Name: Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej 18F tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj protokół inżynierii limfocytów T CAR z symporterem jodku sodu do obrazowania PET w immunoterapii nowotworów krwi. Metoda umożliwia nieinwazyjne śledzenie komórek in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Mayo Clinic K2R pipeline (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) oraz Predolin Foundation (RS). Rysunki 1, 2 i 4 zostały stworzone za pomocą BioRender.com.

SSK jest wynalazcą patentowym w immunoterapii CAR licencjonowanym przez Novartis (na mocy umowy między Mayo Clinic, University of Pennsylvania i Novartis) i Mettaforge (poprzez Mayo Clinic). RS, MJC i SSK są wynalazcami patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Humanigen. SSK otrzymuje fundusze na badania od Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs i Lentigen. Figury zostały stworzone za pomocą BioRender.com.

W artykule opisano metodologię włączania NIS do limfocytów CAR T i obrazowania infuzji komórek CAR T in vivo za pomocą [18F]tfb-PET. Jako dowód słuszności koncepcji, limfocyty T NIS+BCMA-CAR zostały wygenerowane za pomocą podwójnej transdukcji. Niedawno informowaliśmy, że włączenie NIS do limfocytów CAR T nie upośledza funkcji komórek CAR T i skuteczności in vivo , a umożliwia transport i ekspansję komórek CAR T30. Ponieważ terapie komórkami CAR T nadal rozs...

Terapia komórkowa chimerycznym receptorem antygenowym T (CAR T) jest szybko rozwijającym się i potencjalnie leczniczym podejściem w nowotworach hematologicznych1,2,3,4,5,6. Nadzwyczajne wyniki kliniczne odnotowano po terapii limfocytami CAR T (CART19) skierowanym na CD19 lub antygenem dojrzewania komórek B (BCMA) CAR T2. Doprowadziło to do zatwierdzenia przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) komórek CART19 dla agresywnego chłoniaka z komórek B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 i lisocabtagene maraleucel)7, ostra białaczka limfoblastyczna (Tisa-Cel)5,8, chłoniak z komórek płaszcza (brexucabtagene autoleuce)9 i chłoniak grudkowy ( Axi-Cel)10. Ostatnio FDA zatwierdziła terapię komórkami CAR T skierowaną przez BCMA u pacjentów ze szpiczakiem mnogim (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Co więcej, terapia limfocytami CAR T w przewlekłej białaczce limfocytowej (CLL) jest w późnej fazie rozwoju klinicznego i oczekuje się, że otrzyma zgodę FDA w ciągu najbliższych trzech lat1.
Pomimo bezprecedensowych wyników terapii komórkami CAR T, jej powszechne stosowanie jest ograniczone przez: 1) niewystarczającą ekspansję komórek CAR T in vivo lub słaby transport do miejsc nowotworowych, co prowadzi do niższych wskaźników trwałej odpowiedzi12,13 i 2) rozwój zagrażających życiu zdarzeń niepożądanych, w tym zespołu uwalniania cytokin (CRS)14,15. Cechy charakterystyczne CRS obejmują nie tylko aktywację immunologiczną skutkującą podwyższonym poziomem cytokin/chemokin zapalnych, ale także masową proliferację limfocytów T po infuzji limfocytów CAR T15,16. W związku z tym opracowanie zwalidowanej, klinicznej strategii obrazowania limfocytów CAR T in vivo umożliwiłoby 1) śledzenie komórek CAR T w czasie rzeczywistym in vivo w celu monitorowania ich transportu do miejsc nowotworowych i odkrycia potencjalnych mechanizmów oporności oraz 2) monitorowanie ekspansji komórek CAR T i potencjalne przewidywanie ich toksyczności, takich jak rozwój CRS.
Kliniczne cechy łagodnego CRS to wysoka gorączka, zmęczenie, ból głowy, wysypka, biegunka, bóle stawów, bóle mięśni i złe samopoczucie. W cięższym CRS u pacjentów może rozwinąć się tachykardia/niedociśnienie, nieszczelność naczyń włosowatych, dysfunkcja serca, niewydolność nerek/wątroby oraz rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe17,18. Ogólnie wykazano, że stopień podwyższenia cytokin, w tym interferonu gamma, czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów, interleukiny (IL)-10 i IL-6, koreluje z nasileniem objawów klinicznych17,19. Jednak szerokie zastosowanie monitorowania cytokin w surowicy "w czasie rzeczywistym" do przewidywania CRS jest trudne ze względu na wysokie koszty i ograniczoną dostępność. Aby wykorzystać korzystne właściwości terapii komórkami CAR T, nieinwazyjne obrazowanie adoptywnych limfocytów T może być potencjalnie wykorzystane do przewidywania skuteczności, toksyczności i nawrotu po infuzji komórek CAR T.
Kilku badaczy opracowało strategie korzystania z obrazowania opartego na radionuklidach z pozytonową tomografią emisyjną (PET) lub tomografią komputerową emisji pojedynczych fotonów (SPECT), która zapewnia wysoką rozdzielczość i wysoką czułość20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30 do wizualizacji in vivo i monitorowania transportu komórek CAR T. Wśród tych strategii obrazowania opartych na radionuklidach, symporter jodku sodu (NIS) został opracowany jako czuła metoda obrazowania komórek i wirusów za pomocą skanów PET31,32. Obrazowanie limfocytów T NIS + CAR za pomocą [18F]TFB-PET to czuła, wydajna i wygodna technologia do oceny i diagnozowania ekspansji komórek T CAR, transportu i toksyczności30. Protokół ten opisuje: 1) rozwój limfocytów T NIS + CAR poprzez podwójną transdukcję o wysokiej skuteczności oraz 2) metodologię obrazowania limfocytów T NIS + CAR za pomocą skanu [18F]TFB-PET. Limfocyty T BCMA-CAR dla MM są używane jako model potwierdzający słuszność koncepcji do opisania NIS jako reportera do obrazowania limfocytów CAR T. Jednak metodologie te można zastosować do każdej innej terapii komórkami CAR T.

