Name: Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 23 s
Description: Poznaj metodę różnicowania hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich komórek macierzystych w ciągu tygodnia. Protokół umożliwia badanie przejścia śródbłonkowo-krwiotworczego i ma zastosowanie w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty NIH HL128064 i U2EB017103. Dalszego wsparcia udzielił grant CT Innovations 15-RMB-YALE-04.

<ol><li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li>
<li>Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHBV%2Fbioglass+composite+scaffolds+with+co-cultures+of+endothelial+cells+and+bone+marrow+stromal+cells+improve+vascularization+and+osteogenesis+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering.</a> RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).</li>
<li>Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvasculature%3A+An+essential+component+for+organ-on-chip+systems%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems.</a> MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).</li>
<li>Gritz, E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).</li>
<li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%3A+Methods%2C+considerations%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li>
<li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+endothelial+cells+in+scalable+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).</li>
<li>Cossu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lancet+Commission%3A+Stem+cells+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine.</a> The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).</li>
<li>Fox, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+differentiated+pluripotent+stem+cells+in+replacement+therapy+for+treating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease.</a> Science. 345 (6199), 1247391(2014).</li>
<li>Mahla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+applications+in+regenerative+medicine+and+disease+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics.</a> International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).</li>
<li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li>
<li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li>
<li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells%3A+from+2D+to+3D+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li>
<li>Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress%2C+obstacles%2C+and+limitations+in+the+use+of+stem+cells+in+organ-on-a-chip+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).</li>
<li>Ramme, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+induced+pluripotent+stem+cell-derived+four-organ-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Science+OA%22%5BJournal%5D)">Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip.</a> Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).</li>
<li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-a-Chip%3A+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li>
<li>Kane, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+endothelial+cells+from+human+embryonic+stem+cells+by+directed+differentiation%3A+analysis+of+microrna+and+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).</li>
<li>Costa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+endothelial+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+fully+defined+medium+enables+identification+of+lysophosphatidic+acid+and+platelet+activating+factor+as+regulators+of+eNOS+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).</li>
<li>Nguyen, M. T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+endothelial+progenitor+cells+on+laminins+in+defined+and+xeno-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems.</a> Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).</li>
<li>Ikuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+robust+differentiation+of+endothelial+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+via+lineage+control+with+VEGF+and+cyclic+AMP%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP.</a> PLOS One. 12 (3), 0173271(2017).</li>
<li>Aoki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+and+purification+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+progenitor+cells+and+expansion+with+the+use+of+inhibitors+of+ROCK%2C+TGF-B%2C+and+GSK3B%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B.</a> Heliyon. 6 (3), 03493(2020).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li>
<li>Orlova, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li>
<li>Kusuma, S., Gerecht, S. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKusuma%2C+S+%22Human+Embryonic+Stem+Cell+Protocols%22">Human Embryonic Stem Cell Protocols</a>. Turksen, K. , Humana Press. New York, NY. 213-222 (2014).</li>
<li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+wnt+activation+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).</li>
<li>Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+derivation+of+endothelial+lineages+from+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200(2019).</li>
<li>Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+specification+of+pluripotent+stem+cell+derived+endothelial+cells+toward+arterial+and+venous+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143(2019).</li>
<li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communications. 8 (1), 2149(2017).</li>
<li>Dalton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+cell+cycle+to+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Linking the cell cycle to cell fate decisions.</a> Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).</li>
<li>Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity+of+arteries%2C+veins%2C+and+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics.</a> Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).</li>
