Name: Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Poznaj protokół generowania ksenoprzeszczepów w larwach Danio rerio z wykorzystaniem ludzkich komórek nowotworowych. Ta metoda umożliwia analizę proliferacji, angiogenezy i przerzutów w czasie zaledwie czterech dni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Fundacji Champalimaud, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, współfinansowanej przez FCT/Lisboa2020) i FCT-PTDC/MEC-ONC/31627/ 2017 za dofinansowanie. Stypendia FCT dla VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Wszystkim członkom Fior Lab za krytyczne dyskusje; B. Costa i C. Rebelo de Almeida za udostępnianie danych; oraz członkom naszego laboratorium, C. Rebelo de Almeidzie, M. Barroso i L. Leite za ich udział w filmie. Chcielibyśmy podziękować CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro i inni) oraz zespołowi Champalimaud Communication, Events and Outreach, w szczególności Alexandre'owi Azinheirze za fantastyczne stworzenie filmu oraz Catarinie Ramos i Teresie Fernandes za ich pomoc.

<ol><li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Little+Fish%2C+Big+Data%3A+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+of+the+day%3A+zebrafish+as+a+human+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li>
<li>Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+eyes+on+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animals%22%5BJournal%5D)">All eyes on zebrafish.</a> Lab Animals. 46, 323-326 (2017).</li>
<li>Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNovoa%2C+B+%22Current+Topics+in+Innate+Immunity+II%22">Current Topics in Innate Immunity II</a>. Lambris, J. D., Hajishengallis, G. , Springer. 253-275 (2012).</li>
<li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).</li>
<li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).</li>
<li>Póvoa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+evasion+revealed+in+a+colorectal+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model.</a> Nature Communications. 12, 1156(2021).</li>
<li>Galletti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Macrophages+Sensitizes+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+to+Apoptosis+and+Inhibits+Disease+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression.</a> Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).</li>
<li>Rebelo de Almeida, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+xenografts+as+a+fast+screening+platform+for+bevacizumab+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy.</a> Communications Biology. 3, 1-13 (2020).</li>
<li>Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Xenografts+Unveil+Sensitivity+to+Olaparib+beyond+BRCA+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status.</a> Cancers. 12, 1769(2020).</li>
<li>Osmani, N., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+Imaging+of+Metastasis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish.</a> Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).</li>
<li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+Fate+of+Tumor+Extracellular+Vesicles+at+High+Spatiotemporal+Resolution+Using+the+Zebrafish+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).</li>
<li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+zebrafish+avatars+as+radiotherapy+sensitivity+reporters+-+towards+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine.</a> EBioMedicine. 51, 102578(2020).</li>
<li>Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Avatars+towards+Personalized+Medicine-A+Comparative+Review+between+Avatar+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models.</a> Cells. 9, 293(2020).</li>
<li>TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE">https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</a> (2021).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Xenograft+Model+in+Zebrafish+for+High-Resolution+Investigating+Dynamics+of+Neovascularization+in+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors.</a> Plos One. , (2011).</li>
<li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooking+the+big+one%3A+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models & Mechanisms. 7, 745-754 (2014).</li>
<li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate%2C+migrate%2C+produce+melanin%2C+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+New+Age+of+Chemical+Screening+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The New Age of Chemical Screening in Zebrafish.</a> Zebrafish. 7, 1(2010).</li>
<li>Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.invivogen.com/review-mycoplasma">https://www.invivogen.com/review-mycoplasma</a> (2016).</li>
<li>van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+of+metastasis%3A+cell+invasion+and+endothelial+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutation Research. 728, 23-34 (2011).</li>
</ol>