<table><tbody><tr><td>Igła 22 Gauge</td><td>Covidien</td><td>8881250206</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa o rozmiarze 28</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human (ETNL) NIS Przeciwciało</td> ETNL <td>Imanis</td><td>REA009</td><td>wiąże cytozolowy C-koniec NIS</td></tr><tr><td>Anti-human BCMA, klon 19F2, PE-Cy7</td><td>Przeciwciało</td> <td>BioLegend</td><td>357507</td> Flow</tr><tr><td>Anty-ludzki CD45, klon HI30, BV421</td><td>BioLegend</td><td>304032</td><td>Flow przeciwciało</td></tr><tr><td>Anty-mysie CD45, klon 30-F11, APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td>Flow przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-królicze IgG</td><td>R& D</td><td>F0110</td><td>Przeciwciało wtórne do barwienia NIS</td></tr><tr><td>Konstrukt BCMA-CAR, IDT drugiej generacji</td><td>, Coralville, IA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Zestaw roztworu do utrwalania/przepuszczalności Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>CD3 Przeciwciało monoklonalne (OKT3), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>CTS (systemy terapii komórkowej) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System&nbsp; B5-R3-V5</td><td>Beckman Coulter</td><td>C04652</td><td>cytometr przepływowy</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe strzykawki z końcówkami Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>D-Lucyferyna, sól potasowa</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (Magnetyczny koncentrator cząstek)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnes</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji ludzkich komórek T EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>kulki magnetyczne selekcji negatywnej; 17951RF zawiera końcówki i bufor</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>Inveon Wielomodalny skaner PET/CT</td><td>Siemens Medical Solutions USA, Inc.</td><td>10506989 VFT 000 03</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran w płynie</td><td>Piramal Critical Care</td><td>66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>IVIS System obrazowania Lumina S5</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS148588</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&reg; System obrazowania Spectrum In Vivo</td><td>PerkinElmer</td><td>&nbsp; </td><td></td>124262</tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 405 nm</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Filtr próżniowy Nalgene Rapid-Flow 500 mL, 0,22 uM, sterylny</td><td>Thermo Scientific</td><td>450-0020</td><td></td></tr><tr><td>Filtr próżniowy Nalgene Rapid-Flow 500 mL, 0,45 uM, sterylny</td><td>Thermo Scientific</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid&nbsp; Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>05557</td><td></td></tr><tr><td>OPM-2</td><td>DSMZ</td><td>CRL-3273</td><td>linia komórkowa szpiczaka mnogiego</td></tr><tr><td>pBMN (CMV-copGFP-Luc2-Puro)</td> <td>Addgene</td><td>80389</td><td>wektor lentiwirusowy kodujący lucyferazę-GFP</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100x), płyn</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie PMOD</td><td>PMOD</td><td>PBAS i P3D</td><td></td></tr><tr>Połączone <td>innowacyjne badania</td> <td>pochodzące z ludzkiego osocza AB</td><td>IPLA-SERAB-H-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td></td><td></td>0210055210</tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>W pełni automatyczny separator komórek</td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50 (IVD)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td>Probówki do separacji gradientu gęstości</td></tr><tr><td>Azek sodu, 5% (w/v)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T175</td><td>Corning</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Terrell (izofluran, USP)</td><td>Piramal Critical Care Inc</td><td>66794-019-10</td><td></td></tr><tr><td>Webcol Alcohol Prep</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Bezpoetyczne podłoże z komórek krwiotwórczych</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

