Name: Automatyczne wykrywanie i analiza egzocytozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Odkryj automatyczną analizę egzocytozy w komórkach nerwowych przy użyciu mikroskopii TIRF i algorytmów MATLAB. To narzędzie klasyfikuje zdarzenia fuzyjne i ocenia ich rozmieszczenie przestrzenne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dustinowi Revellowi i Reginaldowi Edwardsowi za przetestowanie kodu i graficznego interfejsu użytkownika. Badania te były finansowane przez National Institutes of Health: w tym R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) i F31NS103586 (FLU).

UWAGA: Oryginalny graficzny interfejs użytkownika analizy egzocytozy został napisany i skompilowany w Matlabie w wersji 9.10 (2021a). Nowe wersje MATLABa mają wymagane aktualizacje GUI, które są dostępne do pobrania z naszej strony internetowej: https://guptonlab.web.unc.edu/code/
1. Wybierz zestawy danych i katalog
<ol>
	<li>Aby wybrać zestawy danych do analizy, kliknij przycisk Znajdź zestawy danych (Rysunek 2A, czerwone pole 1), aby przejść do folderu, w którym zdeponowane są dane (np. folder RawData). Pliki danych automatycznie wypełnią pliki danych jako listę. W folderze może znajdować się więcej niż jeden zestaw danych.</li>
	<li>Kliknij przycisk Wybierz katalog i wybierz katalog (np. Test), w którym zostaną zdeponowane analizowane pliki (Rysunek 2A, czerwona ramka 2) . Zestaw folderów i gotowych plików analizy, a także pośrednich obrazów tymczasowych zostanie utworzony w tym katalogu po naciśnięciu przycisku Analiza. Jeśli katalog nie zostanie wybrany, zostaną wygenerowane błędy.</li>
</ol>
2. Ustaw rozmiar piksela i liczbę klatek na sekundę
<ol>
	<li>Wypełnij odpowiednią liczbę klatek na sekundę i rozmiar pikseli obrazów w odpowiednim polu "Liczba klatek na sekundę" lub "rozmiar piksela" (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A, zielone pole). Jeśli nie zostaną podane żadne wartości (są one ustawione na domyślne "0"), program przeszuka metadane powiązane z plikiem pod kątem liczby klatek na sekundę i rozmiaru pikseli. Jeśli tych wartości nie można znaleźć, program domyślnie wybierze wartość na piksel dla pomiaru i dla klatki dla punktów czasowych. 
	UWAGA: W podanym przykładzie liczba klatek na sekundę wynosi 100, a rozmiar piksela to 0,08.</li>
</ol>
3. Wybierz lub stwórz maski
<ol>
	<li>Użyj przycisku Kreator masek, aby automatycznie utworzyć maski komórek dla danych na liście zestawów danych pliku (Rysunek 2A, niebieskie pole). Po użyciu przycisku Kreator masek zostanie utworzony nowy folder w wybranym katalogu o nazwie MaskFiles. "Wskaźnik biegu" zmieni kolor na żółty podczas biegu i powróci do koloru zielonego po zakończeniu. 
	UWAGA: Maska dla każdego pliku na liście Pliki danych zostanie utworzona z pierwszych 10 klatek pliku obrazu (lub ze wszystkich klatek, jeśli w pliku obrazu znajduje się mniej niż 10) i zdeponowana w folderze MaskFiles przy użyciu odpowiedniego schematu nazewnictwa (opisanego poniżej).</li>
	<li>Upewnij się, że pliki maski automatycznie wypełniają listę plików maski. Użytkownik może przejść bezpośrednio do analizy. 
	UWAGA: Zawsze sprawdzaj wizualnie pliki maski i upewnij się, że obejmują one cały obszar zainteresowania. Pierwsza klatka pliku danych i plik maski są wyświetlane w interfejsie użytkownika po wybraniu. (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Kreator masek może generować błędy w przypadku niskiego stosunku sygnału do szumu, więc sprawdzenie, czy pliki maski są odpowiednie, ma kluczowe znaczenie dla kontroli jakości.</li>
	<li>Jako alternatywę dla korzystania z Kreatora masek, jeśli sygnał do szumu obrazów jest niewystarczający, utwórz maski ręcznie w ImageJ.
	<ol>
		<li>Najpierw otwórz plik obrazu raw w ImageJ (Rysunek 3A).</li>
		<li>Kliknij przycisk Zaznaczanie wielokąta i kliknij, aby narysować maskę wokół komórki. Po zakończeniu kliknij dwukrotnie ostatni punkt, aby zakończyć wielokąt.</li>
		<li>Po zakończeniu przejdź do punktu menu Edycja | Selekcja | Utwórz maskę (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Na podstawie rysunku wielokąta zostanie utworzona nowa odwrócona maska. Zapisz maski w wyznaczonym folderze MaskFiles w wybranym katalogu. Schemat nazewnictwa plików maski musi być zgodny z odpowiadającymi im poszczególnymi plikami danych, po których następuje "_mask_file". Na przykład, jeśli plik danych ma nazwę "VAMP2_488_WT_1.tif", odpowiadający mu plik maski musi mieć nazwę "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".</li>
		<li>Użyj przycisku Znajdź pliki maski, aby przejść do wybranego folderu z osadzonymi plikami masek niestandardowych. Maski wypełnią pliki masek jako listę. 
		UWAGA: Ważne jest, aby przed uruchomieniem analizy mieć maskę dla każdego pliku danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza i wyodrębnianie cech
<ol>
	<li>Po wybraniu katalogu i wypełnieniu listy plików danych i listy plików maski kliknij przycisk Analiza (Rysunek 4A). Jeśli wymagana jest klasyfikacja zdarzeń egzocytarnych, przejdź do kroku 5. 
	UWAGA: Kliknięcie przycisku Analiza spowoduje wykonanie serii zautomatyzowanych zadań w celu przeanalizowania danych. Utworzy indywidualne foldery w wybranym katalogu, aby zdeponować przeanalizowane dane. Podczas biegu "wskaźnik biegu" zmieni kolor z zielonego na żółty (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A, czerwona ramka). Po zakończeniu analizy zmieni się z powrotem na zielony.</li>
	<li>Znajdź folder DataFiles (Rysunek 4B) z pełnym zestawem plików analizy (a także plików wyodrębniania cech, które zostaną użyte w późniejszej klasyfikacji) nazwanych zgodnie z każdym plikiem danych (Rysunek 4C). 
	UWAGA: Opis tych plików analitycznych znajduje się poniżej w sekcji Reprezentatywne wyniki.</li>
</ol>
5. Klasyfikacja zdarzeń egzocytarnych
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić jednoczesną klasyfikację zdarzeń egzocytarnych z automatycznym wykrywaniem, zaznacz pole wyboru Klasyfikacja przed kliknięciem przycisku Analiza. Dla każdego zdarzenia egzocytarnego przypisz wynik prawdopodobieństwa od 0 do 1 dla każdej klasy. Zdarzenie egzocytarne jest uważane za sklasyfikowane jako jedna z czterech klas, jeśli wynik prawdopodobieństwa dla tej klasy wynosi > 0,5, 
	UWAGA: Po zakończeniu analizy w wybranym katalogu pojawi się nowy folder z plikami danych. Folder będzie zawierał pliki analityczne odpowiadające każdemu plikowi obrazu.</li>