Rosnące znaczenie danio pręgowanego jako modelu rozwoju nowotworów i badań przesiewowych leków zaowocowało licznymi publikacjami 3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Jednak wstrzykiwanie komórek rakowych do zarodków danio pręgowanego jest techniką, która wymaga wysokiego poziomu zręczności, co może stanowić wyzwanie dla badaczy. W niniejszym protokole staramy się dostarczyć praktycznych informacji i wskazówek, które mogą pomóc w przezwyciężeniu początkowych wyzwań związanych z zakładaniem ksenoprzeszczepów zarodków danio pręgowanego.
Postępowanie z komórkami przed wstrzyknięciem Ten zoptymalizowany protokół generowania ksenoprzeszczepów danio pręgowanego z liniami komórkowymi można dostosować do różnych typów komórek (nowotworowych) o różnej morfologii. Zalecamy, aby wszystkie linie komórkowe używane do ksenoprzeszczepów danio pręgowanego były wolne od mykoplazmy. W przeciwieństwie do innych zanieczyszczeń bakteryjnych, obecność mykoplazmy w hodowli komórkowej nie powoduje zmian, które można łatwo wykryć pod mikroskopem22. Zanieczyszczenie mykoplazmą może wpływać na potencjał wszczepiania linii komórkowych, ich wrażliwość na leki, a także na żywotność zarodków danio pręgowanego.
Chociaż komórki mogą nadal się namnażać przez dłuższy czas, ich fenotyp i genotyp mogą być podatne na zmiany. Ważne jest, aby zapoznać się z morfologią i zachowaniem linii komórkowych w hodowli. Zalecamy utrzymanie liczby pasaży komórkowych po rozmrożeniu w zakresie 3-12, aby uzyskać powtarzalne wyniki. Dlatego należy przeprowadzać regularne badania na obecność mykoplazmy.
Komórki powinny znajdować się w fazie logarytmicznej (faza wzrostu wykładniczego przed osiągnięciem konfluencji ~70%) w dniu wstrzyknięcia. Umożliwi to odpowiednie wszczepienie i prawidłowy rozwój charakterystycznych cech charakterystycznych guza. Aby zapobiec zmianom w fenotypie komórek w obrębie ksenoprzeszczepu, kluczowe znaczenie ma utrzymanie stałej konfluencji dla wstrzyknięć między eksperymentami. Liczba wstrzykiwanych komórek może być dostosowana do charakterystyki każdej linii komórkowej, ponieważ niektóre mogą wymagać większej gęstości wstrzyknięcia, aby rozwijać się w zarodkach danio pręgowanego.
Uwagi dotyczące etykietowania komórek Aby lepiej uwidocznić ludzkie komórki nowotworowe do wstrzyknięcia i przyszłej analizy, komórki nowotworowe można znakować barwnikami fluorescencyjnymi. Ze względu na różnice w wielkości komórek, całkowita liczba komórek/cm2 w przylegających kulturach różni się między liniami komórkowymi. Będzie to miało wpływ na skuteczność protokołu barwienia, a także na liczbę komórek pobranych do wstrzyknięcia. Duże komórki, które dają niską liczbę kolb na kolbę (np. Hs578T) lub rosną w klastrach (tj. BFTC905), będą wymagały połączenia kilku kolb w jednym eksperymencie. W takim przypadku barwienie komórek nie powinno być wykonywane bezpośrednio w kolbie, ponieważ spowoduje to użycie nadmiernej ilości barwnika (wysoki koszt). Z drugiej strony, komórki, które są bardzo wrażliwe na nadmierne cykle wirowania, a także te, które dają duże liczby na kolbę (tj. HCT116), mogą być barwione bezpośrednio w kolbie, a następnie odłączane za pomocą skrobaczki EDTA/komórek (więcej informacji znajduje się w Tabeli 1).
Jeśli to możliwe, zamiast stosować podejście enzymatyczne, należy użyć EDTA do odłączenia komórek w dniu wstrzyknięcia, tak aby komórki szybciej odzyskiwały swoje połączenia komórka-komórka i były poddawane mniejszej liczbie etapów wirowania. Niemniej jednak, jeśli komórki są wrażliwe na EDTA, bardzo przylegają lub rosną w skupiskach - można zastosować metodę enzymatyczną. Optymalizacja idealnego stężenia do iniekcji, jak również pożywki iniekcyjnej zależy od charakterystyki każdej linii komórkowej, dlatego może wymagać pewnych korekt (tabela 1).
Kalibracja mikroiniekcji W przeciwieństwie do dostarczania oligonukleotydów lub leków do zarodka danio pręgowanego, siatka nie jest używana do kalibracji igły podczas pracy z liniami komórkowymi do ksenoprzeszczepów. Po pewnym czasie podczas wstrzykiwania komórki zaczną się zatykać i konieczne jest przecięcie końcówki igły, aby zwiększyć jej średnicę lub całkowicie zmienić igłę. Ta procedura utrudnia kalibrację siatki.
Aby rozwiązać ten problem, liczba dozowanych komórek jest regulowana przez ciśnienie wyrzutu i czas potrzebny do osiągnięcia rozmiaru podobnego do oka zarodka w ciągu 1-3 impulsów. Następnie, aby dalej kontrolować wielkość guza, w rozdzielczości 1 dpi, ksenoprzeszczepy są sortowane według wielkości guza, jak pokazano na rycinie 6 B-B". Jak pokazano na przykładzie z ryc. 6C , ta metoda sortowania jest skuteczna w zmniejszaniu zmienności rozmiarów guza: jeśli zsumujemy je wszystkie razem (+, ++, +++), STEV jest ~dwukrotnie wyższy od klasy ++ (~906 komórek do ~422 komórek), a zmienność współczynnika wynosi ~31,9% w porównaniu do 14,5% w klasie ++. Ponieważ odniesieniem do wstrzykiwań jest objętość, całkowita liczba komórek różni się znacznie w zależności od typu komórek - zależy od wielkości i kształtu komórek. Na przykład duże komórki z dużą ilością cytoplazmy, takie jak rak piersi Hs578T, wytwarzają znacznie mniejsze guzy (~ 600 komórek). Ponadto każda linia komórkowa wymaga innej liczby komórek. Na przykład linie komórkowe HT29 CRC i RT112 raka pęcherza moczowego wykazały, że im większa liczba wstrzykniętych komórek, tym wyższa śmiertelność danio pręgowanego. W związku z tym potrzebny jest okres optymalizacji podczas opracowywania ksenoprzeszczepów, aby sprawdzić, czy linia komórkowa ma działanie toksyczne w zarodku lub wymaga większej/mniejszej gęstości iniekcji.
Wstrzyknięcia Jedną z najczęstszych rozbieżności podczas generowania ksenoprzeszczepów zarodków danio pręgowanego jest miejsce wstrzyknięcia. Żółtko jest zwykle wybieranym miejscem do wstrzykiwania ze względu na jego łatwą dostępność. Zaobserwowaliśmy jednak, że komórki wstrzyknięte do żółtka mają większą tendencję do obumierania. Chociaż jest to trudniejsze technicznie, zalecamy wstrzyknięcie do PVS i jak najdalej od serca. W obrębie PVS komórki mogą się agregować, rekrutować naczynia krwionośne i komórki odpornościowe, migrować, wewnątrznaczynieniowo, wynaczyniać i tworzyć mikroprzerzuty, jeśli wykazują cechy przerzutowe 8,11.
Skuteczność wszczepienia Oczekuje się, że różnice w skuteczności wszczepienia i wielkości guza między liniami komórkowymi w rozdzielczości 4 dpi wynikają z ich różnych stopni podstawowej śmierci/przeżycia/proliferacji komórek, ale także ze względu na wrodzoną immunogenność, którą każda linia komórkowa może wykazywać9.
Przerzutów Przerzuty to wieloetapowa kaskada zdarzeń, które można podzielić na dwa dowolne etapy. W pierwszym etapie komórki nowotworowe muszą oderwać się od miejsca pierwotnego, migrować i zaatakować sąsiednie tkanki, a następnie przedostać się do krwiobiegu. W drugim etapie komórki nowotworowe muszą przetrwać w krążeniu, wynaczynić z naczyń krwionośnych lub limfatycznych, a na koniec skolonizować się w miejscach wtórnych23. Aby odróżnić te wczesne i późne zdarzenia oraz zająć się potencjałem/biegłością różnych komórek nowotworowych do wykonywania tych kroków, zaprojektowaliśmy prosty test.
