Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji

Ten protokół izolacji hepatocytów szczura opiera się na resekcji wątroby przed podejściem do trawienia. Protokół wprowadza kompaktowy i przenośny zintegrowany system perfuzyjny do izolacji komórek. Technika ta obejmuje recyrkulację kolagenazy, która zmniejsza objętość stosowania kolagenazy i zapewnia większą elastyczność w wydłużaniu czasu trawienia, zapewniając jednocześnie wysoką wydajność grawitacyjną i specyficzną funkcję hepatocytów.

Umieść szczura w kapturze. Po przecięciu mięśni brzucha popchnij jelita w prawo tyłem zakrzywionych kleszczy. Przerwij błonę pod przewodem żółciowym końcówką zakrzywionych kleszczyków, aby zapętlić szew wokół żyły wrotnej i przewodu żółciowego.

Użyj jedwabnego szwu chirurgicznego, aby wykonać bardzo luźną ligaturę wokół żyły wrotnej w pobliżu wątroby, tuż przed rozgałęzieniem żyły w lewo i w prawo do różnych płatów wątroby. Około dwóch do trzech centymetrów przed pierwszą ligaturą, tuż przed odgałęzieniem żyły żołądkowej od żyły wrotnej, utwórz otwór w tkance pod żyłą wrotną za pomocą końcówek dwóch par zakrzywionych kleszczy. Następnie rozciągnij otwór, aby podeprzeć żyłę wrotną podczas kaniulacji.

Zapobiegaj wzrostowi ciśnienia w wątrobie, zmniejszając prędkość pompy do czterech obrotów na minutę, aby uzyskać natężenie przepływu około trzech mililitrów na minutę. I upewnij się, że odpływ wolnego od wapnia buforu z cewnika dożylnego jest ograniczony do powolnej kroplówki. Delikatnie podtrzymując żyłę wrotną kleszczami, trzymaj cewnik dożylny skosem igły skierowanym do góry.

I włóż igłę do żyły wrotnej pod kątem od 10 do 20 stopni. Następnie powoli przesuwaj się, aż cały skos znajdzie się wewnątrz żyły. Prawidłowe wprowadzenie powinno skutkować zblednieniem koloru wątroby.

Przesuń kaniulę nad igłą i cofnij igłę za kaniulą, odciągając skrzydełko palcem wskazującym, trzymając cewnik kciukiem i palcem środkowym. Przymocuj żyłę wrotną do cewnika za pomocą klipsa do żyły i klipsa poniżej żyły wrotnej, aby uniknąć zakłócenia przepływu. Następnie przeciąć żyłę główną dolną podwątrobową, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia w wątrobie, i obserwuj, czy nie ma impulsów tryskających krwią, aby zapewnić prawidłowe cięcie.

Zwiększ prędkość pompy do 38 obr./min, aby uzyskać natężenie przepływu około 33 mililitrów na minutę. I przepłucz wątrobę trzy razy, zamykając żyłę główną podwątrobową dolną kleszczami przez dwie do trzech sekund, a następnie ponownie ją otwierając. Aby wykonać perfuzję wszystkich płatów wątroby, wyreguluj położenie końcówki kaniuli i upewnij się, że jest ona umieszczona przed rozgałęzieniem żyły wrotnej na różne płaty wątroby.

Następnie zaciśnij luźną ligaturę wokół żyły wrotnej, nieco przed punktem rozgałęzienia i zabezpiecz położenie kaniuli w żyle wrotnej, aby zapobiec cofaniu się bufora, wykonując trzy węzły w miejscu, w którym twarda igła podtrzymuje kaniulę, między skosem a otworem bocznym. Po resekcji wątroby pozwól wątrobie na perfuzję z buforem wolnym od wapnia przez 12 minut. Następnie dokręć zacisk rolkowy buforu bezwapniowego i poluzuj zacisk rolkowy buforu kolagenazy, aby zmienić bufor perfuzyjny.

Po tym, jak bufor kolagenazy dotrze do wątroby, przepłucz wątrobę trzykrotnie, zamykając żyłę główną nadwątrobową dolną na dwie do trzech sekund i ponownie ją otwierając. Ostrożnie przesunąć wątrobę do etapu na górze zlewki w celu recyrkulacji buforu kolagenazy, przytrzymując membranę kleszczami, jednocześnie podtrzymując cewnik, uważając, aby nie pociągnąć cewnika, aby zapobiec przypadkowemu oderwaniu. Trawić wątrobę przez 12 minut i zatrzymać perfuzję, gdy wątroba straci swoją gładką brązową konsystencję i stanie się papkowata.

W razie potrzeby wydłuż czas trawienia. Po strawieniu wątroby przeciąć żyłę wrotną, ostrożnie usunąć kaniulę. A następnie przenieś wątrobę do zimnego DMEM, aby wyizolować hepatocyty.

Delikatnie postukaj w wątrobę, używając tylnej strony zakrzywionych kleszczy, aby złamać i oderwać błyszczącą kapsułkę. I uwolnij komórki wątroby, delikatnie kołysząc wątrobą w DMEM, aż komórki zostaną całkowicie zdysocjowane w pożywce. Żywotność hepatocytów wynosiła od 88 do 94,8%, jak określono na podstawie podróży i liczenia niebieskich.

Wydajność hepatocytów od szczurów o wadze od 200 do 300 gramów wynosiła do pięciu razy od 10 do ośmiu komórek na izolację. Reprezentatywne obrazy pokazują nieoczyszczoną zawiesinę komórek wątroby i oczyszczoną zawiesinę hepatocytów. Czystość izolowanych hepatocytów wynosiła około 96,8%, co określono ilościowo, zliczając albuminy dodatnio fluorescencyjne wybarwione komórki w stosunku do całkowitej liczby jąder komórkowych.

Na reprezentatywnych obrazach pokazanych w fałszywym kolorze, zielony reprezentuje albuminę, a niebieski oznacza jądra komórkowe z albuminą. Jądra komórkowe bez albuminy są podświetlone na czerwono. Hepatocyty w hodowli kanapkowej tworzyły wyraźne kanały żółciowe i miały dobry kontakt z komórkami komórkowymi.

Jak wykazały testy albuminy, mocznika i cytochromu P450, hepatocyty wykazywały wysokie wydzielanie mocznika i albuminy. W trzecim dniu hepatocyty wykazywały wysoką aktywność enzymatyczną dla CYP1A2, CYP2B1/2 i CYP3B2. Bądź przygotowany psychicznie przed wkłuciem igły do żyły wrotnej.

Po wprowadzeniu chirurg będzie musiał kontynuować bez pulsu, dopóki prędkość pompy nie zostanie zwiększona po przecięciu IVC.