<li>Rocha, S. F., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+differentiation+and+specialization+of+vascular+beds%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Molecular differentiation and specialization of vascular beds.</a> Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).</li>
<li>Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+directing+the+formation+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+murine+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis.</a> Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).</li>
<li>Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+is+essential+for+embryonic+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development.</a> Cell. 155 (1), 215-227 (2013).</li>
<li>Marcelo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemogenic+endothelial+cell+specification+requires+c-kit%2C+notch+signaling%2C+and+p27-mediated+cell-cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control.</a> Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).</li>
<li>Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+endothelial+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of endothelial cell plasticity.</a> Nature Communications. 8 (1), 14361(2017).</li>
<li>Ottersbach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-haematopoietic+transition%3A+an+update+on+the+process+of+making+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood.</a> Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).</li>
<li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li>
<li>Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+promotes+endothelial+cell+cycle+early+g1+state+to+enable+human+hemogenic+endothelial+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification.</a> Cell Reports. 33 (9), 108465(2020).</li>
<li>Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+arterial+and+venous+endothelial+cells+under+feeder-+and+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261(2015).</li>
<li>Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemogenic+endothelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+feeder-+and+xeno-free+defined+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823(2019).</li>
<li>Galat, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-free+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+efficiently+produces+hemogenic+endothelium+with+lymphoid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67(2017).</li>
<li>Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Evidence+for+CD34+as+a+common+marker+for+diverse+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors.</a> Stem Cells. 32 (6), Dayton, Ohio. 1380-1389 (2014).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

W tym artykule przedstawiono etapy wytwarzania hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia przy użyciu mysiego systemu hodowli 2D bez karmnika i surowicy (ryc. 1). Protokół ten rozszerza metodę opisaną przez Srirama i in. (2015) w celu uzyskania pierwotnych EC38. Pierwotny charakter i potencjał specyfikacji CD31 + CD45-EC wykazano poprzez hodowlę tych komórek na płytkach pokrytych DLL4 i ...

Komórki śródbłonka (EC) to heterogeniczna populacja komórek, które pełnią wiele funkcji w całym ludzkim ciele i w zmodyfikowanych tkankach. Oprócz wspierania i regulowania innych typów komórek (np. kardiomiocytów1, komórek osteoblastycznych2), funkcje te obejmują tworzenie selektywnej bariery między krwią a tkankami oraz wspomaganie tworzenia tkanek3. Różnicowanie dojrzałych EC podczas normalnego rozwoju wymaga zróżnicowanych szlaków sygnałowych. Pierwotne EC pochodzą od progenitorów mezodermy, a następnie są określane w kierunku dojrzałych fenotypów tętnic, żylnych, włosowatych i limfatycznych4. Dodatkowo, niewielka podgrupa EC w pozaembrionalnym woreczku żółtkowym i embrionalnym regionie Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) jest również określona, aby stać się hemogennymi EC EC, które powodują powstawanie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC), które migrują do wątroby płodu i szpiku kostnego płodu, gdzie pozostają po urodzeniu i generują wszystkie typy komórek krwi przez całe życie4. Różnorodna gama fenotypów EC jest niezbędna dla rozwoju i utrzymania wszystkich tkanek.
Tak więc, EC i ich pochodne są kluczowymi komponentami badań mających na celu modelowanie i wyjaśnianie mechanizmów rozwoju i/lub chorób człowieka, a także zastosowań medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej5,6,7,8. Jednak głównym ograniczeniem dla tego typu badań jest brak dostępności pierwotnych ludzkich EC w wymaganej ilości. Szacuje się, że dla większości zastosowań terapeutycznych wymagane byłoby minimum 3 x 108 ECs6. Aby rozwiązać ten problem, zaproponowano wykorzystanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) ze względu na ich zróżnicowany potencjał rodowy i zdolność do generowania dużej liczby potomstwa6,9.
Rzeczywiście, przydatność komórek pochodzących z hESC lub hiPSC została wykazana w wielu badaniach skoncentrowanych na modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków10,11,12. Technologia Organ-on-a-Chip (OOC) została wykorzystana do wierniejszego odtworzenia fizjologii ludzkiego ciała poprzez integrację komórek i tkanek w trójwymiarowe rusztowania. Co więcej, połączenie wielu indywidualnych OOC (tzw. body- lub human-on-a-chip, BOC/HOC) może być realizowane za pomocą mikrofluidyki, aby umożliwić przesłuch między narządami będącymi przedmiotem zainteresowania13,14,15. Tkanki podporowe, takie jak naczynia krwionośne, są krytycznymi składnikami OOC i BOC/HOC; Włączenie układu naczyniowego pozwala na transport składników odżywczych, tlenu i czynników parakrynnych w tkankach, promując w ten sposób wymagane mikrośrodowisko specyficzne dla tkanki<klasa SUP="xref">3,<klasa SUP="xref">12. W związku z tym metody uzyskiwania dojrzałych ludzkich EC, takie jak EC tętnicze, żylne, limfatyczne i hemogenne, mają kluczowe znaczenie dla postępu w tych podejściach inżynierii tkankowej.
