Name: Modele tętnicze in vitro 3D z hodowlą komórkową do badania kierowania leków naczyniowych pod przepływem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych modeli tętnic z hodowlą komórek śródbłonka do badania kierowania cząsteczek leków pod przepływem fizjologicznym. Technika ta umożliwia optymalizację nośników leków w chorobach układu krążenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Izraelską Fundację Naukową (grant ISF # 902/18). Stypendium Marii Khoury było wspierane przez The Baroness Ariane de Rothschild Women Doctoral Program.

UWAGA: Ten protokół opisuje wykonanie modelu 3D tętnicy szyjnej i może być zastosowany do wygenerowania dowolnej innej interesującej tętnicy, po prostu modyfikując parametry geometryczne.
1. Projekt i wykonanie 3D bifurkacji modelu tętnicy szyjnej człowieka
<ol>
	<li>Wybierz obrazy od pacjentów lub wcześniej zbadane geometrie rozwidlenia tętnicy szyjnej człowieka i stwórz wspomagany komputerowo model projektowy formy, którą należy wydrukować. 
	UWAGA: Rozwidlenie tętnicy szyjnej ma jeden wlot i dwa wyloty. Ważne jest, aby zaprojektować ramę formy 3D wokół tętnicy i tymczasowe podpory drukarskie między ramą a formą tętnicy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A-C).</li>
	<li>Wydrukuj geometrie za pomocą drukarki 3D. Wytnij tymczasowe podpory drukarskie i użyj papieru ściernego, aby wypolerować i wygładzić formy, szczególnie w miejscach, w których podpory zostały wycięte. Opłucz przeszlifowany model alkoholem izopropylowym, aby usunąć plastikowy pył i pozostaw do całkowitego wyschnięcia w kapturze chemicznym na 2-3 godziny < / >
	UWAGA: W tym przypadku wydrukowane formy zostały wykonane z przezroczystej żywicy v4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D,E).</li>
	<li>Aby łatwo rozpuścić plastik, spryskaj formy przezroczystym lakierem wewnątrz okapu chemicznego i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu na 1 godzinę. Powtórz to 3x. 
	UWAGA: Tutaj użyto 2X Ultra Cover Clear Spray, ale każdy inny rodzaj powinien być odpowiedni, o ile nie jest to lakier do drewna. Upewnij się, że nie pozostał żaden odsłonięty plastik, ponieważ plastik może reagować z silikonem i uniemożliwiać jego prawidłowe zestalenie. Jakość natryskiwanej powierzchni będzie decydować o jakości powierzchni końcowego modelu silikonowego.</li>
	<li>Wytnij przezroczyste prostokątne szkiełka/paski z gładkiego tworzywa sztucznego o tych samych wymiarach co rama formy i przyklej je lakierem do ramy ze wszystkich stron i z jednej strony ramy, tak aby była uszczelniona od dołu i otwarta u góry. Nałóż lakier za pomocą pędzla wewnątrz kaptura chemicznego i pozostaw szkiełka do całkowitego wyschnięcia na co najmniej 24 godziny (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F).</li>
	<li>Aby przygotować mieszankę kauczuku silikonowego, dodaj płynny silikon z jego utwardzaczem (stosunek masowy 1:10) do plastikowej płytki i dokładnie wymieszaj, aby zapewnić całkowite wymieszanie. W przypadku modelu szyjnego dodaj 54 g silikonu i 6 g jego utwardzacza.</li>
	<li>Schłodzić mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odgazować ją w eksykatorze próżniowym do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza. Umieść formę w eksykatorze (otwartą stroną do góry), powoli wlej mieszaninę silikonu do formy i ponownie usuń pęcherzyki powietrza, aż mieszanina będzie klarowna.</li>
	<li>Pozostaw formę z silikonem na noc w temperaturze pokojowej (jeśli to możliwe, pozostaw ją w eksykatorze bez próżni). Jeżeli mieszanina nie wyschła całkowicie, inkubować ją w temperaturze 60 °C przez kolejne kilka godzin.</li>
	<li>Gdy mieszanina całkowicie wyschnie, usuń przezroczyste szkiełka i zanurz model w acetonie absolutnym na 48 godzin w kapturze chemicznym, aż plastik całkowicie się rozpuści. Usuń wszelkie resztki plastiku drewnianym patyczkiem. Aby odparować aceton uwięziony wewnątrz modelu, należy go inkubować w temperaturze 60 °C przez co najmniej 4 dni przed wysiewem komórek.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa i wysiewanie w modelach
<ol>
	<li>Przygotuj trzy złącza do modelu tętnicy szyjnej: jedno dla wlotu i dwa dla wylotów (patrz Tabela materiałów). Sterylizuj model i łączniki promieniowaniem ultrafioletowym w okapie biologicznym przez 20 minut.</li>
	<li>Pokryj modele 4 ml fibronektyny o stężeniu 100 μg/ml (w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C. Wstrzyknąć roztwór fibronektyny do modelu przez wlot za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 5 lub 10 ml. Usuń fibronektynę przez wylot i umyj model pożywką EC.</li>
	<li>Zawiesić 2,5 × 106 komórek/ml ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC, przejście < 6) i napełnić model 4 ml zawiesiny komórkowej za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 5 lub 10 ml (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3A). Umieść model na rotatorze wewnątrz inkubatora (37 °C) z prędkością 1 obr./min przez 48 godzin, aby zapewnić jednorodny wysiew. Upewnij się, że model jest dobrze przymocowany do rotatora (Rysunek 3B). Po 24 godzinach w kapturze biologicznym należy zmienić pożywkę i powrócić do rotatora wewnątrz inkubatora na kolejne 24 godziny 
	UWAGA: Po 24 godzinach komórki są wysiewane i można je obrazować za pomocą mikroskopu.</li>
