Name: Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Naucz się izolować pierwotne hepatocyty szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji. Ta metoda zapewnia wysoką żywotność komórek i wydajność do badań toksykologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest częściowo wspierana przez MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); Dotacja NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Instytut Mechanobiologii w Singapurze (R-714-106-004-135); oraz Instytut Bioinżynierii i Nanotechnologii, Rada ds. Badań Biomedycznych, Agencja ds. Nauki, Technologii i Badań (A*STAR) (numery projektów IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 i MedCaP-LOA-18-02) finansowanie dla Hanry Yu. Ng Chan Way jest pracownikiem naukowym Narodowego Uniwersytetu Singapuru. Chcielibyśmy podziękować Zakładowi Mikroskopii Konfokalnej i Zarządowi Cytometrii Przepływowej Narodowego Uniwersytetu Singapuru za pomoc i porady w analizie czystości hepatocytów.

<ol><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917(2012).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Green, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+primary+hepatocytes+from+human+tissue%3A+optimising+the+use+of+small+non-encapsulated+liver+resection+surplus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138(2011).</li>
<li>Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+portal+fibroblasts+by+in+situ+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669(2012).</li>
<li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501(2019).</li>
<li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> International Immunopharmacology. 85 (95), 106632(2020).</li>
<li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+L-azidohomoalanine+labeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).</li>
<li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+spheroids+as+an+in+vitro+hepatocyte+model+for+drug+safety+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening.</a> Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).</li>
<li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+isolation+of+primary+human+hepatocytes+and+corresponding+major+populations+of+non-parenchymal+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069(2016).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vertical-flow+bioreactor+array+compacts+hepatocytes+for+enhanced+polarity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions.</a> Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).</li>
<li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+sandwich+culture+of+3D+hepatocyte+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer.</a> Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).</li>
<li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li>
<li>Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar-flow+immediate-overlay+hepatocyte+sandwich+perfusion+system+for+drug+hepatotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing.</a> Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).</li>
<li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+canaliculi+contract+autonomously+by+releasing+calcium+into+hepatocytes+via+mechanosensitive+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel.</a> Biomaterials. 259, 120283(2020).</li>
<li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542(2019).</li>
<li>Osypiw, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+rat+hepatocytes+separated+by+Percoll+density-gradient+centrifugation+show+characteristics+consistent+with+different+acinar+locations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations.</a> The Biochemical Journal. 304, Pt 2 617-624 (1994).</li>
<li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+animal+model+of+ex+vivo+normothermic+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541(2018).</li>
<li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+decellularization+of+rat+livers+in+an+oscillating-pressure+perfusion+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029(2015).</li>
</ol>

Zhou Yan i Hanry Yu deklarują konkurencyjne interesy, ponieważ posiadają udziały w firmie Vasinfuse, która produkuje i sprzedaje Zintegrowany System Perfuzji. Hanry Yu posiada udziały w Histoindex, Invitrocue, Osteopore, Pishon Biomedical, Ants Innovate i Synally Futuristech, które nie mają konkurencyjnych interesów w stosunku do przedstawionych tutaj informacji.

Jest kilka punktów, które są szczególnie ważne do przestrzegania w przypadku dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w ogóle. Po pierwsze, należy zachować szczególną ostrożność podczas resekcji wątroby. Upewnij się, że przewód pokarmowy nie jest uszkodzony, ponieważ wyciek zawartości spowoduje zanieczyszczenie bakteryjne. Ponadto należy unikać uszkodzenia kapsułki Glissona, która pokrywa powierzchnię wątroby podczas zabiegu na zwierzętach. Jeśli rozdarcie jest wystarczająco duże, może to pozwolić na przedwczesne uwolni...

