Zaawansowane zarządzanie rytmem serca poprzez zastosowanie optogenetycznej fotostymulacji wieloośrodkowej w mysich sercach

Fizyczne najbardziej podstawowe przyczyny migotania serca i defibrylacji nie są w pełni poznane. Optogenetyka może zaoferować sposób na uzyskanie lepszego wglądu w zjawiska sercowe w dobrze kontrolowanym środowisku. Miejscowa stymulacja światłem za pomocą mikrodiod LED pozwala na innowację określonych obszarów tkanki serca.

Ta ukierunkowana stymulacja jest nowym narzędziem do opracowywania łagodnych dla serca metod terapii antyarytmetycznej. Przedstawiony protokół może być wykorzystany do badania zachowania serca podczas arytmii serca, a zwłaszcza podczas przerywania ciąży. W perspektywie perspektywicznej, opracowane techniki mogą być wykorzystane do badania bardziej istotnych klinicznie dużych modeli zwierzęcych.

Przed każdym eksperymentem wyczyść wszystkie probówki całkowicie zdemineralizowaną wodą. Napowietrzać roztwory tarczycy karbogenem przez 30 minut w temperaturze pokojowej i dostosować pH do 7,3 za pomocą wodorotlenku sodu i kwasu solnego. Podgrzej system perfuzyjny do 37 stopni Celsjusza za pomocą wodnej pompy ciepła.

Utrzymuj stałą temperaturę perfuzjatu w łaźni wodnej za pomocą dodatkowego elementu grzejnego, takiego jak wodoodporny grzejny. Dodaj 500 mililitrów każdego roztworu tarczycy do odpowiedniego zbiornika i odpowietrz rurki, a także pułapkę pęcherzyków, przepuszczając roztwór tarczycy przez system perfuzyjny, aż nie będzie już widać uwięzionych pęcherzyków powietrza w probówkach lub w pułapce pęcherzyków. Kontynuuj napowietrzanie roztworów tarczycy podczas całego eksperymentu w zbiornikach z karbogenem, aby upewnić się, że pH perfuzatu pozostaje stabilne w dalszej części perfuzji.

Po usunięciu serca należy wykonać dokładne przygotowanie pod mikroskopem stereoskopowym. Przymocuj aortę do igły i przymocuj naczynie materiałem do szycia. Jako kontrolę, wstrzyknąć lodowaty roztwór tarczycy przez igłę do serca i sprawdzić, czy serce jest ciasno zamocowane.

Przenieś zamontowane serce do systemu perfuzyjnego i upewnij się, że perfuzat płynie, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do serca podczas łączenia igły z pułapką bąbelkową. Sprawdź, czy serce jest pokryte roztworem tarczycy w kąpieli wodnej i czy bije w ciągu kilku minut. Umieść jedną z elektrod EKG jak najbliżej powierzchni serca, aby zapewnić dobrą jakość sygnału.

Zawieś drugą elektrodę EKG w roztworze tarczycy, upewniając się, że EKG jest rejestrowane. Umieść matrycę micro LED w obszarze zainteresowania. Zmień perfuzję na niską dawkę potasu w tarczycy za pomocą penecidle i obserwuj serce przez 15 do 30 minut.

Aby wywołać arytmię, oświetl serce diodą LED 1 i LED 2 ciągiem od 20 do 50 impulsów świetlnych o częstotliwości od 25 do 35 herców, czasie trwania impulsu od dwóch do 15 milisekund i natężeniu światła 2,8 miliwata na milimetr kwadratowy. Powtarzaj proces, aż do wywołania arytmii. Po wizualnym wykryciu utrzymującej się arytmii zastosuj serię impulsów o różnych szerokościach i częstotliwościach za pomocą trzech, sześciu lub dziewięciu mikrodiod LED układu przy pulsującym prądzie 15 miliamperów.

Jeśli arytmia utrzymuje się po pięciu próbach defibrylacji opartej na matrycach micro LED, zaklasyfikuj próbę jako nieudaną i rozpocznij defibrylację zapasową, używając diody LED 1 i LED 2 o tych samych parametrach czasowych. Wykonaj perfuzję serca roztworem blebbistatyny i poczekaj, aż nastąpi mechaniczne rozprzężenie, które następuje wtedy, gdy serce przestaje bić, ale sygnał EKG jest nadal mierzalny. Podaj barwnik o napięciu jednego mililitra, barwnik 4-A-N-B-D-Q-P-Q jako bolus w pułapce bąbelkowej perfuzji Langendorffa i odczekaj od pięciu do 10 minut, aby barwnik równomiernie przeniknął do serca.

Włącz diodę LED trzy. Ustaw ostrość aparat na powierzchni serca i zastosuj moc optyczną 1.27 miliwata na milimetr kwadratowy. Wyłącz światła laboratoryjne i rozpocznij nagrywanie, upewniając się, że odbierany jest sygnał optyczny, porównując częstotliwość uzyskanego sygnału z częstotliwością zarejestrowanego EKG.

Seria eksperymentów z różnymi częstotliwościami, liczbą mikrodiod LED i czasem trwania impulsów została przetestowana na 11 myszach, wykazując, że impulsy trwające od 1 do 20 milisekund mogą defibrylować z różnym powodzeniem. Obserwuje się znaczny wzrost skuteczności dziewięciu diod LED o czasie trwania impulsu wynoszącym jedną milisekundę i 20 milisekund przy częstotliwości defibrylacji 18 i 20 herców, co jest bliższe analizowanej średniej częstości arytmii wynoszącej 22,55 wszystkich arytmii z przedziałem błędu plus minus cztery punkty zero trzy herce. Przedstawiono tutaj dwie różne próby defibrylacji z częstotliwością 14 Hz wraz z zapisami EKG i odpowiednimi spektrogramami.

W przykładzie defibrylacji impulsami 30 milisekundowymi dominująca częstotliwość arytmii nieznacznie wzrasta, aż do rozpoczęcia fotostymulacji. VF przekształca się w VT, w którym dominująca częstotliwość spada do 14 herców, po czym następuje nieudane zakończenie i powrót do zachowania arytmicznego z dominującą częstotliwością 24 herców. W drugim przykładzie segment pierwszy pokazuje VT z dominującą częstotliwością 23 Hz i jego składowymi harmonicznymi do momentu rozpoczęcia fotostymulacji, z szerokością impulsu 20 milisekund.

Segment trzeci pokazuje pomyślne zakończenie, które prowadzi do normalnego rytmu zatokowego o podstawowej częstotliwości 3,5 Hz i wynikających z tego harmonicznych. Mapowanie optyczne za pomocą szybkich kamer wykazało zmianę intensywności fluorescencji podczas pojedynczego uderzenia serca podczas normalnego rytmu zatokowego. Długość perfuzji musi utrzymywać wszystkie warunki, aby utrzymać serce w zdrowiu, a mianowicie temperaturę, wartość pH i utlenianie, muszą pozostać stałe.

Szczególnie ważne jest, aby roztwór tyroidowy nie był pusty, ponieważ pęcherzyki powietrza w układzie mogą uszkodzić serce. Matryca mikrorzeczywistości oferuje dużą elastyczność. Możesz celować w różne lokalizacje serca, a nawet połączyć wiele matryc w jednym eksperymencie, aby prawidłowo zakończyć arytmię.