Name: 15N Dyspersja relaksacyjna CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali czasowej μs-ms (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj metodę CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali μs-ms przy użyciu spektroskopii NMR. Protokół umożliwia analizę kinetyki i termodynamiki bez specjalistycznego przygotowania próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z NIGMS R35GM133488 oraz z Roy J. Carver Charitable Trust dla V.V.

1. Przygotowanie próbki do NMR
<ol>
	<li>Wyeksponować i oczyścić próbkę białka docelowego znakowanego 2H,15N. 
	UWAGA: Chociaż próbka białka znakowanego 15N może być wykorzystana do przeprowadzenia eksperymentu CPMG RD, perdeuteracja (tam, gdzie jest to możliwe) znacznie zwiększa jakość uzyskanych danych. Protokoły produkcji białek perdeuterowanych są dostępne w literaturze13.</li>
	<li>Wymienić bufor oczyszczonej próbki białka na odgazowany bufor do NMR.</li>
	<li>Przenieść próbkę NMR do probówki NMR. 
	UWAGA: Stężenie próbki NMR musi zostać starannie zoptymalizowane w celu maksymalizacji stosunku sygnału do szumu oraz zminimalizowania występowania oddziaływań białko-białko. Generalnie typowy zakres stężeń dla eksperymentów CPMG wynosi 0,1-1,0 mM.</li>
</ol>
2. Pierwsze przygotowanie eksperymentu NMR
<ol>
	<li>Pobierz i rozpakuj Pliki uzupełniające.</li>
	<li>Skopiuj pliki bits.vv oraz trosy_15N_cpmg.vv (znajdujące się w folderze pulseprogram) do katalogu programów impulsowych (&lt;path&gt;/exp/stan/nmr/lists/pp/user). 
	UWAGA: Upewnij się, że ścieżka do pliku bits.vv podana w pierwszej linii pliku trosy_15N_cpmg.vv jest poprawna.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do akwizycji i skopiuj wcześniej przeprowadzony eksperyment 1H-15N HSQC do nowego eksperymentu, używając komendy edc.</li>
	<li>Za pomocą komendy pulprog załaduj program impulsowy trosy_15N_cpmg.vv do nowo utworzonego eksperymentu.</li>
	<li>Skonfiguruj eksperyment CPMG zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi na końcu pliku programu impulsowego (trosy_15N_cpmg.vv).</li>
</ol>
3. Rutynowa konfiguracja eksperymentu NMR
<ol>
	<li>Wprowadź próbkę do magnesu i wykonaj wszystkie podstawowe kroki akwizycji dowolnego eksperymentu NMR: zablokuj pole i wykonaj shimming próbki; dopasuj i dostrój kanały 1H oraz 15N.</li>
	<li>Ustaw p1 i p7 na czas trwania odpowiednio twardych impulsów 90° dla 1H i 15N. 
	UWAGA: Dla uzyskania optymalnych wyników ważne jest bardzo dokładne skalibrowanie impulsu 90° dla 15N. Kalibrację zazwyczaj przeprowadza się przy użyciu próbki 100 mM mocznika znakowanego 15N w DMSO, zgodnie z opisem w instrukcji spektrometru. Ponadto możliwe jest ponowne sprawdzenie kalibracji bezpośrednio na roboczej próbce NMR poprzez akwizycję pierwszego inkrementu widma 1H-15N HSQC, w którym impuls 90° dla 15N w pierwszym bloku INEPT zastąpiono impulsem 180°. Jeśli kalibracja jest poprawna, sygnał powinien zostać wygaszony.</li>
	<li>W oknie akwizycji ustaw centrum i szerokość widma dla wymiarów 1H i 15N. 
	UWAGA: W celu optymalnej supresji sygnału wody wycentruj widmo 1H na częstotliwości sygnału wody.</li>
	<li>Ustaw opóźnienie relaksacyjne (d30) na wartość równą 0,7 T2, gdzie T2 jest oczekiwanym czasem relaksacji poprzecznej 15N Twojego białka. 
	UWAGA: Wartość d30 można optymalizować empirycznie w celu uzyskania najlepszych wyników.</li>
	<li>Użyj polecenia vclist , aby stworzyć listę liczb całkowitych odpowiadających parametrowi n na Rysunku 1A i Rysunku 1B. Upewnij się, że każdy wpis na liście odpowiada innemu polu CPMG (νcpmg) zgodnie z wzorem νcpmg = 4 x n / d30. Upewnij się, że pierwszą liczbą na liście jest 0 (odpowiada to eksperymentowi referencyjnemu, w którym pomijany jest blok CPMG, a d30 = 0 s) i nie używaj liczb większych niż 1 000 x d30 / 4. Liczby przekraczające ten próg skutkują νcpmg &gt; 1 kHz i mogą uszkodzić sondę.</li>
