Spektroskopia neutronowego echa spinowego jako unikalna sonda do badania dynamiki błony lipidowej i interakcji błona-białko

Protokół ten opisuje przygotowanie próbki i redukcję danych wymaganych do udanych badań echa spinowego neutronów zbiorowych fluktuacji błon mających znaczenie dla funkcji biologicznych i praktycznych zastosowań błon lipidowych. NSE ma bezpośredni dostęp do dynamiki błony w nanosekundowych skalach czasowych kluczowych funkcji błony z unikalną zaletą czułości izotopowej do sondowania selektywnych cech błony niedostępnych przy użyciu innych technik. Badania dynamiki błon w nanoskali są niezbędne do zrozumienia właściwości błony leżących u podstaw mechanizmu molekularnego oraz interakcji błona-białko związanych z różnymi patologiami komórkowymi.

Metoda ta zapewnia naukowcom nowym w NSE szczegółowe wytyczne dotyczące projektowania, przygotowywania i charakteryzowania pęcherzyków lipidowych do udanych eksperymentów oraz późniejszej analizy i interpretacji redukcji danych. Procedurę zademonstrują Teshani Kumarage i Julie Nguyen, doktorantka i studentka studiów licencjackich z laboratorium. Pracując wewnątrz okapu, przygotuj zawiesinę lipidową, rozpuszczając dokładnie zważone lipidy w jednym mililitrze rozpuszczalnika z ręcznym mieszaniem.

Osuszyć roztwór lipidów, delikatnie wtłaczając gaz obojętny do fiolki, powoli obracając ją pod kątem. Aby dokładnie usunąć resztki rozpuszczalnika, umieść fiolki na noc w piecu próżniowym w temperaturze 35 stopni Celsjusza. Następnego dnia uwodnić warstwę lipidową dwoma mililitrami ciężkiej wody, aby uzyskać stężenie lipidów 50 miligramów na mililitr i wirować uwodnioną zawiesinę lipidową, aż do całkowitego rozpuszczenia filmu lipidowego.

Następnie wykonaj pięć cykli zamrażania i rozmrażania, przechowując fiolkę z uwodnioną zawiesiną lipidową w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu zamrożenia. A następnie przeniesienie go do łaźni wodnej o temperaturze 35 stopni Celsjusza w celu rozmrożenia zawiesiny lipidowej. Rozmrożoną zawiesinę należy zmieszać do uzyskania jednorodnej konsystencji przed przejściem do następnego cyklu.

Przed rozpoczęciem eksperymentu zmontuj konfigurację ekstrudera za pomocą membrany poliwęglanowej między dwoma wspornikami membrany i dodaj dwa filtry papierowe z każdej strony, aby zapewnić dodatkowe wsparcie. Użyj hermetycznych szklanych strzykawek, aby nawodnić membranę poliwęglanową, kilkakrotnie przepuszczając 0,3 mililitra ciężkiej wody przez zespół membrany. Po uwodnieniu membrany włóż jednomililitrową gazoszczelną strzykawkę z przygotowanym mlecznobiałym roztworem lipidów do jednego końca, a pustą strzykawkę do przeciwległego końca aparatu wytłaczarki.

Po podłączeniu strzykawek umieść zespół w bloku ekstrudera. Zaprogramuj pompę, przytrzymując przycisk Rate, aby wprowadzić szybkość wytłaczania i naciśnij przycisk Średnica, aby wprowadzić średnicę strzykawki. Następnie naciskaj przycisk Wycofaj, aż lampka się włączy.

Naciśnij przycisk start i poczekaj, aż próbka zacznie nalewać się do pustej strzykawki. Naciśnij przycisk Stop tuż przed całkowitym opróżnieniem strzykawki z próbką. Zapisz dozowaną objętość, a następnie przytrzymaj przycisk Rate, aż na ekranie pojawi się faza pierwsza.

Trzymając kontrolkę Wycofanie wyłączoną, naciśnij przycisk głośności, aby wprowadzić nagraną wcześniej dozowaną objętość. Naciśnij ponownie przycisk Rate (Stawka) i użyj strzałki w górę w prawo, aby przejść do fazy drugiej. Naciśnij przycisk głośności, aby wprowadzić tę samą wartość dozowanej objętości, która została zapisana wcześniej.

W tej fazie naciskaj przycisk Wycofaj, aż zaświeci się kontrolka Wycofaj. Powtórz cykl dla fazy trzeciej, naciskając przycisk głośności, aż na ekranie pojawi się LP:SE i ustaw go na 20. Na koniec naciśnij przycisk Rate, przejdź do fazy czwartej i naciśnij przycisk głośności, aby przejść do funkcji Stop i zakończyć konfigurację pompy.

Po zaprogramowaniu pompy naciśnij Start, aby rozpocząć cykl wytłaczania. Wykonaj od 15 do 20 cykli wytłaczania przed zebraniem przezroczystej opalowej niebieskiej ekstrudowanej zawiesiny lipidowej w czystej fiolce do pomiarów. Otwórz oprogramowanie DAVE i wybierz opcję redukuj dane NSE z menu Data Reduction (Redukcja danych).

