Name: Wykrywanie glikozaminoglikanów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i barwienia srebrem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Poznaj metodę elektroforezy w żelu poliakrylamidowym do wykrywania i analizy glikozaminoglikanów z próbek biologicznych. Technika ta jest czuła i dostępna dla większości laboratoriów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL i EPS)

Wszystkie próbki biologiczne analizowane w tym protokole zostały uzyskane od myszy, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Izolacja siarczanu heparanu
<ol>
	<li>Delipidacja próbek tkanek 
	UWAGA: Delipidacja jest opcjonalnym etapem w przypadku tkanek bogatych w tłuszcz.
	<ol>
		<li>Przygotuj mieszaninę metanolu i dichlorometanu w stosunku 1:1. Przygotować około 500 μl na próbkę; Większe kawałki tkanki mogą wymagać do 1 ml.</li>
		<li>Umieść każdą próbkę tkanki w małym szklanym pojemniku z pokrywką do delipidacji. 
		UWAGA: Masa próbki może się różnić w zależności od tkanki będącej przedmiotem zainteresowania i potrzeb eksperymentalnych. 50 mg lub mniej jest zazwyczaj wystarczające dla odpowiedniej wydajności GAG, ale użytkownik końcowy może wymagać pewnej optymalizacji. </li>
		<li>Dodać 500 μl roztworu metanolu:dichlorometanu do każdego szklanego pojemnika i wymieszać. Upewnij się, że wszystkie próbki tkanek stałych są całkowicie zanurzone w rozpuszczalniku. 
		UWAGA: Do mieszania i obchodzenia się z roztworem metanolu/dichlorometanu należy używać pipet serologicznych lub plastikowych stożkowych probówek; Inne tworzywa sztuczne mogą się rozpuścić.</li>
		<li>Umieścić próbki na wytrząsarce (w zabezpieczonym stojaku) w dygestoriach chemicznych i delikatnie mieszać przez 1 godzinę.</li>
		<li> Mieszać próbki do wymieszania i odwirować w temperaturze 17 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie odpipetować frakcję rozpuszczalnika organicznego (supernatant). Jest to frakcja lipidowa - nie zawiera GAG i można ją wyrzucić. 
		UWAGA: Staraj się nie naruszać tkanki, ponieważ małe kawałki mogą zostać utracone. Lepiej jest pozostawić część warstwy organicznej w pojemniku na próbkę, niż ryzykować utratę próbki.</li>
		<li>Pozostaw pokrywkę szklanego pojemnika otwartą i pozwól mu odparować przez noc w kapturze. Wymień probówkę na następny krok, ponieważ te rurki nie przetrwają dalszej obróbki.</li>
		<li>Po całkowitym odparowaniu mieszaniny rozpuszczalników należy przystąpić do mechanicznego rozdrobnienia (jeśli pozostała próbka wynosi >50 mg) lub roztwarzania aktynazą E (< 50 mg). </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mechaniczny rozpad tkanki stałej (opcjonalnie; dla większych próbek tkanek) 
	UWAGA: Większość mniejszych kawałków tkanki stałej (około 50 mg lub mniej) powinna całkowicie rozpuścić się na etapie trawienia. Jednak większe próbki będą wymagały mechanicznej dezintegracji.
	<ol>
		<li>Próbki do błyskawicznego zamrożenia należy umieścić w probówce polipropylenowej o odpowiedniej wielkości i umieścić zamkniętą probówkę w ciekłym azocie. Pozostawić próbkę do zamrożenia aż do całkowitego zestalenia.</li>
		<li>Za pomocą czystego moździerza i tłuczka zmiel zamrożone próbki na konsystencję przypominającą proszek.</li>
		<li>Przejdź bezpośrednio do trawienia aktynazy E (krok 1.4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odsalanie i zagęszczanie próbki 
	UWAGA: Jest to krok opcjonalny i wymagany tylko w przypadku rozcieńczonych płynnych próbek tkanek (np. płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) lub osocza).
	<ol>
		<li>Zebrać próbki cieczy w odpowiednich grupach doświadczalnych (np. przez kontrpróbę biologiczną lub grupę doświadczalną)</li>
		<li>Umieść całkowitą objętość próbki w odśrodkowej kolumnie filtracyjnej o pojemności 500 μl z punktem odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącym 3 000 Da.</li>
		<li>Wirować przez 30 minut w temperaturze 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Powtórzyć w razie potrzeby, jeśli żądana objętość próbki przekracza pojemność kolumny filtra odśrodkowego.</li>
		<li>Przemyj każdą kolumnę 3x 400 μL dejonizowanej, przefiltrowanej wody. Odrzuć przepływ.</li>
		<li>Odwróć filtr i wiruj przez 1 minutę przy 2 000 x g w świeżych, odpowiednio oznakowanych probówkach zbiorczych. Zamrozić w temperaturze -80 °C lub przejść do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie aktynazy E 
	UWAGA: Ten etap jest wymagany do strawienia i ostatecznego usunięcia zanieczyszczeń białkowych z próbki.
	<ol>
		<li>Wymieszać próbki w stosunku 1:1 z rekombinowaną aktynazą E do pożądanego stężenia 10 mg/ml. Dodać odpowiednią objętość 10-krotnego koncentratu buforowego do wytrawiania. Pożądane stężenie końcowe: 0,005 M octan wapnia i 0,01 M octan sodu, pH 7,5. Na przykład: 190 μl próbki cieczy, 190 μl 20 mg/ml aktynazy E, 20 μl 0,05 M octanu wapnia, 0,1 M octanu sodu.</li>
		<li>Próbki należy delikatnie mieszać w celu wymieszania, a następnie trawić przez 48–72 godzin w temperaturze 55 °C (do 7 dni w przypadku całej tkanki).</li>
		<li>Podgrzewać do 80 °C przez 15-20 minut, aby podgrzać dezaktywację aktynazy E. </li>
		<li>Zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C lub przejść do kroku 1.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odsalanie i zagęszczanie próbki 
	UWAGA: Jeśli przewiduje się, że w próbce biologicznej znajdzie się mała masa GAG będącego przedmiotem zainteresowania lub jeśli pożądane jest zachowanie odczynników zużywalnych (tj. odśrodkowych kolumn filtracyjnych), próbki można połączyć w celu wytworzenia pojedynczego koncentratu na grupę eksperymentalną (np. przez kontrpróbę biologiczną lub grupę eksperymentalną).
	<ol>
		<li>Umieść całkowitą objętość próbki w odśrodkowej kolumnie filtracyjnej o pojemności 500 μl o MWCO 3 000 Da.</li>
		<li>Wirować przez 30 minut w temperaturze 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Czynność tę czynność powtórzyć w razie potrzeby, jeśli żądana objętość próbki przekracza pojemność kolumny filtra odśrodkowego.</li>
		<li>Każdą kolumnę przemyć 3x 400 μl dejonizowanej, przefiltrowanej wody. Odrzuć przepływ.</li>
		<li>Odwróć filtr i wiruj przez 1 minutę przy 2 000 x g w świeżych, odpowiednio oznakowanych probówkach zbiorczych (zwykle dołączonych do kolumn filtra odśrodkowego). Zamrozić w temperaturze -80 °C lub przejść do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osuszenie
	<ol>
		<li>Albo umieścić rozpuszczone próbki z kroku 1.5.5 w rotacyjnym koncentratorze próżniowym na noc, albo liofilizować próbki, jak opisano poniżej.</li>
