Name: Przygotowanie napromieniowanych i oznakowanych samców komarów Aedes aegypti do uwolnienia w operacyjnym programie techniki sterylnych owadów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Naucz się metody masowego hodowlania i przygotowania sterylnych samców komarów Aedes aegypti do zastosowania techniki sterylnego owada w zwalczaniu wektorów chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom R.-D. Xue, C. Bibbs, W. Qualls i V. Aryaprema z Anastasia Mosquito Control District, St. Augustine na Florydzie, za partnerstwo w rozwoju programu SIT i wiedzę ekspercką na temat skutecznego operacyjnego uwalniania bezpłodnych samców Aedes aegypti. Badania te były wspierane przez USDA-ARS i Departament Rolnictwa i Usług Konsumenckich Florydy (FDACS). Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony USDA lub FDACS.

<ol><li>Moyes, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contemporary+status+of+insecticide+resistance+in+the+major+Aedes+vectors+of+arboviruses+infecting+humans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Contemporary status of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses infecting humans.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (7), 0005625(2017).</li>
<li>Baldacchino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+methods+against+invasive+Aedes+mosquitoes+in+Europe%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Control methods against invasive Aedes mosquitoes in Europe: a review.</a> Pest Management Science. 71 (11), 1471-1485 (2015).</li>
<li>Burkett, D. A., Cope, S. E., Strickman, D. A., White, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Deployed+Warfighter+Protection+%28DWFP%29+Research+Program%3A+Developing+new+public+health+pesticides%2C+application+technologies%2C+and+repellent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrated+Pest+Management%22%5BJournal%5D)">The Deployed Warfighter Protection (DWFP) Research Program: Developing new public health pesticides, application technologies, and repellent systems.</a> Journal of Integrated Pest Management. 4 (2), 1-7 (2013).</li>
<li>Harwood, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Aedes+aegypti+in+cryptic+environments+with+manually+carried+ultra-low+volume+and+mist+blower+pesticide+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Controlling Aedes aegypti in cryptic environments with manually carried ultra-low volume and mist blower pesticide applications.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (3), 217-223 (2016).</li>
<li>Morrison, A. C., Zielinski-Gutierrez, E., Scott, T. W., Rosenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+challenges+and+proposing+solutions+for+control+of+the+virus+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defining challenges and proposing solutions for control of the virus vector Aedes aegypti.</a> PLoS Medicine. 5 (3), 68(2008).</li>
<li>Klassen, W., Curtis, C. F. History of the sterile insect technique. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKlassen%2C+W+%22Sterile+insect+technique%3A+principles+and+practice+in+area-wide+integrated+pest+management%22">Sterile insect technique: principles and practice in area-wide integrated pest management</a>. InDyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. , Springer. Netherlands, Dordrecht. 3-36 (2005).</li>
<li>Alphey, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile-insect+methods+for+control+of+mosquito-borne+diseases%3A+an+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+and+Zoonotic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Sterile-insect methods for control of mosquito-borne diseases: an analysis.</a> Vector Borne and Zoonotic Diseases. 10 (3), 295-311 (2010).</li>
<li>Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+applications+of+induced+sterilisation+in+field+populations+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes.</a> Malaria Journal. 8, Suppl 2 (2009).</li>
<li>FAO IAEA. Guidelines for colonization of Aedes mosquito species. Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-colonisation-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.final.pdf">http://www.naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-colonisation-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.final.pdf</a> (2018).</li>
<li>Bond, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+irradiation+dose+to+Aedes+aegypti+and+Ae.+albopictus+in+a+sterile+insect+technique+program%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program.</a> PloS One. 14 (2), 0212520(2019).</li>
<li>Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+one+rabbit+out+of+the+hat%3A+Radiation%2C+transgenic+and+symbiont-based+approaches+for+sustainable+management+of+mosquito+and+tsetse+fly+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations.</a> Acta Tropica. 157, 115-130 (2016).</li>
<li>Carvalho, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+genetically+modified+Aedes+aegypti+for+field+releases+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e3579(2014).</li>
<li>Carvalho, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+lines+for+combined+sterile+insect+technique+and+incompatible+insect+technique+applications%3A+the+importance+of+host+genomic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+experimentalis+et+applicata%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti lines for combined sterile insect technique and incompatible insect technique applications: the importance of host genomic background.</a> Entomologia experimentalis et applicata. 168 (6-7), 560-572 (2020).</li>
<li>FAO/IAEA. Guidelines for mass-rearing of Aedes mosquito species. Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-mass-rearingofAedes-mosquitoes_v1.0.pdf">http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-mass-rearingofAedes-mosquitoes_v1.0.pdf</a> (2020).</li>
<li>FAO/IAEA. Guidelines for mark-release-recapture procedures of Aedes mosquitoes. Bouyer, J., et al. , Vienna, Austria. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-MRR-Aedes_v1.0.pdf">http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-MRR-Aedes_v1.0.pdf</a> (2020).</li>
<li>FAO/IAEA. Guidelines for Routine Colony Maintenance of Aedes Mosquito Species, Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/guidelines-for-routine-colony-maintenance-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.pdf">http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/guidelines-for-routine-colony-maintenance-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.pdf</a> (2017).</li>
<li>Mamai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+larval+development+and+pupal+production+in+the+FAO%2FIAEA+mass-rearing+rack+and+factors+influencing+sex+sorting+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti larval development and pupal production in the FAO/IAEA mass-rearing rack and factors influencing sex sorting efficiency.</a> Parasite. 27, 43(2020).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incompatible+and+sterile+insect+techniques+combined+eliminate+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Incompatible and sterile insect techniques combined eliminate mosquitoes.</a> Nature. 572 (7767), 56-61 (2019).</li>
<li>BEI Resources. Methods in Aedes Research. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods%20in%20Aedes%20Research%202016.pdf">https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods%20in%20Aedes%20Research%202016.pdf</a> (2016).</li>
<li>Focks, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+separator+for+the+developmental+stages%2C+sexes%2C+and+species+of+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">An improved separator for the developmental stages, sexes, and species of mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 17 (6), 567-568 (1980).</li>
<li>International Atomic Energy Agency. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+Dosimetry+in+Radiotherapy.+Technical+Reports+Series+No.+110%22">Manual of Dosimetry in Radiotherapy. Technical Reports Series No. 110</a>. , Vienna. (1970).</li>
<li>Aldridge, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-irradiation+reduces+survivorship%2C+feeding+behavior%2C+and+oviposition+of+female+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Gamma-irradiation reduces survivorship, feeding behavior, and oviposition of female Aedes aegypti.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 36 (3), 152-160 (2020).</li>
<li>Cianci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+mosquito+population+size+from+mark-release-recapture+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Estimating mosquito population size from mark-release-recapture data.</a> Journal of Medical Entomology. 50 (3), 533-542 (2013).</li>
<li>Knipling, E. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipling%2C+EF+%22The+basic+principles+of+insect+population+suppression+and+management%22">The basic principles of insect population suppression and management</a>. , United States Department of Agriculture. Washington, DC. (1979).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.