</ol>
6. Czasoprzestrzenna analiza egzocytozy przy użyciu wartości K Ripleya
<ol>
	<li>Utwórz osobny plik maski "neuryt" i "soma". Najpierw podziel somę na segmenty od neurytu. Nie ma bezstronnej metody segmentacji somy od neurytów, więc użytkownik powinien być ślepy na eksperyment warunkowania i kierować się najlepszym osądem; Sugerowana jest elipsoida bez widocznych rozszerzeń neurytów.</li>
	<li>Otwórz ImageJ/Fiji.</li>
	<li>Przeciągnij i upuść plik maski lub użyj punktu menu Plik | Otwórz, a następnie wybierz plik maski.</li>
	<li>Użyj narzędzia do wybierania kolorów i kliknij dowolny z czarnych pikseli w tle maski, aby ustawić kolor na.</li>
	<li>Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów lub odręcznie, aby narysować kontur wokół somy, oddzielając ją od neurytów. Wymaga to ręcznego podejmowania decyzji.</li>
	<li>Kliknij Edytuj | Selekcja | Zrób maskę. Otworzy się nowy obraz z zakreśloną somą oddzieloną od reszty obrazu. Spowoduje to utworzenie pliku maski soma.</li>
	<li>Nie przesuwając narysowanego regionu, kliknij nagłówek oryginalnego pliku maski.</li>
	<li>Kliknij Edytuj | Napełnij, aby wypełnić zakreśloną somę, tak aby tylko neuryty pozostały w masce.</li>
	<li>Po uzyskaniu oddzielnych plików neurytu i maski zapisz oba pliki maski.</li>
	<li>Otwórz "neurite_2D_network" w Matlabie.</li>
	<li>W programie MATLAB przejdź do katalogu ze wszystkimi danymi analizy.</li>
	<li>Zmień ścieżkę "nazwa maski" na nazwę maski neurytowej, tj. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"</li>
	<li>Zmień "csv_file_name" na miejsce, w którym znajduje się fluorescent_traces.csv plik, tj. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".</li>
	<li>Kliknij przycisk Uruchom, aby zszkieletyzować plik maski neurytowej. Spowoduje to utworzenie szkieletowej wersji pliku maski neurytowej i zdeponowanie jej jako pliku CSV w folderze maskfiles.</li>
	<li>Następnie wygeneruj plik CSV dla somy. Otwórz "CSV_mask_creator.m" w Matlabie.</li>
	<li>Wprowadź ścieżkę do "nazwy maski" do nazwy maski soma, tj. "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif</li>
	<li>Zmień "macierz zapisu" na nazwę pliku csv, który ma zostać utworzony, tj. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"</li>
	<li>Kliknij przycisk Uruchom. Spowoduje to utworzenie nowego pliku VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.</li>
	<li>Powtórz 6.14 dla każdego pliku maski.</li>
</ol>
7. Ustawienia RStudio
<ol>
	<li>Otwórz Rstudio i otwórz ripleys_k_analysis. Plik R.</li>
	<li>Zainstaluj pakiet "spatstat" w programie RStudio, przechodząc do pozycji Narzędzia | Zainstaluj pakiety i wpisz "spatstat", a następnie kliknij Install. 
	UWAGA: Należy to wykonać tylko raz na instalację Rstudio.</li>
	<li>Uruchom bibliotekę spatstat na początku każdej sesji.</li>
	<li>Zwróć uwagę na dwie główne zmienne w tym przypadku: "neuron_mask" i "neuron_datapoints". Neuron Mask wskazuje na zestaw plików masek do uruchomienia, tj. pliki masek soma." 
	UWAGA: Uruchom wszystkie pliki maski soma razem, oddzielnie od plików masek Neurite i odwrotnie.</li>
	<li>Odczytaj .csv plików masek dla każdego z neuronów, które mają być analizowane.</li>
	<li>Uruchamiaj wiele plików jednocześnie, kopiując dodatkowe neuron_mask_n+1. Pozwoli to na agregację analiz Ripleya za pomocą skryptu opisanego w punkcie 8.</li>
	<li>Teraz sprawdź drugą zmienną, "neuron_datapoints".</li>
	<li>Wczytaj do pliku "X_fluorescent_traces.csv" wygenerowanego przez program analityczny (według cech wszystkich extracted_R pliku) z pozycjami x,y,t zdarzeń egzocytarnych, a także specyficznym dla neurytów plikiem pozycji x,y dla sieci 2D. To idzie w pozycji "neuron_datapoints".</li>
	<li>W programie RStudio wybierz pozycję Kod | Region uruchamiania | Uruchom wszystko. Spowoduje to wygenerowanie kilku wykresów, w tym zgrupowanych wartości K Ripleya, a także wykresów gęstości.</li>
	<li>Zapisz działki, przechodząc do punktu menu Eksport | Zapisz obraz jako | Wybierz odpowiedni format obrazu i katalog, wprowadź odpowiednią nazwę pliku, a następnie kliknij przycisk Zapisz. 
	UWAGA: Funkcja kreślenia map cieplnych jest wywoływana w skrypcie za pomocą "plot(density(soma_data,0.4))". Liczba "0,4" oznacza tutaj, jak wygładzona powinna być funkcja gęstości. Można go zmienić, aby w znaczący sposób dopasować dane użytkownika, ale jeśli mają być wykonywane porównania między różnymi mapami cieplnymi, liczba między nimi musi być taka sama.</li>
	<li>Eksportuj lub zapisz obraz z Rstudio. Jeśli mapa cieplna wymaga dalszej edycji, wybierz odpowiedni typ pliku (SVG lub EPS).</li>
</ol>
8. Analiza Ripleya
UWAGA: Ripleys_k_analysis. Plik R automatycznie wygenerował również wykresy wartości k Ripleya. Uruchomienie całego skryptu spowoduje automatyczne uruchomienie funkcji wymienionych poniżej, ale jest on uwzględniony w szczegółach, jeśli ktoś chce uruchomić każdą część skryptu osobno lub wprowadzić zmiany w analizie.
<ol>
	<li>Najpierw uruchom funkcję koperty dla każdej komórki. Funkcja ta symulowała pełną losowość przestrzenną (CSR) w celu przetestowania wartości K Ripleya wzorca punktu zdarzenia egzocytarnego w stosunku do . 
	Data_envelope_1 = envelope(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) 
	Data_envelope_2 = envelope(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)</li>
	<li>Następnie połącz te koperty i utwórz jedno oszacowanie CSR dla grupy: 
	Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...) 
	Następnie uruchom funkcję K Ripleya dla wszystkich punktów danych. 
	Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, stosunek = PRAWDA) 
	Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, stosunek = PRAWDA)</li>
	<li>Po zakończeniu połącz ze sobą wartości K Ripleya i uruchom ich przedziały ufności za pomocą następującego polecenia: 
	Pula danych = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)</li>
	<li>Uruchom plik za pomocą następującego polecenia: 
	Final_Ripleys_K = varblock(zabawa = Kest, Data_pool)</li>
	<li>Wykreśl dane.</li>
	<li>Jeśli wymagana jest twarda różnica statystyczna, do pakietu spatstat dołączany jest Studentised Permutation Test w celu sprawdzenia różnicy między grupami wzorców punktowych: 
	Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ grupa, nperm = np).</li>
</ol>