		<li>Próbki należy dokładnie zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C lub zanurzając je w ciekłym azocie.</li>
		<li>Przekłuć pokrywki próbek igłą 18 G i umieścić w komorze liofilizatora. Dodaj ręczniki papierowe do pakowania w razie potrzeby.</li>
		<li>Przymocuj komorę liofilizatora do liofilizatora i liofilizuj przez noc (co najmniej -40 °C, 0,135 Torr)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolumna wymiany kationów
	<ol>
		<li>Wysuszone próbki zawiesić w maksymalnie 400 μl 8 M mocznika, 2% roztworze CHAPS (lub, w przypadku łączenia próbek, ponownie zawiesić do maksimum (400/n) μl, gdzie n = liczba próbek w żądanej puli. Używaj jak najmniejszej ilości roztworu detergentu.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę kationowymienności (IEX) z 400 μl 8 M mocznika, 2% roztworu TABLET. Wirować przez 5 minut w temperaturze 2 000 x g w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Załadować 400 μl próbki/próbek zbiorczych do kolumny IEX. Wirować przez 5 minut przy 2,000 x g.</li>
		<li>Przemyć 3x 400 μL 8 M roztworu mocznika, 2% CHAPS. Wiruj przez 5 minut przy 2,000 x g za każdym razem.</li>
		<li>Elute 3x za pomocą 400 μL 0,2 M NaCl. Wiruj przez 5 minut przy 2,000 x g każdy. Jest to frakcja o niskim powinowactwie - w razie potrzeby można ją zachować do celów kontroli jakości.</li>
		<li>Elute 3x za pomocą 400 μL 2,7 M (16%) NaCl. Wiruj przez 5 minut przy 2,000 x g każdy. Ta frakcja będzie zawierała wyizolowane glikozaminoglikany będące przedmiotem zainteresowania - zachowaj ją całą!</li>
		<li>Aby odsolić każdą eluowaną frakcję, dodać metanol do 80 % obj. i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Wirować każdą próbkę przez 5 minut w temperaturze 2 000 x g. Odzyskać stałą pozostałość, ponieważ jest to wysuszony, odsolony glikozaminoglikan. 
		UWAGA: Alternatywnie pomiń ten krok i przejdź do kroku 1.8, aby odsolić eluat bez metanolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odsalanie i zagęszczanie próbki
	<ol>
		<li>W razie potrzeby połączyć eluowane frakcje (z 1.7.6) w odpowiednie grupy doświadczalne (np. przez kontrpróbę biologiczną lub grupę doświadczalną).</li>
		<li>Umieść całkowitą objętość próbki w odśrodkowej kolumnie filtracyjnej o pojemności 500 μl o MWCO 3 000 Da.</li>
		<li>Wirować przez 30 minut w temperaturze 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Czynność tę czynność powtórzyć w razie potrzeby, jeśli żądana objętość próbki przekracza pojemność kolumny filtra odśrodkowego.</li>
		<li>Każdą kolumnę przemyć 3x 400 μl dejonizowanej, przefiltrowanej wody. Odrzuć przepływ. Przejdź bezpośrednio do kroku 1.9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie chondroityny 
	UWAGA: Celem tego kroku jest usunięcie plików GAG, które nie są interesujące dla użytkownika końcowego. W tym przypadku chondroitynaza służy do usuwania chondroityny. W tkankach wykorzystywanych do generowania reprezentatywnych wyników (płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i całe płuca) trawienie siarczanu chondroityny pozostawia siarczan heparanu jako pierwotną resztkową GAG. Użytkownicy końcowi mogą być zmuszeni do dodania dodatkowych etapów trawienia w zależności od ich celów eksperymentalnych.
	<ol>
		<li>Załadować 350 μl buforu wytrawiającego (50 mM octanu amonu z 2 mM chlorku wapnia dostosowanym do pH 7,0) do odśrodkowej kolumny filtracyjnej, nie dotykając membrany.</li>
		<li>Dodać 5 μl rekombinowanej chondroitynazy ABC.</li>
		<li>Umieścić probówkę z próbkami w piecu o temperaturze 37 °C i inkubować przez 1 godzinę.</li>
		<li>Odwróć kolumnę i umieść w odpowiednio oznakowanych probówkach zbiorczych. Wirować przez 1 minutę przy 2000 x g.</li>
		<li>Podgrzewać próbki do temperatury 80 °C przez 15-20 minut w celu inaktywacji chondroitynazy ABC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odsalanie i zagęszczanie próbki
	<ol>
		<li>W razie potrzeby należy połączyć próbki trawione chondroityną z etapu 1.9.5 w odpowiednie grupy doświadczalne (np. przez kontrpróbę biologiczną lub grupę doświadczalną)</li>
		<li>Umieść całkowitą objętość próbki w odśrodkowej kolumnie filtracyjnej o pojemności 500 μl o MWCO 3 000 Da.</li>
		<li>Wirować przez 30 minut w temperaturze 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Powtórz w razie potrzeby, jeśli żądana objętość próbki przekracza pojemność kolumny filtra odśrodkowego.</li>
		<li>Każdą kolumnę przemyć 3x 400 μl dejonizowanej, przefiltrowanej wody. Odrzuć przepływ.</li>
		<li>Odwróć filtr i wiruj przez 1 minutę przy 2 000 x g w świeżych, odpowiednio oznakowanych probówkach zbiorczych. Zamrozić w temperaturze -80 °C lub przejść do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysuszenie 
	UWAGA: Na tym etapie konieczne jest wysuszenie, aby próbki można było ponownie zawiesić w jak najmniejszej ilości wody i bieżącego buforu.
	<ol>
		<li>Albo umieścić próbki wytrawione przez chondroitynę z kroku 1.10.5 bezpośrednio w rotacyjnym koncentratorze próżniowym na noc, albo liofilizować w następujący sposób:</li>
		<li>Próbki należy dokładnie zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C lub zanurzając je w ciekłym azocie.</li>
		<li>Przekłuć pokrywki próbek igłą 18 G i umieścić w komorze liofilizatora. Dodaj ręczniki papierowe do pakowania w razie potrzeby.</li>
		<li>Przymocuj komorę liofilizatora do liofilizatora i liofilizuj przez noc (co najmniej 40 °C, 0,135 Torr)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym izolowanych i oczyszczonych glikozaminoglikanów
<ol>
	<li>Przygotować wcześniej roztwory niezbędne do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) (Tabela 1). 
	UWAGA: Wybrać procentową zawartość akrylamidu w rozdzielczym roztworze żelu w zależności od wielkości glikozaminoglikanów, które mają znajdować się w próbce. 15% jest zalecane do rozpuszczania większych fragmentów (o długości większej niż 30 podjednostek disacharydowych); 22% dla mniejszych fragmentów (o długości <20 podjednostek disacharydowych).</li>
	<li>Umieść pustą kasetę w zbiorniku PAGE. Odlej żel rozdzielczy w następujący sposób: W probówce o pojemności 15 ml wymieszaj 10 ml roztworu żelu rozdzielczego, 60 μl 10% nadsiarczanu amonu (musi być świeżo przygotowany) i 10 μl TEMED (dodać TEMED na końcu). Delikatnie odwróć rurkę 2-3x. Użyj pipety, aby szybko dodać powyższe 10 ml roztworu do kasety. Nałożyć 2 ml dejonizowanej, przefiltrowanej wody i pozostawić żel rozdzielczy do polimeryzacji przez 30 min. 