Zainicjowanie programu kontrolnego z udziałem SIT, który wykorzystuje promieniowanie, wymaga ustanowienia lokalnego szczepu Aedes aegypti. Ten krok ma kluczowe znaczenie i może pozwolić SIT naprawdę odróżnić się od podobnych technologii sterowania. Opracowując projekt na lokalnym szczepie komarów, wygenerowane samce prawdopodobnie będą miały zachowania, które pozwolą im przystosować się do zmian i sygnałów środowiskowych oraz zlokalizować i kojarzyć się z dzikimi samicami w pobliżu. Co więcej, wypuszczenie napromieniowanych miejscowych samców może nie wywołać negatywnej opinii publicznej w porównaniu z, powiedzmy, uwolnieniem nielokalnego szczepu genetycznie zmodyfikowanych komarów, który mógłby na przykład wprowadzić nowe allele do lokalnej populacji komarów.
Wydatkowanie znacznych środków na hodowlę ogromnych ilości komarów tylko po to, aby móc wykorzystać około połowy z nich do celów kontrolnych, jest ograniczeniem programu Aedes aegypti SIT. Należy wprowadzić udoskonalenia do protokołu chowu, aby skondensować dojrzewanie larw w bardziej określonych ramach czasowych, w których poczwarki będą gotowe. Pozwoliłoby to na zebranie większej liczby poczwarek w optymalnym momencie separacji. Jednak dodatkowe poczwarki do przetworzenia zwiększają ryzyko przepoczwarzania się większej liczby samic po zebraniu poczwarek, a tym samym zwiększają prawdopodobieństwo, że samice trafią na szalki Petriego z samcami i prawdopodobnie zostaną uwolnione. Chociaż długość życia, zachowania związane z karmieniem krwią i składaniem jaj u napromieniowanych poczwarek Aedes aegypti są zmniejszone u dorosłych, nie jest dobrą strategią przypadkowe wypuszczanie samic wraz z napromieniowanymi samcami22. Dlatego priorytetem powinno pozostać zminimalizowanie liczby samic przypadkowo oddzielonych, napromieniowanych, znakowanych i wypuszczanych z samcami.
Sukces programu SIT ostatecznie zależy od udanej konkurencji partnerskiej ze strony hodowanych w koloniach, napromieniowanych samców. Zachowanie konkurencyjności samców opiera się na wyczerpującym, eksperymentalnie uzyskanym doborze dawki i maksymalizacji szacowanego stosunku bezpłodnych do dzikich samców w populacji. Wybór dawki zależy od kilku kluczowych czynników, takich jak długowieczność, płodność, płodność i śmiertelność poczwarek. Zaobserwowano, że samce komarów będą wykazywać asymptotyczną krzywą płodności, która zbliża się do zera wraz ze wzrostem promieniowania (dane niepublikowane KJL, RLA, SCB). Jednocześnie długowieczność i poziom aktywności samców komarów maleje wykładniczo wraz ze wzrostem dawki promieniowania (dane niepublikowane KJL, RLA, SCB). Dlatego też, zamiast identyfikować dawkę, która daje 99,9% bezpłodności u mężczyzn, lepiej jest skupić się na niższym procencie bezpłodności, jednocześnie wspierając przeżywalność. Po ustaleniu zakresu dawek, który nie różnicuje długowieczności ani śmiertelności w okresie poczwarek u samców poddanych promieniowaniu od śmiertelności samców nienapromieniowanych, należy przeprowadzić dodatkowe oceny płodności w celu określenia dawki, która sprawia, że samce stają się przytłaczająco bezpłodne, a mimo to konkurencyjne.
Jednocześnie bardzo ważne jest porównanie liczby samców komarów w populacji z liczbą uwolnionych napromieniowanych samców. Można to osiągnąć poprzez wielokrotne zbieranie samców z różnych miejsc w obszarze docelowego uwolnienia i wokół niego z tego samego miejsca oraz przed, w trakcie i po zainicjowaniu programu SIT. Należy przeprowadzić badanie znakowania, uwalniania i ponownego chwytania, aby ocenić stosunek dzikich samców komarów do uwolnionych komarów. Badanie typu "znakuj, wypuszczaj, ponownie chwytaj" opiera się na wypuszczeniu znanej liczby oznaczonych komarów z określonego punktu i ich późniejszym ponownym schwytaniu w punktach znajdujących się w bliskiej odległości od początkowego punktu uwolnienia. Porównując liczbę ponownie schwytanych samców i dzikich samców w odległościach od punktu wypuszczenia, możliwe jest oszacowanie ogólnej dzikiej populacji samców na tym obszarze, tak aby można było wypuścić konkurencyjne proporcje bezpłodnych samców23. Maksymalizację stosunku bezpłodnych samców do dzikich samców można osiągnąć poprzez wypuszczenie większej liczby bezpłodnych samców i/lub zmniejszenie dzikiej populacji za pomocą klasycznych środków kontroli, takich jak redukcja źródła, kontrola niedojrzałości lub leczenie dorosłością.
Aby ocenić skuteczność sterylnych wypuszczeń samców, dorosłe kolekcje można porównać chronologicznie z obszarem nieinterwencyjnym. Gdy bezpłodne samce są wypuszczane, a liczba zebranych samców i samic na danym obszarze zmniejsza się w stosunku do porównywalnego obszaru nieobjętego interwencją, można postawić hipotezę, że jest to spowodowane tym, że wypuszczone bezpłodne samce skutecznie konkurują z lokalnymi płodnymi samcami. Efekt ten można również zaobserwować w miseczkach pułapek do składania jaj rozmieszczonych zarówno w miejscach interwencji, jak i nieinterwencji. Jaja mogą być nadal produkowane w miejscu interwencji, ale jeśli wykluwa się mniej jaj niż w miejscu nieinterwencyjnym, można przypuszczać, że nie są one zapłodnione z powodu kojarzenia się samic z bezpłodnymi samcami. Coraz częstsze składanie jaj przez niezapłodnione jaja może ostatecznie prowadzić do zmniejszenia składania jaj z powodu braku wymiany samic w miejscu interwencji 8,24.
Przyszłe kierunki rozwoju technologii i programów SIT w naturalny sposób rozszerzają się na dodatkowe gatunki komarów o znaczeniu medycznym. Na przykład, technologia ta może być łatwo zaadaptowana do zwalczania Aedes albopictus, biorąc pod uwagę bardzo podobną bionomię Aedes aegypti i Aedes albopictus. Inne interesujące gatunki komarów wektorów chorób to Culex quinquefasciatus, Culex tarsalis i różne gatunki Anopheles . Poprawa skuteczności tej technologii zależy od zwiększenia zdolności wytwarzanych w danym czasie poczwarek płci męskiej, co można osiągnąć poprzez manipulację genetyczną lub sztuczną selekcję, oraz poprawy konkurencyjności samców, którą można osiągnąć poprzez zwiększenie męskości, płodności lub długowieczności.
Ostatecznie programy SIT nie są srebrną kulą do zwalczania komarów. Zamiast tego są narzędziem w zestawie innych technik kontroli, takich jak programy IVM, które kompensują krzyżowo słabości między technikami. Na przykład, podczas gdy kontrola chemiczna zapewnia szybką i tanią kontrolę, sprzyja ona również rozwojowi oporności i śmiertelności niebędącej celem zwalczania; i podczas gdy SIT jest specyficzny dla gatunku i prawdopodobnie nie wytworzy odporności, samce SIT muszą być produkowane i wypuszczane na zawsze, aby kontrolować populacje imigracyjne spoza okręgu kontroli wektorów.

