Name: Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj protokół przygotowania próbek Saccharomyces cerevisiae do kriotomografii elektronowej z wykorzystaniem kriogenicznej mikroobróbki wiązką jonową. Metoda obejmuje hodowlę, witrifikację i przygotowanie lameli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez Agencję Technologiczną Republiki Czeskiej, grant numer TN01000008, projekty Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansowane przez program Horyzont 2020 Komisji Europejskiej oraz infrastrukturę badawczą CIISB, Centrum Instruct-ERIC (LM2018127). Dziękujemy za wsparcie uzyskane od Thermo Fisher Scientific Brno.

<ol><li>McMullan, G., Faruqi, A., Clare, D., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+optimal+performance+at+300keV+of+three+direct+electron+detectors+for+use+in+low+dose+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Comparison of optimal performance at 300keV of three direct electron detectors for use in low dose electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 147, 156-163 (2014).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Dubochet, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+pure+water+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Vitrification of pure water for electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 124, 3-4 (1981).</li>
<li>Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+windows+into+the+cell%3A+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Opening windows into the cell: focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).</li>
<li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+molecular+sociology+at+the+HeLa+cell+nuclear+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery.</a> Science. 351 (6276), 969-972 (2016).</li>
<li>Schur, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+high-resolution+in+situ+structural+biology+with+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).</li>
<li>O'Reilly, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+architecture+of+an+actively+transcribing-translating+expressome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome.</a> Science. 369, 554-557 (2020).</li>
<li>Rice, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+determination+of+ice+thickness+for+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204, 38-44 (2018).</li>
<li>Al-Amoudi, A., Norlen, L. P. O., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections+of+native+biological+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues.</a> Journal of Structural Biology. 148, 131-135 (2004).</li>
<li>Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+artefacts+and+cutting+process+in+vitreous+sections+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 150, 109-121 (2005).</li>
<li>Pierson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> Journal of Structural Biology. 169, 219-225 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+%26%2334%3Bread%26%2334%3B+a+vitreous+section%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How to &#34;read&#34; a vitreous section.</a> Methods in Cell Biology. 79, 385-406 (2007).</li>
<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4449-4454 (2012).</li>
<li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-focused+Ion+Beam+Sample+Preparation+for+Imaging+Vitreous+Cells+by+Cryo-electron+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Cryo-focused Ion Beam Sample Preparation for Imaging Vitreous Cells by Cryo-electron Tomography.</a> Bio-protocol. 5, (2015).</li>
<li>Wagner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+samples+from+whole+cells+using+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).</li>
<li>Buckley, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cryo-lamella+preparation+for+high-throughput+in-situ+structural+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural Biology.</a> Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488(2020).</li>
<li>Zachs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+focused+ion+beam+milling+for+cryo-eletron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-eletron tomography.</a> eLife. e52286, (2020).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li>
<li>Hagen, W. J., Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197, 191-198 (2017).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li>
<li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTFFIND4%3A+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192, 216-221 (2015).</li>
<li>Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amira%3A+A+highly+interactive+system+for+visual+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Visualization+Handbook%22%5BJournal%5D)">Amira: A highly interactive system for visual data analysis.</a> The Visualization Handbook. , 749-767 (2005).</li>
<li>Wolff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3A+Micro-expansion+joints+drastically+decrease+the+bending+of+FIB-milled+cryo-lamellae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae.</a> Journal of Structural Biology. 208, 107389(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przygotowanie próbek komórkowych do cryo-ET to złożony przepływ pracy, który wymaga wykorzystania kilku wysokiej klasy instrumentów. Jakość próbki może być zagrożona na każdym etapie przygotowania, co wpływa na przepustowość całego protokołu. Ponadto konieczność przenoszenia próbki pomiędzy poszczególnymi przyrządami stwarza dodatkowe ryzyko zanieczyszczenia lub dewitryfikacji próbki. W związku z tym optymalizacja poszczególnych etapów procesu przygotowania próbki ma duże znaczenie dla zwiększenia przepustowości i powtarzalności przepływu pracy przygotowania lameli. Przedstawiony tutaj protokół opisuje zoptymalizowane przygotowanie Saccharomyces cerevisiae do strukturalnej charakterystyki kompleksów makromolekularnych in situ za pomocą cryo-ET.
