Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej
17 lutego 2022
Ten protokół opisuje metodologię nieinwazyjnego śledzenia limfocytów T genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych in vivo za pomocą klinicznie dostępnej platformy.
Do tej pory nie ma klinicznie potwierdzonej platformy obrazowania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym. Syporter jodku sodu stanowi czuły i klinicznie istotny reporter do obrazowania limfocytów T CAR za pomocą skanu PET. Obrazowanie TLP PET limfocytów T NIS CAR umożliwia badaczom nieinwazyjne śledzenie komórek infuzji in vivo i ma potencjał do przewidywania skuteczności i toksyczności terapii limfocytami T CAR.
Skuteczne obrazowanie limfocytów T CAR umożliwia ocenę transportu i ekspansji limfocytów T oraz umożliwia opracowanie strategii przezwyciężenia ograniczeń. Metoda opisana w tym protokole jest prosta i może być zastosowana do innych konstruktów CAR poza tymi przedstawionymi w tym badaniu. Rozpocznij od wyizolowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub PBMC z próbki krwi przy użyciu techniki standardowego gradientu gęstości.
Aby to zrobić, delikatnie dodaj 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości do 50-mililitrowej rurki do separacji gradientu gęstości, unikając tworzenia się pęcherzyków. Aby uniknąć uwięzienia komórek, rozcieńczyć próbkę krwi PBS zawierającym 2% FBS w stosunku objętościowym jeden do jednego i delikatnie przenieść rozcieńczoną krew na podłoże o gradiencie gęstości, nie przerywając granicy między nimi. Następnie odwirować probówkę separacyjną o stężeniu 1 200 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Zebrać supernatant do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, przemyć komórki PBS zawierającym 2% FBS, napełniając probówkę do 50 mililitrów i odwirowując probówkę przy 300 razy G przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant przed ponownym zawieszeniem granulowanych komórek w 50 mililitrach PBS zawierających 2% FBS. Zawiesić granulowane PBMC w PBS zawierającym 2% FBS do stężenia 50 razy 10 do szóstych komórek na mililitr.
Powtórz pranie w świeżej 50-mililitrowej tubce. Policz liczbę komórek, a następnie odwiruj zawiesinę komórek w temperaturze 300 razy G przez osiem minut w temperaturze pokojowej. W celu izolacji komórek T przenieś izolowane PBMC do 14-mililitrowej probówki z okrągłym dnem z polistyrenu.
Następnie użyj zestawu kulek magnetycznych do selekcji negatywnej, aby przeprowadzić izolację limfocytów T, umieszczając PBMC w koktajlu przeciwciał selekcji negatywnej w pełni zautomatyzowanym separatorze komórek. Po izolacji limfocytów T policz komórki i posadź komórki w pożywce do ekspansji komórek T lub TCM w stężeniu dwa razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Następnie wymieszać fiolkę zawierającą kulki anty-CD3/CD28 poprzez zawirowanie i odpipetować wymaganą objętość kulek do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki.
Do mycia ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze TCM przed umieszczeniem rurki na magnesie na jedną minutę i odessać supernatant. Po wyjęciu rurki z magnesu należy ponownie zawiesić umyte kulki w jednym mililitrze TCM i powtórzyć pranie dwukrotnie. Ponownie zawiesić umyte kulki w jednym mililitrze TCM, aby przenieść je do hodowli limfocytów T, a następnie rozcieńczyć zawiesinę kulek komórek T za pomocą TCM do stężenia 1,0 razy 10 do szóstych komórek na mililitr przed przeniesieniem jej na sześciodołkową płytkę poddaną hodowli tkankowej.
Inkubuj płytkę studzienki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby przejść do transdukcji lentiwirusów, należy rozmrozić zamrożone lentiwirusy w powlekaniu chimerycznych receptorów antygenowych lub symportera jodku sodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po 24 do 48 godzinach stymulacji limfocytów T wymieszaj limfocyty T, aby rozbić klastry i dodaj świeżo rozmrożonego lentiwirusa do komórek przy wielokrotności infekcji wynoszącej pięć.
Inkubuj transdukowane limfocyty T w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. W trzecim, czwartym i piątym dniu inkubacji policz transdukowane limfocyty T i dostosuj stężenie komórek do 1,0 razy 10 do szóstych komórek na mililitr, dodając świeży, wstępnie podgrzany TCM. W przypadku limfocytów T transdukowanych przez NIS zawierających gen oporności na puromycynę, należy potraktować komórki jednym mikrogramem na mililitr dichlorowodorku puromycyny w trzecim, czwartym i piątym dniu.