Przenoszenie patogenów przenoszonych przez komary na ludzi powoduje miliony przypadków chorób i zgonów każdego roku na całym świecie. Wobec braku skutecznych, zatwierdzonych szczepionek przeciwko chorobom przenoszonym przez komary, takim jak Zika czy gorączka denga, jednym z najskuteczniejszych sposobów ograniczenia transmisji jest zmniejszenie populacji komarów będących wektorami choroby. Irytujące jest to, że coraz więcej gatunków komarów, tradycyjnie będących celem pestycydów, wykazuje coraz wyższy poziom odporności na pestycydy1. Jednocześnie agencje rządowe agresywnie wyrejestrowały lub zakazały stosowania wcześniej zatwierdzonych pestycydów i opracowywanych jest niewiele nowych, skutecznych środków kontroli chemicznej2,3. Ta konstelacja przeszkód w zwalczaniu komarów zmotywowała do zbadania alternatywnych technik niechemicznych w celu zmniejszenia populacji komarów.
Niektóre gatunki komarów stanowią wyzwanie dla problemów z odpornością i rejestracją pestycydów. Aedes aegypti (L.) jest wybitnym komarem wektorem choroby, który jest niezwykle trudny do zwalczania za pomocą tradycyjnego zintegrowanego zarządzania wektorami ze względu na tajemnicze siedlisko okołodomowe wykorzystywane przez ten gatunek do niedojrzałego rozwoju i odpoczynku dorosłego osobnika4,5. Wyzwania związane z eksploatacją tajemniczych siedlisk wokół rezydencji obejmują trudności w dotarciu do tych miejsc za pomocą technik opryskiwania pestycydami, a także potencjalny brak akceptacji społeczeństwa dla powtarzającego się dostępu do prywatnej własności dla agencji zdrowia publicznego zajmujących się kontrolą wektorów w celu prowadzenia intensywnych działań w zakresie nadzoru i kontroli, które mają kluczowe znaczenie dla skutecznego zintegrowanego zarządzania wektorami (IVM) dla tego gatunku.
Na szczęście, SIT, podejście, które okazało się skuteczne w długotrwałym zwalczaniu innych bardzo trudnych gatunków owadów6, jest stosowane do problemu Aedes aegypti w przełomowej serii eksperymentów i prób operacyjnych w St. Augustine na Florydzie (dane niepublikowane przez KJL, RLA, SCB). SIT został zastosowany do wielu gatunków owadów, w tym komarów, i został dogłębnie sprawdzony7,8. SIT wykorzystuje masowe uwalnianie samców hodowanych w koloniach, wysterylizowanych, na przykład przez wystawienie na promieniowanie jonizujące lub chemikalia, aby przytłoczyć wybór partnera w naturalnych populacjach samic. Wysterylizowane samce, które kojarzą się z dzikimi samicami, sprawiają, że jaja stają się bezpłodne z powodu uszkodzeń doznanych przez męskie gamety, a jeśli są obecne w wystarczającej liczbie, mogą teoretycznie rozbić naturalną populację Aedes aegypti.
Program SIT został zainicjowany w celu zmniejszenia populacji Aedes aegypti w obszarze miejskim na wybrzeżu Atlantyku na Florydzie, gdzie gatunek ten niedawno ponownie skolonizował i rozprzestrzenia się, stanowiąc zagrożenie dla zdrowia publicznego dla przenoszenia wirusów takich jak Zika, denga czy chikungunya. Aby zmaksymalizować potencjał kompatybilności z dzikimi samicami, założono nową kolonię przy użyciu dziko złowionych Aedes aegypti z populacji docelowej w celu wyprodukowania samców dla programu9. Opierało się to na hipotezie, że lokalnie pochodzące, hodowane w koloniach samce będą bardziej skłonne do konkurowania z lokalnymi dzikimi samcami w kojarzeniu się z lokalnymi dzikimi samicami. Aby SIT był skuteczny, nie tylko przytłaczająca liczba bezpłodnych samców musi być obecna na obszarze docelowym, ale także muszą być zdolne do skutecznego zalecania się i kojarzenia z lokalnymi dzikimi samicami komarów.
Przeprowadzono serię eksperymentów w celu określenia optymalnej liczby bezpłodnych samców do uwolnienia (dane niepublikowane KJL, RLA, SCB), jak również optymalnych dawek promieniowania, które uczyniłyby samce bezpłodnymi, nie ingerując w przeżycie, zachowanie lub akceptację przez dzikie samice (dane niepublikowane przez KJL, RLA, SCB). Dane te zostaną wkrótce opublikowane w publikacjach tej grupy, ale niektóre z tych ustaleń zostały również ujęte w tym protokole i mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia dla nowych programów kontrolnych SIT Aedes aegypti w innych miejscach. Gatunek ten stale poszerza swój zasięg, a programy SIT są bardzo obiecujące, aby być opłacalnymi, długoterminowymi rozwiązaniami do kontrolowania tej populacji. Celem tego protokołu jest produkcja wysterylizowanych, samców, hodowanych w koloniach komarów Aedes aegypti w celu systematycznego wypuszczania na tereny zewnętrzne w celu zakłócenia naturalnych cykli rozrodczych lokalnych populacji Aedes aegypti w ramach operacyjnego programu kontroli wektorów zdrowia publicznego.
Chociaż podobne protokoły i przepływy pracy zostały opublikowane dla produkcji transgenicznych samców Aedes aegypti i przepływy pracy dla Aedes SIT, lub programy niekompatybilności oparte na Wolbachii zostały opublikowane gdzie indziej, ten protokół ilustruje, jak istniejące protokoły zostały zaadaptowane dla Aedes aegypti Produkcja, separacja i napromienianie poczwarek samców, znakowanie i pakowanie dorosłych samców oraz wysyłka do miejsca wydania dla tego programu9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Element znakowania tego protokołu może nie być wymagany w dojrzałym operacyjnym programie SIT; jednak został on uwzględniony tutaj, ponieważ jest to jeden ze sposobów monitorowania skuteczności i kontrolowania jakości całego procesu we wczesnych latach tworzenia programu SIT. Programy zwalczania komarów są zazwyczaj prowadzone przez władze lokalne, więc mogą się znacznie różnić w wielu aspektach swojej organizacji, od wielkości i bazy finansowania po dostrajanie taktyk kontroli w celu maksymalizacji lokalnego sukcesu. W związku z tym protokół opisany w niniejszym dokumencie powinien zostać oceniony pod kątem kompatybilności z dostępnymi zasobami.