Ogólnie rzecz biorąc, po wstrzyknięciu do PVS komórki nowotworowe mogą dostać się bezpośrednio do krążenia, a następnie zostać fizycznie uwięzione w ogonowej tkance krwiotwórczej (CHT) (obszar ogonowy). Jednak zgodnie z charakterystyką każdej komórki nowotworowej - widzieliśmy, że niektóre komórki nowotworowe pozostają na CHT 4 dpi i są w stanie tworzyć mikroprzerzuty, podczas gdy inne komórki nowotworowe znikają (oczyszczone po złapaniu w CHT).
Dlatego, porównując skuteczność mikroprzerzutów (przy 4 dpi), gdy komórki zostały umieszczone bezpośrednio w krążeniu - CIRC (komórki muszą przejść tylko późne etapy przerzutów) vs. gdy nie - NO CIRC (komórki muszą przejść przez wczesne i późne etapy, aby móc utworzyć mikroprzerzuty), możemy ocenić ich wczesny lub późny potencjał przerzutowy. Zaobserwowaliśmy komórki nowotworowe, które mogą skutecznie tworzyć mikroprzerzuty w CHT w obu grupach (CIRC i NO CIRC), co sugeruje, że komórki te mają zdolność do przechodzenia wszystkich etapów kaskady przerzutowej (na przykład SW480 i MDA-MB-468)8,11. W przeciwieństwie do tego, inne komórki nowotworowe mają bardzo niski potencjał przerzutowy w obu grupach, prawie nigdy nie wytwarzają mikroprzerzutów, nawet po wstrzyknięciu do krążenia (tj. widoczne w CHT przy 24 hpi, ale przy 4 dpi już ich tam nie ma, na przykład Hs578T)8. Jednak wyraźnie znaleźliśmy inną grupę - taką, która jest w stanie wytworzyć mikroprzerzuty dopiero po wstrzyknięciu do krążenia (mikroprzerzuty możemy zaobserwować tylko w grupie CIRC). Sugeruje to, że komórki te mają niską skuteczność w wykonywaniu pierwszych kroków kaskady przerzutowej, ale z drugiej strony są w stanie przetrwać w krążeniu, wynaczynić i skolonizować odległe miejsce.
Barwienie immunologiczne i obrazowanie Przed utrwaleniem ten protokół iniekcji może być używany do innych podejść do obrazowania na żywo, takich jak mikroskopia kontrastu różnicowego interferencyjnego na żywo (DIC), mikroskopia z wirującym dyskiem, obrazowanie konfokalne na żywo o wysokiej rozdzielczości i mikroskopia arkuszy świetlnych itp.
Martwe komórki i szczątki komórkowe wydają się jasne, gdy są obserwowane przez fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy i mogą być mylone z żywymi komórkami, zwłaszcza jeśli celem badania jest ocena potencjału przerzutowego linii komórkowych. Pragniemy podkreślić znaczenie wykonywania obrazowania konfokalnego ze specyficznymi markerami żywotności i DAPI w celu oceny stanu przeżycia guza i mikroprzerzutów. Fundamentalne znaczenie ma również stosowanie specyficznych ludzkich przeciwciał do wykrywania komórek ludzkich, takich jak mitochondria anty-ludzkie lub anty-ludzkie HLA. Wdrażając protokół, trenuj oczy eksperymentatora, porównując barwienie w mikroskopie stereoskopowym z obrazami konfokalnymi. Po pewnym czasie eksperymentatorzy są w stanie wyraźnie odróżnić szczątki od żywych komórek w fluorescencyjnym mikroskopie stereoskopowym.
Chociaż powszechnie stosowane są inne metody ilościowego określania obciążenia guza, takie jak cały obszar fluorescencji, zalecamy wykonanie barwienia immunologicznego całej góry i obrazowania konfokalnego jako dokładniejszą metodę. Nie tylko skuteczność barwienia barwnikami lipofilowymi jest bardzo zmienna (tj. niektóre komórki są bardzo dobrze wybarwione, a inne nie - prawdopodobnie ze względu na zawartość lipidów w ich błonach), ale także wielokrotnie barwniki lipofilowe tworzą agregaty, a martwe komórki wydają się być jaśniejsze - tworząc kilka artefaktów, które można pomylić z żywymi komórkami.
Komórki mogą być transdukowane za pomocą białek fluorescencyjnych, aby pomóc w ich śledzeniu i pominąć znakowanie komórek. Należy jednak upewnić się, że transdukowane i nietransdukowane komórki dają takie same wyniki w ksenoprzeszczepach danio pręgowanego.
Ponadto makrofagi mogą fagocytować te fluorescencyjne szczątki komórek, stając się znakowane fluorescencyjnie i migrować, generując fałszywie dodatnie komórki przerzutowe. Dlatego zalecamy szereg narzędzi analitycznych, które oczywiście można rozszerzyć na wiele innych odczytów w celu dokładniejszej interpretacji zachowania guza:
<ul style="list-style-type: square;">
	<li>Proliferacja - kwantyfikacja figur mitotycznych za pomocą przeciwciała DAPI lub anty-pHH3Ser10 (Merck Millipore Cat. #06-570),</li>
	<li>Śmierć komórki przez apoptozę – przeciwciało antyaktywowane Kaspazą3Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) lub równoważne,</li>
	<li>Wielkość guza - liczenie DAPI - ludzkie komórki nowotworowe wykazują bardzo wyraźną organizację chromatyny, dzięki czemu można je łatwo odróżnić od komórek danio pręgowanego i zawsze można je dokładnie sprawdzić za pomocą barwnika (podczas treningu oka),</li>
	<li>Do badań przerzutowych, w celu jednoznacznego wykrycia komórek ludzkich, - anty-ludzkie HLA (Abcam EP1395Y Kat. #ab52922), anty-ludzkie mitochondria (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).</li>
</ul>
W przypadku akwizycji konfokalnej z odstępem 5 μm między warstwami w stosie Z kontrolnych komórek rakowych HCT116 (średnia wielkość jądra 10-12 μm średnicy) z barwieniem przeciwstawnym DAPI, zaobserwowaliśmy, że ~ 50% komórek jest współdzielonych między dwoma kolejnymi plasterkami. W związku z tym, jeśli każdy wycinek jest liczony, istnieje duże ryzyko dwukrotnego policzenia tych samych komórek. Przechodzenie tam i z powrotem między wycinkami w celu uniknięcia problemów z kwantyfikacją skutkuje czasochłonną i podatną na błędy techniką. Aby ułatwić kwantyfikację całkowitej liczby komórek i umożliwić większą odtwarzalność między badaczami, stworzyliśmy wzór na wielkość guza opisany wcześniej w tym protokole8.
Dołączyliśmy numer poprawki (1,5), aby uwzględnić ~50% komórek współdzielonych między wycinkami. Okazało się, że średni błąd ręcznego liczenia całego guza między badaczami wynosił 20%. Dwóch badaczy korzystających z tej formuły miało 2% błąd. Zastosowanie tej formuły ma 93% wskaźnik dokładności i 98% wskaźnik odtwarzalności. Przetestowaliśmy również metody automatyczne, ale wykazały one błąd wyższy niż 50% spowodowany ustawieniami progowymi.
Ze względu na charakterystykę komórek apoptotycznych kwantyfikacja aktywowanych komórek kaspazy 3 jest trudniejsza. Aby zmniejszyć liczbę błędów i różnic w wynikach, zalecamy, aby próbki kontrolne i eksperymentalne były liczone przez tego samego badacza. Dodatkowo, ucząc się tej techniki, nowy badacz musi liczyć obrazy, które zostały już określone ilościowo przez bardziej doświadczonych badaczy, aby porównać wyniki i trenować.
W razie potrzeby czas trwania testu można wydłużyć. Należy jednak wziąć pod uwagę, że larwy danio pręgowanego wymagają żywienia od ~7 dni po zapłodnieniu (5 dni po wstrzyknięciu). Ponadto wytyczne i przepisy dotyczące dobrostanu zwierząt stosowane w przypadku larw starszych niż 6 dni po zapłodnieniu mogą się różnić.
Protokół ten zapewnia przydatne narzędzia, które umożliwiają pojedynczemu badaczowi wstrzyknięcie około ~ 200-300 larw danio pręgowanego na godzinę; oraz wyniki pełnego testu, w tym analizy i interpretacji statystycznej, uzyskane w ciągu trzech tygodni. Mamy nadzieję, że ten protokół pomoże naukowcom stać się ekspertami w generowaniu ksenoprzeszczepów danio pręgowanego. Nie jest to łatwe; Musisz ćwiczyć, ale dotrzesz do celu. Powodzenia!

