Name: Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę preparatyki i immunofluorescencji siatkówki myszy C57-Black/6 w modelu retinopatii indukowanej tlenem. Technika umożliwia obserwację dynamicznych zmian naczyń siatkówki przy zachowaniu integralności tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom z naszego laboratorium i Laboratorium Okulistycznego Centrum Okulistycznego Zhongshan za ich pomoc techniczną. Dziękujemy również prof. Chunqiao Liu za wsparcie eksperymentalne. Prace te były wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC: 81670872; Pekin, Chiny), Fundacja Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong w Chinach (grant nr 2019A1515011347) oraz projekt budowy szpitala wysokiego szczebla z Państwowego Kluczowego Laboratorium Okulistyki w Centrum Okulistycznym Zhongshan (grant nr 303020103; Guangzhou, prowincja Guangdong, Chiny).

Wszystkie procedury związane z użyciem myszy zostały zatwierdzone przez komisję etyki eksperymentów na zwierzętach Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Chiny (autoryzowany numer: 2020-082), oraz zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Centrum Okulistycznego Zhongshan oraz Oświadczenia Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącej wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
1. Indukcja mysiego modelu OIR
<ol>
	<li>Użyj myszy z niższym wskaźnikiem wrodzonych wad rozwojowych oczu, np. myszy C57BL / 6J, i połącz je w pary w stosunku samiec / samica = 1: 2. Pozwól, aby młode urodziły się tego samego dnia i zacznij indukować model OIR w P7. Zapisuj masę ciała szczeniąt myszy dokładnie przed modelowaniem. 
	UWAGA: Zanotuj dzień urodzenia jako P0. Regularnie rejestruj wagę każdej myszy. Masa ciała nowonarodzonych szczeniąt jest bardzo ważna podczas indukcji OIR, ponieważ wrażliwość myszy w różnych stanach na tlen jest różna. Wykluczyć młode o masie większej niż 5 g w P7, aby zapewnić porównywalne wyniki.</li>
	<li>Zapewnij odpowiednie środowisko życia dla matek karmiących i ich szczeniąt, takie jak ustawienie temperatury na 23 °C ± 2 °C, kontrolowanie wilgotności na poziomie 40%-65%, naprzemienne 12 godzin światła i 12 godzin ciemności każdego dnia, dodanie trochę waty do klatki do gniazdowania, zapewnienie odpowiedniej wysterylizowanej żywności i wody, i trzymanie ich w indywidualnie wentylowanych klatkach (IVC).</li>
	<li>Monitoruj poziom wilgotności i temperatury wewnątrz komory. Kontroluj wilgotność w zakresie od 40% do 65% i utrzymuj temperaturę na poziomie 23 °C ± 2 °C.</li>
	<li>Sprawdź dopływ tlenu za pomocą czujników tlenu, utrzymuj stały poziom tlenu na poziomie 75% i kontroluj natężenie przepływu tlenu na poziomie 0,5-0,75 l/min. Umieść 50 g wapna sodowanego na dnie komory, aby wchłonąć nadmiar CO2 i utrzymać wartości CO2 poniżej 3%22.</li>
	<li>Monitoruj zachowania matek karmiących, takie jak budowanie gniazda, gryzienie szczeniąt i odmawianie laktacji przynajmniej raz dziennie. Wyeliminuj matki karmiące z kiepskim macierzyństwem.</li>
	<li>Umieść młode P7 (samca i samicę) oraz ich karmiące matki w komorze tlenowej, w której poziom tlenu wynosi 75% przez 5 dni do P12. Unikaj niepotrzebnego otwierania komory w okresie indukcji modelu. Upewnij się, że są dodatkowe matki zastępcze do wymiany, na wypadek, gdyby matki karmiące zmarły z powodu urazu płuc podczas hiperoksji. 