Pierwotne hepatocyty są ważnymi narzędziami do podstawowych badań związanych z wątrobą, leczenia chorób i zastosowań, takich jak testowanie leków. Obecnym złotym standardem pierwotnej izolacji hepatocytów jest dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazy1,2,3 wprowadzona przez Seglena w latach 19704. Jednak ta procedura jest trudna technicznie i ma wysoki wskaźnik niepowodzeń, gdy jest wykonywana przez początkujących chirurgów. Nawet jeśli perfuzja zostanie uznana za udaną, można zaobserwować drastyczne różnice w żywotności hepatocytów (zwykle 60%-95%) i wydajności (0,5-5 x 108 na szczura o wadze 200-300 g) między izolacjami. Ma to wpływ na jakość i skalę dalszych eksperymentów. Oprócz procedury technicznej, czynnikiem przyczyniającym się do tego jest konfiguracja perfuzyjna używana do izolacji, dostępna na rynku lub zbudowana na zamówienie. Należy zwrócić uwagę na montaż, optymalizację i konserwację zestawu perfuzyjnego. Celem tego protokołu jest poprawa wskaźnika powodzenia i stabilności między izolacjami pierwotnych hepatocytów szczura poprzez wieloparametrową kontrolę perfuzji procedury technicznej i konfigurację perfuzji dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy.
Z technicznego punktu widzenia, najtrudniejszym krokiem w procedurze jest kaniulacja żyły wrotnej. Jeśli chodzi o pozostałe etapy, to jeśli przestrzegana jest dobra praktyka i podejmowane są ogólne środki ostrożności, stabilność izolacji może ulec poprawie. Dlatego ważne jest zrozumienie uzasadnienia każdego kroku, aby chirurg mógł reagować na różne zmienne, które mogą wystąpić podczas zabiegu.
Opublikowano różne protokoły izolacji hepatocytów i komórek wątrobowych niemiąższowych od szczurów i myszy1,2,5,6,7,8,9. Konfiguracje perfuzyjne stosowane w tych protokołach miały kilka wad, do których należą ponowne użycie rurki perfuzyjnej, problemy z kontrolą temperatury, konieczność rutynowej optymalizacji parametrów perfuzji i/lub użycie nieodpowiedniego typu cewnika dożylnego (IV) do kaniulacji żyły wrotnej. Ponowne użycie rurki perfuzyjnej zwiększy ryzyko zanieczyszczenia, zwłaszcza jeśli rurka nie została odpowiednio oczyszczona i zdezynfekowana. Ponowne użycie rurki bez rutynowej wymiany narazi również zestaw perfuzyjny na problemy, takie jak nieszczelne rurki lub łączniki, zatkana pułapka bąbelkowa i zwężone rurki, z których wszystkie znacznie zmniejszą ciśnienie perfuzatu i szybkość przepływu, wpływając w ten sposób na wydajność trawienia wątroby. Bez stałego źródła ciepła w niektórych konfiguracjach do kontroli temperatury, wstępnie podgrzane z czasem ostygną, co prowadzi do niskiej aktywności kolagenazy i trawienia. Chociaż inne konfiguracje wykorzystują szklany skraplacz z płaszczem połączony z cyrkulatorem wody w celu ogrzania bufora, są one nieporęczne i wymagają starannego czyszczenia. Temperatura, ciśnienie i natężenie przepływu buforu wychodzącego z cewnika muszą być mierzone i optymalizowane przed rozpoczęciem izolacji, aby zapewnić stabilne warunki perfuzji. Nawet po optymalizacji parametry mogą nadal zmieniać się w połowie podczas izolacji ze względu na działania operatora, prowadząc w ten sposób do nieoptymalnej perfuzji i trawienia. Większość rodzajów cewników dożylnych nie nadaje się do kaniulacji żyły wrotnej, ponieważ nie pozwalają one na ciągłą perfuzję podczas kaniulacji. Nie są w stanie natychmiast poinformować chirurga, gdy kaniulacja się powiedzie. Ponadto trudno jest zabezpieczyć żyłę wrotną na cewniku miękkim bez jej deformacji.
Tutaj rozwiązujemy te problemy za pomocą standardowych jednorazowych sterylnych przewodów, silikonowej osłony grzewczej do precyzyjnej i stabilnej kontroli temperatury, monitorowania w czasie rzeczywistym i systemu alarmowego z przechowywaniem i zarządzaniem danymi oraz użyciem specjalnego cewnika dożylnego, który umożliwia ciągłą perfuzję podczas nakłuwania żyły wrotnej podczas kaniulacji. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jesteśmy pierwszą grupą, która połączyła wszystkie te cechy w zintegrowany system perfuzyjny (IPS), który jest kompaktowy, dzięki czemu jest wysoce przenośny i można go zmieścić w okapie z przepływem laminarnym, aby zapewnić aseptyczną pracę.