Opublikowano wiele protokołów szczegółowo opisujących etapy wyprowadzania ludzkich pierwotnych lub progenitorowych EC z hESC lub hiPSCs5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Wiele z tych protokołów opiera się na tworzeniu ciała zarodkowego (EB) lub wspólnej hodowli ESC/iPSC z mysią warstwą zasilającą komórki zrębu. Strategie te są zwykle trudne i czasochłonne, z niską wydajnością EC i/lub zanieczyszczeniem ludzkich EC komórkami mysimi. Protokoły, które opierają się wyłącznie na hodowli 2D bez użycia komórek zrębu, często wymagają długich indukcji, wykorzystują złożone kombinacje czynników wzrostu i / lub inhibitorów do indukcji, mają wydłużone okresy ekspansji po separacji komórek lub kombinację tych czynników. Pogłębienie wiedzy na temat szlaków sygnałowych i czynników biorących udział w wyprowadzaniu dojrzałych typów EC in vivo stanowi podstawę dla prostego i solidnego protokołu różnicowania in vitro.
Poprzednio, zidentyfikowano kluczowe role szlaków sygnałowych Notch i kwasu retinowego (RA) w specyfikacji mysich tętniczych i hemogennych EC podczas rozwoju. Szlak sygnałowy Notch odgrywa wiele ról w specyfikacji i utrzymaniu tętniczego fenotypu EC. Prace z wykorzystaniem mysiego modelu unaczynienia siatkówki pozwoliły zidentyfikować szlak, w którym naprężenie ścinające płyn indukuje oś sygnalizacyjną Notch-Cx37-p27, promując zatrzymanie cyklu komórkowego G1, co umożliwia tętniczą specyfikację EC27. Przypuszcza się, że stany cyklu komórkowego odgrywają rolę w decyzjach dotyczących losu komórki, zapewniając wyraźne okna możliwości, w których komórki są otwarte na pewne sygnały, które mogą indukować ekspresję genów i zmiany fenotypowe28. To zatrzymanie G1 za pośrednictwem Notch umożliwiło ekspresję genów wzbogaconych w tętnicze EC EC, w tym ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 i Notch 4 (recenzja w29,30). Wykazano również, że hemogenna specyfikacja EC jest promowana in vivo poprzez sygnalizację RA31,32. Dodatkowe badania wykazały, że po sygnalizacji RZS ekspresja c-Kit i Notch zwiększa p27, co umożliwia specyfikację hemogenną w woreczku z żółtkiem myszy i AGM33. Mysie hemogenne EC można minimalnie zidentyfikować na podstawie ekspresji markerów śródbłonka (tj. CD31, KDR), jak i hematopoetycznych (tj. c-Kit, CD34)4. Wreszcie, hemogenne EC przechodzą przemianę śródbłonkową do krwiotwórczej (EHT) w celu utworzenia HSPC, które mogą dać początek wszystkim typom komórek krwi4,34,35.