	UWAGA: Poniższy protokół PAGE został zoptymalizowany dla pionowego systemu PAGE przy użyciu kaset odlewniczych o wymiarach 13,3 x 8,7 cm (szerokość x długość) o grubości 1,0 mm i łącznej objętości około 12 ml. Można stosować inne systemy kasetowe, ale mogą wymagać optymalizacji przez użytkownika końcowego.</li>
	<li>Po pełnej polimeryzacji żelu rozdzielczego należy wylać nałożoną wodę i odlać żel do układania w stos w następujący sposób: w probówce o pojemności 15 ml wymieszać 3 ml roztworu żelu do układania w stos, 90 μl 10% nadsiarczanu amonu (musi być świeżo przygotowany), 3 μl TEMED (dodać TEMED na końcu).</li>
	<li>Delikatnie odwróć rurkę 2-3x. Za pomocą pipety szybko dodaj roztwór żelu do układania w stos na zestalony żel rozdzielczy; napełnij kasetę po brzegi. Całkowicie włóż grzebień dołączony do zestawu. Pozostawić żel do polimeryzacji żelu do układania na 30 minut.</li>
	<li>Po polimeryzacji żelu upewnij się, że pasek taśmy został usunięty z dna kasety i umieść kasetę z powrotem w zespole zbiornika PAGE.</li>
	<li>Napełnij górną i dolną komorę odpowiednio buforem górnej i dolnej komory.</li>
	<li>Wysuszone próbki z kroku 1.11.4 rozpuścić w minimalnej niezbędnej objętości dejonizowanej, przefiltrowanej wody (co najwyżej 50% objętości studzienek w żelu PAGE). Wymieszać w stosunku 1:1 z buforem ładującym próbkę. Załadować próbki i "drabinki" oligosacharydowe HS (patrz tabela 1) do żelu.</li>
	<li>Uruchom żel przez 5 minut przy napięciu 100 V. Następnie uruchom żel pod napięciem 200 V przez 20-25 minut (dla żelu rozdzielczego 15% poliakryloamidu), 40-50 minut (dla żelu rozdzielczego 18% poliakryloamidu), 90-100 minut (dla żelu rozdzielczego 22% poliakryloamidu). 
	UWAGA: Może być konieczna pewna optymalizacja czasu pracy 200 V. Czerwień fenolowa migruje przed oligosacharydami heparyny, które mają długość 2 podjednostek polimeru (tj. stopień polimeryzacji 2 lub dp2); Błękit bromofenolowy migruje przed DP10-DP14. Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy napięcie jest przyłożone w taki sposób, że czerwony prążek fenolowy migruje prawie, ale nie całkiem, na dno żelu. Dostosuj odpowiednio czas pracy.</li>
</ol>
3. Protokół barwienia srebrem
<ol>
	<li>Przygotuj wcześniej wszystkie roztwory niezbędne do barwienia srebra (Tabela 2). 
	UWAGA: Nie dotykaj bezpośrednio żelu PAGE, dopóki nie zostanie on zabarwiony, rozwinięty i umieszczony w roztworze zatrzymującym. Zamiast tego manipuluj żelem za pomocą czystych plastikowych lub szklanych narzędzi. Bezpośrednie obchodzenie się z żelem spowoduje zniekształcenia odcisków palców i inne widoczne artefakty na żelu po barwieniu.  </li>
	<li>Po zakończeniu cyklu zdemontuj kasetę i ekstrahuj żel w czystym, średnio dużym pojemniku wypełnionym dejonizowaną, przefiltrowaną wodą. 
	UWAGA: Aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z żelem, użyj końcówki pipety lub innego plastikowego przedmiotu, aby delikatnie oderwać żel od kasety, gdy jest zanurzony w wodzie. Żel może być delikatny - należy obchodzić się z nim ostrożnie.
	<ol>
		<li>Wylej wodę. Zabarwić żel w roztworze barwiącym Alcian blue przez 5 min.</li>
		<li>Odrzuć niebieską plamę Alciana. Szybko spłucz/umyj 2-3x dejonizowaną, przefiltrowaną wodą, aż większość roztworu barwiącego Alcian blue zostanie usunięta.</li>
		<li>Pozostaw na noc do odbarwienia w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie na bujaku. Upewnij się, że jest wystarczająca ilość dejonizowanej, przefiltrowanej wody, aby zapewnić, że wszelkie resztki plamy zostaną całkowicie zmyte z żelu przez noc.</li>
		<li>Żel do mycia w 50% metanolu (łącznie 40 minut, zmień roztwór 2-3x).</li>
		<li>Żel myć w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie przez 30 min. Wylej wodę i powtórz jeszcze 3 razy, w sumie przez 2 godziny, za każdym razem wymieniając wodę.</li>
		<li>W świeżym, czystym pojemniku barwić żel przez 30 minut w roztworze barwiącym z azotanu srebra.</li>
		<li>Szybko spłucz/umyj 2-3x w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie, aby całkowicie usunąć roztwór do barwienia srebra.</li>
		<li>Myć przez 30 min w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie. Wylej wodę i powtarzaj 2x przez łącznie 90 minut, za każdym razem wymieniając łaźnię wodną.</li>
		<li>Wylej wodę i dodaj roztwór rozwijający.</li>
		<li>Po dodaniu roztworu do wywoływania należy uważnie obserwować żel i obserwować pojawienie się pasków. W zależności od jakości plamy i masy załadowanej próbki, wywołanie może trwać od kilku sekund do kilku minut.</li>
		<li>Gdy tylko pożądane pasma staną się widoczne, natychmiast wyrzuć rozwijający się roztwór i krótko przemyj roztworem zatrzymującym.</li>
		<li>Wyrzuć roztwór zatrzymujący, umyj go i zastąp świeżym roztworem zatrzymującym. Pozostawić do namoczenia na 1 godzinę na bujaku lub shakerze.</li>
		<li>Myć przez noc w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie (jednak żel można zobrazować natychmiast po przemyciu roztworem).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS%3A+A+critical+role+for+heparan+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membrane%22%5BJournal%5D)">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li>
<li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+the+developing%2C+healthy%2C+and+injured+lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li>
<li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li>
<li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li>
<li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratry+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li>
<li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li>
<li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li>
<li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li>
<li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li>
<li>Møller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li>
<li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels%3A+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li>
<li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels%3A+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li>
<li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+prostaglandin+E1+%28TLC+C-53%29+in+acute+respiratory+distress+syndrome%3A+a+controlled%2C+randomized%2C+double-blind%2C+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li>
<li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li>
<li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li>
<li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025(2021).</li>
<li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