Danio rerio) staje się potężnym modelowym organizmem kręgowców do badania rozwoju i chorób. Danio pręgowany ma wysoce konserwatywne cechy genetyczne (~70% homologii genetycznej i ~84% genów związanych z chorobą) i podstawowe cechy morfologiczne narządów z ludźmi1,2. Ta ochrona pozwala na wykorzystanie danio pręgowanego do modelowania kilku chorób ludzkich, w tym raka3,4.
Obsługa i utrzymanie danio pręgowanego jest znacznie łatwiejsze i bardziej opłacalne niż myszy ze względu na ich małe rozmiary, wysoką płodność przez cały rok i zewnętrzne nawożenie3,5. Zarodki danio pręgowanego nie wymagają żywienia w ciągu pierwszych 5-7 dni życia i są wykorzystywane jako skuteczny model rozwoju, infekcji i raka1,4,6,7. Zarodki danio pręgowanego wykluwają się po 48 godzinach od zapłodnienia (hpf) i są zwierzętami swobodnie pływającymi z uformowanymi wszystkimi narządami, bijącym sercem i funkcjonalnym układem krążenia, wątrobą, mózgiem, szpikiem nerkowym itp.1,3. Ponadto, na tym etapie rozwoju w grę wchodzi tylko odporność wrodzona, odporność adaptacyjna wciąż się rozwija, co pozwala na ogólnie efektywne wszczepianie komórek ludzkich bez potrzeby stosowania mutantów z obniżoną odpornością7,8. Niemniej jednak ważne jest, aby pamiętać, że nie wszystkie ludzkie komórki wszczepiają się jednakowo9 i że na przykład w przypadku komórek białaczkowych wykazano, że fagocyty (neutrofile i makrofagi) muszą zostać zubożone, aby skutecznie wszczepić10.
Genetyczna zdolność do wykonywania danio pręgowanego i optyczna przezroczystość jego wczesnych stadiów embrionalnych pozwalają na obrazowanie intrażyciowe pojedynczej komórki w wysokiej rozdzielczości, a tym samym na tworzenie najnowocześniejszych technik obrazowania w różnych dziedzinach biologii. Ponadto, w kontekście raka, funkcje te są przydatne do badań w czasie rzeczywistym najwcześniejszych etapów interakcji gospodarz-guz, takich jak badanie potencjału angiogennego i przerzutowego, a także interakcji z wrodzonym układem odpornościowym8,9,11,12,13.
Chociaż w krótkim teście ksenoprzeszczepu nie ma czasu na "ewolucję" przerzutową - możliwe jest przeanalizowanie zdolności komórek nowotworowych do przerzutowania (tj. ich zdolności do przechodzenia przez etapy przerzutowe, takie jak inwazja, wynaczynienie, przeżycie w krążeniu, wynaczynienie i kolonizacja, a zatem badanie tych procesów in vivo i w czasie rzeczywistym8,11, 13,14).
Cechy jego cyklu życiowego stawiają danio pręgowanego jako unikalny model dla spersonalizowanej medycyny w leczeniu raka. Testy można przeprowadzić w krótszym czasie, a wyniki można uzyskać w ciągu kilku tygodni7,8,9,11,12,15,16. Szybkość i wykonalność tych testów daje lekarzom i badaczom możliwość uzyskania wyników translacyjnych, które mogą być przydatne dla pacjentów z rakiem, dla których czas jest niezbędną potrzebą.
Pomimo coraz częstszych prób generowania udanych ksenoprzeszczepów zarodków danio pręgowanego, nadal istnieje potrzeba standaryzacji procedury iniekcji, jak również oceny żywotności komórek i zachowania guza po wstrzyknięciu.
W tym protokole dostarczamy badaczom jasny i szczegółowy przewodnik krok po kroku dotyczący wstrzykiwania ludzkich linii komórek rakowych do embrionów danio pręgowanego i późniejszej fiksacji, barwienia immunologicznego, obrazowania i kwantyfikacji zachowania komórek nowotworowych.