<table><tbody><tr><td>Klucz 1-1/8" (1" (1 cal) = 2,54 cm)</td><td>Craftsman</td><td>CMMT44707</td><td></td></tr> 1<tr><td>/2 litra kubka kartonowego (1/2 litra = 236,5 ml)</td><td>Science Supplies WLE corp</td><td>1/2 pinty</td><td></td></tr><tr><td>rurki 1/4" - tygon</td><td>Hudson Extrusions</td><td>LLDPE1/8 X 1/4 BLK</td><td>do zamocowania do reduktora gazu CO2</td></tr> 1<tr><td>/8" mosiężny zadzior z przyłączem MIP</td><td>B& K</td><td>BHB-85NLB</td><td>do podłączenia do reduktora gazu CO2</td></tr><tr><td>1000 ml zlewki z podziałki plastikowej z uchwytem</td><td>Thermo Scientific</td><td>1223-1000</td><td></td></tr><tr><td>3000 mL plastikowe zlewki z podziałką z uchwytem</td><td>Thermo Scientific</td><td>1223-3000</td><td></td></tr><tr><td>Duża klatka dla dorosłych</td><td>Bioquip</td><td>1450D</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki z aspiratorem</td><td>Bioquip</td><td>2809V</td><td></td></tr><tr><td>Wątroba bydlęca w proszku</td><td>MP Biomedicals</td><td>290039601</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże piwne</td><td>MP Biomericals</td><td>02903312-CF</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Regulator CO2</td><td>Zbiornik CO2 Randor</td> 64003038 <td></td></tr><tr><td>(kanister 20 #)</td><td>Zbiornik na CDBEVCARB20 Praxair</td><td>Treasure</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gurus</td><td>KI-ENAMELMISKA</td><td>do separatora</td></tr><tr><td>Waciki - duża</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Kubki delikatesowe z pokrywkami - 470 ml</td><td>Pactiv DELItainer</td><td>PCTYSD2516</td><td></td></tr><tr><td>Kubki delikatesowe z pokrywkami - 1900 ml</td><td>Berry Global</td><td>T60764</td><td></td></tr><tr><td>DoseReader 4</td><td></td><td></td><td>ND0.5 i ND1.0 QA Zestaw filtrów Standardy Folia</td></tr><tr><td>dozymetryczna</td><td>Far West Technology, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Millipore</td><td>AP10045S0</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator latarki</td><td>Bioquip</td><td>2809D</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze - drobne piórka</td><td>Bioquip</td><td>4748 lub 4750</td><td>o wadze piórkowej</td></tr><tr><td>GAFchromowa</td><td></td><td></td><td>folia radiochromowa</td></tr><tr><td>Gammator M</td><td>Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ</td><td></td><td>Cesium-137 promiennik</td></tr><tr><td>Ręczny aspirator mechaniczny</td><td>Clarke Mosquito</td><td>13500</td><td></td></tr><tr><td>Prezerwatywy ze skóry jagnięcej</td><td>Trojan</td><td>Naturalamb</td><td></td></tr><tr><td>Duża komora CO2</td><td>Sterilite</td><td>Walmart #&nbsp; </td><td></td>568789514</tr><tr><td>Patelnie do odchowu larw</td><td>Blue Ridge Thermoforming&</td><td>nbsp; 01-FG-400-3N-ABS</td><td>Wymiary: 22,375 x 17,5 x 3 (cale)</td></tr><tr><td>Magnesy - 20 # ciągnięcie Magnesy</td><td>Master</td><td>MHHH20BX</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik do znakowania</td><td>Dayglo</td><td>ECO-11</td><td>Aurora Różowy</td></tr><tr><td>Barwnik do znakowania</td><td>Dayglo</td><td>ECO-17</td><td>Saturn Yellow</td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Falk</td><td></td><td>T301</td></tr><tr><td>Pipety pastwiskowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>02-708-006</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego - duże</td><td>VWR International</td><td>25384-090 CS</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego - małe (60 mm x 15 mm)</td><td>Marka Fisher FB0875713A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Separator poczwarek</td><td>J.W. Hock</td><td>1512</td><td></td></tr><tr><td>Czerwony wąż gumowy</td><td>Welch</td><td>331040-5</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki zwalniające</td><td>Science Supplies WLE corp</td><td>1 galon</td><td></td></tr><tr><td>Gumki recepturki - krzyż #19</td><td>Alliance</td><td>ALL37196</td><td></td></tr><tr><td>Gumki recepturki - latitude #64</td><td>Skillcraft</td><td>NSN0589974</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Ohaus</td><td>H-4737</td><td></td></tr><tr><td>Papier do kiełkowania nasion - Ciężki materiał 76#</td><td>Anchor Paper</td><td>#76</td><td></td></tr><tr><td>Chłodziarki transportowe - 16 x 13 x 12.5"</td><td>MrBoxonline.com</td><td>Zestaw</td><td></td>chłodnicy piankowej Husky</tr><tr><td>Sito #20</td><td>Advantech</td><td>20BS8F</td><td></td></tr><tr><td>Sito #30</td><td>Advantech</td><td>30BS8F</td><td></td></tr><tr><td>Mała klatka - Bug Dorm</td><td>MegaView</td><td>Bug Dorm-1</td><td></td></tr><tr><td>Mała komora CO2</td><td>Filary</td><td>Walmart #&nbsp; </td><td></td>562922221</tr><tr><td>Pokrywka do sufletu</td><td>SOLO</td><td>41165277456</td><td></td></tr><tr><td>Kubki sufletowe - 4 uncje (1 uncja = 29.6 ml)</td><td>SOLO</td><td>41165024104</td><td></td></tr><tr><td>Gąbka</td><td>ocelo</td><td>MMM7274FD</td><td></td></tr><tr><td>Butelka do wyciskania</td><td>Dynalon</td><td>3UUP6</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Meiji Techno</td><td>EMZ-5</td><td></td></tr><tr><td>Pończocha</td><td>BSN Medyczna</td><td>30-1006</td><td></td></tr><tr><td>Styropianowa</td><td></td><td></td><td>ekstrudowana pianka polistyrenowa</td></tr><tr><td>Pokarm w płatkach ryb tropikalnych</td><td>Tetra</td><td>4,52 funta</td><td></td></tr><tr><td>Komora próżniowa - eksykator</td><td>BelArt</td><td>T9FB892757</td><td></td></tr><tr><td>Łodzie wagowe</td><td>Globe Scientific</td><td>3621</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie napromieniowanych i oznakowanych samców komarów aedes aegypti do uwolnienia w operacyjnym programie techniki sterylnych owadów