	<li>Ustaw l8 na liczbę wpisów w vclist, l3 na liczbę punktów rzeczywistych dla wymiaru pośredniego (zazwyczaj dla l3 ustawia się zakres 64–200), a 1 td na wartość równą l8 x l3 x 2. 
	UWAGA: Wykonaj kroki 3.7–3.11, aby zoptymalizować supresję wody.</li>
	<li>Ustaw wzmocnienie odbiornika (rg) na 1; otwórz plik programu impulsowego (edcpul), przejdź do linii 91, usuń średnik poprzedzający goto 999 i zapisz plik.</li>
	<li>Za pomocą polecenia gs dostrój parametry spdb0 (lub spdw0), aby zminimalizować intensywność sygnału FID.</li>
	<li>Przywróć średnik w linii 91 pliku programu impulsowego i zapisz plik.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.7–3.9, aby zoptymalizować spdb11 (linia 168 pliku programu impulsowego), spdb2 (linia 179 pliku programu impulsowego) oraz pldb2 (linia 184 pliku programu impulsowego).</li>
	<li>Uruchom polecenie rga , aby zoptymalizować wzmocnienie odbiornika.</li>
	<li>Ustaw liczbę skanów (ns) na wielokrotność 8.</li>
	<li>Uruchom polecenie zg, aby rozpocząć eksperyment.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie i analiza danych NMR
<ol>
	<li>Skopiuj folder o nazwie Process (Supplemental Files) do katalogu zawierającego plik ser.</li>
	<li>Użyj plików sep_fid.com i ft2D.com do przetworzenia danych NMR. 
	UWAGA: Instrukcje dotyczące edycji skryptów przetwarzania znajdują się w plikach sep_fid.com i ft2D.com.</li>
	<li>Otwórz w programie Sparky pliki ucsf znajdujące się w katalogu CPMG_Sparky_files. 
	UWAGA: Pliki ucsf są tworzone przez skrypty przetwarzające. Dla każdego wpisu w vclist istnieje jeden plik ucsf. Pierwszy plik ucsf (test_1.ucsf) zawiera eksperyment referencyjny. Kolejne pliki ucsf (test_2.ucsf, test_3.ucsf, …, test_n.ucsf) są uporządkowane od najniższej do najwyższej wartości νcpmg.</li>
	<li>Wyznacz piki krosowe NMR na referencyjnym widmie NMR (test_1.ucsf).</li>
	<li>Zaznacz wszystkie wyznaczone piki krosowe, używając polecenia Sparky pa.</li>
	<li>Uruchom polecenie Sparky rh. Polecenie to otwiera okno dialogowe. Wybierz opcję heights at the same position in each spectrum. Kliknij Setup i zaznacz wszystkie widma NMR. Kliknij Update i zapisz plik wynikowy w katalogu roboczym. Plik wynikowy zawiera macierz intensywności sygnałów dla wszystkich otwartych widm NMR. 
	UWAGA: W literaturze opisano dokładniejsze protokoły wykorzystujące dopasowywanie kształtu linii (lineshape fitting) w celu odzyskania intensywności z przeplatanych eksperymentów pseudo-3D14. Bezpłatne oprogramowanie do dopasowywania kształtu linii jest dostępne pod adresami https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA) oraz w ramach NMRPipe (moduł nLinLS) i SPARKY (moduł it).</li>
	<li>Dla każdego pola CPMG przelicz intensywności sygnałów na szybkości R2 korzystając z wzoru <img alt="Równanie równowagi statycznej; R₂=1/d₃₀ ln(I₀/Iₓ₃₀); metoda analizy wzoru." src="/files/ftp_upload/62395/62395eq03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3">, gdzie I0 i Id30 to odpowiednio intensywność widm NMR referencyjnego (vc = 0) i relaksacyjnego (vc &gt; 0). 
	UWAGA: W Supplemental Files znajduje się szablon pliku arkusza kalkulacyjnego (R2_calc.xls) służący do przeliczania intensywności sygnałów na szybkości R2 oraz do wizualizacji profili RD.</li>
	<li>Odczytaj poziom szumu w widmie referencyjnym za pomocą polecenia Sparky st i przeprowadź propagację błędu dla szybkości R2. 
	UWAGA: W Supplemental Files znajduje się szablon pliku arkusza kalkulacyjnego (R2_calc.xls) służący do propagacji błędu dla zmierzonych szybkości R2.</li>
</ol>
5. Dopasowanie krzywych RD
<ol>
	<li>Skopiuj folder o nazwie RD_fitting (Pliki uzupełniające) do katalogu roboczego.</li>