Szóstego dnia rozbij klastry limfocytów T i usuń kulki anty-CD3 / CD28 z transdukowanych komórek T, umieszczając płytkę na magnesie na jedną minutę. Następnie umieść zebrane komórki z powrotem w kulturze w stężeniu 1,0 razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Przemyć podwielokrotność hodowli limfocytów T zawierającą 50 000 komórek buforem przepływowym i ponownie zawiesić komórki za pomocą 50 mikrolitrów buforu przepływowego.
Aby wykryć ekspresję CAR, wybarwić limfocyty T jednym mikrolitrem koziego przeciwciała anty-mysiego. Aby wykluczyć martwe komórki, dodaj 0,3 mikrolitra LIVE/DEAD Aqua. Inkubuj wybarwione komórki w ciemności w temperaturze pokojowej.
Po 15 minutach przemyć komórki 150 mikrolitrami buforu przepływowego o stężeniu 650 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby utrwalić i przepuszczalność wybarwionych komórek, inkubuj komórki ze 100 mikrolitrami pożywki utrwalającej przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dwukrotnie przemyć komórki 100 mikrolitrami buforu zawierającego środek przepuszczający komórki, taki jak saponina i wirówka.
Po umyciu ponownie zawiesić przepuszczalne komórki w 50 mikrolitrach buforu przepuszczalnego. Następnie dodaj 0,3 nanograma przeciwciała anty-ludzkiego ETNL NIS i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po godzinie inkubacji umyć komórki, dodając 150 mikrolitrów buforu przepływowego i odwirować, jak pokazano.
Następnie inkubować komórki z 50 mikrolitrami buforu przepływowego zawierającego 2,5 mikrolitra wtórnego przeciwciała anty-królika przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po umyciu limfocytów T, jak pokazano, ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach bufora przepływowego w celu przeprowadzenia cytometrii przepływowej. Następnie określ wydajność transdukcji komórek.
Ósmego dnia policz i odwiruj limfocyty T w temperaturze 300 razy G przez osiem minut w czterech stopniach Celsjusza, a następnie ponownie zawiesij osad komórkowy za pomocą pożywki zamrażającej o stężeniu 10 razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Przenieść jeden mililitr zawiesiny komórek do każdej oznakowanej fiolki kriogenicznej, aby przechowywać w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po 48 godzinach przenieś limfocyty T do ciekłego azotu.
Przygotuj myszy, którym wstrzyknięto limfocyty T BCM CAR z dodatnim wynikiem NIS, do obrazowania PET/CT, ważąc myszy i usuwając metalowe kolczyki. Następnie wstrzyknąć myszowi dożylnie 9,25 megabekerela świeżo przygotowanego tetrafluoroboranu F18 poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Po 45 minutach okresu absorpcji przystąp do akwizycji statycznych obrazów PET znieczulonej myszy przez 15 minut, a następnie akwizycji obrazu CT przez pięć minut z obrotem o 360 stopni i projekcjami 180.
W tej reprezentatywnej analizie kotransdukcja dwóch wirusów do limfocytów T wygenerowała dodatnie limfocyty T BCM CAR NAS, gdzie ponad 90% komórek było dodatnich w NIS. Analiza kinetyki wzrostu limfocytów T od zera do ośmiu dni wykazała, że włączenie BCMA CAR i NIS nie wpłynęło znacząco na ekspansję komórek T w porównaniu z komórkami nietransdukowanymi. W analizie cytometrii przepływowej OPM-2 komórki transdukowane lentiwirusem reprezentowały ekspresję GFP po leczeniu puromycyną.
Myszy otrzymujące BCMA dodatnie komórki OPM-2 lucyferazy zostały poddane obrazowaniu bioluminescencyjnemu w celu potwierdzenia wszczepienia komórek OPM-2. Obrazowanie PET myszy z tetrafluoroboranem F18 wykazało rozmieszczenie komórek T BCMA CAR NIS w różnych narządach i szpiku kostnym. Dodatkowo, komórki szpiku kostnego pobrane od myszy wykazywały wszczepienie komórek OPM-2 i dostarczenie NIS dodatnich komórek T BCMA CAR T do szpiku kostnego.
Aby uzyskać wysokiej jakości obrazowanie wlewów limfocytów T CAR, ważne jest, aby postępować zgodnie z krokami protokołu generowania limfocytów T NIS CAR i potwierdzić obecność podwójnych frakcji dodatnich NIS i CAR.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodologię śledzenia nieinwazyjnego komórek T genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych in vivo, z wykorzystaniem klinicznie dostępnej platformy. Symporter sodowo-jodkowy służy jako czuły wskaźnik do obrazowania komórek CAR T za pomocą skanu PET.
Kluczowe Elementy Badania
Obszar Nauki
- Immunologia
- Terapia komórkowa
- Obrazowanie medyczne
Tło
- Obecne platformy obrazowania dla komórek CAR T nie są klinicznie zweryfikowane.