GAG odgrywają kluczową rolę w wielu różnych procesach biologicznych. Jedną z głównych funkcji siarczanowych GAG (takich jak HS i CS) jest oddziaływanie i wiązanie się z ligandami, które mogą zmieniać dalsze funkcje sygnalizacyjne. Ważnym wyznacznikiem powinowactwa wiązania GAG do ligandów pokrewnych jest długość łańcucha polimerowego GAG 8,9,14. Z tego powodu ważne jest, aby naukowcy byli w stanie określić z rozsądną precyzją ro...

Glikozaminoglikany (GAG) to różnorodna rodzina liniowych polisacharydów, które są wszechobecnym pierwiastkiem w organizmach żywych i przyczyniają się do wielu podstawowych procesów fizjologicznych1. GAG, takie jak siarczan heparanu (HS) i siarczan chondroityny (CS), mogą być siarczanowane w różnych miejscach wzdłuż łańcucha polisacharydowego, nadając geograficzne domeny ładunku ujemnego. Te GAG, po przywiązaniu do białek powierzchniowych komórek znanych jako proteoglikany, rzutują do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i wiążą się z pokrewnymi ligandami, umożliwiając regulację procesów sygnalizacji zarówno cis- (ligand przyłączony do tej samej komórki), jak i trans- (ligand przyłączony do sąsiedniej komórki)2. Ponadto GAG pełnią również kluczowe role jako elementy strukturalne w tkankach, takich jak błona podstawna kłębuszków nerkowych3, glycocalyx4 i glikokalix5, oraz w tkankach łącznych, takich jak chrząstka6.
Długość łańcuchów polisacharydowych GAG różni się znacznie w zależności od ich kontekstu biologicznego i może być dynamicznie wydłużana, rozszczepiana i modyfikowana przez wysoce złożony enzymatyczny system regulacyjny7. Co ważne, długość łańcuchów polimerowych GAG w znacznym stopniu przyczynia się do ich powinowactwa do ligandów, a co za tym idzie, do ich funkcji biologicznej8,9. Z tego powodu określenie funkcji endogennego GAG wymaga docenienia jego wielkości. Niestety, w przeciwieństwie do białek i kwasów nukleinowych, istnieje bardzo niewiele łatwo dostępnych technik wykrywania i pomiaru GAG, co historycznie skutkowało stosunkowo ograniczonymi badaniami nad biologicznymi rolami tej różnorodnej rodziny polisacharydów.
Ten artykuł opisuje, jak izolować i oczyszczać GAG z większości tkanek biologicznych, a także opisuje, jak używać elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) do oceny długości izolowanych polimerów z odpowiednim stopniem specyficzności. W przeciwieństwie do innych, wysoce złożonych (i często opartych na spektrometrii mas) podejść glikomicznych, metoda ta może być stosowana przy użyciu standardowego sprzętu i technik laboratoryjnych. To praktyczne podejście może zatem poszerzyć zdolność badaczy do określania biologicznej roli natywnych GAG i ich interakcji z kontekstowo ważnymi ligandami.