	<li>Wyjmij model z rotatora i umyj 1x PBS za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml. Aby utrwalić komórki, inkubuj komórki z 4 ml 4% paraformaldehydu (PFA) do modelu przez 15 minut w kapturze chemicznym, a następnie spłucz 3x PBS. Dodać 4 ml PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia eksperymentu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Wybarwić komórki wewnątrz modelu przy użyciu standardowych protokołów barwienia (np. barwienie jądrowe za pomocą 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI), <silna klasa = "xfig">Rysunek 3D).</li>
</ol>
3. Projekt systemu perfuzyjnego
<ol>
	<li>System perfuzyjny posiada dwie rurki wlotowe i dwie rurki wylotowe. Połącz dwa wloty w jedną rurkę o średnicy wewnętrznej 4 mm i ponownie w dwie rurki o średnicy wewnętrznej 6 mm, które łączą się z pompą perystaltyczną. Połącz dwie rurki o średnicy wewnętrznej 6 mm wychodzące z pompy perystaltycznej w jedną rurkę 4 mm i podłącz ją do tłumika drgań, aby wyeliminować wszelkie drgania pompy. Użyj butelki o pojemności 250 ml z wąskim otworem i pokrywką z trzema otworami jako amortyzatorem.</li>
	<li>Podłącz jeden otwór do wlotu z pompy, zamknij drugi korkiem, który służy do odpowietrzania ciśnienia w sytuacjach awaryjnych i przedłuż trzeci otwór (który jest wylotem) do dna butelki.</li>
	<li>Podłącz przepustnicę do wlotu modelu z hodowlą tętnicy szyjnej za pomocą rurki wylotowej. Połącz dwa wyloty modelu w jedną rurkę, która będzie wylotem systemu (wszystkie rurki mają średnicę wewnętrzną 4 mm).</li>
	<li>Podzielić rurkę wylotową na dwie rurki wylotowe (jedną dla obwodu zamkniętego, a drugą dla pojemnika na odpady w obiegu otwartym). Przymocuj plastikowy zacisk do każdej rurki. 
	UWAGA: Kombinacja zacisków otwarty/zamknięty określi, czy system jest w konfiguracji obwodu zamkniętego czy otwartego. Jak pokazano na Rysunek 1, jeśli zaciski a i d są blisko siebie, podczas gdy b i c są otwarte, system jest obwodem zamkniętym; Odwrotny bieg przenosi system do konfiguracji obwodu otwartego.</li>
	<li>Przygotuj trzy pojemniki: jeden, który może pomieścić 300 ml płynu (do obiegu zamkniętego) i dwa inne po 1 l każdy: jeden do mycia, a drugi na odpady (do obiegu otwartego).</li>
</ol>
4. Konfiguracja obwodu zamkniętego: eksperyment perfuzyjny i obrazowanie
<ol>
	<li>Dodaj 300 ml PBS do pojemnika o obiegu zamkniętym, co wystarczy do napełnienia całego systemu, w tym rurki i modelu. Umieść jedną rurkę wlotową i jedną rurkę wylotową (otwarte clamps b i c) wewnątrz pojemnika.</li>
	<li>Napełnij pojemnik do mycia o pojemności 1 l wodą destylowaną (do umycia na koniec eksperymentu), a drugi pojemnik na odpady o pojemności 1 l pozostaw pusty. Umieść drugi przewód dolotowy i wylotowy (zamknij zaciski a i d) odpowiednio w pojemnikach na pranie i odpady.</li>
	<li>Wyjąć model tętnicy szyjnej z hodowlą komórkową z miejsca przechowywania w temperaturze 4 °C i opróżnić PBS. Podłącz wlot i wylot tętnicy szyjnej zgodnie z opisem w krokach 3.3-3.4. Nie pozostawiaj modelu suchego przez długi czas. Po podłączeniu modelu aktywuj pompę, aby ukrwić płyn.</li>
	<li>Umieść model tętnicy szyjnej pod mikroskopem. Otwórz rurkę przed wlotem i za wylotem modelu szyjnego. Ustaw pompę perystaltyczną na 10 obr./min i włącz ją. Zwiększaj prędkość w krokach co 5 obr./min, co 4-5 minut. Upewnij się, że nie ma wycieków.</li>
	<li>Przy 100 obr./min, co jest równe maksymalnemu natężeniu przepływu fali fizjologicznej ludzkiej tętnicy szyjnej (~400 ml/min), dodaj fluorescencyjne cząstki karboksylowanego polistyrenu (PS) (2 μm, o stężeniu 1,6 μg/ml) do 300 ml PBS w pojemniku o obiegu zamkniętym. Obrazuj obszar zainteresowania co 10 sekund przez 1,5 godziny (w razie potrzeby nieruchome pojedyncze zdjęcia lub filmy).</li>
</ol>
5. Konfiguracja obwodu otwartego: etap mycia
<ol>
	<li>Otwórz zaciski rurek myjących i odpływowych w pojemnikach o pojemności 1 l (zaciski a i d) i natychmiast zamknij zaciski rurek wlotowych i wylotowych w pojemniku 300 ml (zaciski b i c), aby zmienić układ z konfiguracji obwodu zamkniętego na otwarty.</li>
	<li>Pozwól, aby większość wody przepłynęła z pojemnika myjącego do pojemnika na odpady z prędkością 100 obr./min. Przed całkowitym przeniesieniem naciśnij stop na pompie perystaltycznej i zamknij rurkę clamps przed wlotem i za wylotem modelu szyjnego.</li>
	<li>Korzystając z odpowiednich filtrów, uchwyć obrazy modelu w obszarze zainteresowania, aby pokazać osadzanie się i przyleganie cząstek do komórek. Odłącz model tętnicy szyjnej. Ostrożnie i powoli dodawać 4 ml PBS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml przez wlot modelu.</li>
	<li>Podłącz "model atrapy" (który jest również modelem 3D tętnicy szyjnej z gumy silikonowej, używanym tylko do mycia, bez hodowanych komórek) zamiast modelu tętnicy szyjnej i przepłucz system. Dodaj kolejny 1 l wody i ponownie umyj system, aż cała woda zostanie przeniesiona z pojemnika myjącego do odpadów. Wyłącz pompę perystaltyczną.</li>
</ol>
6. Akwizycja i analiza danych
<ol>
	<li>Uzyskaj cyfrowy film osadzania się cząstek w obszarze zainteresowania ze zdjęciami wykonanymi podczas eksperymentu, używając niestandardowego kodu oprogramowania (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Aby odwzorować osadzanie się cząstek wzdłuż modelu, ułóż wiele obrazów, aby pokryć badany obszar zainteresowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A,B). 
	UWAGA: Można napisać niestandardowy kod oprogramowania, aby określić ilościowo liczbę przylegających cząstek w miejscu zainteresowania (przykładowy plik został dostarczony jako informacje uzupełniające)17.</li>
</ol>