	UWAGA: Aby zapewnić porównywalność eksperymentu, ogranicz liczbę do 6-8 młodych dla każdej matki. Zwróć uwagę na potencjalny problem toksyczności tlenu, który powoduje śmierć niektórych matek karmiących. Objawy hiperoksycznego uszkodzenia płuc u matek karmiących obejmują między innymi wahania częstości oddechów, zmniejszoną aktywność i zmniejszone karmienie. Gdy wystąpi powyższe zjawisko, należy jak najszybciej poddać matkę karmiącej eutanazji 1% pentobarbitalem sodu (50 mg/kg). Przygotuj kilka matek zastępczych, np. 129S1/SvImJ do wymiany i używaj ich tylko w razie potrzeby. Nie zaleca się rutynowego zastępowania matek karmiących, ponieważ doprowadzi to do częstego otwierania komory tlenowej, co spowoduje niestabilny poziom tlenu i agresję matki.</li>
	<li>Przyprowadź młode i ich matki karmiące z powrotem do powietrza w pomieszczeniu w temperaturze P12 i monitoruj wagę wszystkich szczeniąt w sposób ciągły aż do P17. Pogrupuj młode na podstawie wagi, aby upewnić się, że każda grupa doświadczalna ma podobny rozkład masy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie całych wierzchowców siatkówki i barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Zapisz masę ciała szczeniąt. Uśmierc młode przez przedawkowanie środka znieczulającego (1% pentobarbital sodu 50 mg/kg) lub wdychanie CO2 . W razie potrzeby można zastosować inne metody eutanazji, takie jak zwichnięcie szyjki macicy i torakotomia obustronna.</li>
	<li>Użyj zakrzywionych nożyczek, aby zwolnić połączenie między gałkami ocznymi a tkanką oczodołu. Następnie umieść zakrzywione kleszcze w tylnej części gałki ocznej, zaciśnij nerw wzrokowy i szybko wyjmij oko z orbity. Umyj gałki oczne we wstępnie schłodzonym 1x buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS), aby usunąć włosy i krew z powierzchni gałek ocznych.</li>
	<li>Umieść oczyszczone gałki oczne w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml wypełnionej 4% paraformaldehydem (PFA) i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 12-15 obrotów na minutę (rpm) (początkowe utrwalenie). 
	UWAGA: Wiadomo, że paraformaldehyd jest alergizujący, ogólnie toksyczny i wyjątkowo cytotoksyczny. Ściśle przestrzegaj instrukcji bezpieczeństwa i unikaj wdychania i kontaktu ze skórą.</li>
	<li>Użyj naczynia hodowlanego i umieść kroplę 1x PBS w centralnej części i wykonaj następujące czynności pod mikroskopem preparacyjnym i umieść jedną gałkę oczną w tej kropli. Przytrzymaj gałkę oczną za pomocą kleszczy i ostrożnie nakłuj rogówkę na rąbku rogówki za pomocą igły do strzykawki o pojemności 1 ml. Włóż końcówkę nożyczek do tego otworu i ostrożnie odetnij rogówkę wzdłuż rąbka rogówki. Uważaj, aby nie przeciąć siatkówki.</li>
	<li>Usuń tęczówkę i obiektyw za pomocą kleszczy. Następnie umieść pozostałą muszlę oczną w 4% PFA i ponownie utrwalaj przez kolejne 45 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min (utrwalenie wtórne).</li>
	<li>Użyj naczynia hodowlanego i wlej kroplę 1x PBS do środkowej części. Umieść stałą gałkę oczną w tej kropli. Przytrzymaj gałkę oczną za pomocą kleszczy. Delikatnie oddziel warstwy siatkówki i twardówki za pomocą dwóch kleszczyków. Umieść końcówkę nożyczek między warstwami siatkówki i twardówki i przetnij twardówkę w kierunku nerwu wzrokowego. Oderwij twardówkę od siatkówki i uzyskaj miseczkę siatkówki. 
	UWAGA: Przytrzymaj tylną miseczkę za nerw wzrokowy za pomocą kleszczy, a następnie użyj zakrzywionego końca innego kleszcza, aby docisnąć twardówkę w głowie nerwu wzrokowego i delikatnie masuj siatkówkę ruchem zamaszystym do przodu jako alternatywę dla uwolnienia siatkówki.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby zwolnić połączenie między promieniowymi naczyniami hialoidalnymi a siatkówką obwodową, zaciśnij korzeń naczyń szklistych, który znajduje się blisko głowy nerwu wzrokowego, i ostrożnie odetnij naczynia hialoidalne.</li>
	<li>Użyj pipety o pojemności 2 ml z odciętą końcówką, aby przenieść kubek siatkówki. Umieść miseczkę siatkówki w jednym dołku na 48-dołkowej płytce i myj ją przez 3 x 5 minut z 1x PBS w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min.</li>
	<li>Inkubować miseczkę siatkówki w mieszanym roztworze 1% Triton X-100 (w PBS) i 5% normalnej surowicy osła (w PBS) przez noc w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Alternatywnie można zablokować i przepuszczalnie siatkówki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Zmienić surowicę blokującą w zależności od źródła przeciwciała drugorzędowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku znakowania naczyń krwionośnych siatkówki za pomocą izolektyny B4, inkubuj siatkówkę w studzience 48-dołkowej z 0,1% normalnej surowicy osła (400 μl) i izollektyny B4-594 (1:400) przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min. 