	<li>Dla każdego przypisanego sygnału NMR oszacuj RProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. poprzez obliczenie <img alt="Równanie R2 w stanach niskim i wysokim, ilustrujące dynamiczną zmianę częstotliwości na schemacie naukowym." src="/files/ftp_upload/62395/62395eq04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 4">. <img alt="R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;lowF&lt;/sup&gt;, wzór chemiczny, równanie, zapis naukowy, zastosowanie edukacyjne." src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 5"> i <img alt="Równowaga statyczna; symbol matematyczny R₂^highF; reprezentacja wzoru fizycznego." src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 6"> czy R2 prędkości zmierzone przy najniższej i najwyższej wartości νCPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) w liście vclist.</li>
	<li>Wizualnie sprawdź krzywe RD za pomocą programu RPrzykładowy tekst do tłumaczenia nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści źródłowej w języku angielskim, abym mógł przygotować profesjonalne tłumaczenie na język polski zgodnie z wytycznymi. większe niż dwukrotność szacowanego błędu i odrzucić wszystkie krzywe RD, które są zbyt zaszumione, aby można było je dokładnie zamodelować. 
	UWAGA: Szum na Rex mogą być propagowane z błędów w <img alt="R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;lowF&lt;/sup&gt;, wzór chemiczny, równanie, zapis naukowy, zastosowanie edukacyjne." src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 5"> i <img alt="Równowaga statyczna; symbol matematyczny R₂^highF; reprezentacja wzoru fizycznego." src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 6">.</li>
	<li>Przygotuj plik wejściowy do skryptu dopasowującego, wykorzystując wszystkie krzywe RD z RPrzykład przewyższający dwukrotność szacowanego błędu. 
	UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania plików wejściowych znajdują się w skryptach dopasowujących. Przykładowe pliki wejściowe zostały udostępnione jako Pliki uzupełniająceZazwyczaj dane RD mierzy się w dwóch różnych polach statycznych i dopasowuje je jednocześnie. W tym protokole wymagane są dwa różne pliki wejściowe (Pliki uzupełniające).</li>
	<li>Dopasuj dane RD, korzystając ze skryptów dostarczonych w Pliki uzupełniające. 
	UWAGA: Dostarczono dwa różne skrypty, służące odpowiednio do dopasowania krzywych RD w oparciu o poszczególne reszty lub do dopasowania globalnego. Oba skrypty dopasowują krzywe RD z wykorzystaniem modelu wymiany dwuCentered (two-site exchange model) oraz równania Carvera-Richardsa. Bardziej szczegółowe instrukcje znajdują się wewnątrz skryptów do dopasowania. Dostępne są również dodatkowe pakiety oprogramowania, takie jak Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) i CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/), służące do dopasowania danych z wykorzystaniem równań Blocka-McConcella.</li>
	<li>Przetestuj wiarygodność dopasowanych parametrów szacujących zredukowane χ2 w funkcji pb oraz kPrzykład. 
	UWAGA: Zredukowany χ2 zostało dostarczone w pliku wyjściowym. pb oraz kPrzykładowy tekst do tłumaczenia. można ograniczyć do określonych wartości, stosując dolne i górne granice w procedurach dopasowania. W naszych skryptach dolne i górne granice dla pb wynoszą odpowiednio lb(2) i ub(2). Dolna i górna granica dla kPrzykładowy tekst do tłumaczenia nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści źródłowej w języku angielskim, którą należy przetłumaczyć na język polski zgodnie z wytycznymi dla treści naukowych i edukacyjnych JoVE. odpowiednio lb(3) i ub(3).</li>
	<li>Oszacuj błąd dopasowanych parametrów. Można to zrobić, ustawiając w skrypcie wartość MC_fac na 1 i powtarzając dopasowanie wielokrotnie (zazwyczaj &gt;20 powtórzeń). Błąd każdego parametru oszacowano jako odchylenie standardowe rozkładu. 
	UWAGA: Ustawienie parametru MC_fac na 1 generuje syntetyczny zestaw danych, w którym do danych eksperymentalnych dodany zostaje błąd o rozkładzie Gaussa (obliczony na podstawie błędu eksperymentalnego).</li>
</ol>