<ol><li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+effect+of+disturbed+flow+on+monocytic+adhesion+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).</li>
<li>Martorell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extent+of+flow+recirculation+governs+expression+of+atherosclerotic+and+thrombotic+biomarkers+in+arterial+bifurcations%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Extent of flow recirculation governs expression of atherosclerotic and thrombotic biomarkers in arterial bifurcations.</a> Cardiovascular Research. 103 (1), 37-46 (2014).</li>
<li>Karino, T., Goldsmith, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+behaviour+of+blood+cells+and+rigid+spheres+in+an+annular+vortex%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Flow behaviour of blood cells and rigid spheres in an annular vortex.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 279 (967), 413-445 (1977).</li>
<li>Goldsmith, H. L., Karino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+in+a+region+of+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+-+American+Society+for+Artificial+Internal+Organs%22%5BJournal%5D)">Platelets in a region of disturbed flow.</a> Transactions - American Society for Artificial Internal Organs. 23, 632-638 (1977).</li>
<li>Farcas, M. A., Rouleau, L., Fraser, R., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+3-D%2C+in+vitro%2C+endothelial+culture+models+for+the+study+of+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">The development of 3-D, in vitro, endothelial culture models for the study of coronary artery disease.</a> Biomedical Engineering Online. 8, 30(2009).</li>
<li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+nanoparticle+targeting+to+a+vascular+surface+in+shear+flow+through+diffusive+particle+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Modeling nanoparticle targeting to a vascular surface in shear flow through diffusive particle dynamics.</a> Nanoscale Research Letters. 10 (1), 942(2015).</li>
<li>Shah, S., Liu, Y., Hu, W., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+particle+shape-dependent+dynamics+in+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoscience+and+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Modeling particle shape-dependent dynamics in nanomedicine.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 11 (2), 919-928 (2011).</li>
<li>Hossain, S. S., Hughes, T. J., Decuzzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+deposition+patterns+for+nanoparticles+in+an+inflamed+patient-specific+arterial+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+in+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Vascular deposition patterns for nanoparticles in an inflamed patient-specific arterial tree.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 585-597 (2014).</li>
<li>Charoenphol, P., Huang, R. B., Eniola-Adefeso, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+size+and+hemodynamics+in+the+efficacy+of+vascular-targeted+spherical+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Potential role of size and hemodynamics in the efficacy of vascular-targeted spherical drug carriers.</a> Biomaterials. 31 (6), 1392-1402 (2010).</li>
<li>Ta, H. T., Truong, N. P., Whittaker, A. K., Davis, T. P., Peter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+particle+size%2C+shape%2C+density+and+flow+characteristics+on+particle+margination+to+vascular+walls+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">The effects of particle size, shape, density and flow characteristics on particle margination to vascular walls in cardiovascular diseases.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 15 (1), 33-45 (2018).</li>
<li>Cooley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+and+shape+on+their+margination+and+wall-adhesion%3A+implications+in+drug+delivery+vehicle+design+across+nano-to-micro+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size and shape on their margination and wall-adhesion: implications in drug delivery vehicle design across nano-to-micro scale.</a> Nanoscale. 10 (32), 15350-15364 (2018).</li>
<li>Jiang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+interactions+and+flow+effects+in+angiogenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+vessels+and+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantum dot interactions and flow effects in angiogenic zebrafish (Danio rerio) vessels and human endothelial cells.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (3), 999-1010 (2017).</li>
<li>Zarins, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carotid+bifurcation+atherosclerosis.+Quantitative+correlation+of+plaque+localization+with+flow+velocity+profiles+and+wall+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Carotid bifurcation atherosclerosis. Quantitative correlation of plaque localization with flow velocity profiles and wall shear stress.</a> Circulation Research. 53 (4), 502-514 (1983).</li>
<li>Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+disturbed+flow+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Effects of disturbed flow on endothelial cells.</a> Annals of Biomedical Engineering. 36 (4), 554-562 (2008).</li>
<li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li>
<li>Glagov, S., Zarins, C., Giddens, D. P., Ku, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+and+atherosclerosis.+Insights+and+perspectives+gained+from+studies+of+human+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics and atherosclerosis. Insights and perspectives gained from studies of human arteries.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 112 (10), 1018-1031 (1988).</li>
<li>Khoury, M., Epshtein, M., Zidan, H., Zukerman, H., Korin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+deposition+of+particles+in+reconstructed+models+of+human+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Mapping deposition of particles in reconstructed models of human arteries.</a> Journal of Controlled Release. 318, 78-85 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Obecne podejścia do badania naczyniowego celowania cząstek w nie są w stanie odtworzyć warunków fizjologicznych występujących w ludzkim ciele. Przedstawiono tutaj protokół wytwarzania zrekonstruowanych w 3D modeli ludzkich tętnic w celu zbadania cząstek skierowanych do EC wyściełających tętnicę pod przepływem fizjologicznym zastosowanym przy użyciu dostosowanego systemu perfuzji. Wybierając materiał do druku 3D, najlepiej użyć przezroczystego tworzywa sztucznego, aby uniknąć przenoszenia pigmentu na model silikonowy, któ...