Ostatnie prace sprawdzały, czy ta sama hierarchia sygnalizacji może promować ludzką hemogenną specyfikację EC. W tym celu opracowano protokół hodowli 2D bez surowicy i karmy w celu uzyskania hemogennych EC z hESC, a te hemogenne EC scharakteryzowano na poziomie pojedynczej komórki jako CD31 + KDR+ c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45-. W badaniu wykorzystano również reporter wskaźnika cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencyjnej (FUCCI), który identyfikuje różne stany cyklu komórkowego przy użyciu H9-hESC, które wyrażają konstrukt reporterowy FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. W badaniach z tymi komórkami wykazano, że RZS sprzyja wczesnemu zatrzymaniu cyklu komórkowego G1 w ECs, a wczesny stan G1 umożliwia specyfikację hemogenną in vitro37. W niniejszym dokumencie przedstawiono szczegółowy protokół różnicowania tych ludzkich hemogennych komórek śródbłonka i testy potwierdzające ich tożsamość. Ta prosta metoda stanowi użyteczny sposób generowania tego wyspecjalizowanego podzbioru EC do przyszłych badań nad mechanizmami rozwoju ludzkich krwinek.

<table><tbody><tr><td>Szalki 15 cm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>hodowla tkankowa poddana obróbce</td></tr><tr><td>Szalki 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>kultura tkankowa poddane działaniu</td></tr><tr><td>6-dołkowych płytek</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>hodowla tkankowa poddana działaniu</td></tr><tr><td>odczynnika przeciwdrobnoustrojowego Nazwa marki: Normocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& Systemy D</td><td>233-FB-025</td><td>stosować w stężeniu 50 ng/ml</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>BioLegend</td><td>595202</td><td>stosować w stężeniu 25 ng/ml</td></tr><tr><td>albuminy surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do depatyzacji komórek Nazwa handlowa: Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DLL4</td><td>R& Systemy D</td><td>1506-D4/CF</td><td>rekombinowany człowiek; stosować przy 10 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>DMEM: F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka Nazwa handlowa: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)</td><td>Rurki Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>polistyren z okrągłym dnem z nasadką</td></tr> <tr><td>filtraPłodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gemini Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>ThermoFisher Scientific 33016015</td><td></td><td>stosowania w wieku 4 &mu; g/cm2</td></tr><tr><td>GSK3i/CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-02</td><td>10 mM kolba; stosować przy 5 &mu; </td></tr><tr><td>M Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Białko macierzy&nbsp; Nazwa handlowa: Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Zmniejszony współczynnik wzrostu. Zapoznać się ze świadectwem analizy dla partii w celu określenia stężenia białka (Matrigel). Stężenie to jest wymagane do obliczenia objętości Matrigelu zawierającego 1 mg białka.</td></tr><tr><td>Pożywka na bazie metylocelulozy Nazwa handlowa: MethoCult H4435 Enriched</td><td>Stemcell Technologies</td><td>4435</td><td></td></tr><tr><td>Pluripotencjalne podłoże różnicujące komórki macierzyste Nazwa handlowa: STEMdiff APEL 2</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5270</td><td></td></tr><tr><td>Pluripotencjalne komórki macierzyste: H1, H9, H9-FUCCI</td><td>WiCell</td><td>WA09 (H9), WA01 (H1)</td><td>człowiek; H9-FUCCI uzyskano z laboratorium dr Ludovica Valliera w Cambridge Stem Cell Institute</td></tr><tr><td>Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)</td> <td>Gibco</td><td>12040077</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50 mg</td><td>przy użyciu 0,5 &mu; M</td></tr><tr><td>Mistrz odwrotnej transkrypcji mix Nazwa handlowa: iScript Reverse Transcription Supermix</td><td>Zestaw do</td> ekstrakcji RNA <td>1708840</td><td></td>BioRad</tr><tr><td> Nazwa handlowa: RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek macierzystych Nazwa handlowa: mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green master mix Nazwa handlowa: iTaq Universal SYBR Green Master Mix</td><td>BioRad</td><td>1725121</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25299956</td><td>0,25%</td></tr> <tr><td>VEGF165 (VEGF-A)</td><td>PeproTech</td><td>100-20</td><td>stosować przy 50 ng/ml</td></tr><tr><td>&alpha;-CD31-FITC</td><td>BioLegend</td><td>303104</td><td>2 &mu; g/ml*</td></tr><tr><td>&alpha;-CD34-Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>343512</td><td>2 &mu; g/ml*</td></tr><tr><td>&alpha;-CD45-APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>304014</td><td>2 &m; g/ml*</td></tr><tr><td>&alpha;-c-Kit-APC</td><td>BioLegend</td><td>313206</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-Flk-1-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>359911</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-VE-Cadherin-PE</td><td>BioLegend</td><td>348506</td><td>2 &mu; g/ml*</td></tr><tr><td>* Koniugaty fluorescencyjne przeciwciał powinny być zoptymalizowane w oparciu o zastosowany sorter komórek. Poniżej przedstawiono końcowe stężenia wykorzystane w tym badaniu.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Naczynia krwionośne są wszechobecne we wszystkich tkankach ciała i pełnią różnorodne funkcje. W związku z tym uzyskanie dojrzałych komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, które wyściełają światło naczyń krwionośnych, z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych ma kluczowe znaczenie dla wielu zastosowań inżynierii tkankowej i regeneracji. In vivo pierwotne komórki śródbłonka pochodzą z linii mezodermalnej i są określone w określonych podtypach, w tym tętniczych, żylnych, włosowatych, hemogennych i limfatycznych. Hemogenne komórki śródbłonka są szczególnie interesujące, ponieważ podczas rozwoju dają początek hematopoetycznym komórkom macierzystym i progenitorowym, które następnie generują wszystkie linie krwi przez całe życie. W związku z tym stworzenie systemu do generowania hemogennych komórek śródbłonka in vitro dałoby możliwość zbadania przejścia ze śródbłonka do układu krwiotwórczego i może doprowadzić do produkcji ex vivo ludzkich produktów krwiopochodnych i zmniejszenia zależności od ludzkich dawców. Chociaż istnieje kilka protokołów wyprowadzania komórek progenitorowych i pierwotnych śródbłonka, nie opisano wytwarzania dobrze scharakteryzowanych hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich komórek macierzystych. W tym miejscu przedstawiono metodę wyprowadzania hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia: protokół różnicowania z prymitywnymi komórkami smugowymi utworzonymi w odpowiedzi na GSK3β inhibitor (CHIR99021), następnie indukcja linii mezodermy za pośrednictwem bFGF, a następnie rozwój pierwotnych komórek śródbłonka promowany przez BMP4 i VEGF-A, a na końcu specyfikacja hemogennych komórek śródbłonka indukowana przez kwas retinowy. Protokół ten daje dobrze zdefiniowaną populację hemogennych komórek śródbłonka, które można wykorzystać do dalszego zrozumienia ich regulacji molekularnej i przejścia ze śródbłonka do układu krwiotwórczego, co może być potencjalnie zastosowane w dalszych zastosowaniach terapeutycznych.

Schemat przedstawiający specyfikację pierwotnych EC oraz hemogennych EC z hESC, a także reprezentacyjny obraz komórek 24 h po wysianiu, pokazano na Rysunku 1. Po specyfikacji pierwotne EC i hemogenne EC są oczyszczane metodą FACS odpowiednio w 5. i 8. dniu. Pierwotne EC definiuje się jako CD31+ CD45-, a hemogenne EC jako CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-. Reprezentacyjną strategię bramkowania cyt...