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

Kontrola takich chorób ludzkich jak denga, Zika i chikungunya opiera się na kontroli ich wektora, komara Aedes aegypti, ponieważ nie ma żadnej prewencji. Zwalczanie komarów-wektorów może opierać się na środkach chemicznych stosowanych w stadiach niedojrzałych i dorosłych, co może przyczyniać się do śmiertelności zwierząt niebędących celami, a co ważniejsze, prowadzić do odporności wektora na środki owadobójcze. Technika sterylnych owadów (SIT) to metoda kontrolowania populacji szkodników poprzez wypuszczanie wysterylizowanych dorosłych samców, które kojarzą się z dzikimi samicami, aby uzyskać niezdolne do życia potomstwo. W artykule opisano proces produkcji bezpłodnych samców do wykorzystania w operacyjnym programie SIT do zwalczania komarów Aedes aegypti. Poniżej przedstawiono kroki stosowane w programie, w tym hodowlę i utrzymanie kolonii, oddzielanie poczwarek płci męskiej i żeńskiej, napromienianie i znakowanie dorosłych samców oraz wysyłkę samców Aedes aegypti do miejsca uwolnienia. Omówiono również zastrzeżenia proceduralne, ograniczenia programu i przyszłe cele.

Czujny i odpowiedni wychow komarów polega na zapewnieniu zrównoważonej dostępności samców i samic w klatkach kolonijnych, utrzymywaniu świeżego roztworu sacharozy i miodu oraz stałym żywieniu krwi wysokiej jakości. Warunki te zapewnią gęsto upakowane arkusze jaj optymalne do stosowania w chlewniach do odchowu larw SIT. Właściwe przechowywanie i stosowanie suszonych arkuszy jaj, takie jak systematyczne etykietowanie w celu ułatwienia użycia od najstarszego do najnowszego, zapewni równomierne wylęganie na wszystkich patelniach. Napełnienie wszystkich pojemników do odchowu larw wodą przed wykluciem może skrócić czas, w którym arkusze jaj znajdują się w pojemnikach wylęgowych i sprzyjać zdrowemu rozwojowi. Utrzymanie misek larwalnych od wylęgu do przepoczwarzenia wymaga starannego zaangażowania personelu kolonii, ponieważ niektóre karmidła mogą potrzebować więcej lub mniej pokarmu lub dodatkowej wody w zależności od etapów rozwoju i zmiennych środowiskowych. Jeśli wystąpią problemy ze stopniem rozwoju do zaplanowanego dnia separacji płci poczwarki, należy dokonać korekt na wcześniejszym etapie procesu, takich jak wcześniejsze lub późniejsze wykluwanie, dostosowanie pokarmu lub zmiana temperatury inkubatora.
Proces hodowli w tym protokole nie sprawia, że wszystkie jaja wykluwają się na czas, aby przekształcić się w poczwarki, które mogą być napromieniowane i wykorzystane do celów kontrolnych. Od 20 do 50% komarów hodowanych w koloniach nadal będzie larwami, zanim poczwarki będą musiały zostać oddzielone. Jednak larwy te nie są marnotrawione, ale pozwalają im dojrzeć przez 24 godziny, aby wytworzyć dodatkowe poczwarki, które można połączyć z poczwarkami samic z separacji poprzedniego dnia i ponownie umieścić w klatkach kolonijnych. W klatkach kolonijnych poczwarki będą mogły dojrzeć do postaci dorosłych, łączyć się w pary, karmić krwią i produkować jaja, które podtrzymują projekt SIT.
Rozdzielanie poczwarek, wlewanie poczwarek na szalki Petriego, napromienianie i umieszczanie w klatkach dla dorosłych po napromieniowaniu musi nastąpić w ciągu jednego dnia; dlatego należy przeznaczyć odpowiedni czas na komfortowe wykonanie wszystkich kroków. Montaż i przygotowanie pojemników zwalniających powinno być wykonane przed procesem znakowania. Po zwrocie pudełek wysyłkowych z miejsca wydania, pojemniki zwalniające powinny zostać sprawdzone i przygotowane do następnego użycia. Wyrzucanie mokrych wacików, wietrzenie mokrych pojemników do uwalniania, czyszczenie szalek Petriego, wymiana siatki i usuwanie elastycznych opasek z pojemnika, gdy nie są używane, znacznie przedłuży żywotność pojemników do uwalniania.
Biorąc pod uwagę ogólnoświatową rzeczywistość pandemii wirusa COVID-19, ten protokół, który zazwyczaj jest operacją wieloosobową, został zmodyfikowany tak, aby był możliwy do wykonania przez jedną osobę pracującą samodzielnie w laboratorium na każdym kroku. Etapy procesu, które są najbardziej utrudnione przez scenariusz jednoosobowy, to etapy określania płci, znakowania, ważenia i utrzymania hodowli kolonii. Oddzielenie poczwarek według płci przez jedną osobę powinno być wystarczające, jeśli w różnych pomieszczeniach pracuje jednocześnie wiele separatorów. W sytuacji pandemii, w której w miejscu pracy występuje dystans społeczny, wymagane jest wyposażenie wielu stanowisk, aby wykonać kroki od seksu po pakowanie. W zależności od prędkości operatora, jedna osoba potrzebuje ~4 godzin, aby zmodyfikować 15 000 komarów, a następnie kolejne 1-2 godziny na ich oznaczenie, zważenie i zapakowanie. Scenariusz dwuosobowy skraca czas, w którym komary są znieczulane do znakowania i skraca ogólny czas pracy. Jednak nawet w scenariuszu dwuosobowym przydzielenie pełnych 2,0 g komarów na klatkę wypuszczania może być trudne ze względu na ograniczony czas pracy, gdy komary są uspokojone. Chociaż proces czyszczenia i przygotowania materiału do odchowu larw i osobników dorosłych jest niezwykle czasochłonny i pracochłonny, można go podzielić tak, aby poszczególni operatorzy mogli pracować samodzielnie i bezpiecznie w czasie pandemii.
Wypuszczanie dorosłych, oznaczonych, napromieniowanych samców Aedes aegypti wykracza poza zakres tego protokołu, ale jest tutaj przedstawione w skrócie. Proces uwalniania oznaczonych, napromieniowanych samców komarów rozpoczyna się od określenia równomiernego rozkładu uwalniania pojemników na uwolnienie w oparciu o wagę (a tym samym wywnioskowaną liczbę bezpłodnych samców), jak podano w tabeli 3. Po dostarczeniu przesyłek do okręgu kontroli wektorów, pudełka są otwierane, a pojemniki zwalniające oceniane pod kątem wszelkich problemów ze śmiertelnością lub stanem kontenerów wydawniczych. Komary w pojemnikach uwalniających są następnie pozostawiane do aklimatyzacji do temperatury i wilgotności otoczenia przez 1-2 godziny przed transportem do obszaru leczenia. Miejsca uwolnienia na obszarze objętym badaniem są identyfikowane po intensywnym nadzorze pod kątem gorących punktów dzikich populacji Aedes aegypti. Czas, częstotliwość i gęstość wypuszczania są równoważone przez bionomię gatunku, a także meteorologię, wsparcie publiczne i możliwości hodowli laboratoryjnej.
Ponieważ konkretne pojemniki uwalniające są dopasowywane do konkretnych miejsc wydania, etykieta musi zostać sprawdzona krzyżowo przed otwarciem pojemnika na uwolnienie poprzez przecięcie siatki na górze, co pozwala operatorowi na odkształcenie siatki, tak aby część samców mogła uciec. Ta metoda uwalniania frakcyjnego jest powtarzana w każdym przypisanym punkcie wypuszczenia dla pojemnika, aż wszystkie swobodnie latające samce zostaną wypuszczone. Proces ten jest następnie powtarzany dla każdego kontenera wydania w odpowiedniej przypisanej lokalizacji wydania, aż wszystkie kontenery zostaną przetworzone. Fakultatywnie, po uwolnieniu komarów, wszystkie martwe lub niepełnosprawne komary, które nie opuściły swobodnie komarów, mogą zostać zebrane na szalki Petriego i oznaczone w celu ręcznego policzenia lub zważenia w celu skorygowania szacowanej liczby uwolnionych komarów. Ciągły i wszechobecny nadzór nad dorosłymi, jajowymi i niedojrzałymi stadiami dzikiego Aedes aegypti na obszarze docelowym i ewentualnie w miejscach kontroli nieinterwencyjnej jest prowadzony w celu oceny skuteczności operacji SIT.

Technika sterylnych owadów (SIT) jest używana do kontrolowania określonych, ważnych z medycznego punktu widzenia populacji komarów, które mogą być odporne na chemiczne kontrole. W tym miejscu opisujemy metodę masowego chowu i przygotowania bezpłodnych samców komarów do wypuszczenia na wolność w operacyjnym programie SIT ukierunkowanym na komara Aedes aegypti.

Przygotowanie napromieniowanych i oznakowanych samców komarów Aedes aegypti do uwolnienia w operacyjnym programie techniki sterylnych owadów

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...