<ol><li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).</li>
<li>Urbina, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM67+regulates+exocytic+mode+and+neuronal+morphogenesis+via+SNAP47%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47.</a> Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).</li>
<li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+kiss-and-run%3A+Role+in+exocytosis%2C+endocytosis%2C+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission.</a> Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+debate+on+the+kiss-and-run+fusion+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The debate on the kiss-and-run fusion at synapses.</a> Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).</li>
<li>Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+patch+clamp+reveals+that+transient+fusion+%28kiss-and-run%29+is+a+major+mechanism+of+secretion+in+calf+adrenal+chromaffin+cells%3A+high+calcium+shifts+the+mechanism+from+kiss-and-run+to+complete+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion.</a> Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030(2006).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+single-vesicle+astrocyte+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).</li>
<li>Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+direct%2C+dynamin-dependent+recapture+of+fusing+secretory+granules+on+plasma+membrane+lawns+from+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).</li>
<li>Wang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+domains+of+synaptotagmin+control+the+choice+between+kiss-and-run+and+full+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion.</a> Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).</li>
<li>Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+combined+methodologies+to+define+the+role+of+plasma+membrane+delivery+during+axon+branching+and+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53743(2016).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Plooster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM9-dependent+ubiquitination+of+DCC+constrains+kinase+signaling%2C+exocytosis%2C+and+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).</li>
<li>Urbina, F. L., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-mediated+exocytosis+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SNARE-mediated exocytosis in neuronal development.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133(2020).</li>
<li>Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second-order+analysis+of+stationary+point+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Probability%22%5BJournal%5D)">The second-order analysis of stationary point processes.</a> Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHmScarlet+is+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+to+monitor+exocytosis+docking+and+fusion+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps.</a> Nature Communication. 12 (1), 1413(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują niczego do ujawnienia.

