Name: Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym reaktywnych form tlenu w neutrofilach zakażonych meningitycznymi Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji reaktywnych form tlenu w neutrofilach zakażonych meningitycznymi Escherichia coli. Protokół wykorzystuje fluorescencyjne sondy DHE i mikropłytkowy czytnik fluorescencji w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31670845, 31870832, 32000811) oraz Program Wybitnego Profesora Prowincji Liaoning (LJH2018-35).

Krew obwodowa od ochotników zastosowana w tym badaniu została zatwierdzona przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną pierwszego Szpitala Chińskiego Uniwersytetu Medycznego (#2020-2020-237-2).
1. Przygotowanie odczynników i pożywki hodowlanej
<ol>
	<li>Przygotować bufor do lizy czerwonych krwinek, dodając 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 37,2 mg Na2EDTA do 1 l podwójnie destylowanej wody i dostosować pH do 7,2-7,4. Usuń bakterie przez filtrację za pomocą filtrów 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować eksperymentalną pożywkę hodowlaną dla neutrofili, dodając 5% płodowej surowicy bydlęcej do pożywki RPMI 1640 i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem zrównoważyć do temperatury pokojowej. 
	UWAGA: Użyj pożywki RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej.</li>
	<li>Przygotować bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) przez dodanie 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4·2H2O i 0,2 g KH2PO4 do 1 l podwójnie destylowanej wody w szklanej kolbie o pojemności 1 l. Dostosuj pH do 7,2-7,4. Autoklawować w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór ryfampicyny, rozpuszczając 0,5 g ryfampicyny w proszku w 10 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu uzyskania roztworu ryfampicyny o stężeniu 50 mg/ml.</li>
	<li>Przygotować roztwór agaru LB, dodając 10 g NaCl, 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 15 g proszku agarowego do 1 l podwójnie destylowanej wody i autoklawować mieszaninę. Napełnić szalki Petriego do połowy objętości, wlewając ciepły roztwór agaru LB zawierający 100 μg/ml ryfampicyny. Przechowywać schłodzoną płytę stałą w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować bulion z naparu z mózgu i serca (BHI) odpowiedni dla szczepów bakterii, rozpuszczając 37 g proszku BHI w 1 litrze podwójnie destylowanej wody. Dostosuj pH do 7,2 i przeprowadź go w autoklawie.</li>
	<li>Rozpuść sondę fluorescencyjną dihydroetydydową (DHE) w rozpuszczalniku DMSO, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM. Delikatnie wymieszać przed użyciem. 
	UWAGA: Natychmiast przesypać roztwór podstawowy do fiolek odpornych na światło. Okres przechowywania roztworu podstawowego wynosi 6 miesięcy w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie szczepu bakterii E44
UWAGA: E44 to zmutowany szczep meningitycznej E. coli z odpornością na ryfampicynę.
<ol>
	<li>Zanurzyć kriokonserwowaną kolonię E44 sterylną końcówką pipety, zaszczepić szczep E44 na płytce agarowej LB zawierającej 100 μg/ml ryfampicyny, rysując linie. Umieścić płytkę do góry nogami w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Dzień przed eksperymentem należy pobrać jedną kolonię E44 z płytki za pomocą sterylnej końcówki pipety i umieścić ją w 5 ml bulionu BHI zawierającego 100 μg/ml ryfampicyny w kolbie o pojemności 50 ml. Inkubować kulturę bakteryjną w temperaturze 37 °C przy 90 obr./min przez 17 godzin w wytrząsarce do inkubacji.</li>
</ol>
3. Izolacja neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej
<ol>
	<li>Pobrać 5 ml próbki krwi od ochotników dożylnie do probówki próżniowej zawierającej EDTA w celu antykoagulacji.</li>
	<li>Odwirować próbki krwi obwodowej przy 500 x g przez 5 minut. Próbki krwi są dzielone na trzy warstwy przez wirowanie, które od dołu do góry obejmują kolejno warstwę czerwonych krwinek (RBC), warstwę białych krwinek (WBC) i warstwę osocza.</li>
	<li>Odessać warstwę białych krwinek za pomocą pipety do nowej probówki z 3x buforem do lizy RBC. Dokładnie zmiksuj mieszaninę i umieść w temperaturze pokojowej na 5 minut.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 5 minut. Całkowicie odessać supernatant i wyrzucić.
	<ol>
		<li>Powtórz procedurę lizy z buforem do lizy RBC 1-2 razy, aż osad zmieni kolor na biały.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć komórki, ponownie zawieszając osad za pomocą 2 ml PBS. Następnie odwirować przy 300 x g przez 5 minut, aby komórki opadły na dno probówki.</li>
	<li>Oznaczyć neutrofile mikrogranulkami CD16 poprzez ponowne zawieszenie osadu za pomocą 50 μl wstępnie schłodzonego buforu do sortowania komórek magnetycznych. Następnie dokładnie wymieszaj z 50 μl ludzkich mikrogranulek CD16. Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez 30 min. 
	UWAGA: Roztwory powinny być wstępnie schłodzone, aby zapobiec zamykaniu przeciwciał na powierzchni komórki i niespecyficznemu znakowaniu. Większość dorosłych ma około 4 000 do 10 000 białych krwinek na mikrolitr krwi, wśród których neutrofile stanowią około 50-70%. Szacuje się, że całkowita liczba białych krwinek w 5 ml ludzkiej krwi obwodowej wynosi zwykle do 2-5 x 107.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 2 ml magnetycznego buforu do sortowania komórek i odwirować w temperaturze 4 °C, 300 x g przez 10 minut. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 500 μl buforu sortującego.</li>
	<li>Zamontuj kolumnę magnetyczną i półkę oddzielającą. Przenieść separator na półkę z kolumną magnetyczną i przepłukać kolumnę 3 ml buforu sortującego.</li>
	<li>Wrzuć zawiesinę komórek do kolumny, aby umożliwić neutrofile oznaczone kulkami magnetycznymi przyczepienie się do kolumny magnetycznej.</li>
