Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji
April 5th, 2021
Ten protokół szczegółowo opisuje użycie specjalnego cewnika dożylnego, standaryzowanego sterylnego jednorazowego wężyka, kontroli temperatury uzupełnionej monitorowaniem w czasie rzeczywistym, oraz systemu alarmowego dla dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w celu poprawy spójności żywotności, wydajności i funkcjonalności izolowanych pierwotnych hepatocytów szczurów.
Ten protokół izolacji hepatocytów szczura opiera się na resekcji wątroby przed podejściem do trawienia. Protokół wprowadza kompaktowy i przenośny zintegrowany system perfuzyjny do izolacji komórek. Technika ta obejmuje recyrkulację kolagenazy, która zmniejsza objętość stosowania kolagenazy i zapewnia większą elastyczność w wydłużaniu czasu trawienia, zapewniając jednocześnie wysoką wydajność grawitacyjną i specyficzną funkcję hepatocytów.
Umieść szczura w kapturze. Po przecięciu mięśni brzucha popchnij jelita w prawo tyłem zakrzywionych kleszczy. Przerwij błonę pod przewodem żółciowym końcówką zakrzywionych kleszczyków, aby zapętlić szew wokół żyły wrotnej i przewodu żółciowego.
Użyj jedwabnego szwu chirurgicznego, aby wykonać bardzo luźną ligaturę wokół żyły wrotnej w pobliżu wątroby, tuż przed rozgałęzieniem żyły w lewo i w prawo do różnych płatów wątroby. Około dwóch do trzech centymetrów przed pierwszą ligaturą, tuż przed odgałęzieniem żyły żołądkowej od żyły wrotnej, utwórz otwór w tkance pod żyłą wrotną za pomocą końcówek dwóch par zakrzywionych kleszczy. Następnie rozciągnij otwór, aby podeprzeć żyłę wrotną podczas kaniulacji.
Zapobiegaj wzrostowi ciśnienia w wątrobie, zmniejszając prędkość pompy do czterech obrotów na minutę, aby uzyskać natężenie przepływu około trzech mililitrów na minutę. I upewnij się, że odpływ wolnego od wapnia buforu z cewnika dożylnego jest ograniczony do powolnej kroplówki. Delikatnie podtrzymując żyłę wrotną kleszczami, trzymaj cewnik dożylny skosem igły skierowanym do góry.
I włóż igłę do żyły wrotnej pod kątem od 10 do 20 stopni. Następnie powoli przesuwaj się, aż cały skos znajdzie się wewnątrz żyły. Prawidłowe wprowadzenie powinno skutkować zblednieniem koloru wątroby.
Przesuń kaniulę nad igłą i cofnij igłę za kaniulą, odciągając skrzydełko palcem wskazującym, trzymając cewnik kciukiem i palcem środkowym. Przymocuj żyłę wrotną do cewnika za pomocą klipsa do żyły i klipsa poniżej żyły wrotnej, aby uniknąć zakłócenia przepływu. Następnie przeciąć żyłę główną dolną podwątrobową, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia w wątrobie, i obserwuj, czy nie ma impulsów tryskających krwią, aby zapewnić prawidłowe cięcie.
Zwiększ prędkość pompy do 38 obr./min, aby uzyskać natężenie przepływu około 33 mililitrów na minutę. I przepłucz wątrobę trzy razy, zamykając żyłę główną podwątrobową dolną kleszczami przez dwie do trzech sekund, a następnie ponownie ją otwierając. Aby wykonać perfuzję wszystkich płatów wątroby, wyreguluj położenie końcówki kaniuli i upewnij się, że jest ona umieszczona przed rozgałęzieniem żyły wrotnej na różne płaty wątroby.
Następnie zaciśnij luźną ligaturę wokół żyły wrotnej, nieco przed punktem rozgałęzienia i zabezpiecz położenie kaniuli w żyle wrotnej, aby zapobiec cofaniu się bufora, wykonując trzy węzły w miejscu, w którym twarda igła podtrzymuje kaniulę, między skosem a otworem bocznym. Po resekcji wątroby pozwól wątrobie na perfuzję z buforem wolnym od wapnia przez 12 minut. Następnie dokręć zacisk rolkowy buforu bezwapniowego i poluzuj zacisk rolkowy buforu kolagenazy, aby zmienić bufor perfuzyjny.
Po tym, jak bufor kolagenazy dotrze do wątroby, przepłucz wątrobę trzykrotnie, zamykając żyłę główną nadwątrobową dolną na dwie do trzech sekund i ponownie ją otwierając. Ostrożnie przesunąć wątrobę do etapu na górze zlewki w celu recyrkulacji buforu kolagenazy, przytrzymując membranę kleszczami, jednocześnie podtrzymując cewnik, uważając, aby nie pociągnąć cewnika, aby zapobiec przypadkowemu oderwaniu. Trawić wątrobę przez 12 minut i zatrzymać perfuzję, gdy wątroba straci swoją gładką brązową konsystencję i stanie się papkowata.
W razie potrzeby wydłuż czas trawienia. Po strawieniu wątroby przeciąć żyłę wrotną, ostrożnie usunąć kaniulę. A następnie przenieś wątrobę do zimnego DMEM, aby wyizolować hepatocyty.
Delikatnie postukaj w wątrobę, używając tylnej strony zakrzywionych kleszczy, aby złamać i oderwać błyszczącą kapsułkę. I uwolnij komórki wątroby, delikatnie kołysząc wątrobą w DMEM, aż komórki zostaną całkowicie zdysocjowane w pożywce. Żywotność hepatocytów wynosiła od 88 do 94,8%, jak określono na podstawie podróży i liczenia niebieskich.
Wydajność hepatocytów od szczurów o wadze od 200 do 300 gramów wynosiła do pięciu razy od 10 do ośmiu komórek na izolację. Reprezentatywne obrazy pokazują nieoczyszczoną zawiesinę komórek wątroby i oczyszczoną zawiesinę hepatocytów. Czystość izolowanych hepatocytów wynosiła około 96,8%, co określono ilościowo, zliczając albuminy dodatnio fluorescencyjne wybarwione komórki w stosunku do całkowitej liczby jąder komórkowych.
Na reprezentatywnych obrazach pokazanych w fałszywym kolorze, zielony reprezentuje albuminę, a niebieski oznacza jądra komórkowe z albuminą. Jądra komórkowe bez albuminy są podświetlone na czerwono. Hepatocyty w hodowli kanapkowej tworzyły wyraźne kanały żółciowe i miały dobry kontakt z komórkami komórkowymi.
Jak wykazały testy albuminy, mocznika i cytochromu P450, hepatocyty wykazywały wysokie wydzielanie mocznika i albuminy. W trzecim dniu hepatocyty wykazywały wysoką aktywność enzymatyczną dla CYP1A2, CYP2B1/2 i CYP3B2. Bądź przygotowany psychicznie przed wkłuciem igły do żyły wrotnej.
Po wprowadzeniu chirurg będzie musiał kontynuować bez pulsu, dopóki prędkość pompy nie zostanie zwiększona po przecięciu IVC.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół przedstawia zaawansowaną metodę izolowania pierwotnych hepatocytów szczurów przy użyciu dwustopniowej techniki perfuzji kolagenazą. Podejście to poprawia żywotność komórek, wydajność i funkcjonalność poprzez zastosowanie przenośnego systemu perfuzji w połączeniu z monitorowaniem w czasie rzeczywistym i systemem alarmowym.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Izolowanie hepatocytów
- Techniki perfuzji
Tło
- Znaczenie izolowania pierwotnych hepatocytów w badaniach
- Wyzwania w utrzymaniu stałej żywotności i wydajności komórek
- Znaczenie perfuzji kolagenazą
Stosowane metody
- Wprowadzanie cewnika żylnego i kanulacja żyły wrotnej
- Recirculacja kolagenazy dla ulepszonej trawienia
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym temperatury i szybkości przepływu
Główne wyniki
- Izolowanie wydajnością do 5 x 10^8 hepatocytów
- Wskaźniki żywotności komórek pomiędzy 88% do 94,8%
- Czystość izolowanych hepatocytów około 96,8%
Wnioski
- Badanie skutecznie demonstruje usprawnioną metodę izolowania hepatocytów z poprawioną żywotnością i funkcjonalnością.
- Ta technika ma ważne implikacje dla badań wątroby i testów leków w badaniach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable isolation of primary rat hepatocytes with high viability and functional integrity is critical for predictive in vitro liver models in drug discovery and toxicity testing. Multiparameter perfusion control and standardized workflows reduce biological and operational variability, supporting robust early-stage decision-making. This protocol enhances reproducibility and scalability, directly impacting portfolio triage and translational research continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables generation of high-quality hepatocytes for mechanistic studies and pathway interrogation.
- Supports functional target validation by preserving albumin, urea, and CYP activity in isolated cells.
- Reduces biological ambiguity by standardizing cell source and isolation conditions.
Screening & Assay Development
- Provides reproducible, viable hepatocytes for assay development and compound screening.
- Facilitates quantitative readouts for toxicity and metabolic profiling.
- Improves assay standardization and cross-lab reproducibility through controlled perfusion parameters.
Translational & Preclinical Research
- Delivers disease-relevant primary cells for translational biomarker studies and preclinical modeling.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by maintaining hepatocyte-specific functions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions with reliable in vitro data.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions primary hepatocyte isolation as a foundational capability from early discovery through preclinical research, enabling consistent cell-based assays and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification with high-quality hepatocytes.
- Screening: Delivers assay-ready cells with validated viability and function for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of albumin, urea, and CYP activity for comparative studies.
- Translational Research: Aligns in vitro models with disease-relevant endpoints and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Standardized protocol allows reproducible implementation across R&D sites and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in liver-based assays.
- Operational Value: Enhances reproducibility, scalability, and aseptic workflow through integrated perfusion control.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by reducing biological variability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and supports cross-program comparability.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in surgical cannulation and perfusion system operation.
- Needs access to compact, sterile perfusion equipment and real-time monitoring infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible cell isolation outcomes.
- Adaptable to various rat models but may require protocol optimization for other species.
- Potential limitations include technical learning curve and dependency on specialized consumables.