Unikalną wartością tego protokołu jest to, że dwóch pracowników korzystających z łatwo dostępnego sprzętu w małych przestrzeniach laboratoryjnych może wyprodukować wystarczającą ilość sterylnych komarów mal, aby wesprzeć 50-hektarowy program operacyjny SIT. Wydajność i niski koszt tej techniki sprawiają, że jest ona dostępna i niewykonalna nawet dla małych okręgów zwalczania komarów, aby rozszerzyć ich zintegrowany program kontroli wektorowej. Procedurę zademonstrujemy ja i Barbara Bayer, technicy laboranci nauk biologicznych z jednostki badawczej.Aby wyhodować dorosłe osobniki Aedes aegypti z poczwarek, przygotuj składane aluminiowe klatki hodowlane o wymiarach 60 na 60 na 60 centymetrów z siatką z włókna szklanego o wymiarach 0,84 na 0,84 milimetra i rękawem pończochy na jednej pionowej ścianie każdej klatki. Umieść plastikowy kubek o pojemności 1 900 mililitrów z poczwarkami Aedes aegypti w stosunku jeden do jednego płci w każdej klatce hodowlanej i zawiąż rękaw zamknięty, pozostawiając kubki w klatkach do eklozji na około cztery dni w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza wyższej niż 50% wilgotności względnej w cyklu światła i ciemności 12:12 lub 14:10, aż nie pojawią się więcej dorosłych. 24 godziny po umieszczeniu poczwarek w klatkach hodowlanych umieść pojemnik z 10% roztworem sacharozy z gąbkowym w każdej klatce i zawieś gąbkę o wymiarach 10 na 2 centymetry nasączoną miodem na drucianym haku, aby zapewnić odpowiednie nawodnienie i odżywienie dorosłym komarom.48 do 72 godzin po pojawieniu się większości dorosłych co dwa do trzech dni przez następne trzy do czterech tygodni, napełnij jedną prezerwatywę ze skóry jagnięcej 50 do 100 mililitrami zdefibrynowanej krwi bydlęcej na klatkę i podgrzej prezerwatywy do około 37 stopni Celsjusza w gorącej kąpieli wodnej. Po dokładnym oklepywaniu prezerwatyw ręcznikiem, umieść częściowo wysuszone prezerwatywy na osobnych wyłożonych papierem szalkach Petriego w klatkach na 30 do 60 minut. 48 do 72 godzin po każdym karmieniu krwią umieścić w każdej klatce kubek do składania jaj o pojemności 1 900 mililitrów, zawierający 800 mililitrów przefiltrowanej wody z poczwarki i wyposażony w arkusz papieru do kiełkowania nasion o wymiarach od 8 do 10 na 30 centymetrów, umieszczony równo wzdłuż wewnętrznego obwodu kubka.Aby wyhodować larwy Aedes aegypti z jaj, użyj papieru do składania jaj z 5 000 do 10 000 jaj i wytnij od trzech do siedmiu centymetrów odcinek prostopadły do linii składania jaj. Umieść kawałek w nowym 460-mililitrowym pojemniku wypełnionym do połowy wodą z kranu i szczyptą sproszkowanych płatków pokarmu dla ryb. Przykryj i energicznie mieszaj pojemnik przez co najmniej jedną minutę przed przelaniem całej zawartości do szalki do hodowli larw zawierającej trzy litry wody z kranu i 50 mililitrów brązowej gnojowicy.Oznacz patelnię datą rozpoczęcia, informacjami o szczepie i harmonogramem karmienia. Po osiągnięciu przybliżonej progowej proporcji larw w miskach dla larw, przelej zawartość każdej patelni przez sito o wielkości 20 do 40 i użyj wyciśniętej butelki z wodą z kranu, aby wypłukać poczwarki i larwy z sita do trzylitrowej plastikowej zlewki z podziałką. Aby oddzielić poczwarki męskie od larw i poczwarek żeńskich, należy podzielić zawartość każdej zlewki między wiele plastikowych pojemników o pojemności 1,9 litra i umieścić sztywny, płytki, czterolitrowy pojemnik zbiorczy pod śluzą u podstawy separatora poczwarek.Napełnij dwie trzylitrowe plastikowe zlewki z podziałką około trzech czwartych wodą z kranu i wlej wodę przez przestrzeń między szklanymi płytkami separatora, jednocześnie regulując górne i dolne pokrętła, aby woda mogła w sposób ciągły przepływać przez separator. Gdy stojąca woda zbierze się równomiernie na wysokości około 1,25 centymetra od podstawy płytek, zaznacz pozycje początkowe na dolnych pokrętłach separatora taśmą i zacznij wlewać pojemniki z poczwarkami i larwami do separatora, ciągle obracając dolne pokrętła w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara od jednego do dwóch centymetrów od pozycji wyjściowych. Gdy większość lub wszystkie larwy zostaną przepłukane przez śluzę do pojemnika zbiorczego, należy wstrzymać przepływ wody i użyć sita numer 30, aby oczyścić pojemnik zbiorczy z larw.Po usunięciu wszystkich larw wlej wodę i ponownie wyreguluj pokrętła, aby umożliwić spłukanie poczwarek płci męskiej do pojemnika zbiorczego. Następnie wlej poczwarki samców z pojemnika do sita numer 20 i użyj jednolitrowej butelki wyciśniętej z kranu, aby umyć poczwarki z sita do osobnego pojemnika o pojemności 1,9 litra. Po zebraniu wszystkich poczwarek płci męskiej wlej wodę i wyreguluj pokrętła, aby umożliwić zebranie poczwarek samic.Za pomocą sita numer 20 przenieś poczwarki samic do nowego pojemnika o pojemności 1,9 litra, jak właśnie pokazano. Następnie wlej wodę i ponownie wyreguluj pokrętła, aż wszystkie niedojrzałe komary zostaną wypłukane z separatora. Zebrane poczwarki płci męskiej odcedź przez sito i umyj kupę w jednolitrowej zlewce z podziałką z jak najmniejszą ilością wody.Ostrożnie wlej poczwarki na szalki Petriego wyłożone wilgotną bibułą filtracyjną w jednej warstwie. Usuń stojącą wodę z dna szalki Petriego za pomocą świeżej trzymililitrowej pipety pastwiskowej, aby zapobiec ruchom poczwarki podczas pracy. Zwiąż szalki Petriego i stosy przed zamknięciem w oznakowanej 3.8-litrowej zamykanej torbie, aby zmieściła się w komorze napromieniania.Aby oznaczyć ilościowo partie dorosłych napromieniowanych samców komarów, należy usunąć wszelkie źródła pożywienia z klatki hodowlanej i umieścić jedną klatkę w dużej komorze na dwutlenek węgla na pięć do siedmiu minut, uderzając w boki pojemnika, aby usunąć wszelkie komary przylegające do ścian. Pod koniec okresu ekspozycji przenieś komary do fiolki z aspiratorem i ponownie znieczul komary, a następnie wstrząśnij komarami na powierzchnię roboczą pokrytą białym papierem. Ostrożnie zassać wszystkie samce z powierzchni roboczej do nowej fiolki i powtarzać ekspozycję i zbieranie, aż wszystkie dorosłe samce zostaną zebrane ze wszystkich klatek hodowlanych.W pewnym momencie procesu sortowania płci wygeneruj fiolkę zawierającą tylko 25 dorosłych samców komarów. Kiedy wszystkie samce zostaną zebrane, zważ każdy z komarów w tarowanej łodzi wagowej na wadze i szybko wlej zważone komary do 240-mililitrowego pojemnika kartonowego zawierającego 50 miligramów barwnika do znakowania. Przechyl i obróć pojemnik o jeden pełny obrót zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aż wszystkie komary zostaną lekko pokryte i wlej komary do nowej łodzi do ważenia, a następnie złóż łódkę ważącą na pół, aby komary mogły zostać przepuszczone przez rękaw pończochy do pojemnika zwalniającego.Po dodaniu około dwóch gramów samców komarów do pojemnika zwalniającego, zawiąż rękaw pończochy i zaznacz taśmę opisową na ramce pojemnika uwalniającego kolorem barwnika, numerem pojemnika i całkowitą wagą komarów. W tym reprezentatywnym eksperymencie dotyczącym hodowli, napromieniania i wprowadzania do obrotu dorosłych samców komarów Aedes aegypti, udało się zebrać dwa gramy dorosłych samców komarów z trzech klatek hodowlanych oraz dwie fiolki po 25 samców z dwóch klatek, aby umożliwić obliczenie średniej wagi na komara. Z dwóch partii wyrzucono w sumie 25 samic.Terminowe i obserwacyjne karmienie w ciągu tygodnia hodowli larw ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia dobrze rozwiniętych poczwarek do separacji. Powoduje to wyraźne rozróżnienie między samcami i samicami, co prowadzi do niskiego występowania samic na etapach znakowania. Oprócz wykorzystania ich w operacyjnych programach SIT, te bezpłodne samce mogą być również szeroko wykorzystywane w eksperymentach badających rywalizację godową, przeżywalność i rozprzestrzenianie się napromieniowanych samców w porównaniu z dzikimi samcami nienapromieniowanymi.Modyfikacja techniki w celu uwzględnienia samic komarów pozwala nam zbadać wpływ niezamierzonego uwolnienia napromieniowanych samic na płodność i kompetencję wektora.