Ostatnio zastosowano kilka podejść wykorzystujących modele 3D ludzkich tętnic1,2,3,4,5. Modele te odtwarzają fizjologiczną anatomię i środowisko różnych tętnic w ludzkim ciele in vitro. Są one jednak wykorzystywane głównie w badaniach biologii komórki. Obecne badania nad naczyniowym kierowaniem cząstek do śródbłonka obejmują symulacje obliczeniowe in silico6,7,8, modele mikroprzepływowe in vitro9,10,11, oraz modele zwierzęce in vivo12. Pomimo dostarczonych przez nich spostrzeżeń, te eksperymentalne modele nie zdołały dokładnie zasymulować procesu celowania, który zachodzi w ludzkich tętnicach, w których przepływ krwi i hemodynamika stanowią dominujące czynniki. Na przykład badanie cząstek skierowanych do obszarów miażdżycowych w rozwidleniu tętnicy szyjnej, które są znane ze złożonego wzorca przepływu recyrkulacyjnego i gradientu naprężeń ścinających ścianę, może mieć wpływ na drogę, jaką przebyły cząstki, zanim dotrą do śródbłonka13,14,15,16. Dlatego badania te muszą być wykonywane w warunkach, które odtwarzają środowisko fizjologiczne, tj. wielkość, wymiary, anatomię i profil przepływu.
Niedawno, ta grupa badawcza stworzyła zrekonstruowane w 3D modele tętnic ludzkich do badania osadzania i kierowania cząsteczek do układu krwionośnego17. Modele opierały się na geometrycznych replikach 3D ludzkich naczyń krwionośnych, które następnie zostały wyhodowane z ludzkimi EC, które następnie wyłożyły ich wewnętrzne ściany. Ponadto, po poddaniu działaniu systemu perfuzyjnego, który wytwarza przepływ fizjologiczny, modele dokładnie odwzorowywały warunki fizjologiczne. System perfuzyjny został zaprojektowany do perfuzji płynów ze stałym natężeniem przepływu, przy użyciu pompy perystaltycznej zarówno w konfiguracji z obiegiem zamkniętym, jak i otwartym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). System może być używany jako obwód zamknięty do mapowania osadzania się cząstek i kierowania na komórki zasiane wewnątrz modelu tętnicy szyjnej. Ponadto może być używany jako obwód otwarty do wymywania nieprzylegających cząstek pod koniec eksperymentów oraz do czyszczenia i konserwacji systemu. W artykule przedstawiono protokoły wytwarzania modeli 3D bifurkacji tętnicy szyjnej człowieka, projektowania systemu perfuzji oraz mapowania osadzania się docelowych cząstek wewnątrz modeli.