<table><tbody><tr><td>Mikrowirówka stołowa Accuspin Micro17</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td>Każda kombinacja mikrowirówki/wirnika stołowego o wydajności 14000 xG jest odpowiednia</td></tr><tr><td>Akrylamid (stały)</td> <td>thermoFisher Scientific</td><td>BP170-100</td><td>Klasa elektroforezy</td></tr><tr><td>Actinase E</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5147</td><td>Mieszanina proteaz z S. griseus</td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX (ciało stałe)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>AC400460100</td><td></td></tr><tr><td>octan amonu (stały)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A639-500</td><td>klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu (płynny)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>certyfikowany ACS</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (stały)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>klasa elektroforezy</td></tr><tr><td>Barnstead GenPure Pro Water System oczyszczania</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10-451-217PKG</td><td>Każdy system dejonizacji/oczyszczania wody jest dopuszczalnym substytutem</td></tr><tr><td>Kwas borowy (stały)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Błękit bromfenolowy (stały)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Octan wapnia (stały)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18-609-432</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (stały)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC349610250</td> Detergent CHAPS <td>klasy do biologii molekularnej</td></tr><tr><td>(3-((3-cholamidopropylo)dimetyloamonio)-1-propanosulfonian)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28299</td><td></td></tr><tr><td>Chondroitynaza ABC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3667</td><td></td></tr><tr><td>Kryterium pusta kaseta do PAGE (grubość 1,0 mm, 12 + 2 dołki)</td><td>Bio-Rad</td><td>3459901</td><td>Wystarczy dowolny system kaset odlewniczych PAGE o grubości 1,0 mm</td></tr><tr><td>System Criterion PAGE Cell (ogniwo i zasilacz)</td><td>Bio-Rad</td><td>1656019</td><td>każdy porównywalny pionowy żelowy system PAGE będzie działał)</td></tr><tr><td>Dichlorometan (ciecz)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>AC610931000</td><td>certyfikowana przez ACS</td></tr><tr><td>EDTA sól disodowa (stała)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td>Molekularny klasa biologiczna</td></tr><tr><td>Lodowcowy kwas octowy (płynny)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A35-500</td><td>Certyfikowany ACS</td></tr><tr><td>Glicyna (stała)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>G48-500</td><td>Klasa elektroforezy</td></tr><tr><td>Heparanaza I/III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3917</td><td>Z Flavobacterium heparinum</td></tr><tr><td>Decasacharyd pochodzący z heparyny (dp10)</td><td>galen scientific</td><td>HO10</td><td></td></tr><tr><td>Heksazacharda pochodząca z heparyny (dp6)</td><td>Galen scientific</td><td>HO06</td><td></td></tr><tr><td>Oligosacharydy pochodzące z heparyny (dp20)</td><td>galen scientific</td><td>HO20</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (płynny)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A466-250</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Labconco</td><td>7752020</td><td>Każdy liofilizator, który może osiągnąć -40C i 0,135 Torr, będzie działał; można go również zastąpić rotacyjnym koncentratorem próżni</td></tr><tr><td>Metanol (płynny)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A412-500</td><td>Certyfikowany żel do</td></tr><tr><td>obrazowania molekularnego ACS Doc XR System</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8170</td><td>Każdy porównywalny system obrazowania żeli jest dopuszczalnym substytutem</td></tr><tr><td>N,N'-metyleno-bis-akryloamid (stały)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP171-25</td><td>Klasa do elektroforezy</td></tr><tr><td>Czerwony fenolowy (stały)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>P74-10</td><td>Wolny kwas</td></tr><tr><td>Q Mini H Kolumna jonowymienna</td><td>Vivapure</td><td>VS-IX01QH24</td><td>Kolumna jonowymienna musi mieć minimalną objętość ładunku 0,4 ml, pH robocze 2-12 i selektywność dla grup jonowych o pKa</td></tr><tr><td>11 Azotan srebra (stały)octan sodu (stały)</td> z <td>certyfikatem</td> <td>ACS ThermoFisher Scientific</td><td>S181-25</td></tr> (<tr><td>stały)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S210-500</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (stały)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (stały)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S392-212</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza (stała)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>TEMED (N,N,N',N'-tetrametylenodiamina)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>Klasa elektroforezy</td></tr><tr><td>Podstawa Tris (stała)</td> <td>thermoFisher Scientific</td><td>BP152-500</td> Ultra filtry odśrodkowe <td>klasy biologii molekularnej</td></tr><tr><td>, 0,5 mL, odcięcie masy cząsteczkowej 3000 Da</td><td>Amicon</td><td>UFC500324</td><td>Można stosować jednostki filtrujące o większej objętości, w zależności od wielkości próbki.</td></tr><tr><td>Mocznik (stały)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>Każdy rotacyjny koncentrator próżni będzie działał; można go zastąpić liofilizatorem</td></tr><tr><td>Filtr próżniowy, jednorazowego użytku, 0,22uM porów PES, objętość 500 ml</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>569-0020</td><td>Dopuszczalne alternatywne objętości i materiały filtracyjne</td></tr></tbody></table>