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Protokół ten szczegółowo opisuje metodę generowania dobrze scharakteryzowanej populacji ludzkich hemogennych komórek śródbłonka. Komórki te można wykorzystać do badania regulacji molekularnej i przejścia ze śródbłonka do układu krwiotwórczego. Zacznij od hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przez cztery dni, aby zróżnicować je w pierwotne komórki śródbłonka.Piątego dnia odessaj pożywkę powyżej komórek. Następnie delikatnie umyj komórki jednym mililitrem DMEM/F-12 na dołek. Dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanej hemogennej pożywki do różnicowania komórek śródbłonka do studzienki i inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.W szóstym i siódmym dniu zastąp pożywkę nad komórkami jednym mililitrem świeżo przygotowanej homogenicznej pożywki do różnicowania komórek śródbłonka na dołek i inkubuj komórki przez kolejne 24 godziny. W ósmym dniu. Po odłączeniu i umyciu komórek należy je równomiernie podzielić na probówki do mikrowirówek na lodzie, z których każda zawiera co najmniej 600 mikrolitrów komórek o gęstości 1 razy 10 do 5 komórek na mililitr.Dodać przeciwciała do probówek zawierających komórki, jeśli to właściwe, i inkubować na lodzie, chronionym przed światłem przez 30 minut. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 1000 razy G i 4 stopnie Celsjusza przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki w 600 mikrolitrach lodowatego buforu sortującego.Przecedzić próbki przez siatkową nasadkę filtra pięciomililitrową probówkę FACS i przechowywać komórki na lodzie chronionym przed światłem w celu natychmiastowego sortowania komórek. Aby wyizolować hemogenne komórki śródbłonka za pomocą FACS, najpierw należy przebramować populację komórek CD45-ujemnych. Następnie w populacji CD45-ujemnej bramkują komórki CD31-dodatnie.Następnie w populacji CD31-dodatniej brama dla populacji komórek VE-kadheryno-ujemnych. A następnie w populacji VE-kadheryny-ujemnej, brama dla komórek c-Kit-dodatnich. Z populacji c-Kit dodatniej bramkuje się populację komórek CD34-dodatnich.I wreszcie z populacji komórek CD34-dodatnich zidentyfikuj i zbierz komórki KDR-dodatnie. Po wysianiu hemogennych komórek śródbłonka w pożywce na bazie metylocelulozy opracowanej do wzrostu hematopoetycznych komórek progenitorowych, w ósmym dniu liczy się kolonie erytroidalne tworzące kolonie tworzące kolonie erytroidalne i kolonie erytroidalne tworzące wybuch. Jednostka tworząca kolonie-granulocyt-makrofag i jednostka tworząca kolonię-granulocyt, erytroid, makrofagi i megakariocyty.Multipotencjalne krwiotwórcze kolonie progenitorowe są liczone w 14 dniu. Na 1000 hemogennych komórek śródbłonka platerowanych generowanych jest około 20 jednostek tworzących kolonie. W hodowlach widoczne są również komórki o morfologii komórek śródbłonka.Są to hemogenne komórki śródbłonka, które dają początek wieloliniowym krwiotwórczym komórkom progenitorowym na poziomie pojedynczej komórki. Protokół ten to system hodowli bez surowicy 2D i mysiego karmnika, który może wygenerować ludzkie hemogenne komórki śródbłonka w ciągu około jednego tygodnia.

directed-differentiation-hemogenic-endothelial-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Ten film demonstruje wieloetapowy proces różnicowania ludzkich iPSC w mikronaczyniowe komórki śródbłonka mózgu. Powstałe w ten sposób zróżnicowane komórki ściśle naśladują komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, charakteryzujące się ścisłymi połączeniami, co czyni je idealnymi do badań nad chorobami mózgu.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Ten protokół demonstruje indukcję programu hemogennego w ludzkich fibroblastach skóry poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych GATA2, GFI1B i FOS w celu wytworzenia hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Hemogenne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych

Celem tego artykułu jest dostarczenie ustandaryzowanego podejścia do indukowania różnicowania ludzkich komórek progenitorowych wątroby od pluripotencjalnych komórek macierzystych. Opracowanie tej procedury z gotowymi do użycia preparatami pożywek oferuje użytkownikowi łatwy system do generowania ludzkich komórek wątroby do badań biomedycznych i translacji.

Specyfikacja progenitorów wątroby z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu różnicowania

Tutaj opisujemy protokół, rozszerzoną metodę hodowli komórek śródbłonka (EECM), która umożliwia różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu (BMEC). Komórki te wykazują ekspresję cząsteczki adhezyjnej komórek śródbłonka, a zatem są modelem bariery krew-mózg odpowiednim do badania interakcji komórek odpornościowych in vitro.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich komórek macierzystych w ciągu tygodnia. Protokół umożliwia badanie przejścia śródbłonkowo-krwiotworczego i ma zastosowanie w medycynie regeneracyjnej.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów