych składowych: rozlanie widma z wygaszonego sygnału donorowego do ponad 585 kanału detekcji z czynnikiem przesłuchu S1, sygnał akceptorowy z bezpośredniego wzbudzenia światłem 488 nanometrów ze współczynnikiem przesłuchu S2, uwrażliwiona emisja akceptora przez FRET z wzbudzonej cząsteczki donora, i sygnał tła. Obrazy uzyskano w kanale dawczym, kanale transferowym i kanale akceptorowym, pokazano komórki wyrażające tylko GFP, tylko wiśnię, koeksprymujące GFP i wiśnię oraz białko fuzyjne wiśni GFP. Średnia wydajność komórkowa FRET obliczona w komórkach NRK eksprymujących białko fuzyjne wiśni GFP i w komórkach współeksprymujących wiśnię GFP jest wykreślana w porównaniu ze stosunkiem intensywności stosunku akceptora do dawcy lub stosunkiem molekularnym w każdej komórce.Pokazano tutaj znormalizowane piksel po pikselu obrazy FRET komórek wyrażających białko fuzyjne wiśni GFP, koeksprymujących GFP i wiśnię jako kontrolę negatywną oraz wyrażających podjednostki receptora Ashwella-Morella. RHL1 i 2 lektyny wątrobowej szczura znakowano GFP i wiśnią po cytoplazmatycznej stronie błony komórkowej. Średnie wydajności komórkowe FRET komórek eksprymujących GFP RHL1 i wiśniowy RHL2 oraz GFP RHL1 delta i wiśniowy RHL2 są wykreślane w zależności od stosunku molekularnego akceptora do dawcy.Przedstawione ilościowe podejście FRET pozwala na następujące działania. Wykrywanie oddziaływań białkowych w kontekście fizjologicznym żywej komórki. Zmiany w interakcjach białek w czasie.Różnice w interakcjach w przedziałach subkomórkowych aż do poziomu piksel po pikselu obrazu konfokalnego. Oraz zależność wykrytego sygnału FRET od molekularnego stosunku akceptora do dawcy wyrażonego w żywej komórce.

assessing-protein-interactions-live-cells-with-fret-sensitized

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Film opisuje technikę obrazowania FLIM-FRET w celu określenia interakcji białko-białko w żywych bakteriach wyrażających białka cytoplazmatyczne znakowane białkami fluorescencyjnymi, donorem eGFP i akceptorem mCherry. Połączona technika pozwala również na ilościowe określenie oddziałujących białek.

Obrazowanie FLIM-FRET w celu scharakteryzowania interakcji białko-białko u żywych bakterii

Interakcje między białkami są fundamentalne dla wszystkich procesów komórkowych. Korzystając z transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego, można monitorować interakcję między parą białek w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym. Ponadto można ocenić skutki potencjalnie patogennych mutacji.

Badanie interakcji białko-białko w żywych komórkach za pomocą transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) to technika obrazowania służąca do wykrywania interakcji białek w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiono protokół FRET w celu zbadania związku enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi, które rekrutują je do docelowych promotorów w celu epigenetycznej regulacji ekspresji genów w tkankach roślinnych.

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowego określenia czasoprzestrzennej dynamiki aktywacji i fosforylacji Akt w żywych komórkach HepG2. Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii metodą Förster (FRET) jest potężnym narzędziem, które dostarcza cennych informacji na temat szlaków sygnalizacji insuliny i regulacji metabolicznej w komórkach nowotworowych.

Obrazowanie transferu energii rezonansu Förstera w żywych komórkach metabolicznie regulowanej dynamiki aktywacji Akt w komórkach HepG2

Poznaj metodę ilościowego pomiaru FRET w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej i algorytmów matematycznych. Technika ta umożliwia badanie interakcji białek w czasie rzeczywistym w fizjologicznych warunkach komórkowych.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

Przeglądaj więcej filmów