Korzystając z oprogramowania do wykrywania i analizy egzocytów, należy wziąć pod uwagę, że program akceptuje tylko pliki .tif z kompresją bezstratną jako dane wejściowe. .tif pliki obrazów mogą być 8-bitowymi, 16-bitowymi lub 32-bitowymi obrazami w skali szarości (jednokanałowymi). Inne formaty obrazów muszą zostać przekonwertowane na jeden z tych typów przed wprowadzeniem. Przykładami użytymi w tym artykule są 16-bitowe obrazy w skali szarości.
Nieodłącznym elementem automatycznego procesu de...

Konstrukty VAMP-pHluorin lub receptor transferyny (TfR)-pHuji są doskonałymi markerami zdarzeń egzocytarnych, ponieważ te wrażliwe na pH fluorofory są wygaszane w świetle pęcherzyka kwasowego i fluoryzują natychmiast po otwarciu porów fuzyjnych między pęcherzykiem a błoną plazmatyczną1. Po otwarciu porów fuzyjnych fluorescencja zanika wykładniczo, z pewną niejednorodnością, która ujawnia informacje o zdarzeniu fuzji. Tutaj opisana jest aplikacja graficznego interfejsu użytkownika (GUI), która automatycznie wykrywa i analizuje zdarzenia egzocytarne. Ta aplikacja pozwala użytkownikowi na automatyczne wykrywanie zdarzeń egzocytarnych ujawnionych przez markery wrażliwe na pH2 i generowanie cech z każdego zdarzenia, które można wykorzystać do celów klasyfikacji3 (Rysunek 1A). Ponadto opisano analizę grupowania zdarzeń egzocytarnych z wykorzystaniem funkcji K Ripleya.
Niedawno zgłoszono automatyczną klasyfikację zdarzeń egzocytarnych do różnych trybów egzocytarnych3. Dwa tryby egzocytozy, egzocytoza pełnej fuzji pęcherzykowej (FVF) i egzocytoza fuzji typu kiss-and-run (KNR) zostały wcześniej opisane4,5,6,7. Podczas FVF pory fuzyjne rozszerzają się, a pęcherzyk jest wbudowywany w błonę plazmatyczną. Podczas KNR por fuzji przejściowo się otwiera, a następnie ponownie uszczelnia4,5,8,9,10. Zidentyfikowano cztery tryby egzocytozy w rozwijających się neuronach, dwa związane z FVF i dwa związane z KNR. Praca ta pokazuje, że zarówno FVF, jak i KNR można dalej podzielić na zdarzenia fuzji, które przechodzą natychmiast do rozpadu fluorescencji (FVFi i KNRi) po otwarciu porów fuzyjnych lub zdarzenia egzocytarne, które wykazują opóźnienie po otwarciu porów fuzyjnych przed rozpoczęciem zaniku fluorescencji (FVFd i KNRd) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Klasyfikator identyfikuje tryb egzocytozy dla każdego zdarzenia fuzji. W tym przypadku ta analiza została włączona do graficznego interfejsu użytkownika, który można zainstalować w MATLAB w systemach operacyjnych Windows i Mac. Wszystkie pliki analityczne można znaleźć pod adresem https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing lub 
https://github.com/GuptonLab.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td></td><td>R Core Team</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio, PBC</td><td></td><td>https://rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

