Przygotowanie mikroskopowej siatki krioelektronowej do badań rozdzielczych w czasie przy użyciu nowatorskiego systemu robotycznego, Spotiton

Korzystając z systemu robotycznego Spotiton, można wymieszać i zeszklone białko z partnerem oddziałującym na siatce mikroskopu elektronowego w ciągu zaledwie 90 milisekund. Protokół ten pozwala na wychwycenie pośrednich potwierdzeń białek, które są zbyt przejściowe, aby można je było uchwycić za pomocą standardowych technik przygotowania siatki. Spotiton z rozdzielczością czasową może informować o systemach biologicznych lub biochemicznych w czasie krótszym niż sekunda, takich jak aktywacja kanału błonowego, synteza DNA lub RNA lub wczesna interakcja leku lub przeciwciała z białkiem docelowym.

Użytkownik musi jednocześnie zarządzać kilkoma komponentami, które mają bezpośredni wpływ na jakość sieci. Ważne jest, aby zrozumieć system przed użyciem i uzbroić się w cierpliwość podczas przygotowywania siatek. Aby rozpocząć, otwórz główny zawór na zbiorniku doprowadzającym azot i upewnij się, że zbiornik systemu jest napełniony odgazowaną ultraczystą wodą.

Włącz komputer i system Spotiton na listwie zasilającej z wieloma gniazdkami. Kliknij ikonę na pulpicie, aby otworzyć interfejs użytkownika oprogramowania Spotiton. W menu Narzędzia wybierz opcję Inicjalizuj etapy, aby zainicjować i ustawić położenie początkowe trzyosiowych robotów i zespołu obrotowej głowicy dozownika, upewniając się, że końcówki dozownika są skierowane w dół przed inicjalizacją i bazowaniem.

W menu głównym kliknij Przejdź do bezpiecznej pozycji, aby wysłać roboty do bezpiecznej pozycji. Na karcie Ssanie wybierz opcję Zalej, aby wielokrotnie przepłukać głowice dozownika wodą ze zbiornika. Kontynuuj, aż z końcówek będą widoczne dwa nieprzerwane strumienie wody.

Na karcie Inspekcja wyślij pierwszą końcówkę do kamery inspekcyjnej i przetestuj wodę przeciwpożarową, dostosowując amplitudę, aż do wytworzenia dyskretnych kropel. Naciśnij przycisk nagrywania na monitorze górnej kamery, aby nagrać wideo z odpalania pierwszej końcówki. Wyślij wskazówkę drugą do kamery inspekcyjnej.

Odtwórz wideo z wystrzeliwania końcówki pierwszej na monitorze po prawej stronie w tym samym czasie, gdy końcówka druga jest wystrzeliwana na monitorze górnej kamery, dopasowując się do wzorca wytwarzania kropel z dwóch dozowników. Zdejmij pęsetę z uchwytu na robocie siatkowym za pomocą dostarczonego klucza imbusowego. Na pobliskim blacie stołu umieść nanodrut siatki testowej stroną do góry na krawędzi bloku siatki.

Ostrożnie chwyć krawędź siatki i umieść ją prawidłowo w pęsetze. Następnie ponownie zamontuj pęsetę. Na karcie Cryo kliknij Tip to Camera (Wskazówka do kamery), aby przesunąć końcówkę pierwszą w pole view górnej kamery ścieżki zanurzenia, upewniając się, że na monitorze górnej kamery wybrano opcję Na żywo.

Włącz i wyreguluj górne światło aparatu. Ustaw pierwszą końcówkę widoczną na górnym monitorze kamery, klikając myszą na monitorze. Kliknij Siatka do kamery, aby ustawić siatkę przed górną kamerą, a następnie w razie potrzeby ponownie dostosuj końcówkę o jedną pozycję.

Na karcie Cryo upewnij się, że nie wybrano opcji Vitrified Grid, kliknij Queue Target, a następnie Plunge. Oceń górny i dolny obraz, aby upewnić się, że dozowniki działają normalnie. Rozcieńczyć dwie próbki do pożądanych stężeń odpowiednim buforem, najlepiej używając go dla obu, i napełnić miskę kriogeniczną ciekłym azotem.

Plazma oczyść trzy do czterech nanoprzewodowych siatek, używając pięciu watów wodoru i tlenu, a punktem wyjścia jest 1,5 minuty. Podłącz nebulizator i obserwuj, jak para wydostaje się z centralnego portu nasadki nebulizatora. Obserwuj monitor wilgotności na żywo w oknie głównym lub otwórz monitor wilgotności otoczenia w sekcji Raporty i otoczenie.