<ol><li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li>
<li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li>
<li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li>
<li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer%2Fdimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li>
<li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960(2015).</li>
<li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li>
<li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+slow+%28micros-ms%29+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+%2815%29N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%3A+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li>
<li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+thermophilic%2Fmesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li>
<li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relaxation-compensated+Carr%E2%88%92Purcell%E2%88%92Meiboom%E2%88%92Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li>
<li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li>
<li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li>
<li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li>
<li>Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li>
<li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li>
<li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li>
<li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Contrast%27+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd%2FCeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemCatChem%22%5BJournal%5D)">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li>
<li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li>
<li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li>
<li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy%3A+application+to+a+723-residue+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li>
<li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+backbone+%2813%29CO+and+%2815%29N+relaxation+dispersion+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li>
<li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+%2813%29C-detected+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747(2019).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy zapoznali się z manuskryptem i go zatwierdzili. Oświadczamy, że nie występujemy w przypadku konfliktu interesów.

W artykule opisano protokół zastosowany w laboratorium w celu pozyskiwania i analizy danych 15N RD dotyczących białek. W szczególności omówiono kluczowe etapy przygotowania próbki NMR, pomiaru danych NMR i analizy profili RD. Poniżej omówiono kilka ważnych aspektów dotyczących pozyskiwania i analizy eksperymentów RD. Jednak w celu bardziej szczegółowego opisu eksperymentu i analizy danych zaleca się dokładne przestudiowanie oryginalnej literatury 3,8,11,15,16.<sup class="xref...

