Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
31 marca 2021
Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.
Protokół ten szczegółowo opisuje metodę generowania dobrze scharakteryzowanej populacji ludzkich hemogennych komórek śródbłonka. Komórki te można wykorzystać do badania regulacji molekularnej i przejścia ze śródbłonka do układu krwiotwórczego. Zacznij od hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przez cztery dni, aby zróżnicować je w pierwotne komórki śródbłonka.
Piątego dnia odessaj pożywkę powyżej komórek. Następnie delikatnie umyj komórki jednym mililitrem DMEM/F-12 na dołek. Dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanej hemogennej pożywki do różnicowania komórek śródbłonka do studzienki i inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
W szóstym i siódmym dniu zastąp pożywkę nad komórkami jednym mililitrem świeżo przygotowanej homogenicznej pożywki do różnicowania komórek śródbłonka na dołek i inkubuj komórki przez kolejne 24 godziny. W ósmym dniu. Po odłączeniu i umyciu komórek należy je równomiernie podzielić na probówki do mikrowirówek na lodzie, z których każda zawiera co najmniej 600 mikrolitrów komórek o gęstości 1 razy 10 do 5 komórek na mililitr.
Dodać przeciwciała do probówek zawierających komórki, jeśli to właściwe, i inkubować na lodzie, chronionym przed światłem przez 30 minut. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 1000 razy G i 4 stopnie Celsjusza przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki w 600 mikrolitrach lodowatego buforu sortującego.
Przecedzić próbki przez siatkową nasadkę filtra pięciomililitrową probówkę FACS i przechowywać komórki na lodzie chronionym przed światłem w celu natychmiastowego sortowania komórek. Aby wyizolować hemogenne komórki śródbłonka za pomocą FACS, najpierw należy przebramować populację komórek CD45-ujemnych. Następnie w populacji CD45-ujemnej bramkują komórki CD31-dodatnie.
Następnie w populacji CD31-dodatniej brama dla populacji komórek VE-kadheryno-ujemnych. A następnie w populacji VE-kadheryny-ujemnej, brama dla komórek c-Kit-dodatnich. Z populacji c-Kit dodatniej bramkuje się populację komórek CD34-dodatnich.
I wreszcie z populacji komórek CD34-dodatnich zidentyfikuj i zbierz komórki KDR-dodatnie. Po wysianiu hemogennych komórek śródbłonka w pożywce na bazie metylocelulozy opracowanej do wzrostu hematopoetycznych komórek progenitorowych, w ósmym dniu liczy się kolonie erytroidalne tworzące kolonie tworzące kolonie erytroidalne i kolonie erytroidalne tworzące wybuch. Jednostka tworząca kolonie-granulocyt-makrofag i jednostka tworząca kolonię-granulocyt, erytroid, makrofagi i megakariocyty.
Multipotencjalne krwiotwórcze kolonie progenitorowe są liczone w 14 dniu. Na 1000 hemogennych komórek śródbłonka platerowanych generowanych jest około 20 jednostek tworzących kolonie. W hodowlach widoczne są również komórki o morfologii komórek śródbłonka.
Są to hemogenne komórki śródbłonka, które dają początek wieloliniowym krwiotwórczym komórkom progenitorowym na poziomie pojedynczej komórki. Protokół ten to system hodowli bez surowicy 2D i mysiego karmnika, który może wygenerować ludzkie hemogenne komórki śródbłonka w ciągu około jednego tygodnia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę generowania dobrze scharakteryzowanej populacji ludzkich komórek endoteliohematogenicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w około 1 tydzień. Te komórki mogą być wykorzystane do badania regulacji molekularnej i przejścia z komórek endoteliowe na hematopoetyczne.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Różnicowanie komórek
- Biologia komórek macierzystych
- Hematopoeza
Tło
- Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Komórki endoteliowe endoteliohematogeniczne odgrywają kluczową rolę w tworzeniu krwi.
- Zrozumienie ich różnicowania jest istotne dla medycyny regeneracyjnej.
- Ten protokół zapewnia uproszczone podejście do generowania tych komórek.
Cel badania
- Ustanowienie niezawodnej metody różnicowania komórek endoteliohematogenicznych.
- Ułatwienie badań nad przejściem z komórek endoteliowe na hematopoetyczne.
- Dostarczenie zasobów do badania mechanizmów molekularnych w hematopoezie.
Zastosowanie metod
- Hodowla ludzkich zarodkowych komórek macierzystych przez cztery dni.
- Płukanie komórek za pomocą pożywki DMEM/F-12.
- Dodanie pożywki do różnicowania komórek endoteliohematogenicznych.
- Inkubacja komórek w 37 stopniach Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.
Główne wyniki
- Udane wygenerowanie komórek endoteliohematogenicznych.
- Charakteryzacja zróżnicowanej populacji komórek.
- Wgląd w regulację molekularną hematopoezy.
- Potencjalne zastosowania w medycynie regeneracyjnej i modelowaniu chorób.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia proste podejście do generowania komórek endoteliohematogenicznych.
- Otwierają nowe możliwości dla dalszych badań nad rozwojem komórek krwi.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu zbadania różnych zaburzeń hematopoezy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells addresses a critical bottleneck in modeling hematopoietic development and generating blood lineages ex vivo. This capability enables mechanistic de-risking of endothelial-to-hematopoietic transition and supports predictive confidence in early-stage cell therapy and regenerative medicine pipelines. The protocol's feeder-free, serum-free design enhances reproducibility and scalability for enterprise R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of molecular pathways governing endothelial-to-hematopoietic transition.
- Supports functional target validation for factors influencing blood lineage specification.
- Facilitates predictive de-risking of candidate targets in hematopoietic development.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, well-characterized cell population for downstream functional assays.
- Enables quantitative assessment of hematopoietic colony formation from defined progenitors.
- Supports reproducible screening of modulators affecting endothelial or hematopoietic fate.
Translational & Preclinical Research
- Establishes a platform for modeling disease-relevant hematopoietic defects in vitro.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of blood cell generation strategies.
- Supports risk-adjusted advancement of cell-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust generation and isolation of hemogenic endothelial cells for mechanistic studies and functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on molecular regulation of blood lineage emergence.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative colony-forming outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides flow cytometry-based gating and colony quantification for objective readouts.
- Translational Research: Bridges in vitro modeling with preclinical evaluation of hematopoietic potential.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, feeder-free system adaptable across stem cell lines and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in hematopoietic lineage modeling and target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell differentiation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for cell therapy and regenerative medicine programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of early-stage cell-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human pluripotent stem cell culture and differentiation protocols.
- Demands access to flow cytometry instrumentation for multi-parameter cell sorting.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and colony quantification.
- Adaptable to various human stem cell lines with protocol optimization.
- Dependent on validated antibody panels and methylcellulose-based functional assays.