	<li>Zmyj nieoznakowane komórki, dodając 3 ml magnetycznego bufora do sortowania komórek 3 razy, upewniając się, że zbiornik kolumny jest za każdym razem pusty</li>.
	<li>Wyjmij kolumnę z separatora magnetycznego i umieść ją w probówce o pojemności 15 ml. Dodaj 5 ml magnetycznego buforu do sortowania komórek do kolumny. Wypchnij komórki oznaczone magnetycznie za pomocą tłoka. 
	UWAGA: Aby poprawić czystość neutrofili, etapy sortowania można powtórzyć przy użyciu nowej kolumny.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut, całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki hodowlanej. Określ liczbę komórek za pomocą licznika komórek i przygotuj komórki do dalszych eksperymentów.</li>
</ol>
4. Pomiar ROS
<ol>
	<li>Odwirować wyizolowane neutrofile przy 300 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad i dostosować stężenie komórek do 2 x 106/ml za pomocą pożywki hodowlanej zawierającej sondę fluorescencyjną 5 μM DHE.</li>
	<li>Inkubować neutrofile w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby załadować sondę DHE, a następnie przydzielić zawiesinę komórek do 96-dołkowej czarnej mikropłytki polistyrenowej z 200 μl na studzienkę.</li>
	<li>Włącz czytnik mikropłytek i otwórz oprogramowanie wykrywające. Wybierz nieprzezroczysty format płytki 96-dołkowej i określ obszar odczytu.
	<ol>
		<li>Ustaw fluorescencję (Ex/Em = 518/605 nm) w trybie kinetycznym co 5 minut przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że potrząsasz płytką przez 3 sekundy przed każdym odczytem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć mikropłytkę z inkubatora, dodać wyhodowany E44 (MOI=100) lub 12-mirystynian forbolu 13-octan (PMA) (100 ng/ml) do każdej studzienki zawierającej wstępnie załadowane neutrofile z 3 powtórzeniami. Użyj PMA jako kontroli pozytywnej.</li>
	<li>Umieścić płytkę w czytniku mikropłytek i natychmiast rozpocząć oznaczanie.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11(2010).</li>
<li>Woll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+Etiology+of+Invasive+Bacterial+Infection+in+Infants+%3C%2F%3D60+Days+Old+Treated+in+Emergency+Departments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments.</a> Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etiology+and+Clinical+Features+of+Full-Term+Neonatal+Bacterial+Meningitis%3A+A+Multicenter+Retrospective+Cohort+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 31(2019).</li>
<li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Meningitis-Associated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EcoSal+Plus%22%5BJournal%5D)">Human Meningitis-Associated Escherichia coli.</a> EcoSal Plus. 7 (1), (2016).</li>
<li>Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).</li>
<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li>
<li>Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Molecules%2C+Functions+and+Pathophysiological+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects.</a> Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).</li>
<li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+and+ROS-induced+ROS+release%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li>
<li>Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+NADPH+oxidase+in+modulating+neutrophil+effector+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses.</a> Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).</li>
<li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neutrophil%27s+Role+During+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+roles+of+NOX2+NADPH+oxidase-derived+ROS+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity.</a> Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).</li>
<li>Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases%3A+an+overview+from+structure+to+innate+immunity-associated+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies.</a> Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).</li>
<li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+Oxidase+and+Associated+Ion+Fluxes+During+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis.</a> Traffic. 14, 1118-1131 (2013).</li>
<li>Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Neutrophil+Oxidants%3A+From+Laboratory+Curiosity+to+Clinical+Reality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality.</a> Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).</li>
<li>Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+%28ROS%29+in+the+Formation+of+Extracellular+Traps+%28ETs%29+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans.</a> Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).</li>
<li>Haynes, A. P., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neutrophil+function+test%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">neutrophil function test.</a> Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).</li>
<li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li>
<li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C7%27-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement%3A+Forty+years+of+application+and+controversy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li>
<li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li>
<li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mitochondrial+Mass%2C+Damage%2C+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Neutrofile działają jako najobficiej występujący składnik białych krwinek w ludzkim krążeniu krwi. Są ważnymi komórkami efektorowymi we wrodzonym układzie odpornościowym człowieka, który buduje pierwszą linię obrony przed inwazją patogenów11. Wytwarzanie ROS stanowi jeden z głównych mechanizmów bakteriobójczych neutrofili po fagocytozie11. Ostatnie badania wykazały, że struktura przypominająca siatkę uwalniana przez neutrofile zwana zewnątrzkomórkową pułapką neutrofili (NET...

Bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków jest powszechną chorobą zakaźną u dzieci. Escherichia coli (E. coli) z kapsułką K1 jest najczęstszym patogenem Gram-ujemnym powodującym bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków, stanowiącym około 80% całkowitej częstości występowania<klasa sup="xref">1,2,3. Pomimo postępów w chemioterapii przeciwbakteryjnej i leczeniu wspomagającym, bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych jest nadal jednym z najbardziej wyniszczających stanów o wysokiej zachorowalności i śmiertelności4.
Występowanie bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków zwykle zaczyna się od bakteriemii spowodowanej przedostaniem się bakterii chorobotwórczych do krążenia obwodowego z miejscowych zmian u noworodków, po której następuje przenikanie przez barierę krew-mózg (BBB) do mózgu, co skutkuje zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych4. Początek bakteriemii zależy od interakcji między bakteriami a komórkami odpornościowymi gospodarza, w tym neutrofilami i makrofagami itp. Neutrofile, które stanowią ~50-70% białych krwinek, są pierwszą linią obrony przed infekcjami bakteryjnymi5,6. Podczas inwazji bakterii aktywowane neutrofile są rekrutowane do miejsc infekcji i uwalniają reaktywne formy tlenu (ROS), w tym anion ponadtlenkowy, nadtlenek wodoru, rodniki hydroksylowe i tlen singletowy7. ROS ulegają reakcjom redoks z błoną komórkową, cząsteczkami kwasu nukleinowego i białkami bakterii, co skutkuje uszkodzeniem i śmiercią atakujących bakterii8. Mitochondria są głównym miejscem produkcji ROS w komórkach eukariotycznych, a różne oksydazy (np. kompleks oksydazy fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH), system lipooksygenazy, kinaza białkowa C i układ cyklooksygenazy) pośredniczą w produkcji ROS9,10. Pomiar produkcji RFT w czasie rzeczywistym, reprezentującego główny mechanizm przeciwdrobnoustrojowy w neutrofilach, jest przydatną metodą badania obrony gospodarza podczas interakcji bakteria-gospodarz.
W tym protokole, zależna od czasu produkcja ROS u neutrofili zakażonych meningitycznymi E. coli została określona ilościowo za pomocą fluorescencyjnej sondy ROS DHE, wykrytej przez czytnik mikropłytek fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym. Metoda ta może być również stosowana do oceny produkcji ROS w komórkach innych ssaków podczas interakcji patogen-gospodarz.