Sprawdź poziom wilgotności w komorze i strefach osłony. Dodać pięć mikrolitrów każdej próbki do kubków na próbki. Załaduj kubki na próbki do tacki do przechowywania z próbką dla końcówki pierwszej po lewej stronie i dla końcówki drugiej po prawej stronie.

Następnie wsuń tacę z powrotem do urządzenia, aż się usiądzie. Na karcie Aspirat wybierz trzy mikrolitry objętości, która ma być zasysana przez każdą końcówkę. Upewnij się, że tacka na próbkę została bezpiecznie osadzona, kliknij przycisk Aspirat i obserwuj, jak stolik pipety przesuwa głowice dozownika do kubków na próbki.

Sprawdzić, czy obie próbki zostały pomyślnie zasysane, wyjmując kubki na próbki i obserwując spadek poziomu cieczy. Na karcie Inspekcja wyślij każdą końcówkę do kamery inspekcyjnej, aby potwierdzić niezakłócone dozowanie. Dostosuj amplitudę zgodnie z potrzebami, aby dopasować się do tworzenia się kropel z każdej końcówki.

Załaduj świeżo oczyszczoną plazmowo siatkę do pęsety, ale nie montuj jeszcze pęsety. Upewnij się, że poziom wilgotności jest podniesiony do około 90 do 95%Napełnij kubek na etan i wykonaj ostatni test ogniowy obu końcówek przed kamerą inspekcyjną, potwierdzając, że nie ma przeszkód. Na karcie Cryo kliknij Wskazówka do kamery.

Sprawdź kubek na etan. Jeśli utworzył się lód etanowy, w razie potrzeby stopić go dodatkowym gazem etanowym. Zamontuj pęsetę z siatką na stoliku siatki.

Na karcie Cryo kliknij Grid to Camera (Siatka do kamery), upewniając się, że końcówka pierwsza jest prawidłowo umieszczona na górnym monitorze kamery. Kliknij na Zeszkloną siatkę, Cel kolejki, a następnie Zanurz. Kliknij OK, gdy pojawi się monit, aby nakazać robotowi siatkowemu przeskoczenie siatki z etanu do ciekłego azotu i wypuszczenie go na zanurzoną półkę.

Zapoznaj się z obrazami siatki, aby zdecydować, czy należy ją zachować, czy wyrzucić. Jeśli trzymasz siatkę, wstępnie ostudź kleszcze z cienką końcówką, delikatnie chwyć siatkę za krawędź i umieść ją w szczelinie w pudełku z siatką, zaczynając od pierwszej szczeliny po lewej stronie wycięcia i idąc zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Użyj przeglądarki eksperymentów, aby przejrzeć i porównać obrazy siatki z górnej i dolnej kamery wraz z ustawieniami maszyny i pomiarami wilgotności w momencie zanurzenia, wybierając Raporty i Eksperyment.

Pokazano tutaj obrazy siatek przygotowanych podczas pojedynczej sesji Spotiton z rozdzielczością czasową przez zmieszanie polimerazy RNA w oligomerze DNA o 105 parach zasad przenoszącym sekwencję promotora przez 150 milisekund przed witryfikacją. Z sześciu siatek tylko jedna wykazuje nieoptymalne odprowadzanie wilgoci. Wzór osadzania się lodu na zeszklonej siatce ściśle pasuje do wzoru osadzonej cieczy widocznego na zdjęciu z górnej kamery.

Skuteczne odprowadzanie zmieszanych próbek następuje wzdłuż prętów siatki pokrytych nanodrutem, gdzie próbka rzadko przelewa się na kwadraty sąsiadujące z tymi, w których wylądowała. W kwadratach wypełnionych lodem lód jest zwykle najgrubszy w otworach w środku kwadratu i staje się cieńszy w otworach bliżej prętów siatki. Otwory bezpośrednio przylegające do prętów siatki są często puste ze względu na bliskość nanodrutów.

Właściwe przygotowanie i obchodzenie się z siatkami nanodrutowymi zapewni dobrą grubość lodu na siatkach próbek mieszanych. System Spotiton pozwala również użytkownikowi na oddzielne umieszczanie dwóch próbek na jednej siatce, co umożliwia pobieranie niemieszanej kontroli podczas tej samej sesji konserwacji sieci. Spotiton umożliwił wychwycenie pierwszych produktów pośrednich w ekspresji genów bakteryjnych w czasie rzeczywistym.

Ponieważ powstają w skali czasowej poniżej sekundy, ich struktura była do tej pory nieznana.