Emulgacja szablonowa cząstek umożliwia oznaczanie kropel bez mikroprzepływowości

Cyfrowa PCR kropelkowa zapewnia większą dokładność i czułość w porównaniu z ilościowym PCR. Jest to prosta metoda cyfrowego PCR kropelkowego, wymagająca minimalnego sprzętu i braku specjalistycznej wiedzy. Emulgacja szablonowa cząstek to metoda emulgowania niezawierająca mikroprzepływów, która nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu.

Dodatkowo emulgacja zachodzi w ciągu kilku sekund i skaluje się do objętości pojemnika. W przypadku kulek komercyjnych dodaj 0,5 grama suszonych cząstek poliakrylamidu kompatybilnych z emulgacją szablonu cząstek lub PTE do 30 mililitrów sterylnej wody w 50-mililitrowej stożkowej probówce i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Aby mikroprzepływowo wytworzyć koraliki, wlej jeden mililitr fotorezystu na środek trzycalowej płytki krzemowej, a następnie obracaj ją z prędkością 500 obr./min przez 30 sekund, a następnie 1250 obr./min przez 30 sekund. Umieść wafel na płycie grzejnej ustawionej na 95 stopni Celsjusza na 15 minut, aby odparować rozpuszczalnik. Przymocuj fotomaskę do płytki krzemowej za pomocą szkiełka nakrywkowego i naświetl płytkę pod skolimowaną diodą UV LED przez 2,5 minuty.

Umieść wafel na płycie grzejnej ustawionej na 95 stopni Celsjusza na pięć minut do pieczenia po ekspozycji. Wywołaj fotorezystu krzemowy, zanurzając go w kąpieli 100% PGMEA na maksymalnie 15 minut. Opłucz wafel świeżym 100% PGMEA, a następnie 100% izopropanolem.

Wysusz wafel na powietrzu, a następnie wysusz go na płycie grzejnej ustawionej na 95 stopni Celsjusza przez minutę i umieść na czystej, trzycalowej szalce Petriego. Wymieszaj bazę silikonową PDMS i odczynnik utwardzający w stosunku 10:1, a następnie odgazuj zmieszany PDMS za pomocą eksykatora w próżni, aż nie będzie można zaobserwować pęcherzyków powietrza. Wlej odgazowany PDMS na szalkę Petriego, upewniając się, że płytka krzemowa jest całkowicie zanurzona.

Odgazuj płytkę krzemową i PDMS, a następnie utwardź PDMS, umieszczając płytkę krzemową w piekarniku ustawionym na 65 stopni Celsjusza na co najmniej 60 minut. Za pomocą skalpela należy wyciąć blok PDMS zawierający cechy mikroprzepływowe z płytki Petriego. Przebij wloty i wyloty do bloku PDMS za pomocą 0,75-milimetrowego stempla biopsyjnego.

Następnie usuń kurz i cząstki stałe poprzez wielokrotne nakładanie i usuwanie taśmy pakowej na powierzchnię bloku. Wyczyść szkiełko podstawowe, spłukując je 100% izopropanolem, a następnie wysuszając powierzchnię na powietrzu. Plazmę należy traktować zarówno szkiełko podstawowe, jak i PDMS jednym milibarem plazmy tlenowej przez jedną minutę, używając spawarki plazmowej.

Przymocuj PDMS do szkiełka podstawowego, umieszczając PDMS poddanego obróbce plazmowej z elementami skierowanymi w dół na szkiełku podstawowym, stroną poddaną plazmie skierowaną do góry. Umieść szkiełko w piekarniku nastawionym na 65 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut, aby zakończyć klejenie. Potraktuj wszystkie kanały mikroprzepływowe fluorowaną obróbką powierzchni, aby zapewnić hydrofobowość powierzchni, a następnie piecz urządzenie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej 10 minut.

Załaduj zarówno poliakryloamid (PAA), jak i hydrofluoroeter (HFE) zawierające roztwór do pomp strzykawkowych. Podłączyć obie strzykawki do urządzenia mikroprzepływowego za pomocą rurki polietylenowej. Uruchom urządzenie do generowania kropli i zbierz jeden mililitr kropelek w 15-mililitrowej probówce zbiorczej, a następnie inkubuj przez trzy godziny w temperaturze pokojowej w celu polimeryzacji.