<table><tbody><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3025</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>DINGGUO</td><td>DH010-1.1</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-rad</td><td>508BR03397</td><td></td></tr><tr><td>Bezpieczeństwo biologiczne Carbinet</td><td>Shanghai Lishen</td><td>Hfsafe-1200Lcb2</td><td></td></tr><tr><td>Napar z serca mózgu</td><td>BD</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>CD16 Mikrogranulki, ludzkie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-701</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Changsha Xiangyi</td><td>TDZ5-WS</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium (DHE)</td><td>MedChemExpress</td><td>104821-25-2</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Cellmax</td><td>SA211.02</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Heraeus</td><td>Hera Cell</td><td></td></tr><tr><td>Bufor separacyjny MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax M5</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-mirystynian 13-octan (PMA)</td><td>Beyoitme</td><td>S1819-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka separacji QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Solarbio</td><td>13292-46-1</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 medium</td><td>Sangon Biotech</td><td>E600027-0500</td><td></td></tr><tr><td>Shaker termostatyczny</td><td>Shanghai Zhicheng</td><td>ZWY-100D</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja w czasie rzeczywistym reaktywnych form tlenu w neutrofilach zakażonych meningitycznymi escherichia coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) jest najczęstszą bakterią Gram-ujemną powodującą zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych noworodków. Występowanie bakteriemii i przenikanie bakterii przez barierę krew-mózg są niezbędnymi etapami rozwoju zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych E. coli. Reaktywne formy tlenu (ROS) reprezentują główne mechanizmy bakteriobójcze neutrofili w celu zniszczenia zaatakowanych patogenów. W tym protokole zależną od czasu wewnątrzkomórkową produkcję ROS w neutrofilach zakażonych meningitycznymi E. coli określono ilościowo za pomocą fluorescencyjnych sond ROS wykrytych przez czytnik mikropłytek fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym. Metoda ta może być również stosowana do oceny produkcji ROS w komórkach ssaków podczas interakcji patogen-gospodarz.

Stosując protokół opisany w niniejszym artykule, neutrofile wyizolowano z ludzkiej krwi obwodowej i załadowano sondą fluorescencyjną DHE, aby wykryć zmiany poziomów ROS w odpowiedzi na zakażenie szczepem E44. Poniżej przedstawiamy reprezentatywne dane obrazujące produkcję ROS wywołaną przez szczep E44, zmierzoną w czasie rzeczywistym za pomocą czytnika płytek mikrotitracyjnych. Po dodaniu szczepów E44 przy MOI wynoszącym 100, poziomy ROS wzrosły natychmiastowo i wykazały ciągłą tendencję wzrostową w zależności od czasu (...

Escherichia coli jest główną przyczyną Gram-ujemnego bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków. Podczas infekcji bakteryjnej główną rolę bakteriobójczą odgrywają reaktywne formy tlenu wytwarzane przez neutrofile. Tutaj przedstawiamy metodę wykrywania reaktywnych form tlenu w neutrofilach w odpowiedzi na zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych E. coli.

Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym reaktywnych form tlenu w neutrofilach zakażonych meningitycznymi Escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli jest najczęstszą bakterią Gram-ujemną powodującą zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków. Występowanie bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków zaczyna się wyłącznie od bakteriemii, a następnie bakterie we krwi przenikają przez barierę krew-mózg, powodując zapalenie opon mózgowych. Neutrofile są pierwszą linią obrony przed infekcjami bakteryjnymi.Podczas inwazji bakteryjnej aktywne neutrofile uwalniają ROS. ROS reprezentuje główne mechanizmy bakteriobójcze komórek gospodarza w celu niszczenia atakujących patogenów. Pomiar produkcji ROS w neutrofilach jest przydatną metodą uruchamiania obrony gospodarza podczas interakcji bakteria-gospodarz.Pobrać pojedynczą kolonię bakteryjną z płytki za pomocą sterylnej pipety i umieścić ją w pięciomililitrowej pożywce infuzyjnej Brain-Heart zawierającej ryfampicynę we wklęsłej kolbie. Inkubować kulturę bakteryjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z prędkością 90 obr./min przez 17 godzin w wytrząsarce do inkubacji. Odwirować próbki krwi obwodowej z prędkością 2000 obr./min przez pięć minut.Po odwirowaniu próbki krwi dzieli się na trzy warstwy. Od dołu do góry warstwa czerwonych krwinek, warstwa białych krwinek i warstwa osocza. Odessać warstwę białych krwinek do nowej probówki za pomocą sterylnej pipety.Dodać trzykrotny bufor do lizy czerwonych krwinek. Dokładnie wymieszaj mieszaninę i umieść w temperaturze pokojowej na pięć minut. Odwirować probówkę z prędkością 2000 obr./min przez pięć minut.Całkowicie odessać supernatant i wyrzucić. Powtórz procedurę lizy czerwonych krwinek jeden lub dwa razy, aż osady zmienią kolor na biały. Umyj komórki, ponownie zawieszając osad za pomocą dwóch mililitrów PBS.Następnie odwiruj probówkę z prędkością 1000 obr./min przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad za pomocą 15-mikrolitrowego bufora do sortowania komórek magnetycznych z kodem wstępnym dla 15 milionów komórek. Dodaj 15 mikrolitrów mikrokulek magnetycznych i dokładnie wymieszaj.Inkubować mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. W normalnych warunkach dorosły człowiek ma około czterech do 10 000 białych krwinek na mikrolitr krwi. Tak więc koszt całkowitej liczby białych krwinek w pięciu mililitrach ludzkiej krwi obwodowej wynosi prawie mniej niż 50 milionów.A 50 mikrolitrów kulek magnetycznych w 15-mikrolitrowym buforze do sortowania magnetycznego wystarczy. Normalny odsetek neutrofili wynosi od 50 do 70% całkowitej liczby białych krwinek. Tak więc około 10 milionów neutrofili można uzyskać z pięciu mililitrów krwi.Umyj komórki, dodając do probówki dwa mililitry magnetycznego buforu sortującego na 10 milionów komórek i odwiruj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, 1 200 obr./min przez 10 minut. Zamontuj kolumnę magnetyczną i półkę oddzielającą. Całkowicie odrzuć supernatant i ponownie zawieś osady za pomocą magnetycznego bufora sortującego o pojemności 500 mikrolitrów dla maksymalnie 100 milionów komórek.Przepłukać kolumnę trzymililitrowym magnetycznym buforem sortującym. Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę, aby umożliwić neutrofile oznaczone kulkami magnetycznymi przymocowanymi do kolumny. Zmyj niespecyficzne specyficzne komórki, dodając trzy mililitry buforu trzy razy, gdy zbiornik kolumny jest za każdym razem pusty.Wyjmij kolumnę z separatora magnetycznego i umieść ją w nowej probówce. Dodaj do kolumny pięciomililitrowy magnetyczny bufor sortujący. Wypchnij komórki oznaczone magnetycznie za pomocą tłoka.Odwirować probówkę z prędkością 1 200 obr./min przez pięć minut. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą jednego mililitrowego podłoża hodowlanego. Określ numer komórki za pomocą licznika.Dostosowano stężenie komórek do 2 milionów na mililitr w pożywce hodowlanej zawierającej sondę fluorescencyjną DHE. Umieść neutrofile w inkubatorze na 30 minut, aby załadować sondę DHE. Przydzielić zawiesinę komórek do 96-dołkowej czarnej mikropłytki z 200 mikrolitrami na dołek.Włącz czytnik mikropłytek. Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, wybierz tryb odczytu fluorescencji, typ odczytu kinetycznego, ustaw długość fali fluorescencji. Wybierz format płyty.Określ obszar czytania. Mierz intensywność fluorescencji co pięć minut przez godzinę. Potrząsaj płytką przez trzy sekundy przed każdym odczytem.Wyjąć mikropłytkę z inkubatora. Dodaj szczepy PMA lub E44 z trzema powtórzeniami. Umieść płytkę w czytniku mikropłytek, naciśnij przycisk start, aby natychmiast rozpocząć test.Korzystając z zarysu protokołu opisanego w tym artykule, neutrofile wyizolowano z ludzkiej krwi obwodowej i załadowano sondą fluorescencyjną DHE. Po dodaniu PMA, wewnątrzkomórkowy ROS w neutrofilach wykazał znaczny wzrost od 20 do 40 minut i osiągnął szczyt po 60 minutach. Ale myślę, że E44 się odkształca, produkcja ROS następuje natychmiast i w zależności od czasu się wydłuża.Ekspresja ROS spowodowana przez szczep E44 jest podobna do tej spowodowanej przez PMA. Wykrycie produkcji ROS w neutrofilach może przyczynić się do dalszych badań nad mechanizmami bakteriobójczymi neutrofili. W tym protokole zapewniamy łatwiejszy sposób wykrywania produkcji ROS w neutrofilach w czasie rzeczywistym.Ta prosta metoda może być również wykorzystana do monitorowania produkcji ROS w innych typach komórek gospodarza podczas interakcji gospodarz-bakteria.