wykrywanie glikozaminoglikanów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i barwienia srebrem

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Siarczanowane glikozaminoglikany (GAG), takie jak siarczan heparanu (HS) i siarczan chondroityny (CS), są wszechobecne w organizmach żywych i odgrywają kluczową rolę w wielu podstawowych strukturach i procesach biologicznych. Jako polimery, GAG występują jako mieszanina polidyspersyjna zawierająca łańcuchy polisacharydowe, które mogą wahać się od 4000 Da do ponad 40 000 Da. W tych łańcuchach istnieją domeny zasiarczenia, nadające wzór ładunku ujemnego, który ułatwia interakcję z dodatnio naładowanymi resztami pokrewnych ligandów białkowych. Siarczanowane domeny GAG muszą mieć wystarczającą długość, aby umożliwić te oddziaływania elektrostatyczne. Aby zrozumieć funkcję GAG w tkankach biologicznych, badacz musi być w stanie wyizolować, oczyścić i zmierzyć rozmiar GAG. Niniejszy raport opisuje praktyczną i wszechstronną technikę opartą na elektroforezie w żelu poliakrylamidowym, którą można wykorzystać do rozwiązania stosunkowo niewielkich różnic w wielkości między GAG wyizolowanymi z różnych typów tkanek biologicznych.

Błękit alcianowy jest wykorzystywany do barwienia siarczanowanych GAG-ów 10; sygnał ten jest wzmacniany poprzez zastosowanie następującego po nim barwienia srebrem 11. Rysunek 1 przedstawia wizualną demonstrację procesu wywoływania barwienia srebrem. Jak pokazano, sygnał błękitu alcianowego reprezentujący GAG-i rozdzielone za pomocą elektroforezy ulega wzmocnieniu w miarę przenikania czynnika wywołującego do żelu poliakrylamidowego. Zazwyczaj p...

Ten raport opisuje techniki izolacji i oczyszczania siarczanowych glikozaminoglikanów (GAG) z próbek biologicznych oraz metodę elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w celu przybliżenia ich wielkości. GAG przyczyniają się do budowy tkanek i wpływają na procesy sygnalizacyjne poprzez oddziaływanie elektrostatyczne z białkami. Długość polimeru GAG przyczynia się do ich powinowactwa do pokrewnych ligandów.