Eksperymenty dyspersji relaksacyjnej (RD) Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) są rutynowo stosowane do charakteryzacji równowag konformacyjnych zachodzących w skali czasowej µs-ms przy użyciu spektroskopii NMR w roztworach1,2,3,4,5. W porównaniu z innymi metodami badania dynamiki konformacyjnej, techniki CPMG są stosunkowo łatwe do wdrożenia na nowoczesnych spektrometrach NMR, nie wymagają specjalistycznych etapów przygotowania próbek (np. krystalizacji, zamrażania lub orientowania próbek i/lub kowalencyjnego sprzęgania z markerem fluorescencyjnym lub paramagnetycznym) oraz zapewniają kompleksową charakteryzację równowag konformacyjnych, dostarczając informacji strukturalnych, kinetycznych i termodynamicznych o procesach wymiany. Aby eksperyment CPMG mógł dostarczyć informacji o równowadze konformacyjnej, muszą zostać spełnione dwa warunki: (i) obserwowane spiny NMR muszą posiadać różne przesunięcia chemiczne w stanach podlegających wymianie konformacyjnej (mikrostanach) oraz (ii) wymiana musi zachodzić w skali czasowej od ~50 µs do ~10 ms. W tych warunkach obserwowana szybkość relaksacji poprzecznej (<img alt="Wzór miernika odporności, R_obs." src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">) jest sumą wewnętrznej R2 (R2 mierzonej w przypadku braku dynamiki µs-ms, <img alt="Równanie równowagi statycznej ΣFx=0, ΣFy=0; wzór matematyczny; schemat edukacyjny." src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">) oraz wkładu wymiany w relaksację poprzeczną (Rex). Wkład Rex do R2obs można stopniowo wygaszać poprzez zmniejszanie odstępu między impulsami 180° tworzącymi blok CPMG w sekwencji impulsowej, a otrzymane krzywe RD można modelować w oparciu o teorię Blocha-McConnella, aby wyznaczyć różnicę przesunięć chemicznych między mikrostanami, ułamkową populację każdego mikrostanu oraz szybkości wymiany między mikrostanami (Rycina 1)1,2,3.
W literaturze opisano kilka różnych sekwencji impulsów i protokołów analizy dla eksperymentów CPMG dla 15N. W niniejszym materiale opisano protokół wdrożony w laboratorium. W szczególności przedstawione zostaną kluczowe etapy przygotowania próbki do NMR, konfiguracji i akwizycji eksperymentów NMR oraz przetwarzania i analizy danych NMR (Rysunek 2). Aby ułatwić przeniesienie protokołu do innych laboratoriów, program impulsowy, skrypty do przetwarzania i analizy oraz jeden przykładowy zestaw danych zostały udostępnione jako Pliki uzupełniające i są dostępne do pobrania pod adresem (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Dostarczona sekwencja impulsów zawiera czterostopniowy cykl fazowy w bloku CPMG w celu stłumienia artefaktów zależnych od przesunięcia6 i jest zaprogramowana do akwizycji kilku przeplatających się eksperymentów. Eksperymenty te mają identyczny okres relaksacji, ale różną liczbę impulsów refokusejących w celu uzyskania różnych pól CPMG7. Należy również zauważyć, że opisany program impulsowy mierzy 15N R2 komponentu TROSY sygnału NMR8. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten został z powodzeniem zastosowany do charakteryzacji wymiany konformacyjnej w białkach średnich i dużych4,5,9,10. W przypadku mniejszych układów (&lt;20 kDa) zaleca się stosowanie sekwencji impulsów opartej na heterojądrowej pojedynczej korelacji kwantowej (HSQC)11,12.