real-time-quantification-reactive-oxygen-species-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Neisseria meningitidis (Nm), gram-ujemny patogen dróg oddechowych specyficzny dla ludzi, może wiązać się z ludzką α-aktyniną. Przedstawiamy tutaj protokół wizualizacji kolokalizacji bakterii z wewnątrzkomórkową α-aktyniną po wniknięciu bakterii do ludzkich komórek śródbłonka mikro naczyniowego mózgu (HBMECs).

Wizualizacja i kwantyfikacja oddziaływań wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis oraz ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego

W tym filmie demonstrujemy test chemiluminescencji in vitro, który wykrywa wytwarzanie reaktywnych form tlenu przez neutrofile po wystawieniu na działanie opsonizowanego biofilmu bakteryjnego.

Oznaczanie produkcji ROS przez neutrofile po interakcji z opsonizowanym biofilmem

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Dostosowaliśmy zestaw protokołów do pomiaru reaktywnych form tlenu (ROS), które mogą być stosowane w różnych modelach komórkowych ameb i ssaków do badań jakościowych i ilościowych.

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Zakażenie noworodków myszy bioluminescencyjnym E. coli O1:K1:H7 powoduje infekcję septyczną ze znacznym zapaleniem płuc i patologią płuc. W tym miejscu opisano procedury modelowania i dalszego badania sepsy noworodków za pomocą podłużnego obrazowania przyżyciowego równolegle z wyliczaniem ogólnoustrojowych obciążeń bakteryjnych, profilowaniem stanu zapalnego i histopatologią płuc.

Noworodkowy model obrazowania posocznicy bakteryjnej Gram-ujemnej

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Obecny protokół opisuje badanie interakcji neutrofil-biofilm. Biofilmy Staphylococcus aureus tworzy się in vitro i inkubuje z neutrofilami ludzkimi pochodzącymi z krwi obwodowej. Odpowiedź oksydacyjna neutrofili jest określana ilościowo, a lokalizacja neutrofili w biofilmie jest określana za pomocą mikroskopii.

Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus

Opisujemy stopniowe protokoły mierzące oddychanie mitochondrialne mysich i ludzkich neutrofili oraz komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego.

Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę kwantyfikacji reaktywnych form tlenu w neutrofilach zakażonych meningitycznymi Escherichia coli. Protokół wykorzystuje fluorescencyjne sondy DHE i mikropłytkowy czytnik fluorescencji w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym reaktywnych form tlenu w neutrofilach zakażonych meningitycznymi Escherichia coli

Przeglądaj więcej filmów