dynamiczne obrazowanie limfocytów t z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18f] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Limfocyty T genetycznie zmodyfikowane do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) wykazały bezprecedensowe wyniki w kluczowych badaniach klinicznych dla pacjentów z nowotworami złośliwymi komórek B lub szpiczakiem mnogim (MM). Jednak liczne przeszkody ograniczają skuteczność i uniemożliwiają powszechne stosowanie terapii komórkami CAR T ze względu na słaby transport i infiltrację do miejsc nowotworu, a także brak trwałości in vivo. Ponadto poważne obawy stanowią zagrażające życiu toksyczności, takie jak zespół uwalniania cytokin lub neurotoksyczność. Wydajne i czułe obrazowanie i śledzenie limfocytów CAR T umożliwia ocenę transportu komórek T, ekspansji i charakterystyki in vivo, a także umożliwia opracowanie strategii przezwyciężenia obecnych ograniczeń terapii limfocytami CAR T. W artykule opisano metodologię włączania symportera jodku sodu (NIS) do limfocytów CAR T oraz obrazowania limfocytów CAR T za pomocą [18F]tetrafluoroborianowo-pozytonowej tomografii emisyjnej ([18F]TFB-PET) w modelach przedklinicznych. Metody opisane w tym protokole mogą być stosowane do innych konstruktów CAR i genów docelowych oprócz tych użytych w tym badaniu.

Rycina 1 przedstawia etapy generowania komórek NIS+BCMA-CAR T. W dniu 0 należy wyizolować PBMC, a następnie wyizolować limfocyty T poprzez selekcję negatywną. Następnie stymuluje się limfocyty T za pomocą kulek anty-CD3/CD28. W dniu 1 limfocyty T poddaje się transdukcji lentiwirusami NIS oraz BCMA-CAR. W dniach 3, 4 i 5 należy policzyć limfocyty T i dodać pożywkę, aby dostosować ich stężenie do poziomu 1,0 × 106/mL. W przypadku limfocytów T transdukowanych NIS dodaje si...

Ten protokół opisuje metodologię nieinwazyjnego śledzenia limfocytów T genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych in vivo za pomocą klinicznie dostępnej platformy.

Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Do tej pory nie ma klinicznie potwierdzonej platformy obrazowania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym. Syporter jodku sodu stanowi czuły i klinicznie istotny reporter do obrazowania limfocytów T CAR za pomocą skanu PET. Obrazowanie TLP PET limfocytów T NIS CAR umożliwia badaczom nieinwazyjne śledzenie komórek infuzji in vivo i ma potencjał do przewidywania skuteczności i toksyczności terapii limfocytami T CAR.Skuteczne obrazowanie limfocytów T CAR umożliwia ocenę transportu i ekspansji limfocytów T oraz umożliwia opracowanie strategii przezwyciężenia ograniczeń. Metoda opisana w tym protokole jest prosta i może być zastosowana do innych konstruktów CAR poza tymi przedstawionymi w tym badaniu. Rozpocznij od wyizolowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub PBMC z próbki krwi przy użyciu techniki standardowego gradientu gęstości.Aby to zrobić, delikatnie dodaj 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości do 50-mililitrowej rurki do separacji gradientu gęstości, unikając tworzenia się pęcherzyków. Aby uniknąć uwięzienia komórek, rozcieńczyć próbkę krwi PBS zawierającym 2% FBS w stosunku objętościowym jeden do jednego i delikatnie przenieść rozcieńczoną krew na podłoże o gradiencie gęstości, nie przerywając granicy między nimi. Następnie odwirować probówkę separacyjną o stężeniu 1 200 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Zebrać supernatant do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, przemyć komórki PBS zawierającym 2% FBS, napełniając probówkę do 50 mililitrów i odwirowując probówkę przy 300 razy G przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant przed ponownym zawieszeniem granulowanych komórek w 50 mililitrach PBS zawierających 2% FBS. Zawiesić granulowane PBMC w PBS zawierającym 2% FBS do stężenia 50 razy 10 do szóstych komórek na mililitr.Powtórz pranie w świeżej 50-mililitrowej tubce. Policz liczbę komórek, a następnie odwiruj zawiesinę komórek w temperaturze 300 razy G przez osiem minut w temperaturze pokojowej. W celu izolacji komórek T przenieś izolowane PBMC do 14-mililitrowej probówki z okrągłym dnem z polistyrenu.Następnie użyj zestawu kulek magnetycznych do selekcji negatywnej, aby przeprowadzić izolację limfocytów T, umieszczając PBMC w koktajlu przeciwciał selekcji negatywnej w pełni zautomatyzowanym separatorze komórek. Po izolacji limfocytów T policz komórki i posadź komórki w pożywce do ekspansji komórek T lub TCM w stężeniu dwa razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Następnie wymieszać fiolkę zawierającą kulki anty-CD3/CD28 poprzez zawirowanie i odpipetować wymaganą objętość kulek do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki.Do mycia ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze TCM przed umieszczeniem rurki na magnesie na jedną minutę i odessać supernatant. Po wyjęciu rurki z magnesu należy ponownie zawiesić umyte kulki w jednym mililitrze TCM i powtórzyć pranie dwukrotnie. Ponownie zawiesić umyte kulki w jednym mililitrze TCM, aby przenieść je do hodowli limfocytów T, a następnie rozcieńczyć zawiesinę kulek komórek T za pomocą TCM do stężenia 1,0 razy 10 do szóstych komórek na mililitr przed przeniesieniem jej na sześciodołkową płytkę poddaną hodowli tkankowej.Inkubuj płytkę studzienki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby przejść do transdukcji lentiwirusów, należy rozmrozić zamrożone lentiwirusy w powlekaniu chimerycznych receptorów antygenowych lub symportera jodku sodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po 24 do 48 godzinach stymulacji limfocytów T wymieszaj limfocyty T, aby rozbić klastry i dodaj świeżo rozmrożonego lentiwirusa do komórek przy wielokrotności infekcji wynoszącej pięć.Inkubuj transdukowane limfocyty T w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. W trzecim, czwartym i piątym dniu inkubacji policz transdukowane limfocyty T i dostosuj stężenie komórek do 1,0 razy 10 do szóstych komórek na mililitr, dodając świeży, wstępnie podgrzany TCM. W przypadku limfocytów T transdukowanych przez NIS