<table><tbody><tr><td>Sonda kriogeniczna</td><td>Bruker</td><td>5 mm TCI 800 H-C/N-D Kriosonda</td><td>Poprawa czułości</td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>756822-1</td><td>>99,8% czysty, stosowany do przygotowywania próbek NMR i kultur deuterowanych</td></tr><tr><td>Wirówka z napędem ręcznym</td> United <td>Scientific dostarcza</td><td>CENTFG1</td><td>Służy do usuwania wszelkich pęcherzyków powietrza lub resztek cieczy, które utknęły na ściankach rurki NMR.</td></tr><tr><td>Spektrometr NMR wysokiego pola</td><td></td><td>Bruker Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td><td>Akwizycja danych NMR</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td><td>Modelowanie danych NMR</td></tr><tr><td>Pasteur Pipeta NMR Corning</td><td>Incorporation</td><td>7095D-NMR</td><td>Pipeta pastuer ze szkła Pyrex do przenoszenia próbki cieczy w probówce NMR</td></tr><tr><td>Rurka NMR</td><td>Willmad Precyzja</td><td>535-PP-7</td><td>5mm cienkościenna 7-calowa cylindryczna szklana rurka</td></tr><tr><td>NMRPipe</td><td>Badania Instytutu Nauk Biologicznych i Biotechnologii</td><td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td><td>Przetwarzanie danych NMR</td></tr><tr><td>SPARKY</td><td>Uniwersytet Kalifornijski, San Francisco</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td> <td>Analiza danych NMR</td></tr><tr><td>Tospin 3.2 (lub nowszy)</td><td>Bruker</td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji</td> https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</tr></tbody></table>

15n dyspersja relaksacyjna cpmg do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali czasowej μs-ms

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Dynamika konformacyjna białek odgrywa fundamentalne role w regulacji katalizy enzymatycznej, wiązania ligandów, allosterii i sygnalizacji, które są ważnymi procesami biologicznymi. Zrozumienie, w jaki sposób równowaga między strukturą a dynamiką rządzi funkcjami biologicznymi, stanowi nową granicę we współczesnej biologii strukturalnej i zapoczątkowało szereg osiągnięć technicznych i metodologicznych. Wśród nich metody NMR z roztworem dyspersji relaksacyjnej CPMG dostarczają unikalnych informacji o rozdzielczości atomowej na temat struktury, kinetyki i termodynamiki równowag konformacyjnych białek zachodzących w skali czasu μs-ms. W pracy przedstawiono szczegółowe protokoły akwizycji i analizy eksperymentu z dyspersją relaksacyjną 15N. Jako przykład pokazano potok analizy dynamiki μs-ms w domenie C-końcowej bakterii Enzym I.

Opisany tutaj protokół pozwala na pozyskanie profili RD dla każdego piku w widmie 1H-15N TROSY (Rysunek 3A). Na podstawie uzyskanych profili RD można oszacować wkład wymiany w relaksację poprzeczną 15N każdej grupy amidowej szkieletu (Rysunek 3A,3B). Poprzez naniesienie wartości Rex na strukturę 3D badanego białka możliwe jest zidentyfikowanie regionów strukturalnych podlegających wymianie konformacyjn...

Tutaj znajduje się szczegółowy opis protokołu wdrożonego w laboratorium do akwizycji i analizy profili dyspersji relaksacyjnej 15N za pomocą spektroskopii NMR roztworu.