Protokół opisuje przygotowanie dwóch rodzajów próbek drożdży, które różnią się przede wszystkim stężeniem komórek na siatce TEM. Z obu próbek drożdży uzyskano wysokiej jakości blaszki do krio-ET, a dobór rodzaju próbki może być dokonany zgodnie z celami danego badania. Drożdże tworzą izolowane skupiska kilku komórek losowo rozrzuconych po powierzchni siatki w pierwszym przypadku, podczas gdy ciągła monowarstwa komórek jest obecna na powierzchni siatki TEM dla drugiego typu próbki. Ten pierwszy nadaje się do szybkiego przygotowania lameli dzięki niewielkiej objętości materiału, który należy zmielić. Końcowa blaszka jest dość krótka, a zatem zawiera tylko 2-4 przekroje komórkowe. Obszary odpowiednie do przygotowania próbki są losowo rozmieszczone na powierzchni siatki, w tym na kwadratach siatki, co może częściowo ograniczać automatyzację procesu przygotowania lameli. Ten ostatni rodzaj próbki wymaga wykorzystania większych prądów podczas początkowej fazy mielenia, aby zachować całkowity czas mielenia. Ponadto ten rodzaj próbki jest bardziej podatny na artefakty, które wynikają z nierównomiernego mielenia (kurtyny). W związku z tym GIS jest napylany na powierzchnię próbki przez o 50% dłuższy okres niż w przypadku próbki z małymi skupiskami komórkowymi w celu utworzenia grubszej warstwy ochronnej. Następnie próbka jest napylana dodatkową warstwą irydu (alternatywnie platyny lub złota) w celu utwardzenia warstwy GIS, usztywnienia jej i zwiększenia przewodności powierzchniowej próbki. Stwierdzono, że FIBM dodatkowych obszarów po każdej stronie lameli (~2-5 μm od krawędzi lameli) podczas pierwszego etapu zgrubnego frezowania lameli jest korzystne dla zmniejszenia liczby łamanych lameli, najprawdopodobniej ze względu na zmniejszone naprężenie w końcowym przekroju23. Końcowa blaszka jest długa i zawiera ~10 przekrojów komórkowych, co zwiększa liczbę regionów odpowiednich dla cryo-ET. Niewłaściwa witryfikacja pożywki lub buforu między komórkami może być łatwo osłabiona przez dodanie krioprotektoru do roztworu buforowego (5% glicerolu użytego w tym badaniu). Ponieważ większość kwadratów nadaje się do przygotowania lameli, próbka z komórkami zorganizowanymi w ciągłą monowarstwę dobrze nadaje się do przygotowania lameli bez nadzoru.
Kolejnym ważnym aspektem w procesie przygotowania lameli jest przeniesienie do transmisyjnego mikroskopu elektronowego i odpowiednie ustawienie lameli względem osi nachylenia stolika mikroskopu. Optymalnie, główna oś lameli jest prostopadła do osi nachylenia mikroskopu, co umożliwia śledzenie i ustawianie ostrości na wysokości obrazowanego obszaru i zapobiega zasłanianiu przez krawędzie lameli pola widzenia przy dużych kątach nachylenia. Podczas zbierania danych krio-ET przy użyciu schematu symetrycznego dawki,18 próbka powinna być początkowo obrócona w mikroskopie, aby skompensować nachylenie blaszki w stosunku do płaszczyzny siatki.

Ostatnie osiągnięcia technologiczne i programowe sprawiły, że kriomikroskopia elektronowa (cryo-EM) zeszklonych próbek biologicznych stała się jedną z kluczowych technik w badaniach biologii strukturalnej w ostatniej dekadzie1,2. Przygotowanie próbki do krio-EM zwykle polega na nałożeniu oczyszczonego białka lub kompleksu białek z kwasem nukleinowym na nośnik próbki (siatka TEM), a następnie usunięciu większości cieczy za pomocą bibuły filtracyjnej i zanurzeniu zamrażania siatki z pozostałą cienką warstwą próbki w ciekłym etanie lub propanie3. Próbka jest zatem utrwalana w cienkiej warstwie (zwykle <80 nm) amorficznego buforu w stanie w pełni uwodnionym, w warunkach zbliżonych do natywnych i bez potrzeby jakiegokolwiek utrwalania chemicznego lub kontrastowania metali ciężkich. Obrazowanie strukturalnie jednorodnej próbki w transmisyjnym mikroskopie elektronowym daje następnie dane, które można wykorzystać do określenia trójwymiarowej struktury makrocząsteczki w rozdzielczości bliskiej atomowi przy użyciu protokołu analizy pojedynczych cząstek2. Taka struktura in vitro odpowiada reprezentacji makrocząsteczki w warunkach i obróbce zastosowanych podczas przygotowania próbki. Chociaż struktury wyznaczone w warunkach in vitro zwykle odpowiadają w pełni funkcjonalnemu stanowi makrocząsteczki, zdolność do obrazowania relacji przestrzennych między różnymi makrocząsteczkami wewnątrz komórki zapewniłaby dodatkowy kontekst funkcjonalny dla danych strukturalnych.