zawierających gen oporności na puromycynę, należy potraktować komórki jednym mikrogramem na mililitr dichlorowodorku puromycyny w trzecim, czwartym i piątym dniu.Szóstego dnia rozbij klastry limfocytów T i usuń kulki anty-CD3 / CD28 z transdukowanych komórek T, umieszczając płytkę na magnesie na jedną minutę. Następnie umieść zebrane komórki z powrotem w kulturze w stężeniu 1,0 razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Przemyć podwielokrotność hodowli limfocytów T zawierającą 50 000 komórek buforem przepływowym i ponownie zawiesić komórki za pomocą 50 mikrolitrów buforu przepływowego.Aby wykryć ekspresję CAR, wybarwić limfocyty T jednym mikrolitrem koziego przeciwciała anty-mysiego. Aby wykluczyć martwe komórki, dodaj 0,3 mikrolitra LIVE/DEAD Aqua. Inkubuj wybarwione komórki w ciemności w temperaturze pokojowej.Po 15 minutach przemyć komórki 150 mikrolitrami buforu przepływowego o stężeniu 650 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby utrwalić i przepuszczalność wybarwionych komórek, inkubuj komórki ze 100 mikrolitrami pożywki utrwalającej przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dwukrotnie przemyć komórki 100 mikrolitrami buforu zawierającego środek przepuszczający komórki, taki jak saponina i wirówka.Po umyciu ponownie zawiesić przepuszczalne komórki w 50 mikrolitrach buforu przepuszczalnego. Następnie dodaj 0,3 nanograma przeciwciała anty-ludzkiego ETNL NIS i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po godzinie inkubacji umyć komórki, dodając 150 mikrolitrów buforu przepływowego i odwirować, jak pokazano.Następnie inkubować komórki z 50 mikrolitrami buforu przepływowego zawierającego 2,5 mikrolitra wtórnego przeciwciała anty-królika przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po umyciu limfocytów T, jak pokazano, ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach bufora przepływowego w celu przeprowadzenia cytometrii przepływowej. Następnie określ wydajność transdukcji komórek.Ósmego dnia policz i odwiruj limfocyty T w temperaturze 300 razy G przez osiem minut w czterech stopniach Celsjusza, a następnie ponownie zawiesij osad komórkowy za pomocą pożywki zamrażającej o stężeniu 10 razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Przenieść jeden mililitr zawiesiny komórek do każdej oznakowanej fiolki kriogenicznej, aby przechowywać w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po 48 godzinach przenieś limfocyty T do ciekłego azotu.Przygotuj myszy, którym wstrzyknięto limfocyty T BCM CAR z dodatnim wynikiem NIS, do obrazowania PET/CT, ważąc myszy i usuwając metalowe kolczyki. Następnie wstrzyknąć myszowi dożylnie 9,25 megabekerela świeżo przygotowanego tetrafluoroboranu F18 poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Po 45 minutach okresu absorpcji przystąp do akwizycji statycznych obrazów PET znieczulonej myszy przez 15 minut, a następnie akwizycji obrazu CT przez pięć minut z obrotem o 360 stopni i projekcjami 180.W tej reprezentatywnej analizie kotransdukcja dwóch wirusów do limfocytów T wygenerowała dodatnie limfocyty T BCM CAR NAS, gdzie ponad 90% komórek było dodatnich w NIS. Analiza kinetyki wzrostu limfocytów T od zera do ośmiu dni wykazała, że włączenie BCMA CAR i NIS nie wpłynęło znacząco na ekspansję komórek T w porównaniu z komórkami nietransdukowanymi. W analizie cytometrii przepływowej OPM-2 komórki transdukowane lentiwirusem reprezentowały ekspresję GFP po leczeniu puromycyną.Myszy otrzymujące BCMA dodatnie komórki OPM-2 lucyferazy zostały poddane obrazowaniu bioluminescencyjnemu w celu potwierdzenia wszczepienia komórek OPM-2. Obrazowanie PET myszy z tetrafluoroboranem F18 wykazało rozmieszczenie komórek T BCMA CAR NIS w różnych narządach i szpiku kostnym. Dodatkowo, komórki szpiku kostnego pobrane od myszy wykazywały wszczepienie komórek OPM-2 i dostarczenie NIS dodatnich komórek T BCMA CAR T do szpiku kostnego.Aby uzyskać wysokiej jakości obrazowanie wlewów limfocytów T CAR, ważne jest, aby postępować zgodnie z krokami protokołu generowania limfocytów T NIS CAR i potwierdzić obecność podwójnych frakcji dodatnich NIS i CAR.