Wykrywanie glikozaminoglikanów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i barwienia srebrem

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Protokół ten opisuje prostą technikę, którą można wykorzystać do wykrycia obecności i zmierzenia długości glikozaminoglikanów, które są cząsteczkami o coraz bardziej uznanym znaczeniu dla wielu procesów biologicznych. Technikę tę można łatwo zaadaptować w większości laboratoriów zajmujących się naukami przyrodniczymi. Porównywalne techniki glikomiczne często wymagają sprzętu i wiedzy specjalistycznej, które można znaleźć tylko w laboratoriach badawczych glikochemicznych.Technika ta może być szczególnie przydatna dla badaczy, którzy są zainteresowani badaniem glikokaliksu, powłoki polisacharydowej, która wyściela śródbłonkowe i nabłonkowe powierzchnie ludzkiego ciała. Zacznij od umieszczenia pustej kasety w zbiorniku PAGE. Odlać żel rozdzielczy, mieszając 10 mililitrów roztworu żelu rozdzielczego z 60 mikrolitrami świeżo przygotowanego w 10% nadsiarczanu amonu w 15-mililitrowej probówce.Następnie dodaj 10 mikrolitrów TEMED. Delikatnie odwróć rurkę dwa do trzech razy. Szybko dodaj 10 mililitrów aktywowanego roztworu żelu poliakrylamidowego do kasety za pomocą pipety.Nałożyć na dwa mililitry dejonizowanej przefiltrowanej wody i pozostawić rozdzielczy żel do polimeryzacji przez 30 minut. Po pełnej polimeryzacji żelu rozdzielczego wylej nałożoną wodę. Odlać żel do układania, mieszając trzy mililitry roztworu żelu do układania w stos z 90 mikrolitrami świeżo przygotowanego 10% nadsiarczanu amonu w 15-mililitrowej probówce.Następnie dodaj trzy mikrolitry TEMED i delikatnie odwróć probówkę dwa do trzech razy. Za pomocą pipety szybko dodaj roztwór żelu do układania w stos na zestalony żel rozdzielczy, aż kaseta zostanie wypełniona po brzegi. Całkowicie włóż grzebień dołączony do pustej kasety z żelem poliakrylamidowym i pozwól żelowi do polimeryzacji przez 30 minut.Po polimeryzacji żelu usuń pasek taśmy z dna kasety i umieść kasetę z powrotem w zespole zbiornika PAGE. Napełnij górną i dolną komorę odpowiednimi roztworami buforowymi. Rozpuścić wysuszone próbki glikozaminoglikanu w minimalnej niezbędnej objętości dejonizowanej przefiltrowanej wody i wymieszać z buforem ładującym próbkę w stosunku jeden do jednego.Załadować próbki i drabinki oligosacharydowe HS do żelu. Uruchom żel przez pięć minut przy napięciu 100 woltów, a następnie uruchom go przy napięciu 200 woltów przez 20 do 100 minut, w zależności od procentowej zawartości akrylamidu w roztworze żelu rozdzielczego. Po zakończeniu biegu zdemontuj kasetę i ostrożnie wyekstrahuj żel do dużego czystego pojemnika wypełnionego dejonizowaną, przefiltrowaną wodą.Następnie wylej wodę i zabarwij żel w roztworze barwiącym Alcian blue przez pięć minut. Wyrzuć niebieską plamę Alcian i szybko umyj dwa do trzech razy dejonizowaną, przefiltrowaną wodą, aż większość roztworu do barwienia alcian blue zostanie usunięta. Zabarwić żel w roztworze barwiącym azotanu srebra w świeżym, czystym pojemniku przez 30 minut.Następnie umyj dwa do trzech razy przez 30 minut w dejonizowanej przefiltrowanej wodzie, aby całkowicie usunąć roztwór do barwienia srebra. Wylej wodę i dodaj rozwijający się roztwór. Uważnie obserwuj żel pod kątem wyglądu pasm.W zależności od jakości plamy i masy załadowanej próbki, wywołanie może trwać od kilku sekund do kilku minut. Gdy tylko pojawią się pożądane prążki, natychmiast wyrzuć rozwijający się roztwór i krótko przemyj żel roztworem STOP. Wyizolowane i oczyszczone glikozaminoglikany uwidoczniono przy użyciu techniki barwienia niebiesko-srebrem Alcian po rozdzielczości zależnej od gęstości za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.Jak widać na tym rysunku, oligosacharydy siarczanu heparanu o różnej długości polimeru były łatwo wykrywalne przy użyciu podejścia opartego na PAGE. Granica wykrywalności tej metody, wynosząca zaledwie 0,5 mikrograma, pokazuje, że technika ta jest bardzo czuła w wykrywaniu glikozaminoglikanów wyizolowanych i oczyszczonych z próbek biologicznych. Spośród czterech różnych oligosacharydów siarczanu heparyny uwidocznionych za pomocą tej metody, heparyna niefrakcjonowana była najmniej wykrywalna.Ze względu na polidyspersyjność heparyny niefrakcjonowanej, gęstość każdego pojedynczego prążka z tej próbki jest mniejsza niż prążków wytworzonych przez równą masę oczyszczonych oligosacharydów heparyny. Skuteczność oczyszczania glikozaminoglikanu z ciekłych próbek biologicznych oceniano na podstawie próbek popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych pobranych od myszy, które pierwotnie zawierały stosunkowo niskie stężenia glikozaminoglikanów. Dodatkowo skuteczność tej techniki wykazano przy użyciu siarczanu heparyny wyizolowanego z całego homogenatu płuc, w wyniku czego uzyskano dużą ilość wyizolowanego siarczanu heparyny, przy czym najmniejsze fragmenty odpowiadały masowo około 10 podjednostkom disacharydu.Bardzo ważne jest, aby używać świeżo przygotowanych odczynników i filtrować każdy odczynnik używany w tym protokole. Bardzo ważne jest, aby używać odczynników o najwyższej czystości i jakości, aby skutecznie wykonać tę technikę.