automatyczne wykrywanie i analiza egzocytozy

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

Timelapse Mikroskopia TIRF wrażliwego na pH GFP (pHluoryny) dołączonego do białek SNARE pęcherzyków jest skuteczną metodą wizualizacji pojedynczych zdarzeń egzocytarnych pęcherzyków w hodowli komórkowej. Aby przeprowadzić bezstronną, skuteczną identyfikację i analizę takich zdarzeń, opracowano i wdrożono w MATLAB podejście oparte na wizji komputerowej. Potok analizy składa się z algorytmu segmentacji komórek i identyfikacji zdarzeń egzotycznych. Podejście oparte na widzeniu komputerowym obejmuje narzędzia do badania wielu parametrów pojedynczych zdarzeń, w tym okresu półtrwania rozpadu fluorescencji i piku ΔF/F, a także analizy całej komórki częstości egzocytozy. Te i inne parametry fuzji są wykorzystywane w podejściu klasyfikacyjnym do rozróżniania różnych trybów fuzji. W tym miejscu nowo zbudowany graficzny interfejs użytkownika wykonuje potok analizy od początku do końca. Dalsza adaptacja funkcji K Ripleya w R Studio służy do rozróżniania zgrupowanych, rozproszonych lub losowych zdarzeń fuzji zarówno w przestrzeni, jak i w czasie.

Oto interfejs graficzny użytkownika (GUI) (Rysunek 2A) wykorzystano do analizy zdarzeń egzocytozy w trzech neuronach wykazujących ekspresję VAMP2-pHluorin w 3. dniu in vitro (DIV), z zastosowaniem mikroskopii TIRF (całkownego wewnętrznego odbicia fluorescencyjnego). Neurony korowe E15.5 zostały wyizolowane, następnie poddane transfekcji VAMP2-pHluorin i wysiane zgodnie z protokołami opisanymi w pracach Winkle et al., 2016 oraz Viesselmann et al., 2011.11,<s...

Opracowaliśmy zautomatyzowane oprogramowanie do rozpoznawania zdarzeń egzocytarnych oznaczonych przez sondy fluorescencyjne o pH czułym na pH. W tym miejscu zademonstrujemy użycie graficznego interfejsu użytkownika i programu RStudio do wykrywania zdarzeń fuzji, analizowania i wyświetlania parametrów czasoprzestrzennych fuzji oraz klasyfikowania zdarzeń w odrębnych trybach fuzji.