Tomografia krioelektronowa (cryo-ET) służy do rekonstrukcji objętości 3D obiektów pleomorficznych lub kompleksów makromolekularnych in situ4,5. Zaletą cryo-ET jest to, że trójwymiarowa informacja jest uzyskiwana poprzez obrazowanie pojedynczej jednostki. Jednak rozdzielczość, w której obserwuje się poszczególne kompleksy lub organelle makromolekularne, jest bardzo ograniczona. W związku z tym konieczne jest uśrednienie makrocząsteczek (uśrednianie subtomogramu, STA) o tej samej strukturze z większej liczby tomogramach w celu uzyskania modeli o rozdzielczości 4-8 A z danych cryo-ET6,7. Niedawno wykazano, że cryo-ET i STA mogą być również stosowane do określania struktur o wysokiej rozdzielczości maszyn makromolekularnych, takich jak rybosomy, w kontekście środowiska komórkowego7. Jednak wykorzystanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest ograniczone przez grubość próbki. Ogólnie rzecz biorąc, nie stanowi to problemu w przypadku krio-EM z pojedynczymi cząstkami, gdzie optymalizacja warunków witryfikacji może ostatecznie doprowadzić do zatopienia próbki w cienkiej warstwie lodu. Z drugiej strony, większość ogniw nie jest w rzeczywistości przezroczysta dla wiązki elektronów o natężeniu 300 keV. Nieelastyczna średnia swobodna ścieżka w zeszklonych próbkach biologicznych dla elektronów 300 keV wynosi około 395 nm8, co oznacza, że badania krio-ET są ograniczone do peryferii komórkowych dla większości komórek.
Opracowano różne techniki, aby rozrzedzić próbkę do grubości wystarczającej do zastosowania cryo-ET. Krio-ultramikrotomia wykorzystuje mechaniczne krojenie próbki za pomocą noża diamentowego w temperaturze ciekłego azotu (-196 °C) w celu uzyskania przekrojów o grubości 60-80 nm odpowiednich dla cryo-ET9,10,11. Z jednej komórki można przygotować wiele sekcji, a analiza danych może ostatecznie wygenerować informacje strukturalne 3D dla większej części komórki. Jednak mechaniczne cięcie może powodować kilka artefaktów, takich jak zakrzywione sekcje, szczeliny lub kompresja próbki, które mogą wpływać na wynikową strukturę i zniekształcać dane cryo-ET10,11,12. Mikroobróbka wiązki jonów skupionych kriogenicznie (cryo-FIBM) stanowi alternatywne podejście, w którym cienki wycinek komórkowy jest przygotowywany przez stopniową ablację próbki za pomocą skupionej wiązki jonów Ga+ (FIB) w wieloetapowym procesie, co może skutkować przekrojem komórkowym o grubości 80–300 nm (blaszka)13,14,15. W przeciwieństwie do krio-ultramikrotomii, z pojedynczej komórki przygotowuje się tylko jedną blaszkę, co stanowi ~0,3–3% jej objętości, a mikroobróbka wielu komórek jest zwykle konieczna, aby znaleźć obszar zainteresowania w zmielonym przekroju poprzecznym. Ponadto przepustowość całego przepływu pracy jest obecnie nadal dość niska, często ograniczona do 6-8 wysokiej jakości lameli z 8-godzinnej sesji kriogenicznej FIBM. Z drugiej strony, przekroje czynne cryo-FIBM są pozbawione jakichkolwiek artefaktów kompresji i zapewniają odpowiednie dane wejściowe dla krio-ET o wysokiej rozdzielczości. Ponadto przenoszenie blaszki na nośnik próbki dla cryo-ET nie jest konieczne, ponieważ próbka jest zatrzymywana na siatce TEM podczas całego procesu przygotowania lameli i ta sama siatka może być następnie przeniesiona do TEM. Spodziewamy się, że przepustowość cryo-FIBM zostanie wkrótce znacznie poprawiona, przede wszystkim dzięki dostępności oprogramowania do nienadzorowanego mielenia lameli 16,17 oraz wykorzystaniu FIB działających na zasadzie plazmy z parą ładunków, co pozwoli na szybszą ablację materiału.