Po inkubacji usunąć dolną warstwę oleju za pomocą pipetowania. Dodaj jeden mililitr 20% PFO w oleju HFE do 15-mililitrowej probówki zbiorczej jako deemulgator chemiczny. Po wymieszaniu odwirowywać 15-mililitrową probówkę zbiorczą o masie 2000 x g przez dwie minuty.

Usuń dolną warstwę za pomocą pipetowania i powtórz proces jeszcze raz. Dodaj dwa mililitry 2% monooleinianu sorbitanu w heksanie do 15-mililitrowej probówki zbiorczej i zwiruj ją. Wirować probówkę o masie 3000 x g przez trzy minuty i usunąć supernatant przez pipetowanie w celu usunięcia roztworu środka powierzchniowo czynnego.

Powtórz to dwa razy. Dodać pięć mililitrów buforu TEBST i dobrze wymieszać, a następnie odwirować do 3000 x g przez trzy minuty i usunąć supernatant przez pipetowanie. Powtórz to trzy razy, a następnie ponownie zawieś w pięciu mililitrach TEBST.

Przygotować cząstki poliakrylamidu do emulgowania z szablonami cząstek, wirując przy 6000 x g przez jedną minutę w celu osadzenia cząstek. Następnie usunąć supernatant za pomocą pipetowania i ponownie zawiesić osad w sterylnej wodzie. Powtórz trzy razy, aby upewnić się, że usunięto wszelkie pozostałości TEBST.

Przygotować fazę dyspersyjną w świeżej 15-mililitrowej probówce wirówkowej, używając wzorcowej mieszanki PCR, odpowiednich starterów i sondy do hydrolizy fluoresceiny, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut pod delikatnym mieszaniem, używając rotatora rurowego. Odwirować fazę dyspersyjną o sile 6000 x g przez jedną minutę i usunąć supernatant.

Dodać jeden mikrolitr genomowego DNA Saccharomyces cerevisiae do granulki i dokładnie wymieszać przez pipetowanie lub energiczne stukanie. Dodaj 200 mikrolitrów 2% fluorosurfaktantu w oleju HFE do probówki w celu emulgacji. Usunąć osad, pipetując lub stukając w rurkę, a następnie wirować z prędkością 3000 obr./min przez 30 sekund.

Pozostawić emulsje na jedną minutę, następnie usunąć 100 mikrolitrów dolnej fazy olejowej i zastąpić tę objętość świeżym 2% fluorosurfaktantem w oleju HFE. Delikatnie odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać. Powtórz to trzy razy lub więcej, aż małe kropelki satelitarne zostaną usunięte.

Po dwóch do pięciu minutach osiadania usuń dolną fazę olejową. Zastąp tę objętość 5% fluorosurfaktantem w oleju fluorowęglowym. Odpipetować 100 mikrolitrów próbki do 200-mikrolitrowych probówek do PCR i umieścić probówki do PCR w termocyklerze.

Odpipetować próbkę na szkiełku zliczającym w celu obrazowania fluorescencyjnego i zobrazować próbkę. Emulgacja z szablonem cząstek zapewnia doskonałą monodyspersyjność. Gdy nadmiar supernatantu jest usuwany, dodaje się stabilizujący środek powierzchniowo czynny, a próbka jest wirowana w celu wytworzenia emulsji.

Powstałe kropelki składają się z rdzenia cząstki i próbki wodnej zawierającej odczynniki i cząsteczki próbki lub komórki niezbędne do reakcji. Polirozproszone kropelki z cząstkami szablonowymi wskazują na niewystarczający wir. Kolejną kwestią jest generowanie nadmiernej ilości satelitów, które obniżają skuteczność enkapsulacji.

Satelity nie powinny stanowić więcej niż 10% całkowitej objętości zamkniętej próbki. Można je usunąć z emulsji, przemywając je świeżym olejem. Użyteczność PTE można wykazać w cyfrowym PCR, gdy kropelki zawierające amplifikowane cele stają się fluorescencyjne, co pozwala na bezpośrednie ilościowe określenie celów.

Fluorescencyjne kropelki dają niewiele pozytywów, gdy cel jest rzadki, i wiele, gdy jest obfity. Wyniki te są powtarzalne przy użyciu dostępnych na rynku cząstek poliakrylamidu, co pozwala uzyskać dokładne pomiary w tym samym zakresie. Usunięcie supernatantu z fazy dyspersyjnej jest ważne dla enkapsulacji próbki.

Znajomość objętości osadu i supernatantu może pomóc w zidentyfikowaniu interfejsu między nimi. W razie wątpliwości należy postąpić zgodnie z usunięciem supernatantu.