Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
31 marca 2021
Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.
Protokół ten szczegółowo opisuje metodę generowania dobrze scharakteryzowanej populacji ludzkich hemogennych komórek śródbłonka. Komórki te można wykorzystać do badania regulacji molekularnej i przejścia ze śródbłonka do układu krwiotwórczego. Zacznij od hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przez cztery dni, aby zróżnicować je w pierwotne komórki śródbłonka.
Piątego dnia odessaj pożywkę powyżej komórek. Następnie delikatnie umyj komórki jednym mililitrem DMEM/F-12 na dołek. Dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanej hemogennej pożywki do różnicowania komórek śródbłonka do studzienki i inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
W szóstym i siódmym dniu zastąp pożywkę nad komórkami jednym mililitrem świeżo przygotowanej homogenicznej pożywki do różnicowania komórek śródbłonka na dołek i inkubuj komórki przez kolejne 24 godziny. W ósmym dniu. Po odłączeniu i umyciu komórek należy je równomiernie podzielić na probówki do mikrowirówek na lodzie, z których każda zawiera co najmniej 600 mikrolitrów komórek o gęstości 1 razy 10 do 5 komórek na mililitr.
Dodać przeciwciała do probówek zawierających komórki, jeśli to właściwe, i inkubować na lodzie, chronionym przed światłem przez 30 minut. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 1000 razy G i 4 stopnie Celsjusza przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki w 600 mikrolitrach lodowatego buforu sortującego.
Przecedzić próbki przez siatkową nasadkę filtra pięciomililitrową probówkę FACS i przechowywać komórki na lodzie chronionym przed światłem w celu natychmiastowego sortowania komórek. Aby wyizolować hemogenne komórki śródbłonka za pomocą FACS, najpierw należy przebramować populację komórek CD45-ujemnych. Następnie w populacji CD45-ujemnej bramkują komórki CD31-dodatnie.
Następnie w populacji CD31-dodatniej brama dla populacji komórek VE-kadheryno-ujemnych. A następnie w populacji VE-kadheryny-ujemnej, brama dla komórek c-Kit-dodatnich. Z populacji c-Kit dodatniej bramkuje się populację komórek CD34-dodatnich.
I wreszcie z populacji komórek CD34-dodatnich zidentyfikuj i zbierz komórki KDR-dodatnie. Po wysianiu hemogennych komórek śródbłonka w pożywce na bazie metylocelulozy opracowanej do wzrostu hematopoetycznych komórek progenitorowych, w ósmym dniu liczy się kolonie erytroidalne tworzące kolonie tworzące kolonie erytroidalne i kolonie erytroidalne tworzące wybuch. Jednostka tworząca kolonie-granulocyt-makrofag i jednostka tworząca kolonię-granulocyt, erytroid, makrofagi i megakariocyty.
Multipotencjalne krwiotwórcze kolonie progenitorowe są liczone w 14 dniu. Na 1000 hemogennych komórek śródbłonka platerowanych generowanych jest około 20 jednostek tworzących kolonie. W hodowlach widoczne są również komórki o morfologii komórek śródbłonka.
Są to hemogenne komórki śródbłonka, które dają początek wieloliniowym krwiotwórczym komórkom progenitorowym na poziomie pojedynczej komórki. Protokół ten to system hodowli bez surowicy 2D i mysiego karmnika, który może wygenerować ludzkie hemogenne komórki śródbłonka w ciągu około jednego tygodnia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół otrzymywania hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w czasie około jednego tygodnia. Metoda ta pozwala badaczom na wygenerowanie dobrze scharakteryzowanej populacji tych komórek, które są kluczowe dla badania przejścia śródbłonkowej w hematopoetyczną i mają potencjalne zastosowania w medycynie regeneracyjnej oraz produkcji produktów krwiopochodnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Biologia naczyń krwionośnych
- Hematopoeza
- Inżynieria tkankowa
Wstęp
- Naczynia krwionośne są niezbędne dla funkcjonowania tkanek i wyścielone są komórkami śródbłonka naczyniowego.
- Hemogenne komórki śródbłonka są wyspecjalizowanym podtypem, z którego w trakcie rozwoju powstają hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe.
- Generowanie tych komórek in vitro jest wartościowe dla badania rozwoju komórek krwi oraz w potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych.
- Istniejące protokoły otrzymywania komórek śródbłonka nie pozwalają na uzyskanie dobrze scharakteryzowanych hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich komórek macierzystych.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnego protokołu generowania hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.
- Umożliwienie badania regulacji molekularnej oraz przejścia śródbłonka w komórki krwiotwórcze (endothelial-to-hematopoietic transition) in vitro.