Automatyczne wykrywanie i analiza egzocytozy

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

Oprogramowanie do automatycznego wykrywania i analizy egzocytozy pozwoli użytkownikowi na automatyczne wykrywanie zdarzeń egzocytarnych i sekwencji obrazów TIRF fluoroforów wrażliwych na pH. Automatycznie wypisze również cechy egzocytozy, takie jak rozkład przestrzenny lub częstotliwość, a także indywidualne właściwości zdarzeń egzocytarnych, takie jak okres półtrwania lub zmiana fluorescencji w tle. Ponadto zawarto opcję klasyfikacji zdarzeń egzocytarnych do czterech trybów egzocytozy, opisanych wcześniej w literaturze.Aby skorzystać z oprogramowania do automatycznego wykrywania i analizy egzocytozy, najpierw kliknij przycisk znajdź zestaw danych, a następnie przejdziesz do miejsca, w którym zdeponowane są Twoje dane, i będziesz chciał umieścić je w folderze o nazwie surowe dane. Twoje pliki danych zostaną automatycznie wypełnione listą w tym miejscu, a w tym folderze może znajdować się dowolna liczba plików danych. Następnie wybierz katalog, w którym zostaną zdeponowane pliki analizy.Tutaj wybrałem katalog o nazwie test. Będziesz także chciał wypełnić liczbę klatek na sekundę swoich obrazów, a także rozmiar w pikselach. Tutaj moja liczba klatek na sekundę wynosi sto milisekund na klatkę, mój rozmiar piksela to osiem nanometrów.Wreszcie, będziesz potrzebować plików maski, aby uruchomić oprogramowanie do automatycznego wykrywania i analizy egzocytozy. Możesz użyć dołączonego przycisku kreatora masek, aby automatycznie generować pliki masek z plików danych. Wskaźnik pracy zmieni kolor na żółty, a następnie z powrotem na zielony, gdy producent masek zakończy pracę.Twoja maska zostanie zdeponowana w nowym folderze o nazwie pliki maski w wybranym katalogu. I pamiętaj, że pliki maski automatycznie wypełnią listę w tym miejscu. Będziesz chciał sprawdzić, czy twoje pliki maski są odpowiednio wykonane dla twoich plików danych i możesz to zrobić, podświetlając dowolny plik danych na liście, a także odpowiadający mu plik maski.Pojawi się pierwsza klatka pliku danych, a także wybrany plik maski. Tu. Widzimy, że nasze pliki masek są odpowiednie do danej analizy. Pliki maski mogą być również dostarczane przez użytkownika osobno.Jeśli ktoś chce utworzyć plik maski z bieżącego pliku danych, zalecamy użycie Obrazu J.In aby to zrobić, najpierw otwórz obraz na obrazie J, z którego chcesz utworzyć plik maski. Następnie możesz użyć narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby rozpocząć tworzenie pliku maski, klikając wokół krawędzi komórki. Po zakończeniu maskowania kliknij dwukrotnie, aby połączyć się z całym wielokątem.Gdy to zrobisz, przejdziesz do edycji, wyboru i utworzenia maski. Zostanie utworzona odwrócona maska. Będziesz chciał zapisać ten plik maski pod tą samą nazwą, co plik danych, a następnie _mask_file.Teraz, jeśli dostarczysz własne niestandardowe pliki maski, ważne jest, aby oprogramowanie do automatycznego wykrywania wiedziało, gdzie znajdują się te pliki maski. Aby to zrobić, kliknij przycisk znajdź pliki maski i przejdź do katalogu, w którym znajdują się pliki maski. Nowe pliki maski zostaną następnie wypełnione listą w tym miejscu.Ważne jest, aby mieć maskę dla każdego pliku danych przed uruchomieniem analizy. Teraz, po załadowaniu zestawu danych, plikach masek, prawidłowym dostosowaniu liczby klatek na sekundę i rozmiaru pikseli oraz wybraniu katalogu, możesz w końcu zdecydować, czy chcesz uwzględnić klasyfikację jako część swojej analizy. Jeśli przełączysz przycisk klasyfikacji, oprócz wykrywania zdarzeń egzocytarnych, każde zdarzenie egzocytarne zostanie sklasyfikowane w jednej z czterech klas.Po podjęciu decyzji o sposobie przeprowadzenia analizy można rozpocząć analizę, klikając przycisk analizy. Wskaźnik przebiegu zmieni kolor na żółty, aby wskazać, że analiza jest w toku, i zmieni kolor z powrotem na zielony po zakończeniu analizy. Po zakończeniu analizy, na co wskazuje zmiana wskaźnika uruchamiania z żółtego na zielony, zauważysz, że w wybranym katalogu pojawił się nowy folder plików danych.W folderze plików danych znajdują się pliki analizy odpowiadające poszczególnym zestawom obrazów w przebiegu analizy. Ponadto znajduje się tutaj plik statystyk komórkowych zawierający informacje podsumowujące, takie jak częstotliwość egzocytozy dla każdego z zestawów obrazów. Dla każdego zestawu obrazów masz plik ze śladami fluorescencyjnymi, który zawiera informacje o pozycji X, pozycji Y i numerze klatki, w której występują zdarzenia egzocytarne.Ponadto średnia fluorescencja w obszarze zainteresowania wokół każdego zdarzenia egzocytarnego jest prezentowana zarówno przed, w trakcie, jak i po egzocytozie. Ponadto istnieje również plik śledzenia, który zawiera podobne informacje o pozycjach X, Y i czasowych. Jeśli jednak pole wyboru klasyfikacji jest zaznaczone, dodatkowo pojawią się cztery dodatkowe kolumny, które wskazują prawdopodobieństwo przynależności zdarzenia egzocytarnego do jednej z czterech klas.Albo pełna fuzja pęcherzyków natychmiastowa, pełna fuzja pęcherzyków opóźniona, pocałunek-i-ucieczka natychmiastowa, albo pocałunek-ucieczka opóźniona. Zdarzenie egzocytarne należy do jednej z czterech klas, jeśli jest większe niż 0,5 i jest najbardziej prawdopodobne w ramach czterech zarządzanych klas. W tym przypadku pierwsze zdarzenie egzocytarne należy do klasy chwilowej pełnej fuzji pęcherzyków, ponieważ jest to najwyższa liczba powyżej czterech klas i jest większa niż 0,5.Ponadto dla każdego zestawu obrazów istnieje szereg innych plików cech, które