detection-glycosaminoglycans-polyacrylamide-gel-electrophoresis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Użycie specyficznych glikozydaz do usuwania cukrów z glikoprotein, a następnie przeprowadzenie elektroforezy SDS-PAGE, jest cenną metodą wykrywania modyfikacji glikanowych w próbkach białek i stanowi dobry wybór do wstępnych badań z zakresu glikobiologii. Zmiany występujące po deglikozylacji można wykryć jako przesunięcia w mobilności w żelu lub poprzez barwienie odczynnikami wrażliwymi na glikany.

Identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz

W tym filmie demonstrujemy metodę barwienia srebrem żeli poliakrylamidowych do wizualizacji całkowitego białka za pomocą sond fluorogenicznych.

Barwienie srebrem fluorescencyjnym: technika wizualizacji białka całkowitego w żelach poliakrylamidowych

W tym filmie demonstrujemy procedurę łączonego barwienia alcian niebieskim i srebrnym siarczanowych glikozaminoglikanu oligosacharydów. Ta połączona technika barwienia znacznie wzmacnia pasma polimerów glikozaminoglikanu o różnej długości w żelach poliakrylamidowych.

Barwienie srebrem siarczanowanych glikozaminoglikanów: metoda barwienia do wizualizacji siarczanowych glikozaminoglikanów w żelach poliakryloamidowych

Ten film demonstruje procedurę separacji siarczanów heparanu wyizolowanych z tkanki płucnej myszy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika analityczna do wykrywania siarczanów heparanu o różnej długości łańcucha wyizolowanych z tkanki płucnej myszy

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

Aby kompleksowo zbadać różnorodność glikanów sprzężonych z O, nowa procedura redukcyjnej eliminacji β w żelu, połączona z permetylacją i metodą szybkiego podziału fazy, jest stosowana do analizy glikanów sprzężonych z O, bezpośrednio uwalnianych z glikoprotein rozdzielonych przez SDS-PAGE i podatnych na późniejszą analizę glikomiczną za pomocą spektrometrii mas.

Ulepszona redukcyjna eliminacja β w żelu dla kompleksowych O-sprzężonych i sulfoglikomów za pomocą spektrometrii mas

Ten artykuł opisuje metodologię przygotowania próbek tkanek sercowo-naczyniowych do analizy MS, która pozwala na (1) analizę składu białka ECM, (2) identyfikację miejsc glikozylacji oraz (3) charakterystykę składu form glikanów. Metodologia ta może być zastosowana, z niewielkimi modyfikacjami, do badania ECM w innych tkankach.

Glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas

Kwas sjalowy to typowa jednostka monosacharydowa występująca w glikokoniugatach. Bierze udział w wielu interakcjach molekularnych i komórkowych. W artykule przedstawiono metodę modyfikacji ekspresji kwasu sjalowego na powierzchni komórki za pomocą glikoinżynierii metabolicznej z pochodnymi N-acetylmannosaminy.

Glikoinżynieria metaboliczna kwasu sjalowego z wykorzystaniem mannozaminy modyfikowanych N-acylem

Tutaj przedstawiamy prosty i tani protokół barwienia srebrem, który wymaga tylko trzech odczynników i 7 minut przetwarzania, i jest odpowiedni do szybkiego generowania wysokiej jakości danych SSR w analizie genetycznej.

Szybki protokół barwienia srebrem umożliwiający proste i skuteczne wykrywanie markerów SSR przy użyciu niedenaturującego żelu poliakrylamidowego

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół opisujący nową technikę barwienia fluorescencyjnego do całkowitego wykrywania białek w żelach poliakrylamidowych. Protokół wykorzystuje specyficzną dla jonów srebra sondę fluorescencyjną, która wykrywa kompleksy białkowe Ag + i eliminuje pewne ograniczenia tradycyjnych chromogennych barwników srebra.

Fluorescencyjne barwienie srebrem białek w żelach poliakryloamidowych

Immunoglobulina G (IgG) N-glikan jest scharakteryzowany za pomocą hydrofilowej chromatografii oddziaływań UPLC. Ponadto struktura N-glikanu IgG jest wyraźnie oddzielona. Przedstawiono tutaj wprowadzenie do tej metody eksperymentalnej, tak aby mogła być szeroko stosowana w warunkach badawczych.

Analiza N-glikanu immunoglobuliny G metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej

Poznaj metodę elektroforezy w żelu poliakrylamidowym do wykrywania i analizy glikozaminoglikanów z próbek biologicznych. Technika ta jest czuła i dostępna dla większości laboratoriów.

Wykrywanie glikozaminoglikanów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i barwienia srebrem

Przeglądaj więcej filmów