	UWAGA: W przypadku znakowania naczyń krwionośnych innymi markerami, takimi jak CD31, lub znakowania innych komórek, należy użyć specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych do ich znakowania.</li>
	<li>Inkubować siatkówkę z 1:100-1:500 specyficznymi przeciwciałami pierwszorzędowymi (w 400 μl 0,1% normalnej surowicy osła) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min przez 48 godzin. (opcjonalnie)</li>
	<li>Po powrocie do temperatury pokojowej przemyj siatkówkę 0,1% PBST (0,1% TritonX-100 w PBS) przez 3 x 20 min na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min.</li>
	<li>Inkubować siatkówkę z przeciwciałami drugorzędowymi w proporcji 1:1000 (w 400 μl 0,1% normalnej surowicy osła) przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min. (Opcjonalnie)
	<ol>
		<li>Alternatywnie inkubuj siatkówkę z przeciwciałami drugorzędowymi o wysokim powinowactwie w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubuj siatkówkę z DAPI (1:1,000) w temperaturze pokojowej przez 20-25 minut, aby oznaczyć jądro. 
	UWAGA: Przetestuj optymalne proporcje rozcieńczenia dla wszystkich przeciwciał użytych w krokach 10-11 i 13-14 w eksperymencie.</li>
	<li>Myć siatkówkę przez 3 x 30 min 0,1% PBST na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieś miseczkę siatkówki na czysty szkiełko z otworem skierowanym do góry. Przetnij siatkówkę promieniowo w pozycjach godziny 3, 6, 9 i 12 od obwodu do środka, odcinając około 1-1,5 mm od głowy nerwu wzrokowego.</li>
	<li>Dodaj kilka kropli 1x PBS, aby trzykrotnie przepłukać siatkówkę. Użyj papieru układanego powietrzem, aby wysuszyć i spłaszczyć siatkówkę. Dodać kroplę podłoża montażowego (patrz Tabela materiałów) na środek szkiełka nakrywkowego i przestań dodawać je, aż średnica kropli zwiększy się do połowy szkiełka nakrywkowego. Szybko odwróć szkiełko nakrywkowe i umieść je na wierzchu rozpostartej siatkówki. Unikaj tworzenia się bąbelków.</li>
	<li>Zrób zdjęcia płaskich mocowań siatkówki lub przechowuj i chroń szkiełka przed światłem w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Analiza i kwantyfikacja płaskich mocowań siatkówki
UWAGA: W mysim modelu OIR, badacze często rejestrują obszar okluzji naczyniowej centralnej siatkówki i patologicznej neowaskularyzacji obwodowej siatkówki podczas P12-P25. Wcześniejsze badania wykazały, że centralny obszar jałowy siatkówki osiąga maksimum w P12 i stopniowo kurczy się od P13 do P17; w tym samym czasie siatkówka myszy OIR osiąga szczyt obszaru neowaskularyzacji około P1722,29. Od P17 naczynia nowotworowe stopniowo się cofają, a naczynia funkcjonalne odrastają w obszar jałowy. Unaczynienie siatkówki w zasadzie wraca do normy przy P2533.
<ol>
	<li>Zrób zdjęcia płaskich mocowań siatkówki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów) z soczewką obiektywową 10x. Najpierw wybierz kanał DAPI i ustaw głowę nerwu wzrokowego w środku pola widzenia. Następnie dostosuj inne kanały i skup się na powierzchownym unaczynieniu siatkówki. Sprawdź Kafelki w programie fotograficznym (patrz Spis materiałów) i ustaw liczbę zdjęć, które mają zostać zszyte. Kliknij Rozpocznij eksperyment, aby uchwycić całą siatkówkę.</li>
	<li>Użyj programu do przetwarzania obrazu (patrz tabela materiałów), aby określić ilościowo obszar obliteracji naczyń krwionośnych (VO) i neowaskularyzacji (NV) po barwieniu immunofluorescencyjnym.