dynamic-imaging-chimeric-antigen-receptor-t-cells-with

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Dyfuzyjna tomografia fluorescencyjna oferuje stosunkowo niskokosztowe i potencjalnie wysokoprzepustowe podejście do przedklinowego obrazowania guzów in vivo. Przedstawiono metodologię zbierania danych optycznych, kalibracji i rekonstrukcji obrazu dla bezkontaktowego systemu w dziedzinie czasu sterowanego tomografią komputerową, z wykorzystaniem fluorescencyjnego celowania w biomarker nowotworowy – receptor Epidermal Growth Factor Receptor w modelu glejaka u myszy.

Tomografia dyfuzyjna fluorescencji w dziedzinie czasu sterowana tomografią komputerową u małych zwierząt w celu lokalizacji biomarkerów nowotworowych

Bioortogonalna cykloaddycja Dielsa-Aldera została wykorzystana do stworzenia skutecznej i modułowej, pretargetowanej strategii obrazowania PET dla raka. W niniejszym protokole etapy tej metodologii są opisane w kontekście systemu modelowego wykorzystującego przeciwciało ukierunkowane na raka jelita grubego huA33 i radioligand znakowany 64Cu.

Wykorzystanie bioortogonalnej cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET

Opisujemy protokół obrazowania hybrydowego, łączący tomografię za pośrednictwem fluorescencji (FMT) z mikrotomografią komputerową (μCT). Po fuzji i rekonstrukcji przeprowadzamy interaktywną segmentację narządów w celu wyodrębnienia ilościowych pomiarów rozkładu fluorescencji.

Hybrydowe obrazowanie μCT-FMT i analiza obrazu

Demonstrujemy półautomatyczną syntezę radiochemiczną [18F]3F4AP i procedury kontroli jakości.

Zautomatyzowana synteza radiochemiczna [18F]3F4AP: nowy znacznik PET do obrazowania chorób demielinizacyjnych

Miejsca obrazowania pozytonowej tomografii emisyjnej (PET), które biorą udział w wielu wczesnych badaniach klinicznych, wymagają solidnych i wszechstronnych możliwości produkcji radioznaczników. Na przykładzie radioznacznika [18F] Klofarabiny ilustrujemy, jak zautomatyzować syntezę radioznacznika za pomocą elastycznego radiosyntezatora opartego na kasecie i zwalidować syntezę do użytku klinicznego.

Automatyzacja protokołu syntezy radioznacznika metodą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) do produkcji klinicznej

Synteza radiofarmaceutyków znakowanych fluorem-18 (18F) do pozytonowej tomografii emisyjnej zazwyczaj wymaga miesięcy doświadczenia. Po włączeniu do radioznacznika, motyw akceptora krzemowo-fluorkowego (SiFA) umożliwia prosty protokół znakowania 18F, który jest niezależny od kosztownego sprzętu i szkolenia przygotowawczego, przy jednoczesnym zmniejszeniu ilości potrzebnego prekursora i wykorzystaniu łagodniejszych warunków reakcji.

Rozdział 18Znakowanie F radioznaczników funkcjonalizowanych akceptorem fluorku krzemu (SiFA) do pozytonowej tomografii emisyjnej

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię znakowania radioaktywnego przeciwciała monoklonalnego anty-CD19 specyficznego dla człowieka i jak go używać do ilościowego oznaczania limfocytów B w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych mysiego modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu obrazowania in vivo PET, zliczania gamma ex vivo i metod autoradiograficznych.

Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Ten artykuł opisuje radiosyntezę, formułowanie, kontrolę jakości nowej sondy znakowanej radioaktywnie (tj. nanoniki NM-02 znakowanej 68Ga) oraz jej zastosowanie do obrazowania PET/CT małych zwierząt w modelu ksenoprzeszczepu.

Radiosynteza, kontrola jakości i obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej małych zwierząt 68nanocząsteczek znakowanych Ga

To badanie opisuje zautomatyzowany proces produkcji [68Ga]Ga-3BP-3940 za pomocą syntezatora GAIA V2, do obrazowania PET białka aktywującego fibroblasty. Przedstawiono również wyniki badań kontroli jakości przeprowadzonych na trzech seriach testowych.

Automatyczne przygotowanie [68Ga]GA-3BP-3940 na module syntezy do obrazowania PET mikrośrodowiska guza

Poznaj protokół inżynierii limfocytów T CAR z symporterem jodku sodu do obrazowania PET w immunoterapii nowotworów krwi. Metoda umożliwia nieinwazyjne śledzenie komórek in vivo.

Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej 18F tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej (Wideo) | JoVE Journal

Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [¹⁸F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej

Przeglądaj więcej filmów