- Symporter sodowo-jodkowy jest odpowiednim wskaźnikiem do obrazowania PET.
- Nieinwazyjne śledzenie podawanych komórek może przewidywać skuteczność i toksyczność terapii.
- Wydajne obrazowanie pomaga w ocenie migracji i ekspansji komórek T.
Cel Badania
- Dostarczenie protokołu śledzenia komórek CAR T in vivo.
- Wykorzystanie obrazowania PET do monitorowania zachowania komórek T po podaniu.
- Opracowanie strategii mających na celu poprawę wyników terapii CAR T.
Wykorzystane Metody
- Izolacja komórek mononuklearnych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą standardowej techniki gradientu gęstości.
- Zastosowanie symporteru sodowo-jodkowego do obrazowania.
- Wykorzystanie skanów PET do nieinwazyjnego śledzenia.
- Ocena ekspansji i migracji komórek T.
Główne Wyniki
- Wykażano wykonalność nieinwazyjnego śledzenia komórek CAR T.
- Uwidoczniono potencjał przewidywania skuteczności i toksyczności terapii CAR T.
- Podkreślono zastosowalność metody do różnych konstrukcji CAR.
- Dostarczono wgląd w zachowanie komórek T in vivo.
Wnioski
- Protokół umożliwia efektywny monitoring komórek CAR T.
- Może on zwiększyć zrozumienie dynamiki komórek T w terapii.
- Przyszłe zastosowania mogą poprawić strategie leczenia CAR T.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Non-invasive, quantitative imaging of CAR T cell trafficking and persistence addresses a critical bottleneck in cell therapy development by enabling real-time assessment of in vivo behavior. The integration of NIS-based PET/CT imaging provides actionable insights into cell distribution, expansion, and engraftment, supporting predictive confidence at key discovery and translational inflection points. This capability enhances risk-adjusted decision-making and portfolio prioritization for next-generation immunotherapies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of CAR T cell trafficking and tumor infiltration in preclinical models.
- Supports functional validation of engineered constructs by confirming in vivo persistence and expansion.
- Facilitates mechanistic de-risking by correlating cell localization with therapeutic outcomes.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized imaging readout for evaluating CAR T cell constructs across multiple targets.
- Enables reproducible quantification of cell distribution and expansion for comparative screening.
- Supports assay development for cell tracking and biodistribution studies in translational workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical imaging outputs with translational biomarker strategies for cell therapy programs.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking cell fate in vivo.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by providing early indicators of efficacy and toxicity potential.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging methodology bridges early discovery, lead optimization, and preclinical validation by enabling non-invasive, quantitative tracking of engineered cell therapies in vivo.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on trafficking, persistence, and tumor targeting of CAR T cells.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs for construct comparison and optimization.
- Analytics: Provides PET/CT-based measurements of cell localization and expansion to inform data-driven decisions.
- Translational Research: Connects preclinical imaging data to clinical biomarker strategies for cell therapy programs.
- Enterprise Reuse: Offers a modular imaging platform adaptable to diverse CAR constructs and target genes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell therapy efficacy and safety by enabling real-time in vivo tracking.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows for reproducibility and scalability across programs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by providing early, actionable readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cell therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic engineering, cell culture, and PET/CT imaging technologies.
- Demands access to radiochemistry infrastructure for [18F]TFB production and imaging facilities.
- Necessitates standardized protocols for cell engineering and imaging to ensure reproducibility.
- Adaptable to various CAR constructs and target genes with protocol modifications as needed.
- Dependent on preclinical model suitability and imaging sensitivity for specific research questions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:02
Ex Vivo T Cell Isolation from Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs)
2:47
T Cell Stimulation and T Cell Expansion
3:54
Transduction of Lentiviruses on Stimulated T Cells
5:10
Surface Staining of B Cell Maturation Antigen (BCMA)-CAR Using Goat Anti-Mouse IgG (H+L) and Intracellular Staining of NIS Using Anti-Human ETNL NIS
7:18
NIS+BCMA-CAR T Cell In Vivo Imaging Using BCMA+OPM-2 Xenograft Mouse Model
7:57
Results: T Cell Growth Kinetics and In Vivo Cell Trafficking Assay
9:08
Conclusion
![Zautomatyzowana synteza radiochemiczna [18F]3F4AP: nowy znacznik PET do obrazowania chorób demielinizacyjnych](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F55537.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.884Z&w=384&q=75)
![Automatyczne przygotowanie [68Ga]GA-3BP-3940 na module syntezy do obrazowania PET mikrośrodowiska guza](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F68356.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A55%253A13.427Z&w=384&q=75)