<table><tbody><tr><td>Agar do bakteriologii</td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td>Płytka agarowa</td></tr><tr><td>anty-kaspaza3Asp175 (monoklonalny królik)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>9661</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe do barwienia immunologicznego całej góry (Rozcieńczenie 1:100)</td></tr><tr><td>anty-ludzkie HLA (monoklonalne królika)</td><td>Abcam EP1395Y</td><td>ab52922</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe do barwienia immunologicznego całej góry (Rozcieńczenie 1:100)</td></tr><tr><td>anty-488 (monoklonalny królik)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35552</td><td>Przeciwciało drugorzędowe do barwienia immunologicznego całego wierzchowca (Rozcieńczenie 1:200)</td></tr><tr><td>anty-594 (monoklonalne królika)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35560</td><td>Przeciwciało drugorzędowe do barwienia immunologicznego całej góry (Rozcieńczenie 1:200)</td></tr><tr><td>CellTracker Deep Red Dye</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific C34565</td><td>Barwnik lipofilowy (Rozcieńczenie 1:1000)</td></tr><tr><td>CellTracker Zielony barwnik CMFDA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Barwnik lipofilowy (rozcieńczenie 1:1000)</td></tr> <tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa 50 ml</td><td>VWR</td><td>525-0610</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa 15 ml</td><td>VWR</td><td>525-0604</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserowy ściągacz do mikropipet jądrowych i chromosomowych P-2000</td><td>Sutter-Instrument</td><td></td><td> Ściągacz</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Abdos</td><td>P10202</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, krawędź tnąca</td><td>RS France</td><td>BPB016</td><td>Szkiełka do montażu</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>Medium montażowe</td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa Picopump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>Mikrowtryskiwacz</td></tr><tr><td>Prostokątne okulary nakrywkowe, Menzel Gl&auml; ser</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>631-9430</td><td>Szkiełka nakrywkowe do montażu</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td>Płytka agarowa</td></tr><tr><td>Cienkościenne szklane kapilary</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>Kapilary borokrzemianowe</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605036</td><td>Enzymatyczny roztwór odrywający</td></tr><tr><td>Wazelina</td><td></td><td></td><td>Wazeli uszczelnienie</td></tr><tr><td>Vybrant CM-DiI Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22888</td><td>Barwnik lipofilowy (Rozcieńczenie 1:1000)</td></tr><tr><td>Vybrant DiO Roztwór do znakowania komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td>Barwnik lipofilowy (Rozcieńczenie 1:1000)</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Zoom.V16 do biologii</td><td>ZEISS</td><td></td><td>&nbsp; Fluorescencyjny mikroskop stereo zmiennoogniskowy</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710</td><td>Mikroskop konfokalny</td> <td>ZEISS</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Ksenoprzeszczepy larw danio pręgowanego są szeroko wykorzystywane do badań nad rakiem w celu przeprowadzenia badań in vivo i w czasie rzeczywistym nad ludzkim rakiem. Możliwość szybkiej wizualizacji odpowiedzi na terapie przeciwnowotworowe (chemioterapia, radioterapia i leki biologiczne), angiogenezy i przerzutów z rozdzielczością pojedynczych komórek, stawia model ksenoprzeszczepu danio pręgowanego jako najlepszy wybór do opracowania badań przedklinicznych.