preparing-irradiated-marked-male-aedes-aegypti-mosquitoes-for-release

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie Nijole Jasinskiene prezentuje metodologię wykorzystywaną do tworzenia transgenicznych komarów Aedes aegypti, które są wektorami gorączki Denga. Przedstawione zostają techniki prawidłowego przygotowania igieł do mikroiniekcji, wysuszania embrionów oraz przeprowadzania mikroiniekcji.

Mikroiniekcja zarodków A. aegypti w celu uzyskania transgenicznych komarów

Aby osiągnąć supresję populacji Aedes aegypti przy użyciu systemu RIDL® (Release of Insects carrying a Dominant Lethal), konieczne jest uwolnienie dużych liczb samców komarów. Wymaga to zastosowania technik i technologii masowej hodowli w celu zapewnienia niezawodnych systemów pozwalających na uzyskanie maksymalnej liczby wysokiej jakości samców komarów.

Masowa produkcja genetycznie zmodyfikowanych Aedes aegypti do wypuszczeń w terenie w Brazylii

Komary Aedes aegypti zakażone Wolbachią są uwalniane do naturalnych populacji w celu zahamowania transmisji arbowirusów. Opisujemy metody hodowli Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia w laboratorium do eksperymentów i uwolnienia w terenie, podejmując środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji i selekcji laboratoryjnej.

Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia

Skuteczność pestycydów zdrowia publicznego przeciwko uciążliwym owadom i wektorom chorób nie jest jednakowa w różnych strefach ekologicznych. W tym miejscu przedstawiamy system technik wykorzystujących owady wektory żyjące w niewoli jako strażników skuteczności pestycydów w celu uzyskania elektronicznych map wspierających standardową ocenę pestycydów w wielu środowiskach.

Wizualizacja skuteczności pestycydów przeciwko komarom wektorom chorób w terenie

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

Opisana to oszczędzająca czas i miejsce metoda liczenia jaj i określania szybkości wylęgu poszczególnych komarów za pomocą 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, co może znacznie zwiększyć skalę i szybkość testów płodności i płodności.

Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL)

Protokół hodowli pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis. Pasożyt przechodzi z jednego pokolenia komarów Aedes aegypti do następnego poprzez przenoszenie poziome w stadium larwalnym, a następnie przenoszenie pionowe w stadium dorosłym. Żywe sporoplazmy przeżywają długotrwale w zakażonych jajach.

Rozmnażanie pasożyta mikrosporydów Edhazardia aedis w komarach Aedes aegypti

Tutaj prezentujemy protokół badania konkurencyjności godowej samców Aedes aegypti przy użyciu barwnika fluorescencyjnego jako markera. Samice komarów są narażone na kontakt zarówno z oznaczonymi, jak i nieoznaczonymi samcami w celu kopulacji. Po kryciu ich plemniki są badane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia ich partnera godowego.

Wykorzystanie barwnika fluorescencyjnego, rodaminy B, do badania konkurencyjności godowej samców komarów Aedes aegypti

Przedstawione tutaj protokoły ilustrują trzy alternatywne sposoby oceny wydajności genetycznie modyfikowanych komarów przeznaczonych do kontroli wektorów w laboratoryjnych próbach z małymi klatkami. Każdy protokół jest dostosowany do konkretnej modyfikacji, jaką niesie ze sobą szczep komarów (napęd genowy lub nie-genowy) oraz rodzajów mierzonych parametrów.

Badania laboratoryjne w małych klatkach genetycznie modyfikowanych komarów anofeliny

Obecny protokół opisuje, jak mierzyć dane dotyczące typowych parametrów życia komarów Aedes aegypti, w tym płodności, rozmiaru skrzydeł, płodności, stosunku płci, żywotności, czasu rozwoju, wkładu samców i długowieczności dorosłych. Pomiary te można wykorzystać do oceny przydatności komarów transgenicznych.

Ilościowe określanie kosztów przystosowania u transgenicznych komarów Aedes aegypti

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9.

Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9

Naucz się metody masowego hodowlania i przygotowania sterylnych samców komarów Aedes aegypti do zastosowania techniki sterylnego owada w zwalczaniu wektorów chorób.

Przygotowanie napromieniowanych i oznakowanych samców komarów Aedes aegypti do uwolnienia w operacyjnym programie techniki sterylnych owadów (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie napromieniowanych i oznakowanych samców komarów Aedes aegypti do uwolnienia w operacyjnym programie techniki sterylnych owadów

Przeglądaj więcej filmów