Wytwarzanie i hodowla organoidów językowych pochodzących z komórek macierzystych smakowych dorosłych myszy

Organoidy to potężna technologia in vitro wykorzystywana do badań przesiewowych leków i zrozumienia procesów biologicznych. Tak więc generowanie organoidów, które modelują język, ma kluczowe znaczenie dla badania rozwoju i regeneracji komórek smakowych. Tradycyjne badania smaku in vivo mogą być kosztowne i czasochłonne.

Ten protokół organoidowy oferuje ustandaryzowaną, powtarzalną alternatywę, która minimalizuje te wyzwania, umożliwiając jednocześnie eksperymenty o większej przepustowości. Po eutanazji dorosłej myszy użyj dużych sterylnych nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć policzki i złamać szczękę. Następnie podnieś język i przetnij wędzidełko językowe, aby oddzielić język od dna jamy ustnej.

Wytnij język i zbierz go w sterylnym, lodowatym dPBS z wapniem i magnezem. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń i wyrzuć przedni język, przecinając żyletką tylko przednią część wyniosłości międzymalarycznej. Następnie za pomocą delikatnej chusteczki do usuwania włosów i nadmiaru płynu z tylnego języka.

Następnie napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra 200 do 300 mikrolitrami roztworu enzymu do wstrzykiwań i włóż igłę o rozmiarze 30 cm tuż nad wyniosłością międzymalaryczną, aż do przodu brodawek okołobrzegich lub CVP. Wstrzyknąć roztwór enzymu pod i na bocznych krawędziach CVP między nabłonkiem a znajdującymi się pod nim tkankami. Powoli i w sposób ciągły wyjmować strzykawkę z języka podczas wstrzykiwania roztworu.

Inkubuj język i sterylny dPBS bez wapnia i magnezu w temperaturze pokojowej dokładnie przez 33 minuty. Używając bardzo drobnych nożyczek preparacyjnych, wykonaj małe nacięcia w nabłonku obustronnie i tuż przed CVP. Następnie delikatnie obierz nabłonek, unosząc go drobnymi kleszkami.

Gdy nabłonek okopu zostanie wolny od leżącej pod spodem tkanki łącznej, umieść go w dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej, wstępnie pokrytej FBS. Dodaj koktajl enzymów dysocjacyjnych do probówek zawierających obrany nabłonek CVP i inkubuj je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut z krótkim wirowaniem co 15 minut. W ciągu ostatnich 15 minut inkubacji podgrzej 0,25% trypsyny-EDTA w łaźni wodnej.

Po inkubacji wirować probówki w trituration szklaną pipetą Pasteura przez jedną minutę. Po opadnięciu kawałków tkanki należy pipetować supernatant zawierający pierwszą kolekcję zdysocjowanych komórek do nowych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych pokrytych FBS. Wirować supernatant przez pięć minut w temperaturze 370 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aby osadzać komórki.

Usunąć powstały supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórek w buforze FACS i trzymać go na lodzie. Aby oddzielić pozostałe kawałki tkanki w oryginalnych dwumililitrowych probówkach do mikrowirówki, dodaj wstępnie podgrzaną 0,25% trypsynę-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut z krótkim wirowaniem co 10 minut. Następnie rozcieraj kawałki tkanki szklaną pipetą Pasteura przez jedną minutę.

Po opadnięciu kawałków tkanki należy pipetować supernatant do 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówkowych zawierających wcześniej zebrane zdysocjowane komórki w buforze FACS. Zakręć probówkami ze zdysocjowanymi komórkami. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osady komórek w buforze FACS i przechowywać je na lodzie.

Następnie wyizoluj komórki Lgr5-GFP dodatnie za pomocą FACS za pomocą kanału białka zielonej fluorescencji, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Przenieś żądaną liczbę dodatnich zawieszonych komórek Lgr5 do nowej probówki do mikrowirówki. Obracaj probówkę przez pięć minut w temperaturze 370 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aby rozpylić komórki.

Usunąć supernatant i umieścić probówkę na lodzie. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości żelu matrycowego, delikatnie pipetując. Następnie trzymaj probówkę mikrowirówki na lodzie w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, aby zapobiec żelowaniu żelu matrycowego.

Dodaj 15 mikrolitrów żelu matrycowego do mieszaniny komórek w środku każdego dołka 48-dołkowej płytki. Aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek, należy wymieszać żel matrycowy i mieszaninę komórek, pipetując w górę iw dół po posiewaniu co trzy dołki. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i wilgotności 95% na 10 minut, aby umożliwić żelowanie żelu matrycowego.

Następnie dodaj 300 mikrolitrów pożywki WENRAS o temperaturze pokojowej uzupełnionej inhibitorem skał Y27632 do każdej studzienki i zwróć płytkę do inkubatora. Dwa dni po posiewie usuń pożywkę z każdej studzienki za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra lub przez aspirację próżniową, upewniając się, że nie dochodzi do zanieczyszczenia krzyżowego między warunkami. Dodać 300 mikrolitrów pożywki WENRAS po bokach studzienki, uważając, aby nie naruszyć żelu matrycowego i zwrócić płytkę z powrotem do inkubatora.

Kiedy organoidy językowe są hodowane przy użyciu pożywek WENR, nie rosną wydajnie. Jednak po dodaniu A 83-01, inhibitora sygnalizacji TGF-beta, a SB202190, inhibitora sygnalizacji kinazy mapy P-38, obserwuje się silny wzrost. Co ciekawe, usunięcie tych inhibitorów z pożywki po sześciu dniach powoduje wyższą ekspresję markera komórkowego receptora ogólnego smaku, Kcnq1, co sugeruje, że A 83-01 i SB-202190 utrudniają różnicowanie komórek smakowych.

W ten sposób optymalny wzrost i różnicowanie uzyskuje się poprzez hodowlę organoidów w pożywkach WENRAS od dnia zerowego do szóstego i w pożywkach WENR od szóstego do dwunastego dnia. Dojrzałe organoidy zawierają zarówno komórki smakowe oznaczone keratyną-8, jak i komórki nabłonka bez smaku oznaczone keratyną-13. Co więcej, keratyna-13 ulega ekspresji na wyższych poziomach niż wszystkie trzy markery komórkowe receptora smaku, co sugeruje, że organoidy składają się głównie z komórek nabłonka bez smaku.

Organoidy wyrażają wszystkie typy komórek receptorów smaku. Komórki typu pierwszego oznaczone Entpd2 i gorzkie komórki typu drugiego oznaczone Gnat3 mają wysoką ekspresję w organoidach smakowych, podczas gdy komórki typu trzeciego z kwaśnym wyczuwaniem są mniej powszechne. Komórki receptorów smaku są losowo rozmieszczone w organoidach, a nie w dyskretnych strukturach kubków smakowych obserwowanych in vivo.

Upewnij się, że podczas wycinania języka z jamy ustnej uwzględniono część tkanki za CVP. Dodatkowo upewnij się, że oba rowy wyskakują i są uzyskiwane podczas złuszczania nabłonka.