15N Dyspersja relaksacyjna CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali czasowej μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Protokół ten może być wykorzystany do wykrywania i charakteryzowania dynamiki konformacyjnej białek, która jest niezbędna do zrozumienia szerokiej gamy procesów komórkowych. W porównaniu z innymi metodami, metoda ta nie wymaga specjalistycznych etapów przygotowania próbki i zapewnia kompleksową charakterystykę kinetyki, termodynamiki i strukturalnych aspektów równowagi potwierdzającej. Dyspersja relaksacyjna CPMG może być szerzej stosowana do charakterystyki dynamiki konfirmacyjnej w kwasach nukleinowych i innych biomolekułach, a także do charakterystyki oddziaływań nanocząstek ligandowych.Nasz protokół jest skierowany do początkujących użytkowników CPMG. Jest to więc dobry punkt wyjścia. Oczekujemy jednak, że użytkownicy będą znali podstawowe kroki przeprowadzania konwencjonalnych eksperymentów NMR.Aby skonfigurować eksperyment NMR po raz pierwszy, najpierw pobierz i rozpakuj te dodatkowe pliki. Skopiuj bity. VV i trosy_15N_CPMG.VV w folderze programu Pulse do katalogu programu Pulse. Otwórz oprogramowanie do akwizycji i użyj polecenia EDC, aby skopiować poprzednio uruchomiony eksperyment HSQC z azotem wodorowym 15 do nowego eksperymentu. Użyj polecenia programu impulsowego, aby załadować trosy_15N_CPMG.vv pulse do nowo utworzonego eksperymentu. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami na końcu pliku programu impulsowego, aby skonfigurować eksperyment CPMG. Aby przygotować się do rutynowego eksperymentu NMR, wprowadź próbkę do magnesu i wykonaj wszystkie podstawowe kroki akwizycji NMR.Ustaw P1 na czas trwania twardych impulsów wodorowych 90 stopni, a P7 na czas trwania twardych impulsów azotu 15 stopni 90 stopni. W oknie akwizycji ustaw środek i szerokość widmową dla 15 wymiarów wodoru i azotu. Ustaw opóźnienie relaksacji na 0,7 T2 i użyj polecenia VC list, aby utworzyć listę liczb całkowitych odpowiadających N. Po potwierdzeniu, że każdy wpis na liście odpowiada innemu polu CPMG zgodnie z CPMG pole równa się 4N podzielone przez D30, sprawdź, czy pierwsza liczba na liście ma wartość zero.Ustaw L8 na liczbę wpisów na liście VC, L3 na liczbę punktów rzeczywistych dla wymiaru pośredniego, a 1TD na L8 razy L3 razy dwa. Aby zoptymalizować tłumienie wody, ustaw wzmocnienie odbiornika na jeden i wpisz EDC pull, aby otworzyć plik programu impulsowego. W wierszu 91 usuń średnik poprzedzający goto 999 i zapisz plik.Za pomocą polecenia GS dostosuj parametry SPDB0, aby zminimalizować intensywność sygnału FID. Gdy intensywność sygnału została zmodyfikowana, ponownie wprowadź średnik w wierszu 91 pliku programu impulsowego i zapisz plik. Aby zoptymalizować SPDB11, ustaw wzmocnienie odbiornika na jeden i typ EDC pull, aby otworzyć plik programu impulsowego.W wierszu 168 usuń średnik poprzedzający goto 999 i zapisz plik. Za pomocą polecenia GS dostosuj parametry SPDB11, aby zminimalizować intensywność sygnału FID. Gdy intensywność sygnału zostanie zmodyfikowana, ponownie wprowadź średnik w wierszu 168 i zapisz plik.Aby zoptymalizować SPDB2, ustaw wzmocnienie odbiornika na jeden i wprowadź EDC pull, aby otworzyć plik programu impulsowego. W wierszu 179 usuń średnik poprzedzający goto 999 i zapisz plik. Za pomocą polecenia GS dostosuj parametry SPDB2, aby zminimalizować intensywność sygnału FID.Gdy intensywność sygnału została zmodyfikowana, ponownie wprowadź średnik w wierszu 179 pliku programu impulsowego i zapisz plik. Aby zoptymalizować PLDB2, ustaw wzmocnienie odbiornika na jeden i wprowadź EDC pull, aby otworzyć plik programu impulsowego. W wierszu 184 usuń średnik poprzedzający goto 999 i zapisz plik.Za pomocą polecenia GS dostosuj parametry PLDB2, aby zminimalizować intensywność sygnału FID. Gdy intensywność sygnału została zmodyfikowana, wprowadź ponownie średnik w wierszu 184 pliku programu impulsowego i zapisz plik. Uruchom polecenie RGA, aby zoptymalizować wzmocnienie odbiornika.Następnie uruchom polecenie ZG, aby rozpocząć eksperyment. Na tym rysunku można zaobserwować wyniki profili dyspersji relaksacyjnej uzyskanych dla każdego piku w widmie azotu wodorowego 15 Trosy. Na podstawie uzyskanych profili dyspersji relaksacyjnej można oszacować udział wymiany w poprzecznej relaksacji azotu 15 każdej grupy AMI szkieletu.Wykreślając relaksację poprzeczną na strukturze 3D badanego białka, możliwe jest zidentyfikowanie regionów strukturalnych podlegających wymianie potwierdzającej w skali milisekundowej mikrosekund. Modelowanie krzywych dyspersji relaksacji przy użyciu równań Carvera-Richardsa zwraca parametry termodynamiczne i kinetyczne procesu wymiany, takie jak ułamkowe populacje stanów w równowadze i szybkość wymiany między tymi stanami. Zależność temperaturowa tych parametrów termodynamicznych i kinetycznych może być następnie modelowana za pomocą równań van't Hoffa i I-ringu, odpowiednio, w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat energii wymiany konfirmacyjnej.Bardzo ważne jest, aby dokładnie zoptymalizować wszystkie parametry akwizycji, w szczególności P7.It ważne jest również wytwarzanie próbek o wysokiej czystości i jednorodności, aby uniknąć fałszywych dyspersji. Parametry kinetyczne, termodynamiczne i chemiczne chipa uzyskane za pomocą tego protokołu mogą być wykorzystane do uzyskania informacji energetycznych i strukturalnych o gatunkach podlegających wymianie potwierdzającej. Charakterystyka dynamiki potwierdzenia białek uzyskana metodami CPMG dostarcza kluczowych informacji dla zrozumienia sygnalizacji i aktywności enzymatycznej, a także nowych perspektyw projektowania leków.