<table><tbody><tr><td><mocny>Materiał/Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL strzykawka</td><td>Igła Nipro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G</td><td>Nipro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pleciony jedwabny niewchłanialny, niesterylny szew chirurgiczny</td><td>Look</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki ze stali nierdzewnej Bochem 18/10, ostra końcówka zawiera wygiętą okrągłą końcówkę</td><td>Bochem</td><td>10333511</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy zestaw perfuzyjny</td><td>Vasinfuse</td><td>BPF-112</td><td></td></tr><tr><td>Pływający okrągły stojak na probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3133</td><td></td></tr><tr><td>Niemieckie standardowe kleszczyki do tkanek, ząbkowane / 1 i razy; 2 zęby, pipeta aspiracyjna 14,5 cm</td><td>Walentech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Greiner Cellstar</td><td>Merck</td><td>GN710183</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zintegrowany system perfuzyjny</td><td>Vasinfuse</td><td>IPS-001</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki zakrzywione, nierdzewne, 11 cm</td><td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td> Mikroskop <td>CVD</td><td></td></tr><tr><td>Light z soczewką</td> <td>10XArkusz siatki Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100&micro; M Nylon</td><td>Spectra-Teknic(s) Pte Ltd</td><td>06630-75</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne, BL/BL, 13cm</td><td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td><td>STR &ndash; Nożyczki operacyjne BL/BL</td><td></td></tr><tr><td>, SH/BL, 13cm</td><td>Optimal Medical Products Pte Ltd</td><td>STR &ndash; SH / BL</td><td></td></tr><tr><td>Klips hemostatyczny o odwrotnej sile</td><td>Shanghai Jin Zhong Pte Ltd</td><td>XEC230</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki/Chemikalia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9056</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>137101</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>TCI</td><td>D1961</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1-9278</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>VWRC26764.298</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Kwas linolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9530</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen bydlęcy typu I</td><td>Zaawansowany BioMatrix</td><td>5005-100ml</td><td></td></tr><tr><td>William' s E Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W1878</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Pierwotne hepatocyty są szeroko stosowane w podstawowych badaniach nad chorobami wątroby oraz do testowania toksyczności in vitro. Dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazy do pierwotnej izolacji hepatocytów jest technicznie trudna, szczególnie w przypadku kaniulacji żyły wrotnej. Procedura jest również podatna na sporadyczne zanieczyszczenia i zmiany warunków perfuzji z powodu trudności w montażu, optymalizacji lub konserwacji układu perfuzji. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół ulepszonej dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy z wieloparametrową kontrolą perfuzji. Pierwotne hepatocyty szczura zostały pomyślnie i niezawodnie wyizolowane dzięki zastosowaniu niezbędnych technicznych środków ostrożności na krytycznych etapach procedury oraz poprzez zmniejszenie trudności operacyjnych i złagodzenie zmienności parametrów perfuzji poprzez zastosowanie specjalnego cewnika dożylnego, znormalizowanego sterylnego jednorazowego rurki, kontroli temperatury oraz systemu monitorowania i alarmowania w czasie rzeczywistym. Wyizolowane pierwotne hepatocyty szczura konsekwentnie wykazują wysoką żywotność komórek (85%-95%), wydajność (2-5 x 108 komórek na 200-300 g szczura) i funkcjonalność (aktywność albuminy, mocznika i CYP). Procedura została uzupełniona o zintegrowany system perfuzyjny, który jest na tyle kompaktowy, że można go ustawić w okapie z przepływem laminarnym, aby zapewnić aseptyczną pracę.

Chirurg może ocenić, czy perfuzja wątroby przebiega prawidłowo, obserwując wyniki po określonych etapach. Pierwszy efekt można zaobserwować po kaniulacji, przecięciu podwątrobnego odcinka żyły głównej dolnej (IVC) i przywróceniu szybkości przepływu perfuzji. Wątroba powinna całkowicie zmienić kolor z ciemnoczerwonego na brązowy, zachowując jednocześnie swoją objętość. Jeśli wątroba wydaje się lekko zapadnięta i ma czerwonawy odcień lub czerwone plamy, oznacza to, że szybkość przepływu perfuzji została ustawiona błędnie (...

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie specjalnego cewnika dożylnego, standaryzowanego sterylnego jednorazowego wężyka, kontroli temperatury uzupełnionej monitorowaniem w czasie rzeczywistym, oraz systemu alarmowego dla dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w celu poprawy spójności żywotności, wydajności i funkcjonalności izolowanych pierwotnych hepatocytów szczurów.

Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Ten protokół izolacji hepatocytów szczura opiera się na resekcji wątroby przed podejściem do trawienia. Protokół wprowadza kompaktowy i przenośny zintegrowany system perfuzyjny do izolacji komórek. Technika ta obejmuje recyrkulację kolagenazy, która zmniejsza objętość stosowania kolagenazy i zapewnia większą elastyczność w wydłużaniu czasu trawienia, zapewniając jednocześnie wysoką wydajność grawitacyjną i specyficzną funkcję hepatocytów.Umieść szczura w kapturze. Po przecięciu mięśni brzucha popchnij jelita w prawo tyłem zakrzywionych kleszczy. Przerwij błonę pod przewodem żółciowym końcówką zakrzywionych kleszczyków, aby zapętlić szew wokół żyły wrotnej i przewodu żółciowego.Użyj jedwabnego szwu chirurgicznego, aby wykonać bardzo luźną ligaturę wokół żyły wrotnej w pobliżu wątroby, tuż przed rozgałęzieniem żyły w lewo i w prawo do różnych płatów wątroby. Około dwóch do trzech centymetrów przed pierwszą ligaturą, tuż przed odgałęzieniem żyły żołądkowej od żyły wrotnej, utwórz otwór w tkance pod żyłą wrotną za pomocą końcówek dwóch par zakrzywionych kleszczy. Następnie rozciągnij otwór, aby podeprzeć żyłę wrotną podczas kaniulacji.Zapobiegaj wzrostowi ciśnienia w wątrobie, zmniejszając prędkość pompy do czterech obrotów na minutę, aby uzyskać natężenie przepływu około trzech mililitrów na minutę. I upewnij się, że odpływ wolnego od wapnia buforu z cewnika dożylnego jest ograniczony do powolnej kroplówki. Delikatnie podtrzymując żyłę wrotną kleszczami, trzymaj cewnik dożylny skosem igły skierowanym do góry.I włóż igłę do żyły wrotnej pod kątem od 10 do 20 stopni. Następnie powoli przesuwaj się, aż cały skos znajdzie się wewnątrz żyły. Prawidłowe wprowadzenie powinno skutkować zblednieniem koloru wątroby.Przesuń kaniulę nad igłą i cofnij igłę za kaniulą, odciągając skrzydełko palcem wskazującym, trzymając cewnik kciukiem i palcem środkowym. Przymocuj żyłę wrotną do cewnika za pomocą klipsa do żyły i klipsa poniżej żyły wrotnej, aby uniknąć zakłócenia przepływu. Następnie przeciąć żyłę główną dolną podwątrobową, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia w wątrobie, i obserwuj, czy nie ma impulsów tryskających krwią, aby zapewnić prawidłowe cięcie.Zwiększ prędkość pompy do 38 obr./min, aby uzyskać natężenie przepływu około 33 mililitrów na minutę. I przepłucz wątrobę trzy razy, zamykając żyłę główną podwątrobową dolną kleszczami przez dwie do trzech sekund, a następnie ponownie ją otwierając. Aby wykonać perfuzję wszystkich płatów wątroby, wyreguluj położenie końcówki kaniuli i upewnij się, że jest ona umieszczona przed rozgałęzieniem żyły wrotnej na różne płaty wątroby.Następnie zaciśnij luźną ligaturę wokół żyły wrotnej, nieco przed punktem rozgałęzienia i zabezpiecz położenie kaniuli w żyle wrotnej, aby zapobiec cofaniu się bufora, wykonując trzy węzły w miejscu, w którym twarda igła podtrzymuje kaniulę, między skosem a otworem bocznym. Po resekcji wątroby pozwól wątrobie na perfuzję z buforem wolnym od wapnia przez 12 minut. Następnie dokręć zacisk rolkowy buforu bezwapniowego i poluzuj zacisk rolkowy buforu kolagenazy, aby zmienić bufor perfuzyjny.Po tym, jak bufor kolagenazy dotrze do wątroby, przepłucz wątrobę trzykrotnie, zamykając żyłę główną nadwątrobową dolną na dwie do trzech sekund i ponownie ją otwierając. Ostrożnie przesunąć wątrobę do etapu na górze zlewki w celu recyrkulacji buforu kolagenazy, przytrzymując membranę kleszczami, jednocześnie podtrzymując cewnik, uważając, aby nie pociągnąć cewnika, aby zapobiec przypadkowemu oderwaniu. Trawić wątrobę przez 12 minut i zatrzymać perfuzję, gdy wątroba straci swoją gładką brązową konsystencję i stanie się papkowata.W razie potrzeby wydłuż czas trawienia. Po strawieniu wątroby przeciąć żyłę wrotną, ostrożnie usunąć kaniulę. A następnie przenieś wątrobę do zimnego DMEM, aby wyizolować hepatocyty.Delikatnie postukaj w wątrobę, używając tylnej strony zakrzywionych kleszczy, aby złamać i oderwać błyszczącą kapsułkę. I uwolnij komórki wątroby, delikatnie kołysząc wątrobą w DMEM, aż komórki zostaną całkowicie zdysocjowane w pożywce. Żywotność hepatocytów wynosiła od 88 do 94,8%, jak określono na podstawie podróży i liczenia niebieskich.Wydajność hepatocytów od szczurów o wadze od 200 do 300 gramów wynosiła do pięciu razy od 10 do ośmiu komórek na izolację. Reprezentatywne obrazy pokazują nieoczyszczoną zawiesinę komórek wątroby i oczyszczoną zawiesinę hepatocytów. Czystość izolowanych hepatocytów wynosiła około 96,8%, co określono ilościowo, zliczając albuminy dodatnio fluorescencyjne wybarwione komórki w stosunku do całkowitej liczby jąder komórkowych.Na reprezentatywnych obrazach pokazanych w fałszywym kolorze, zielony reprezentuje albuminę, a niebieski oznacza jądra komórkowe z albuminą. Jądra komórkowe bez albuminy są podświetlone na czerwono. Hepatocyty w hodowli kanapkowej tworzyły wyraźne kanały żółciowe i miały dobry kontakt z komórkami komórkowymi.Jak wykazały testy albuminy, mocznika i cytochromu P450, hepatocyty wykazywały wysokie wydzielanie mocznika i albuminy. W trzecim dniu hepatocyty wykazywały wysoką aktywność enzymatyczną dla CYP1A2, CYP2B1/2 i CYP3B2. Bądź przygotowany psychicznie przed wkłuciem igły do żyły wrotnej.Po wprowadzeniu chirurg będzie musiał kontynuować bez pulsu, dopóki prędkość pompy nie zostanie zwiększona po przecięciu IVC.