Prześlij pliki danych dla różnych wartości Q za pomocą opcji Otwórz pliki echo z menu plików. Przesłane pliki pojawią się w dostępnych zestawach danych. Kliknij prawym przyciskiem myszy wybrany plik i oznacz go zgodnie z pomiarem, któremu odpowiada, takim jak próbka, komórka lub rozdzielczość.

Korzystając z karty Zbiór danych, pogrupuj piksele detektora w 2 x 2, aby poprawić stosunek sygnału do szumu. Zastosuj to samo kategoryzowanie do wszystkich plików Rozdzielczość, Komórka i Próbka. Sprawdź dane we wszystkich grupach pikseli i zamaskuj te, które mają słabe sygnały, naciskając End na klawiaturze.

Naciśnij Enter, aby uzyskać dostęp do wyskakującego okienka i zastosować tę samą maskę do wszystkich czterech razy. Zamaskowane piksele zmienią kolor na zielony. Upewnij się, że zebrane dane mają postać sygnału echa.

Rozpocznij dopasowywanie pliku rozdzielczości z listy przesłanych plików, klikając prawym przyciskiem myszy żądany plik i wybierając z menu podręcznego Operacje dopasowania, Rozdzielczość dopasowania echa. Upewnij się, że pasowania sygnałów echa dają rozsądne parametry dopasowania. Aby sprawdzić błąd skojarzony z każdym parametrem dopasowania w całym detektorze, wybierz opcję Opcje obrazu, a następnie wybierz interesujący Cię parametr dopasowania.

Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy obraz detektora, aby uzyskać dostęp do wyskakującego okienka z mapą paska błędów. Jeśli dopasowanie do określonego piksela jest niezadowalające, ponownie nałóż sygnał na ten piksel, zaznaczając go, naciskając kartę Dopasowanie, a następnie naciskając przycisk Dopasuj piksel. Wprowadź nowe parametry początkowe dla fazy i okresu w zakładce Dopasowanie.

Zmniejsz przykładowy plik, wybierając odpowiedni plik z listy przekazanych i oznaczonych plików. Sprawdź wszystkie piksele i zamaskuj te słabe, jak opisano powyżej. Następnie kliknij plik prawym przyciskiem myszy i wybierz Operacje dopasowania, Fazy importu.

W przypadku pliku rozdzielczości dopasuj sygnały echa zgodnie z wcześniejszym opisem z niezmienionymi wartościami okresu, a punkt fazy echa zaimportowany z rozdzielczości pasuje. Wprowadź środek belki dla wszystkich plików danych, uzyskując dostęp do karty Ogólne i wprowadzając wartości środka belki X i Y zarejestrowane w eksperymencie. Po zakończeniu pasowań oblicz znormalizowaną funkcję rozpraszania pośredniego, klikając prawym przyciskiem myszy żądany plik próbki z listy dopasowanych plików i wybierając Oblicz I z Q z menu podręcznego.

Wprowadź wymagane informacje dotyczące rozdzielczości i plików komórek oraz liczby łuków Q w wyskakującym okienku, a następnie naciśnij OK, aby wyświetlić wyniki. Zauważ, że dane w kolorze cyjanu pokazują słaby sygnał z powodu efektów krawędzi detektora i powinny zostać wyeliminowane podczas kompilowania różnych zestawów danych Q. Na koniec zapisz zredukowane zestawy danych jako pliki ASCII i zapisz całą sesję jako projekt DAVE w żądanym folderze.

W niniejszej pracy przeprowadzono pomiary NSE próbek liposomalnych przygotowanych przy użyciu różnych schematów deuteracji. Pomiary NSE fluktuacji zginania błony wykonuje się na liposomach w pełni kontrastowych. Ten schemat deuteracji powoduje dużą różnicę długości rozpraszania między rdzeniem membrany a środowiskiem deuterowanego płynu, znacznie wzmacniając sygnał rozpraszania z błon liposomalnych i poprawiając statystyki pomiarowe dynamiki zginania.

Z drugiej strony, pomiary NSE fluktuacji grubości błony liposomów wykazują odchylenia względem Q do trzeciej zależności fluktuacji zginania. Aby wyizolować sygnał fluktuacji grubości, uzyskany sygnał jest dzielony przez Q do trzeciej, a nadmierna dynamika jest dopasowywana do funkcji Lorentza w Q. Ta metoda jest uzależniona od dobrej jakości danych, które są bardziej osiągalne w przypadku próbek o wysokich stężeniach i silnych sygnałach rozpraszania. Dynamika badana przez NSE może być synergistycznie badana za pomocą relaksometrii deuteru NMR i symulacji molekularno-dynamicznych, aby zilustrować, w jaki sposób molekularne struktury lipidowe i motywy upakowania wpływają na funkcje błony.

Badania NSE nad błonami lipidowymi rzucają nowe światło na biofizykę błon, skomplikowane relacje struktury i dynamiki błony oraz ich wpływ na funkcje błony i interakcje błona-białko.