15n-cpmg-relaxation-dispersion-for-investigation-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może scharakteryzować dynamikę strukturalną białka w sposób specyficzny dla reszt. Udostępniamy praktyczny protokół do rejestrowania eksperymentów z relaksacją NMR 15N R1 i R2 oraz eksperymentów z heterojądrowym efektem Overhausera (hetNOE) {1H}-15N, wrażliwych na skalę czasową od pikosekund do nanosekund.

NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

Ten protokół oparty na NMR bada słabe interakcje białko-glikan przy użyciu cyjanowiryny-N i D-mannozy. Łącząc metody wykrywania ligandów i białek, mapuje miejsca wiązania, wykrywa efekty allosteryczne i identyfikuje kompleksy spotkań. Podejście to obejmuje przygotowanie próbek i analizę danych, oferując strukturalne i dynamiczne spostrzeżenia cenne dla mechanizmów diagnostyki i rozpoznawania specyficznych dla glikanów.

Badanie interakcji białko-glikan: postępy w magnetycznym rezonansie jądrowym

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Tutaj opisujemy prosty protokół szybkiego wytwarzania setek pożywek hodowlanych dla nicieni, 96-dołkowych płytek hodowlanych ze stałą liczbą Caenorhhabditis elegans na studzienkę. Kultury te są przydatne do fenotypowych badań przesiewowych całych organizmów. Skupiamy się tutaj na wykorzystaniu tych kultur do badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem efektów sprzyjających długowieczności.

Prosta metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku Caenorhabditis elegans

Jednym z najtrudniejszych warunków stresowych, z jakimi organizmy spotykają się w ciągu swojego życia, jest akumulacja utleniaczy. Podczas stresu oksydacyjnego komórki w dużym stopniu polegają na molekularnych białkach opiekuńczych. W tym miejscu przedstawiono metody wykorzystywane do badania regulowanej przez redoks aktywności antyagregacyjnej, a także do monitorowania zmian strukturalnych regulujących funkcję opiekuńczą za pomocą HDX-MS.

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Poznaj metodę CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali μs-ms przy użyciu spektroskopii NMR. Protokół umożliwia analizę kinetyki i termodynamiki bez specjalistycznego przygotowania próbek.

¹⁵N Dyspersja relaksacyjna CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali czasowej μs-ms

Przeglądaj więcej filmów