isolation-primary-rat-hepatocytes-with-multiparameter-perfusion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano technikę izolacji fibroblastów wrotnych z wątroby szczura. Wątroby poddano perfuzji oraz trawieniu in situ kolagenazą, a następnie trawieniu ex vivo zawiesiny wątrobowej i selekcji komórek pod względem wielkości. Metoda ta pozwala na uzyskanie czystej populacji fibroblastów wrotnych bez konieczności pasażowania w hodowli.

Izolacja fibroblastów wrotnych szczura poprzez perfuzję wątroby in situ

Pierwotne hepatocyty stanowią cenne narzędzie do oceny funkcji biochemicznych, molekularnych i metabolicznych w fizjologicznie istotnym systemie eksperymentalnym. Opisujemy niezawodny protokół perfuzji wątroby szczura in situ, który pozwala na konsekwentne uzyskiwanie żywotnych hepatocytów w ilości do 1,0 × 108 komórek na preparat, przy żywotności komórek w zakresie 88 ~ 96%.

Izolacja i hodowla pierwotna komórek wątroby szczura

Opisana jest zmodyfikowana dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazy do izolacji ludzkich hepatocytów. Metodę tę można również zastosować do wątroby innych ssaków. Wyizolowane hepatocyty są dostępne w wysokiej wydajności i żywotności, co czyni je odpowiednim modelem do badań naukowych w takich dziedzinach jak regeneracja wątroby, farmakokinetyka i toksykologia.

Izolacja ludzkich hepatocytów za pomocą dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Tutaj pokazujemy enzymatyczne podejście do izolacji pierwotnych hepatocytów od dorosłych myszy i opisujemy kwantyfikację odpowiedzi zapalnej za pomocą ELISA i PCR w czasie rzeczywistym.

Indukcja odpowiedzi zapalnej w pierwotnych kulturach hepatocytów od myszy

Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.

Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym szlakiem metabolicznym odpowiedzialnym za wytwarzanie energii w wielu różnych typach komórek, w tym w hepatocytach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach pierwotnych przy użyciu 14znakowanych C kwasów palmitynowych.

Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Tutaj prezentujemy solidną metodę perfuzji in situ wątroby myszy do badania ostrej i bezpośredniej regulacji metabolizmu wątroby bez naruszania architektury wątroby, ale przy braku czynników pozawątrobowych.

Produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.

Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D

Naucz się izolować pierwotne hepatocyty szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji. Ta metoda zapewnia wysoką żywotność komórek i wydajność do badań toksykologicznych.

Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji

Przeglądaj więcej filmów