Saccharomyces cerevisiae (drożdże) to komórki eukariotyczne o kulistym kształcie i średnicy ~2-5 μm. Dzięki swojej wielkości, dostępności, genetyce, czasowi generacji i prostej manipulacji, drożdże są szeroko badane jako eukariotyczny organizm modelowy w badaniach biologii komórkowej i molekularnej, podobne do Escherichia coli, który jest dobrze przebadany jako prokariotyczny organizm modelowy w bakteriologii. Drożdże można łatwo hodować w zawiesinie, a w krótkim czasie powstaje duża ilość komórek (czas podwojenia 1 – 2 godziny). Co ważniejsze, drożdże mają złożoną wewnętrzną strukturę komórkową z komórkami zwierzęcymi i roślinnymi, zachowując jednocześnie mały genom składający się z niskiej zawartości niekodującego DNA. Charakterystyka strukturalna proteomu drożdży na podstawie danych in situ o wysokiej rozdzielczości może zatem pomóc w dostarczeniu mechanistycznego opisu obszernej ilości danych funkcjonalnych dostępnych w literaturze.
Tutaj, udostępniamy kompleksowy protokół pozyskiwania danych in situ cryo-ET na próbce drożdży, który obejmuje wszystkie etapy od hodowli próbki do przygotowania lameli cryo-FIBM, aż do transferu próbki do TEM w celu akwizycji danych cryo-ET.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Himedia</td><td>MB053</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>PENTA</td><td>12020-31000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>etan</td><td>Messer</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>LN2</td><td>Lineq</td><td>LN2-1L</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Merck</td><td>P5905-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>szczep BY4741</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Dumont</td><td>T539</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>Y1333.1000</td><td></td></tr><tr><td><Silne>Jednorazowe</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bibułki</td><td>Ted Pella</td><td>47000-10</td><td></td></tr><tr><td>C-clip</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 909 97551</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień</td> <td>zaciskowy CThermoScientific</td><td>9432 909 97561</td><td></td></tr><tr><td>Pałeczki do rozsiewania</td><td>Merck</td><td>Z376779-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pętle do zaszczepiania</td><td>BRAND</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne plastikowe szalki Petriego</td><td>Sigma</td><td>SIAL0166</td><td></td></tr><tr><td>siatki TEM</td><td>Quantifoil</td><td>4420G-XA</td><td></td></tr><<tr><td>mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Systec</td><td>101291545</td><td></td></tr><tr><td>wagi</td><td>BEL</td><td>M124A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Cryo-FIB/SEM</td><td>Mikroskop ThermoScientific</td><td>1006123</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Cryo-TEM</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 057 03301</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka laminarna</td><td>Telstar</td><td>AH5</td><td></td></tr><tr><td>Odkurzacz plazmowy</td><td>Gatan</td><td>955.82001</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem</td><td>New Brunswick</td><td>M1282-0002</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV/VIS</td><td></td><td>WPA S800</td><td></td></tr><tr><td>Robot do witryfikacja</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 053 50621</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i mikroobróbka cryo-fib saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Dzisiaj, krioelektronowa tomografia (cryo-ET) jest jedyną techniką, która może dostarczyć danych strukturalnych o rozdzielczości zbliżonej do atomowej na temat kompleksów makromolekularnych in situ. Ze względu na silne oddziaływanie elektronu z materią, badania krio-ET o wysokiej rozdzielczości są ograniczone do próbek o grubości mniejszej niż 200 nm, co ogranicza możliwość zastosowania krio-ET tylko do peryferyjnych obszarów komórki. W ciągu ostatniej dekady wprowadzono złożony proces pracy, który obejmuje przygotowanie cienkich przekrojów komórkowych za pomocą mikroobróbki wiązki jonów w skupieniu kriogenicznym (cryo-FIBM), aby umożliwić pozyskiwanie danych krio-ET z wnętrza większych komórek. Przedstawiamy protokół przygotowania blaszek komórkowych z próbki zeszklonej przez zamrażanie wgłębne z wykorzystaniem Saccharomyces cerevisiae jako prototypowego przykładu komórki eukariotycznej o szerokim zastosowaniu w badaniach biologii komórkowej i molekularnej. Opisujemy protokoły witryfikacji S. cerevisiae w izolowane plamy kilku komórek lub ciągłą monowarstwę komórek na siatce TEM i podajemy protokół przygotowania lameli za pomocą krio-FIB dla tych dwóch próbek.

Kulturę Saccharomyces cerevisiae zebrano w połowie fazy wzrostu wykładniczego. Przygotowaliśmy dwa rodzaje preparatów, w których komórki były rozmieszczone albo w postaci małych skupisk kilku komórek na powierzchni siatki TEM (Rycina 1A,C), albo tworzyły ciągłą monowarstwę w poszczególnych polach siatki TEM (Rycina 1B,D). Czynnikiem decydującym o przygotowaniu próbki z oddzielnymi wysepkami komórkowymi lub monowarstwą komórkową jest stężenie kultury komórkowej naniesionej na siatkę TEM. W pierwszym przypadku zebraną kulturę komórkową zagęszczono do OD600 = 1.0, a w drugim do OD600 = 30 do 60. Próbkę do przygotowania monowarstwy komórkowej uzupełniono dodatkowo o 5% v/v glicerolu przed witryfikacją. Glicerol jest kluczowy dla witryfikacji roztworu buforowego wypełniającego przestrzeń między komórkami (Rycina 2), ponieważ odbicia od krystalicznego buforu mogą utrudniać prawidłowe śledzenie pozycji i ostrzenie podczas zbierania danych cryo-ET.
Dodatkowo, zawiesina kultur drożdży była odsączana przy użyciu materiału nieabsorpcyjnego, takiego jak podkładka do odsączania z PTFE lub specjalnie wydrukowana w technologii 3D podkładka wykonana z materiału FlexFill 98A. Papier do odsączania umieszczano wyłącznie po stronie przeciwnej do aplikacji próbki na siatce (odsączanie od tyłu). Strategia odsączania od tyłu jest zalecana w przypadku mrożenia metodą plunge freezing kultur w zawiesinie, ponieważ odsączanie papierem filtrującym z obu stron prowadzi do przylegania komórek do papieru (Rycina 1E).
Opisany tutaj protokół wykorzystuje siatki TEM zamocowane w kasecie do siatek, która stanowi stabilne podparcie dla siatki i ułatwia manipulację próbką po witryfikacji. W związku z tym konieczne jest, aby pozostałe uchwyty próbek i transmitery w mikroskopach FIB/SEM oraz TEM były kompatybilne z taką kasetą do siatek.
Po przeniesieniu próbki do mikroskopu FIB/SEM, okaz został najpierw pokryty warstwą metylocyklopentadienylowej platyny o grubości 0,3–1,0 μm przy użyciu systemowego wtryskiwacza gazu (GIS) mikroskopu. Na powierzchnię próbki napylono dodatkową warstwę nieorganicznego irydu, aby utwardzić warstwę GIS i uczynić powierzchnię przewodzącą. Lamelle były frezowane w wielu etapach (Rycina 3), podczas których stopniowo zmniejszano (I) prąd frezowania, (II) szerokość lamelli oraz (III) odległość obszaru frezowania powyżej i poniżej próbek. Końcowy etap frezowania („polerowanie”) przeprowadzono przy niskim prądzie (10-30 pA) wyłącznie z górnej strony lamelli, z próbką nachyloną o dodatkowy 1° w stronę wiązki Ga+.
Siatki TEM z lamelami zostały następnie przeniesione do transmisyjnego mikroskopu elektronowego. W pierwszej kolejności lamelami poddano przesiewowi i do pozyskania danych cryo-ET wybrano wyłącznie te, które wykazywały minimalny efekt zasłony (artefakty wynikające z nierównomiernego frezowania powierzchni lameli), niski poziom zanieczyszczeń powierzchniowych oraz dobry kontrast komórkowy (zazwyczaj obserwowany w przypadku lamel o grubości &lt;200 nm). Ponadto z procesu zbierania danych wykluczono lamelie zawierające pęknięcia przebiegające przez całą ich długość. Ogólnie około 50% lamel przeniesionych do TEM nadawało się do pozyskania danych. Serie pochyleń zbierano za pomocą bezpośredniego detektora elektronów post-GIF K2 z przesłoną selekcji energii ustawioną na 20 eV. Zbieranie danych przeprowadzono w oprogramowaniu SerialEM18, a serie pochyleń pozyskano przy użyciu schematu symetrycznego dawkowania19 w zakresie pochyleń ±60° z przyrostem 3°. Dane pozyskano przy powiększeniu odpowiadającym rozmiarowi piksela 3.47 A/px. Całkowita dawka 65 e/Å2 została równomiernie rozłożona na poszczególne podramki. Obrazy pochyleń zbierano jako zestaw trzech ramek, które następnie korygowano pod kątem ruchu i uszkodzeń radiacyjnych podczas akwizycji danych za pomocą programu MotionCor220. Parametry funkcji przenoszenia kontrastu oszacowano za pomocą programu Ctffind421. Serie pochyleń przetworzono w programie eTomo18. Do wyrównania obrazów wykorzystano procedurę śledzenia fragmentów (patch tracking). Tomogram zrekonstruowano za pomocą algorytmu ważonej projekcji wstecznej po dwukrotnym binowaniu obrazów, a następnie przefiltrowano za pomocą filtra typu SIRT (ustawionego na 8 iteracji) w programie IMOD18. Segmentację tomogramu wykonano ręcznie w oprogramowaniu Amira22. Zrekonstruowane tomogramy zapewniają wysokorozdzielczą reprezentację wnętrza komórki drożdży i umożliwiają nam obserwację organelli, takich jak wakuole czy mitochondria, z wysokim poziomem szczegółowości lub badanie kompleksów makromolekularnych, takich jak mikrotubule czy kompleksy porów jądrowych in situ i w warunkach zbliżonych do naturalnych (Rycina 4).
<img alt="Obrazy SEM powierzchni grafenu i schemat; nanowzorowanie i charakterystyka materiału." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Obrazy FIB i SEM witryfikowanych S. cerevisiae 
Obrazy FIB (A) i SEM (C) małych skupisk drożdży witryfikowanych na siatce TEM. Obrazy FIB (B) i SEM (D) drożdży tworzących ciągłą monowarstwę na powierzchni siatki. Przed obrazowaniem próbka została pokryta warstwą GIS i irydu. Paski skali na panelach A-B odpowiadają 10 μm. Próbka drożdży jest osuszana za pomocą materiału nieabsorpcyjnego, takiego jak PTFE lub FlexFill 98A (kolor zielony), przy papierze osuszającym umieszczonym z tyłu siatki (kolor biały, E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy, porównanie gęstości cząstek w mediach porowatych; zaznaczenie zmienności okręgami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Lamelle S. cerevisiae 
Obraz TEM lamelli obrobionej mikrotechnicznie z próbki z ciągłą monowarstwą drożdży na powierzchni siatki. Odblaski zaobserwowane między komórkami zawierały niewłaściwie zwitryfikowane medium/bufor (A, zaznaczone czerwonymi okręgami). Obraz TEM lamelli utworzonej z drożdży zwitryfikowanych w ciągłą monowarstwę po dodaniu 5% glicerolu do medium/buforu (B). Pasek skali odpowiada 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Pomiar nanostruktury, schemat, przedstawiający zakresy prądów (nA, pA) w różnych skalach rozmiarów (μm, nm)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Procedura Cryo-FIBM 
Schematyczny opis procesu frezowania lameli. Wstępne etapy zgrubnego frezowania są wykonywane przy wysokich prądach FIB z obu stron planowanej pozycji lameli (zaznaczonej na zielono), natomiast końcowy etap polerowania jest przeprowadzany wyłącznie od strony górnej i przy niskim prądzie FIB (zaznaczony na pomarańczowo, patrz towarzyszące wideo w 6:33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy kompleksów białkowych wykonane metodą kriomikroskopii elektronowej; analiza strukturalna, wizualizacja molekularna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Organelle drożdży i kompleksy makromolekularne przedstawione za pomocą cryo-ET 
Przekroje zrekonstruowanych tomogramów przedstawiające wakuolę (A, pasek skali: 200 nm), rybosomy (B, pasek skali: 200 nm), rdzeń parakrystaliczny peroksysomu (C, pasek skali: 100 nm), mikrotubulę (biała strzałka) w sąsiedztwie niezidentyfikowanej struktury włóknistej (czarna strzałka, D, pasek skali: 100 nm), szczegóły wielu mikrotubul (E, pasek skali: 50 nm), błonę jądrową z porami wskazanymi strzałkami (F, pasek skali 200 nm), mitochondrium (G,H, pasek skali: 100 nm, strzałki wskazują poszczególne grzebienie), pęk niezidentyfikowanych struktur nitkowatych (I, pasek skali: 100 nm). Panele B, C, D, E, G zawierają sekcje tomogramów przygotowane z małych skupisk komórek, natomiast sekcje tomogramów zebrane z lameli z monowarstwy komórek przedstawiono na panelach A, F, H, I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Ten film skupi się na przygotowaniu salmonelli drożdżowej do kriotomografii elektronowej Przejdziemy przez przepływ pracy od hodowli komórek do kriotomografii elektronowej Saccharomyces cerevisiae są uprawiane do przygotowania próbek jonowych w zawiesinie Zaleca się pracę w sterylnych warunkach wewnątrz skrzynki laminarnej Dodaje się dziesięć mililitrów sterylnych drożdży ekstrahowanych do pożywki do hodowli komórek w celu sterylizacji kolby hodowlanej dodaje się jeden mililitr sterylnej dwudziestoprocentowej glukozy do kolby z podłożem hodowlanym jedna kolonia drożdży jest ostrożnie wybierana z naszej płytki hodowlanej i przenoszona do przygotowanej pożywki wzrostowej w kolbie hodowlacyjnej, kolba hodowlana jest następnie przykrywana folią i dobrze mieszana w celu rozproszenia komórek, hodowla komórkowa jest umieszczana w inkubatorze i hodowana w temperaturze trzydziestu stopni przy stałym mieszaniu, aż do osiągnięcia fazy wykładniczej, hodowla komórek drożdży jest hodowana do fazy wykładniczej i mierzona jest gęstość fizyczna komórek poprzez przytrzymanie miernika przy czystym podłożu jako próbce referencyjnej hodowla komórkowa jest zagęszczona do OD1 lub OD30 dodatkowo pięciu procent glicerolu przed zamrożeniem blanszowym Powierzchnia siatek elektromikroskopijnych jest oczyszczana i aktywowana w celu zastosowania zawiesiny komórek za pomocą siatek plazmowych umieszcza się w komorze rozładowania jarzeniowego skierowaną stroną węglową do góry, a procedura czyszczenia plazmowego jest ustawiona na trzydzieści do czterdziestu pięciu sekund, które siatki EM mają teraz i są gotowe do Zastosowanie próbki komórki Witryfikacja zawiesiny komórek drożdży na siatkach EM odbywa się poprzez zamrożenie blanszu do ciekłego etanu za pomocą maszyny Vitrobot Przygotowanie ciekłego etanu odbywa się poprzez skroplenie gazowego etanu w metalowym kubku chłodzonym ciekłym azotem Siatka EM z zawiesiną komórek jest osuszana bibułą filtracyjną od tyłu i nieprzylepnym tworzywem sztucznym wygiętym od przodu od strony węgla Temperatura wewnątrz komory Vitrobot jest ustawiona do osiemnastu stopni i wilgotności do stuprocentowego czasu oczekiwania, czasu blot i siły blot są również ustawiane na ekranie Vitrobot Siatka wyładowań jarzeniowych jest wybierana przez pęsetę Vitrobot i montowana do instrumentu trzy punkty pięć mikrolitrów zawiesiny Saccharomyces cerevisiae jest nakładana na węglową stronę siatki wewnątrz komory klimatycznej Vitrobot Zawiesina musi być odpowiednio wymieszana przed każdym zastosowaniem siatki kratowej zamrożone w elektromikroskopii ciekłego etanu siatki z zeszklonymi komórkami są przechowywane w warunkach ciekłego azotu lub montowane we wkładzie siatkowym w celu załadowania do mikroskopu kriogenicznego SEM Siatka z zeszklonymi komórkami jest następnie mocowana w kartridżu siatkowym odpowiednim do załadunku zarówno do mikroskopów SEM, jak i TEM Pierścień zaciskowy C jest montowany do klipsa i schładzany w ciekłym azocie siatka jest umieszczana na kartridżu siatkowym węgiel skierowany w dół i przypinany próbka pierścienia C-clip jest następnie umieszczana w specjalnej skrzynce siatkowej Próbka do przygotowania lamili jest ładowana do mikroskopu FIB / SEM z podwójną wiązką i dopasowywana do komory przygotowania kriogenicznego, garnek ładujący jest odpowiednio schładzany i napełniany ciekłym azotem, uchwyt na próbkę zwany czółenkiem, jest umieszczany w i schładzany, a także pudełko siatkowe z próbką jest przenoszone z magazynu Dewara do doniczki, a siatki umieszcza się w dwóch szczelinach w strona węglowa wahadłowca z komórkami skierowanymi do góry w przypadku stosowania wkładów siatkowych FIB wycięcie wkładu siatkowego należy ostrożnie wyrównać do godziny dwunastej w kratkach wahadłowych dokręca się śrubą, a czółenko odchyla się w dół do pozycji załadunku garnek załadowczy umieszcza się w stacji przeładunkowej i przykrywa pokrywą Komorę transferową z garnkiem załadowczym umieszcza się na górze pokrywy i przepompowuje wahadłowiec o niskiej próżni z kratkami jest mocowany na pręcie i zamykany wewnątrz małych komór transferowych, komory zebrane do komory przygotowawczej są pompowane, a czółenko jest wkładane na kriostopień w wysokiej próżni Stopień komory SEM jest przechylany do czterdziestu pięciu stopni i przesuwany o cztery milimetry w środkowej pozycji siatki, wkładając igłę systemu wtrysku gazu, tworzy warstwę ochronną organiczną na próbce biologicznej przed uszkodzeniem przez promieniowanie podczas Siatki do mielenia skupionej wiązki jonów są następnie napylane cienką powłoką z metalu nieorganicznego w celu wytworzenia warstwy przewodzącej na materiale biologicznym Skupione mielenie wiązki jonowej blaszki w klastrze komórkowym lub monowarstwie odbywa się w kilku krokach etap jest przesuwany do kąta frezowania Znajduje się obszar zainteresowania i tworzone są wzory frezowania od góry i od dołu Szorstka lamella jest frezowana ze stopniowym zmniejszaniem prądu FIB i grubości lameli Końcowe polerowanie lameli jest wykonywany tylko z górnym wzorem i niskim prądem FIB, aby uniknąć uszkodzenia przodu i efektu kurtyny na powierzchni lameli wiązka elektronów pokazuje postęp podczas procesu frezowania, tutaj możemy zobaczyć ostateczną polerowaną lamelę Ostateczna grubość lameli musi być mniejsza niż dwieście pięćdziesiąt nanometrów, aby była przezroczysta do przenoszenia wiązki elektronów, ilustracja blaszki frezowanej w klastrze komórkowym i monowarstwie z zaletami i wadami obu typów próbek, siatki z lamali, są bardzo delikatnie przenoszone przez komorę przygotowawczą z powrotem do garnka załadowczego, są schładzane i napełniane świeżym i czystym ciekłym azotem, aby uniknąć lodu, zanieczyszczenie zmielonych siatek lamali są usuwane z czółenka i zwracane z powrotem do skrzynki siatkowej próbka ze zmielonym lamali jest ostatecznie przenoszona do transmisyjnego kriomikroskopu elektronowego, siatka musi być obrócona o dziewięćdziesiąt stopni przed włożeniem do automatycznego podajnika TEM kaseta zapewniająca prawidłową orientację lameli względem dostępu do pochylenia TEM, Lamili są przesiewane, a obszar zainteresowania do pozyskiwania danych tomograficznych krioelektronowych jest zlokalizowany Oś główna lameli jest prostopadła do osi nachylenia mikroskopu, aby zobaczyć właściwe pole widzenia przy dużych kątach nachylenia metoda dozymetryczna służy do zbierania danych krioelektronowej tomografii elektronowej zebrany tomogram jest następnie przetwarzany w oprogramowaniu Etomo i jednowarstwowy podzielony na segmenty Oprogramowanie Amira W tym protokole pokazaliśmy, jak efektywnie przygotować próbkę komórek drożdży do mikromaszyny lamelowej za pomocą kriofokusowego mielenia wiązką jonów oraz jak przygotować i przetworzyć dane z tomografii elektronowej i blaszki komórkowe

preparation-cryo-fib-micromachining-saccharomyces-cerevisiae-for-cryo

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.

Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Nowo opracowany mikro-wzorzysty chip z okienkami z tlenku grafenu jest wytwarzany przy użyciu technik systemów mikroelektromechanicznych, umożliwiając wydajne i wysokoprzepustowe obrazowanie kriogenicznej mikroskopii elektronowej różnych biomolekuł i nanomateriałów.

Wytwarzanie mikrowzorzystego chipa o kontrolowanej grubości do wysokoprzepustowej kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Ta metoda zapewnia dostępny i elastyczny protokół do przygotowania siatek mikroskopii elektronowej (EM) do kriotomografii komórkowej in situ oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM).

Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Poznaj protokół przygotowania próbek Saccharomyces cerevisiae do kriotomografii elektronowej z wykorzystaniem kriogenicznej mikroobróbki wiązką jonową. Metoda obejmuje hodowlę, witrifikację i przygotowanie lameli.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Przeglądaj więcej filmów