- Zapewnienie systemu bez komórek karmionek i bez surowicy, odpowiedniego do dalszych zastosowań.
Użyte metody
- Kulturowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i etapowa różnicowanie w ciągu ośmiu dni.
- Indukcja linii mezodermalnej i śródbłonkowej przy użyciu specyficznych czynników wzrostu i małych cząsteczek (np. inhibitora GSK3β, bFGF, BMP4, VEGF-A, kwasu retinowego).
- Cytometria przepływowa (FACS) do sekwencyjnego bramkowania i izolacji hemogennych komórek śródbłonka na podstawie markerów powierzchniowych (CD45-, CD31+, VE-cadherin-, c-Kit+, CD34+, KDR+).
- Ocena funkcjonalna za pomocą testów tworzenia kolonii w medium na bazie metylocelulozy w celu oceny potencjału krwiotwórczego.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na uzyskanie zdefiniowanej populacji hemogennych komórek śródbłonka w ciągu jednego tygodnia.
- Generowane jest około 20 jednostek tworzących kolonie na 1000 hemogennych komórek śródbłonka, co wskazuje na wysoki potencjał krwiotwórczy.
- Obserwuje się kolonie progenitorów erytroidalnych oraz wielopotencjalnych progenitorów hematopoetycznych.
- Morfologia komórek śródbłonka jest zachowana w hodowli, co potwierdza tożsamość komórek.
Wnioski
- Ten protokół bez użycia warstwy karmowej i bezsurowiczy pozwala na efektywne generowanie ludzkich hemogennych komórek śródbłonka z embrionalnych komórek macierzystych.
- Metoda ta ułatwia badania in vitro przejścia śródbłonkowa-hematopoetycznego oraz regulacji molekularnej.
- Stanowi ona platformę do potencjalnego generowania produktów krwi ex vivo i zmniejsza zależność od ludzkich dawców.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Kierowana różnicowanie hemogennych komórek śródbłonkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych rozwiązuje krytyczny problem w modelowaniu rozwoju krwiotwórczego oraz generowaniu linii krwi ex vivo. Możliwość ta pozwala na mechanistyczną redukcję ryzyka w analizie przejścia śródbłonkowo-krwiotwórczego i zwiększa pewność prognostyczną w początkowych etapach opracowywania terapii komórkowych oraz metod medycyny regeneracyjnej. Projekt protokołu, niewymagający komórek pokarmowych oraz surowicy, zwiększa powtarzalność i skalowalność w ramach portfeli badawczo-rozwojowych przedsiębiorstw.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia analizę szlaków molekularnych sterujących przejściem z komórek śródbłonkowych w hematopoetyczne.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów dla czynników wpływających na specyfikację linii krwi.
- Ułatwia predykcyjną ocenę ryzyka w odniesieniu do potencjalnych celów w rozwoju hematopoetycznym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną, dobrze scharakteryzowaną populację komórek do dalszych analiz funkcjonalnych.
- Umożliwia ilościową ocenę tworzenia kolonii krwiotwórczych z określonych komórek progenitorowych.
- Wspiera powtarzalne przesiewanie modulatorów wpływających na losy komórek śródbłonkowych lub krwiotwórczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Tworzy platformę do modelowania istotnych dla przebiegu chorób defektów hematopoetycznych in vitro.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do przedklinicznej walidacji strategii generowania komórek krwi.
- Wspiera optymalizację koncepcji terapii komórkowych w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając stabilną generację i izolację hemogennych komórek śródbłonka do badań mechanistycznych i testów funkcjonalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących regulacji molekularnej powstawania linii komórkowych krwi.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki tworzenia kolonii do analizy porównawczej.
- Analityka: Umożliwia bramkowanie w oparciu o cytometrię przepływową oraz kwantyfikację kolonii w celu uzyskania obiektywnych odczytów.
- Badania translacyjne: Łączy modelowanie in vitro z przedkliniczną oceną potencjału hematopoetycznego.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Oferuje skalowalny system bez komórek karmicieli, możliwy do adaptacji w różnych liniach komórek macierzystych i modelach chorób.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w modelowaniu linii hematopoetycznych i walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów różnicowania komórek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go w programach terapii komórkowej i medycyny regeneracyjnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację wczesnych kandydatów na terapie komórkowe z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz w protokołach ich różnicowania.
- Wymaga dostępu do aparatury do cytometrii przepływowej umożliwiającej wieloparametrową sortowanie komórek.
- Konieczna jest standaryzacja strategii bramkowania oraz kwantyfikacji kolonii pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych ludzkich linii komórek macierzystych poprzez optymalizację protokołu.
- Zależność od zwalidowanych paneli przeciwciał oraz funkcjonalnych testów opartych na metylocelulozie.