<table><tbody><tr><td>Drukarka 3D</td><td>FormLabs</td><td>PKG-F2-REFURB</td><td></td></tr><tr><td>Aceton, absolutny (klasa AR)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Złącza</td><td>Nordson Medical</td><td>FTLL013-1</td><td>Żeński Luer</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FTLL230-1</td><td>Żeński Luer</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FTLL360-1</td><td>Żeński Luer</td></tr><tr><td></td><td></td><td>LP4-1</td><td>Męski Luer Integral Lock</td></tr><tr><td>Przepustnica</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>DS2127-0250</td><td>Nalgene Poliwęglan, Walidacyjny Pokrywa przepustnicy butelki</td></tr><tr><td></td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>2162-0531</td><td>Nalgene Zamknięcia napełniające/wentylacyjne</td></tr><tr><td>Elastosil Elastosil RT 601 A</td><td>Wacker</td><td>60003805</td><td></td></tr><tr><td>Elastosil RT 601 B</td><td>Wacker</td><td>60003817</td><td>Środek sieciujący</td></tr><tr><td>Media komórkowe śródbłonka</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Fibrontectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0895-5mg</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza</td><td>CC-2519</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy, klasa AR 99.5%</td><td></td><td></td><td>Usuń pył plastikowy z szlifowanego modelu</td></tr><tr><td>Lakier</td><td>Rust-Oleum</td><td></td><td>2X-Ultra pokrywa Gloss Clear</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ25</td><td></td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Watson Marlow</td><td>530U IP31</td><td>Z 2 głowicami pompy: 313D</td></tr><tr><td>Plastikowy zacisk do rur</td><td>Quickun</td><td>1-2240-zawór odcinający-2szt Cząstki</td><td></td></tr><tr><td>polistyrenu</td><td>&nbsp; Thermo-Fisher Naukowy</td><td>&nbsp; F8827</td><td>&nbsp; Średnica = 2 &mikro; </td></tr><tr><td>m Żywica do drukarki</td><td>FormLabs</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>ELMI Sp. z o.o.</td><td></td><td>Mieszalnik Intelli-RM-2</td></tr><tr><td>Solidworks&nbsp;</td><td>SolidWorks Corp.,&nbsp; Dassault Syst&egrave; mes</td><td></td><td>https://www.solidworks.com/</td></tr> <tr><td>Rurki</td><td>Watson Marlow</td><td>933.0064.016</td><td>Rurki do pompy: 6,4 mm ID</td></tr><tr><td colspan="4">Wszystkie inne rurki: Rurki silikonowe: 4 mm ID</td></tr></tbody></table>

