In vitro Analiza funkcji ligazy ubikwityny E3

Ogólnym celem tego protokołu jest analiza ważnych kluczowych aspektów funkcji ligazy E3, w tym specyficzności enzymu E2, wyboru substratu i transferu ubikwityny. Główną zaletą tej techniki jest jej szerokie zastosowanie, ponieważ białka ze wszystkich źródeł eukariotycznych mogą być rekombinowane i badane in vitro bez konieczności stosowania specjalnego sprzętu. Przy pierwszym zastosowaniu techniki uwalniania lizyny ważne jest zoptymalizowanie parametrów testu, takich jak stężenia enzymów, w celu określenia idealnych warunków uwalniania dla wybranej ligazy E3.

Aby przeprowadzić test autoubikwitylacji in vitro, należy skonfigurować schemat pipetowania w celu przetestowania zdolności funkcjonalnej różnych enzymów E2 i przygotować mieszankę wzorcową na lodzie dla wszystkich reakcji ubikwitylacji oraz jednej dodatkowej reakcji. Następnie dodaj jeden mikromol enzymów E2 do odpowiednich probówek i inkubuj próbki w termocyklerze PCR przez dwie godziny we wskazanych warunkach. Po inkubacji dodać bufor próbki SDS do każdej reakcji i kilkakrotnie wymieszać pipetując.

Następnie natychmiast gotuj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut i przechowuj zdenaturowane białka w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić test ubikwitylacji substratu in vitro, należy przygotować schemat pipetowania dla wszystkich reakcji. Po obliczeniu ilości mieszanki wzorcowej wymaganej do jednej reakcji, należy przygotować mieszankę wzorcową dla wszystkich reakcji na lodzie i dodać mieszankę wzorcową do każdej probówki.

Dodaj odpowiednie ligazy E3 pojedynczo. Następnie inkubować próbki w termocyklerze PCR przez dwie godziny, jak pokazano. Pod koniec inkubacji dodać dwukrotny bufor próbki SDS do każdej reakcji, kilkakrotnie wymieszać pipetując i gotować próbki przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.

Aby przeprowadzić test wyładowania lizyny, należy skonfigurować schemat pipetowania dla reakcji ładowania i inkubować reakcje ładowania przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby zatrzymać reakcję ładowania, dodaj apyrazę do końcowego stężenia 1,8 jednostki na mililitr i inkubuj reakcję przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji dodać EDTA do końcowego stężenia 30 milimolowych i użyć podwójnie destylowanej wody, aby dostosować objętość reakcji do 30 mikrolitrów.

Aby rozładować ubikwitylację E2 przez E3, ustaw pięć probówek odpowiadających punktom czasowym eksperymentu, dodaj 6,7 mikrolitra nieredukującego buforu próbki do każdej probówki, usuń sześć mikrolitrów zatrzymanej reakcji ładowania z probówki punktu zerowego w czasie i dostosuj całkowitą objętość do 26,7 mikrolitrów. Aby ustawić reakcje wyładowania, dodaj podwójnie destylowaną wodę, bufor ubikwitylacyjny, BSA, lizynę, ligazę E3 i naładowany E2 do każdej reakcji. Po upływie wybranych okresów czasu przenieść 20-mikrolitrowe próbki z każdej reakcji rozładowania do odpowiedniej probówki z próbką.

Następnie natychmiast zwiruj próbki i umieść je w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 10 minut. W tej reprezentatywnej analizie Western blot nieaktywny CHIP nie był automatycznie ubikwitylowany. Jednak produkty ubikwityny niezależne od E3 powstawały w obecności nieaktywnego CHIP i przy braku CHIP.

CHIP typu dzikiego ulegał autoubikwitylacji w połączeniu z białkami z rodziny UBE2D i UBE2E, podczas gdy wolne łańcuchy poliubikwityny były wytwarzane we współpracy z białkami z rodziny UBE2D, ale nie z białkami z rodziny UBE2E. Wiązanie ubikwityny przez UBE2N/V1 ukierunkowało tworzenie wolnych łańcuchów ubikwityny. Automatyczną ubikwitylację i ubikwitylację UNC-45B zaobserwowano w przypadku CHIP typu dzikiego, ale nie w przypadku nieaktywnego mutanta CHIP, co wskazuje, że UNC-45B działa jako konserwatywny substrat dla CHIP.

Gdy aktywność katalityczną CHIP analizowano za pomocą testu wyładowczego lizyny, nienaładowany enzym UBE2D2 miał masę cząsteczkową 17 kilodaltonów, a naładowany UBE2D2 z pojedynczą cząsteczką ubikwityny miał masę cząsteczkową około 26 kilodaltonów. W czasie 0 zaobserwowano całą wydajność naładowanego E2. W obecności nieaktywnego CHIP wykryto słabe, niezależne od ligazy E3 wyładowanie UBE2D2, ale nie auto-ubikwitylację CHIP.

W obecności CHIP typu dzikiego rozładowanie UBE2D2 było szybkie i zakończyło się w ciągu 60 minut, a autoubikwitylacja CHIP wskazywała na przeniesienie ubikwityny na własne reszty lizyny. Ze względu na ograniczoną zdolność E2 należy pracować tak szybko, jak to możliwe i natychmiast przystąpić do reakcji wyładowania, a następnie SDS-PAGE i Western blotting. Zgodnie z tymi protokołami ubikwitylacji in vitro, specyficzne typy wiązań ubikwitylacyjnych można zidentyfikować, sondując Western blot za pomocą przeciwciał specyficznych dla wiązania.