Test ksenoprzeszczepu larwalnego danio pręgowanego ma kilka zalet eksperymentalnych w porównaniu do innych modeli, ale prawdopodobnie najbardziej uderzającą jest zmniejszenie skali rozmiaru, a co za tym idzie czasu. To zmniejszenie skali pozwala na obrazowanie pojedynczych komórek, wykorzystanie stosunkowo niewielkiej liczby komórek ludzkich (zgodnych z biopsjami), średnio-wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków, ale co najważniejsze umożliwia znaczne skrócenie czasu testu. Wszystkie te zalety sprawiają, że test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego jest niezwykle atrakcyjny dla przyszłych zastosowań medycyny spersonalizowanej.

Wiele protokołów ksenoprzeszczepu danio pręgowanego zostało opracowanych z uwzględnieniem szerokiej gamy ludzkich nowotworów; jednak nadal brakuje ogólnego i ustandaryzowanego protokołu do efektywnego generowania ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego. Tutaj przedstawiamy protokół krok po kroku, ze wskazówkami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi dotyczącymi analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Ksenoprzeszczepy danio pręgowanego są szeroko stosowane w badaniach nad rakiem. Możesz wziąć ludzkie komórki nowotworowe i wstrzyknąć je małym larwom danio pręgowanego, a nawet dorosłym. Tutaj prezentujemy protokół krok po kroku modelu larw, w którym możemy zbadać kilka cech charakterystycznych raka u żywego zwierzęcia.Możesz badać proliferację, możesz badać angiogenezę, możesz badać przerzuty, a także interakcje w mikrośrodowisku guza. Dużą zaletą jest to, że możesz to przestudiować w bardzo krótkim czasie. Na przykład tylko cztery dni.Kolejną wielką zaletą jest to, że można to badać na żywo z rozdzielczością pojedynczej komórki, za pomocą mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu z arkuszem świetlnym. Możesz badać, w jaki sposób komórki migrują, jak komórki oddziałują ze sobą, a nawet jak ze sobą rozmawiają. Jest to więc naprawdę potężny model do badania biologii raka.Ksenoprzeszczepy danio pręgowanego mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi na terapie przeciwnowotworowe, takie jak chemioterapia, radioterapia, a nawet terapie celowane z przeciwciałami. I wreszcie, protokół ten można również dostosować do wykorzystania komórek pochodzących od pacjenta z próbki chirurgicznej, a nawet z biopsji, a następnie wygenerować awatary danio pręgowanego. Przygotowanie do wstrzyknięcia.Dwa tygodnie przed wstrzyknięciem należy rozbudować komórki w hodowli. Zacznij od nadmiaru komórek i nadmiaru ryb, aż osiągniesz biegłość w technice, ponieważ wiele komórek i ryb zostanie utraconych podczas treningu. Tabela pierwsza w załączonym pliku PDF zawiera szczegółowy przewodnik po optymalnym procencie konfluencji in vitro dla wstrzyknięcia kilku linii komórkowych.Trzy dni przed wstrzyknięciem należy skrzyżować danio pręgowanego na pożądanym tle. 24 godziny przed wstrzyknięciem. Oczyść płytki zarodkowe danio pręgowanego.Wyrzucić wszystkie martwe i nierozwinięte zarodki i odświeżyć podłoże E3. W pomieszczeniu do hodowli komórkowych wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowych. Umyj raz PBS 1X, aby usunąć martwe komórki i dodać świeże podłoże.Przygotuj narzędzia do procedury wstrzykiwania, takie jak igły do mikroiniekcji, płytki agarozowe i spinki do włosów, aby wyrównać zarodki do wstrzyknięcia. W celu przygotowania płytki wlej jedną warstwę rozpuszczonej 2% agarozy do pokrywki czystej szalki Petriego. Pozwól mu spolimeryzować i za pomocą linijki wykonaj trzy do czterech prostych linii agarozy w celu wyrównania zarodków.Dzień wstrzyknięcia. Oddziel wyklute zarodki od niewyklutych jaj. Dodanie Pronazy do pożywki zarodkowej na tym etapie może przyspieszyć wylęganie.Umieść zarodki w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza do momentu wstrzyknięcia. Znakowanie komórek do wstrzykiwań. Aby pomóc w ustaleniu powtarzalnej techniki znakowania komórek, sprawdź tabele pierwszą i drugą pisemnego protokołu, aby uzyskać zestawienie listy linii komórkowych i kilku roztworów do etykietowania.Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i dwukrotnie umyć kolbę PBS 1X. Oznaczyć komórki barwnikiem lipofilowym, unikając ekspozycji na światło, i inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni. Możesz również zdecydować się na oznaczenie komórek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml po odłączeniu.Usuń roztwór do etykietowania komórek i umyj komórki PBS 1X, aby usunąć nadmiar barwnika. Dodać odpowiedni środek oddzielający i inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ułatwić proces odłączania, szczotkując kolbę sterylnym skrobakiem do komórek i zbierając komórki za pomocą pipety serologicznej.Przenieść komórki do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i odwirować. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad na pożywce do hodowli komórkowych. Określ ilościowo żywotność komórek za pomocą komory Neubauera z wykluczeniem błękitu trypanowego lub innej wybranej metody.Odwirować i ponownie zawiesić komórki w podłożu iniekcyjnym. Zalecane stężenia komórek w pożywce znajdują się w tabeli pierwszej manuskryptu. Od tego momentu komórki muszą być trzymane na lodzie.Procedury iniekcyjne. Znieczulaj zarodki w tricaine 1X przez 5 minut. Następnie przenieś niewielką ilość znieczulonych zarodków na płytkę agarozową i wyrównaj je za pomocą pętli spinki do włosów.Upewnij się, że zachowasz odległość między zarodkami. Zwłaszcza między żółtkiem jednego a główką drugiego. Aby zapobiec śmiertelności, upewnij się, że wyrównane zarodki nie wysychają na płytce agarozy, ostrożnie dodając jedną do trzech kropli roztworu tricainy 1X do płytki.Lekko postukaj w probówkę mikrowirówki, aby ponownie zawiesić komórki. Do igły iniekcyjnej należy ponownie naładować zawiesinę komórek za pomocą końcówki Microloadera, unikając pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one zagrozić integralności zarodków. Otwórz zawór ciśnienia powietrza, ustaw mikrowtryskiwacz i ostrożnie umieść igłę do mikroiniekcji w uchwycie.Przeciąć igłę do mikroiniekcji blisko końcówki. Ostrożnie przekłuć żółtko zarodka, obniżając kąt igły i ostrożnie popychając, aż końcówka igły dotrze do przestrzeni okołojajowej. Gdy końcówka znajdzie się w przestrzeni okołookwiatowej, wstrzyknij komórki.Spróbuj wstrzyknąć objętość komórek podobną do wielkości oka zarodka i jak najdalej od serca, aby zapobiec obrzękowi serca. W razie potrzeby wyreguluj ciśnienie mikrowtryskiwacza. Przenieś wstrzyknięte zarodki na czystą szalkę Petriego z roztworem tricainy 1X i pozostaw je na pięć do 10 minut.To da rana czas na zamknięcie. Usuń roztwór tricainy 1X i dodaj świeże podłoże E3. Następnie inkubuj zarodki w temperaturze 34 stopni Celsjusza.Taka temperatura pozwoli na przeżycie zarówno zarodków danio pręgowanego, jak i ludzkich komórek nowotworowych. Test przerzutowy. Jeśli chcesz zbadać potencjał przerzutowy swoich linii komórkowych, około godziny po wstrzyknięciu, przebadaj wstrzyknięte zarodki pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym i podziel je na dwie grupy w zależności od braku lub obecności komórek rakowych w krążeniu.Jeden dzień po wstrzyknięciu. Na stereomikroskopie fluorescencyjnym dokładnie przeanalizuj każdy zarodek i wybierz te z prawidłowo wstrzykniętymi guzami. Sortuj wybrane ksenoprzeszczepy według wielkości guza.Do porównania użyj wielkości oka. Wyrzuć wszelkie zarodki z nieprawidłową morfologią, obrzękiem serca lub żółtka, ksenoprzeszczepy z bardzo małą ilością komórek rakowych lub te, które mają komórki rakowe tylko wewnątrz żółtka. Rozprowadź ksenoprzeszczepy zgodnie z pożądanym układem eksperymentalnym i rozpocznij test leku.Leki i pożywkę E3 należy wymieniać codziennie. Inkubować ksenoprzeszczepy, utrzymując temperaturę 34 stopni Celsjusza do końca testu. Cztery dni po wstrzyknięciu.W ostatnim dniu testu znieczulij ksenoprzeszczepy roztworem trikainy 1X i ostrożnie wyrównaj je na płytce agarowej. Wyrzuć wszystkie martwe lub spuchnięte ksenoprzeszczepy. Te ksenoprzeszczepy nie są brane pod uwagę przy ilościowym określaniu dawki przeszczepu.Na stereomikroskopie fluorescencyjnym dokładnie przeanalizuj każdy ksenoprzeszczep i oceń brak lub obecność guzów w przestrzeni okołofluornej. Zgodnie z konfiguracją eksperymentalną, wybierz interesujące Cię ksenoprzeszczepy i poddaj je eutanazji za pomocą tricaine 25X. Utrwal je w 4% formaldehydzie przez co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej, aby przystąpić do barwienia immunologicznego.W przeciwnym razie przechowuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnego dnia zastąp formaldehyd 100% metanolem. Ksenoprzeszczepy utrwalone w 100% metanolu mogą być przechowywane w temperaturze 20 stopni w nieskończoność. Barwienie immunologiczne całego mocowania do obrazowania konfokalnego.Cała technika immunofluorescencji mount trwa trzy dni, podzielone w następujący sposób. Pierwszy dzień przeznaczony jest na przenikanie ksenoprzeszczepów i inkubację przeciwciał pierwotnych. Drugi dzień do mycia i wtórnej inkubacji przeciwciał.I trzeci dzień, do mycia, utrwalania ksenoprzeszczepów i przechowywania w podłożu montażowym. Więcej szczegółów na temat tej procedury można znaleźć w załączonym pliku PDF. Montaż ksenoprzeszczepów.Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego wazeliną lub smarem silikonowym, aby medium montażowe nie wyciekało. Za pomocą pipety Pasteura przenieś ksenoprzeszczepy na szkiełko nakrywkowe. Ostrożnie wyrównaj je spinką do włosów.Dodać podłoże montażowe do innego szkiełka nakrywkowego. Ostrożnie połącz oba szkiełka nakrywkowe i umieść je na szkiełku mikroskopowym, aby ułatwić manipulację. Obrazowanie konfokalne.Apochromatyczna soczewka obiektywowa z 25-krotnym zanurzeniem z korekcją wody jest optymalna do obrazowania guzów z rozdzielczością pojedynczej komórki. Pobieraj próbki za pomocą funkcji Z-Stack z odstępem pięciu mikronów między każdym plasterkiem. Otwórz surowe dane w oprogramowaniu Fidżi.Wybierz trzy reprezentatywne wycinki guza od góry, środka i dołu, na stos z, na ksenoprzeszczep. Otwórz wtyczkę Cell Counter z oprogramowania Fiji. W narzędziu Licznik komórek kliknij przycisk Zainicjuj, wybierz typ licznika i kliknij obraz, aby ręcznie uruchomić tryb zliczania.Za każde kliknięcie licznik, ile komórek zostało zliczonych. Aby uzyskać całkowitą liczbę komórek w guzie, użyj następującego wzoru. Aby ocenić całkowitą liczbę lub procent markerów, takich jak między innymi komórki odpornościowe, figury mitotyczne, aktywowana kaspaza, należy ręcznie określić ilościowo komórki, które są dodatnie dla określonego znakowania, markera lub transgenu będącego przedmiotem zainteresowania, wzdłuż wszystkich wycinków stosu z wtyczką Cell Counter.Należy pamiętać, że niektóre komórki będą znajdować się między dwoma wycinkami. Przechodź tam i z powrotem w stosie z, aby upewnić się, że żadna komórka nie jest liczona dwa razy. Reprezentatywne wyniki.Ksenografy linii komórkowej raka jelita grubego HCT 116 wygenerowano zgodnie z opisem w protokole. Ksenoprzeszczepy były losowo rozdzielane w nieleczonych kontrolach i chemioterapii FOLFIRI. Przeprowadzono immunofluorescencję w celu wykrycia komórek apoptotycznych przy użyciu przeciwciała przeciw rozszczepionej kaspazie-3 i DAPI do przeciwbarwienia nukleinów.Kwantyfikacja indeksu mitotycznego, apoptozy i wielkości guza wykazała, że FOLFIRI indukuje znaczny spadek mitozy i znaczną indukcję apoptozy, której towarzyszy zmniejszenie wielkości guza o 54%. Cechy te są przydatne w wysokoprzepustowych fenotypowych badaniach przesiewowych leków, a także do testowania wewnętrznych i fizjologicznych efektów komórkowych kilku metod leczenia raka w krótkim czasie. Kolejną wielką zaletą modelu ksenoprzeszczepu danio pręgowanego jest to, że możliwe jest badanie interakcji różnych komórek nowotworowych i analizowanie, w jaki sposób każdy typ komórki może wpływać na zachowanie drugiego.Różne ludzkie komórki rakowe, różne klony z tego samego guza lub z różnych nowotworów, mogą być wstrzykiwane jednocześnie. W tym przykładzie dwie linie komórkowe raka jelita grubego pochodzące od tego samego pacjenta zostały oznaczone różnymi barwnikami lipofilowymi i zmieszane w stosunku jeden do jednego do wstrzyknięcia. Mamy nadzieję, że ten protokół pomoże naukowcom stać się prawdziwymi ekspertami w generowaniu ksenoprzeszczepów danio pręgowanego.Nie jest to łatwe. Trzeba ćwiczyć, ćwiczyć. Nie poddawaj się.Jestem pewien, że tam dotrzesz. Powodzenia.

generation-of-zebrafish-larval-xenografts-and-tumor-behavior-analysis

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje technikę tworzenia modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z danio pręgowanego. W protokole próbki oceniamy skuteczność leków Gemcytabina i Navitoclax na modelu ksenoprzeszczepu guza trzustki.

Ksenoprzeszczep danio pręgowanego od pacjenta (zPDX): model raka

Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania komórek raka piersi do przestrzeni okołobiałkowej transgenicznych embrionów danio pręgowanego. Po inkubacji wizualizujemy zarodek pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby obserwować inwazję, rozprzestrzenianie się i przerzuty komórek rakowych.

Analiza inwazyjności zPDX: badanie inwazyjnego zachowania przerzutowych komórek rakowych w ksenoprzeszczepach zarodków danio pręgowanego

Ten film opisuje test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego w celu oceny powstawania nowotworów in vivo i zbadania efektu środków terapeutycznych.

Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego: metoda oceny skuteczności przeciwnowotworowej leków na rakotwórczość u danio pręgowanego in vivo

Przeszczepianie komórek nowotworowych jest ważnym narzędziem do identyfikacji mechanizmów nowotworowych i odpowiedzi terapeutycznych. Obecne techniki opierają się na zwierzętach niekompetentnych immunologicznie. W tym miejscu opisujemy metodę przeszczepiania komórek nowotworowych danio pręgowanego do zarodków kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowej analizy zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki in vivo.

Przeszczepianie pediatrycznych guzów mózgu danio pręgowanego do gospodarzy kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowego badania zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki

Ten protokół opisuje procedury optymalizacyjne w opartym na wirusie, dwufluorescencyjnie znakowanym modelem ksenoprzeszczepu guza, wykorzystującym larwy danio pręgowanego jako gospodarzy. Ten heterogeniczny model ksenoprzeszczepu naśladuje skład tkankowy mikrośrodowiska raka trzustki in vivo i służy jako bardziej precyzyjne narzędzie do oceny reakcji leków w spersonalizowanych modelach zPDX (ksenoprzeszczep pobrany od pacjentów z danio pręgowanego).

Heterogeniczny model ksenoprzeszczepu raka trzustki uzyskany od pacjenta z wykorzystaniem larw danio pręgowanego jako gospodarzy do porównawczej oceny leków

Celem tej metody jest wygenerowanie in vivo modelu angiogenezy guza poprzez ksenografowanie komórek nowotworowych ssaków do zarodka danio pręgowanego, który ma fluorescencyjnie znakowane naczynia krwionośne. Obrazując ksenoprzeszczep i związane z nim naczynia, można uzyskać ilościowy pomiar odpowiedzi angiogennej.

Obrazowanie in vivo i kwantyfikacja odpowiedzi angiogennej gospodarza w ksenoprzeszczepach guza danio pręgowanego

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Modele przedkliniczne mają na celu poszerzenie wiedzy na temat biologii nowotworów i przewidywanie skuteczności leczenia. W artykule opisano wytwarzanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (zPDX) na podstawie danio pręgowanego z fragmentami tkanki nowotworowej. ZPDX leczono chemioterapią, której efekt terapeutyczny oceniano pod kątem apoptozy komórek przeszczepionej tkanki.

Opracowanie ksenoprzeszczepów raka trzustki od pacjentów danio pręgowanego do testów wrażliwości na chemoterapię

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół automatycznego wszczepiania ksenoprzeszczepu nowotworowego larwam danio pręgowanego za pomocą nowoczesnego robotycznego systemu iniekcji. Ponadto prezentujemy filmy z iniekcjami oraz dane walidacyjne pokazujące skuteczną wydajność systemu.

Automatyzacja implantacji guzów w larwach danio dano młodego dla badań i medycyny nowotworowej

Poznaj protokół generowania ksenoprzeszczepów w larwach Danio rerio z wykorzystaniem ludzkich komórek nowotworowych. Ta metoda umożliwia analizę proliferacji, angiogenezy i przerzutów w czasie zaledwie czterech dni.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Przeglądaj więcej filmów