są używane podczas klasyfikacji egzocytozy i mogą być interesujące do dalszej analizy. Wreszcie, jeśli chcemy użyć analizy K Ripleya w celu wykrycia przestrzenno-czasowej organizacji egzocytozy, najpierw zaczniemy od podzielenia naszego pliku maski na plik maski neurytowej i plik maski somy. Zrobimy to, najpierw otwierając naszą maskę na obrazie J.Będziemy chcieli użyć selektora kolorów, aby wybrać piksel tła.W ten sposób, gdy wypełnimy plik maski, jest to poprawna wartość. Następnie użyjemy narzędzia do zaznaczania wielokątów i obrysujemy region somatyczny. Teraz wymaga to trochę subiektywnego, ręcznego podejmowania decyzji.Sugerujemy przybliżoną elipsoidę. Gdy to zrobisz, przejdziesz do edycji, wyboru i tworzenia maski. Na koniec wrócisz do naszego oryginalnego pliku maski i użyjesz edycji i wypełnienia, aby wypełnić somę, a teraz mamy osobny plik maski neurytowej i soma, który następnie zapiszesz.Po zapisaniu oddzielnego pliku maski neurytu i somy, tutaj mam go jako plik maski podkreślenie neur dla neurytu i podkreślenia soma, przejdziemy do MATLAB i otworzymy plik MATLAB sieci neurytowej 2D. Tutaj przejdziemy do bieżącego folderu do naszego katalogu, w którym zdeponowaliśmy wszystkie nasze dane analityczne. Gdy to zrobimy, zmienimy ścieżkę nazwy maski na nasz nowy plik maski, którym jest neurite.Tak więc w tym przypadku mam mój plik maski neurytowej w folderze plików maski. Następnie zmienimy nazwę pliku CSV na miejsce, w którym znajduje się nasz plik ze śladami fluorescencyjnymi. W tym przypadku nadal znajduje się w folderze plików danych, a więc pliki danych są ukośne, a nazwa pliku CSV ze śladami fluorescencyjnymi.Gdy to zrobisz, możesz nacisnąć uruchom. Spowoduje to utworzenie szkieletowej wersji pliku maski neurytowej i zdeponowanie jej jako pliku CSV w folderze plików maski, który możemy zobaczyć tutaj. Następnie wygenerujemy plik CSV również dla somy.Aby to zrobić, otwórz plik twórcy maski CSV. Będziesz chciał wprowadzić ścieżkę do maski soma i nazwę pliku CSV, który ma zostać utworzony. Tutaj po prostu poszedłem dalej i użyłem tej samej dokładnej nazwy pliku, tylko z dołączoną kropką CSV.Naciśnij uruchom, a zobaczysz, że wraz z neurytem został utworzony nowy plik CSV soma. Po utworzeniu plików CSV zarówno dla maski neurytowej, jak i maski soma, możemy uruchomić analizę K Ripleya. Aby to zrobić, przejdziemy do R Studio i otworzymy plik R analizy K Ripley.Istnieją tutaj dwie główne zmienne, na które należy zwrócić uwagę, maska neuronu i punkty danych neuronu. Maska Neuron wskaże dowolny plik maski, który chcesz uruchomić. W tym przypadku najpierw uruchamiam pliki maski soma.Będziesz chciał uruchomić wszystkie pliki maski soma oddzielnie od wszystkich plików masek neurytowych. Tutaj mam dwa neurony, których będę używał do tej analizy. Możesz jednak użyć tylu, ile chcesz do analizy K Ripleya, wystarczy skopiować i wkleić ten kod dla maski neuronu i zmienić zmienną na trzy i dalej.Drugą zmienną są punkty danych neuronów. W tym miejscu chcesz wskazać plik, który został wygenerowany przez wszystkie wyodrębnione pliki R. Teraz mój został nazwany statystykami fuzji i to jest to, co tutaj czytam.Jak już wspomniałem, mam drugi plik maski somy i neuron, który jest analizowany równocześnie, abyśmy mogli agregować K Ripleya razem. Po zmianie tych ścieżek na poprawne ścieżki użyjesz kodu, uruchomisz region i uruchomisz wszystko. Po zakończeniu przebiegu zostanie wygenerowanych kilka wykresów, w tym zgrupowane wartości K Ripleya, a także wykresy gęstości.Można je zapisać, przechodząc do eksportu, zapisz obraz jako i wybierając odpowiedni format obrazu, katalog, nazwę pliku, a na koniec naciskając Zapisz. Tutaj widzimy reprezentatywne wyniki z 12 mysich neuronów korowych wyrażających wentylację do fluoru, zobrazowane po dwóch dniach in vitro przy użyciu mikroskopii TIRF. W A widzimy częstość egzocytozy podzieloną według klasy.Tutaj widzimy, że chwilowa pełna fuzja pęcherzyków występuje częściej niż w innych klasach. W B możemy zobaczyć rozkład modów, co potwierdza, że chwilowa pełna fuzja pęcherzyków stanowi ponad połowę wszystkich zdarzeń. W C określamy rozkład przestrzenny egzocytozy jako mapę cieplną.Widzimy, że większość zdarzeń egzocytarnych skupia się w gorącym punkcie w pobliżu somy, a także na dystalnych końcach neurytów. W D możemy stwierdzić, że zdarzenia egzocytarne są statystycznie istotnie zgrupowane, a wielkość tych klastrów waha się od pół mikrona do jednego mikrona. Zastosowanie zautomatyzowanego programu analitycznego do prawidłowej identyfikacji i analizy zdarzeń egzocytarnych w bezstronny sposób zwiększa wydajność analizy oraz poprawia odtwarzalność i rygor.Aby zapewnić dokładność wykrywania, ważne jest, aby podczas obrazowania utrzymywać wysoki stosunek sygnału do szumu. Uchwycenie zdarzeń egzocytarnych lub innych wrażliwych na pH zdarzeń przejściowych wymaga częstotliwości obrazowania wystarczająco szybkiej, aby uchwycić wszystkie zdarzenia i poprawić szacunki, takie jak okres półtrwania lub zmiana piku fluorescencji. Wykazaliśmy, że ten program działa nie tylko w celu dokładnego wychwytywania fluorescencji wrażliwej na pH w rozwijających się neuronach, ale także w innych typach komórek.Jeśli jednak używasz innego typu komórek, ważne jest, aby sprawdzić różnice w dokładności ze względu na różne zachowania zdarzeń przejściowych w innych typach komórek. Do tej pory ta klasyfikacja była stosowana tylko w rozwoju neuronów. I rzeczywiście, nie wiemy, czy procesy te zachodzą w innych typach komórek lub w późniejszych punktach rozwojowych neuronów.