modele tętnicze in vitro 3d z hodowlą komórkową do badania kierowania leków naczyniowych pod przepływem

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Wykorzystanie trójwymiarowych (3D) modeli tętnic ludzkich, które są zaprojektowane z prawidłowymi wymiarami i anatomią, umożliwia prawidłowe modelowanie różnych ważnych procesów w układzie sercowo-naczyniowym. Ostatnio, chociaż przeprowadzono kilka badań biologicznych przy użyciu takich modeli 3D ludzkich tętnic, nie zostały one zastosowane do badania celowania naczyniowego. W artykule przedstawiono nową metodę wytwarzania zrekonstruowanych modeli tętnic ludzkich o rzeczywistych rozmiarach przy użyciu techniki druku 3D, wyrównywania ich z ludzkimi komórkami śródbłonka (EC) i badania celowania cząstek w przepływie fizjologicznym. Modele te mają tę zaletę, że odwzorowują fizjologiczny rozmiar i warunki naczyń krwionośnych w ludzkim ciele przy użyciu tanich komponentów. Technika ta może posłużyć jako nowa platforma do badania i zrozumienia celowania leków w układzie sercowo-naczyniowym i może udoskonalić projektowanie nowych nanoleków do wstrzykiwań. Co więcej, przedstawione podejście może dostarczyć istotnych narzędzi do badania celowanego dostarczania różnych leków stosowanych w chorobach sercowo-naczyniowych w specyficznych dla pacjenta warunkach przepływu i fizjologicznych.

Niniejsza praca przedstawia nowy protokół mapowania osadzania się cząsteczek wewnątrz rzeczywistych rozmiarowo trójwymiarowych modeli ludzkich tętnic, co może stanowić nową platformę dla badań nad dostarczaniem leków. Wykorzystując technikę druku 3D, wykonano model ludzkiej tętnicy w obrębie rozwidlenia szyjnego (Rysunek 2). Model został wykonany z gumy silikonowej i obsiany ludzkimi komórkami śródbłonka (ECs) (Rysunek 3). Co istotne, protokół ten umożliwił odtw...

Tutaj prezentujemy nowy protokół do badania i mapowania celowego osadzania nośników leków na komórkach śródbłonka w sfabrykowanych, rzeczywistych rozmiarach, trójwymiarowych modelach tętnic ludzkich pod przepływem fizjologicznym. Przedstawiona metoda może posłużyć jako nowa platforma do celowania w nosicieli leków w obrębie układu naczyniowego.

Modele tętnicze in vitro 3D z hodowlą komórkową do badania kierowania leków naczyniowych pod przepływem

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Obecny protokół może służyć jako nowa platforma do badania i rozwoju nośników leków do celowania w miejsca chorobowe w ludzkim układzie naczyniowym. Główną zaletą naszej techniki jest to, że pozwala ona na badanie akumulacji nośników leków w replikowanym przez człowieka modelu tętniczym 3D. Odbywa się to w warunkach fizjologicznych, w tym w przepływie krwi.Podejście to może być wykorzystane do optymalizacji nośników leków w diagnostyce i leczeniu szerokiego zakresu chorób naczyniowych, w tym tętnic miażdżycowych. Zacznij od wybrania obrazów od pacjentów lub wcześniej zbadanych geometrii rozwidlenia tętnicy szyjnej człowieka i wykorzystania obrazów do stworzenia wspomaganego komputerowo modelu projektowego formy. Użyj drukarki 3d, aby wydrukować projekt, usuń tymczasowe wsporniki do drukowania i spłucz model acetonem przed użyciem papieru ściernego do wypolerowania i wygładzenia form, zwłaszcza obszarów, z których wycięto podpory.Po szlifowaniu spłucz model alkoholem izopropylowym, aby usunąć plastikowy pył i pozostaw model do wyschnięcia w kapturze chemicznym na dwie do trzech godzin. Aby ułatwić łatwe odczarowanie plastiku, spryskaj model przezroczystym lakierem trzy razy, pozwala

in-vitro-3d-cell-cultured-arterial-models-for-studying-vascular-drug

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten protokół replikuje fizjologiczny lub patologiczny przepływ krwi in vitro, aby pomóc w określeniu odpowiedzi komórek w patologiach chorobowych. Wprowadzając komorę tłumiącą ciśnienie za pompą krwi, przepływ krwi przez naczynia krwionośne może zostać ponownie podsumowany i nałożony na monowarstwę śródbłonka naczyniowego lub kokulturę mimetyczną.

In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.

Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Ta metoda opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D w standaryzowanej platformie mikroprzepływowej. Platforma ta umożliwia badanie angiogennego kiełkowania sterowanego gradientem w 3D, w tym zespolenia i stabilizacji kiełków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.

Standaryzowany i skalowalny test do badania perfundowanego angiogennego kiełkowania 3D komórek śródbłonka pochodzących z iPSC in vitro

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Opisano tutaj prosty proces różnicowania komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, a następnie szczegółowy protokół ich mechanicznej stymulacji. Pozwala to na badanie mechanobiologii rozwojowej komórek śródbłonka. Podejście to jest kompatybilne z dalszymi testami żywych komórek pobranych z chipa hodowlanego po stymulacji mechanicznej.

In vitro Model płodu ludzkiego naczynia na chipie do badania mechanobiologii rozwojowej

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Opracowaliśmy test podrażnienia oczu, który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE). Test jest w stanie odróżnić materiały drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od tych, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS).

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych modeli tętnic z hodowlą komórek śródbłonka do badania kierowania cząsteczek leków pod przepływem fizjologicznym. Technika ta umożliwia optymalizację nośników leków w chorobach układu krążenia.

Modele tętnicze in vitro 3D z hodowlą komórkową do badania kierowania leków naczyniowych pod przepływem

Przeglądaj więcej filmów