automated-detection-and-analysis-of-exocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje technikę wizualizacji egzocytozy w komórkach tucznych. Komórki są inkubowane z dekstranem FITC - fluorescencyjnym reporterem - który jest pobierany przez komórki wewnątrz granulek wydzielniczych (SG), gdzie kwaśne pH wygasza jego fluorescencję. Po stymulacji egzocytozy ziarnistości, wyższe pH pożywki indukuje fluorescencję reporterową wewnątrz stopionych SG, która jest wizualizowana za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Technika in vitro do wizualizacji egzocytozy granulek wydzielniczych w komórkach tucznych

Endocytoza za pośrednictwem klatryny, szybki i bardzo dynamiczny proces internalizuje wiele białek, w tym receptory sygnałowe. Opisany tutaj protokół bezpośrednio wizualizuje kinetykę poszczególnych zdarzeń endocytarnych. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rdzeniowi członkowie maszynerii endocytarnej koordynują się ze sobą i jak ładunek białka wpływa na ten proces.

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Istnieje wiele różnych metod pomiaru pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą cytometrii przepływowej (FCM). Przy określaniu najodpowiedniejszej metody należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Przedstawiono dwa protokoły pomiaru EV, wykorzystujące albo indywidualną detekcję, albo podejście oparte na kulkach.

Techniki analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Celem obecnego protokołu było opracowanie metody, która pozwoli na funkcjonalne analizy genomiczne wydzielania komórek tucznych. Protokół opiera się na ilościowej ocenie uwalniania fluorescencyjnego genu reporterowego skotransfekowanego z genem będącym przedmiotem zainteresowania oraz analizach morfologii granulki wydzielniczej w czasie rzeczywistym.

badanie granulek wydzielniczych komórek tucznych; od biosyntezy do egzocytozy

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Stres osmotyczny wpływa na egzocytozę i ilość neuroprzekaźników uwalnianych podczas tego procesu. Pokazujemy, w jaki sposób połączenie metod elektrochemicznych z transmisyjną mikroskopią elektronową może być wykorzystane do badania wpływu zewnątrzkomórkowego ciśnienia osmotycznego na aktywność egzocytozy, wielkość ilościową pęcherzyków i ilość neuroprzekaźnika uwalnianego podczas egzocytozy.

Monitorowanie wpływu stresu osmotycznego na pęcherzyki wydzielnicze i egzocytozę

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę obrazowania żywych komórek regulowanej egzocytozy. Metoda ta wykorzystuje dekstran FITC, który gromadzi się w organellach związanych z lizosomami, jako reporter. Ta prosta metoda pozwala również na rozróżnienie różnych trybów regulowanej egzocytozy w komórkach, które są trudne do manipulowania genetycznie.

Obrazowanie FITC-dekstranu jako reportera regulowanej egzocytozy

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Obrazowanie na żywo lizosomalnej egzocytozy na mikrowzorcach komórek pozwala na przestrzenną kwantyfikację tego procesu. Normalizacja morfologii za pomocą mikrowzorców jest znakomitym narzędziem do odkrywania ogólnych zasad dotyczących przestrzennego rozkładu procesów komórkowych.

Kwantyfikacja parametrów czasoprzestrzennych egzocytozy komórkowej w komórkach z mikrowzorami

Ten protokół opisuje podejścia do wykrywania i ilościowego oznaczania dużych zagregowań i/lub organelli (~4 μm) wytwarzanych przez komórki C. elegans w postaci egzoferów związanych z błoną. Opisujemy szczepy, warunki wzrostu, kryteria punktacji, czas i rozważania mikroskopowe potrzebne do ułatwienia sekcji tego mechanizmu wydalania gruzu.

Ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u C. elegans

Odkryj automatyczną analizę egzocytozy w komórkach nerwowych przy użyciu mikroskopii TIRF i algorytmów MATLAB. To narzędzie klasyfikuje zdarzenia fuzyjne i ocenia ich rozmieszczenie przestrzenne.

Automatyczne wykrywanie i analiza egzocytozy

Przeglądaj więcej filmów