	<ol>
		<li>Najpierw kliknij narzędzie Magiczna różdżka i ustaw odpowiednią tolerancję zgodnie z różnicą jasności, a następnie przesuń kursor na tło i kliknij myszą. Następnie wybierz opcję Wybierz odwrotność, aby uzyskać podstawowy zarys siatkówki. Użyj narzędzia Lasso, aby dokładniej obrysować szczegóły siatkówki. Korzystając z funkcji Histogram, zapisz wartość piksela całej siatkówki i zapisz ją lub wygeneruj tabelę w programie bazy danych.</li>
		<li>Podziel obraz siatkówki na cztery ćwiartki. W każdej ćwiartce użyj narzędzia Lasso, aby narysować obszar VO (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2A-C) i użyj narzędzia Magiczna różdżka, aby wybrać obszar NV (<silna klasa = "xfig"> Rysunek 2D-F). Na podstawie informacji o pikselach na histogramie oblicz stosunek pikseli VO i NV do całej siatkówki, czyli procent obszaru VO lub NV w stosunku do całej siatkówki. 
		UWAGA: Istnieje również w pełni zautomatyzowany potok o otwartym kodzie źródłowym do kwantyfikacji obszarów VO i NV na obrazach OIR przy użyciu sieci neuronowych głębokiego uczenia (http://oirseg.org/), który zapewnia badaczom niezawodny i oszczędzający czas sposób, a także ujednolica standard kwantyfikacji34.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisuj informacje o pikselach w tabeli arkusza kalkulacyjnego, co jest wygodne do późniejszej analizy.</li>
</ol>
4. Obrazowanie in vivo z angiografią dna oka z fluoresceiną (FFA)
UWAGA: Dla myszy OIR, zarówno perfuzja FITC, jak i barwienie immunofluorescencyjne mogą być użyte tylko raz z powodu śmierci zwierząt doświadczalnych. W porównaniu z tym, jedną z zalet FFA jest obserwacja dynamicznych zmian naczyń siatkówkowych myszy podczas rozwoju i stanu patologicznego in vivo35,36.
<ol>
	<li>Zważ szczenięta przed znieczuleniem.</li>
	<li>Znieczulenie szczeniąt przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,3% pentobarbitalu sodu w dawce 30-50 mg/kg. 
	UWAGA: W przypadku myszy w ciągu 1 miesiąca należy zwrócić uwagę na dawki środka znieczulającego. Stosuj niższe stężenia i dawki środka znieczulającego, aby zmniejszyć śmierć myszy spowodowaną znieczuleniem. Po znieczuleniu szczeniąt użyj małej poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała. Hipotermia nie tylko wpływa na funkcje fizjologiczne szczeniąt, ale także prowadzi do zmian w krystalinie i przyspiesza rozwój zaćmy.</li>
	<li>Użyj 20 μl kropli do oczu z rozszerzaniem źrenic (0,5% tropikamidu + 0,5% chlorowodorku fenylefryny) dla każdego szczeniaka i odczekaj 5 minut, aby osiągnąć długotrwałe rozszerzenie źrenicy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A,B).</li>
	<li>Przynieś znieczulone szczenięta przed urządzenie do obrazowania (patrz Tabela materiałów). Trzymaj szczenięta na małej poduszce grzewczej, umieszczaj szczenięta w stabilnej pozycji i regularnie używaj sztucznych łez, aby utrzymać wilgoć w rogówce. Kliknij tryb obrazowania dna oka w podczerwieni (IR), aby ustawić głowę nerwu wzrokowego na środku ekranu. 
	UWAGA: Obserwując jedno oko szczeniąt, nie zapomnij chronić drugiego oka. Stosuj krople do oczu z hypromelozą, aby zapobiec wybielaniu rogówki z powodu suchości.</li>
	<li>Po dootrzewnowym wstrzyknięciu 0,15 ml 0,5% roztworu soli sodowej fluoresceiny, należy natychmiast kliknąć przycisk FA i przycisk Wstrzyknięcie na panelu dotykowym urządzenia do obrazowania, aby rozpocząć odmierzanie czasu. Zapisz obrazy po 3 minutach, gdy krążenie krwi w siatkówce wejdzie w fazę żylną i obserwuj siatkówkę nie mniej niż 6-8 minut. 
	UWAGA: Po dootrzewnowym wstrzyknięciu roztworu soli sodowej fluoresceiny, skóra, błona śluzowa i mocz szczeniąt wykazują wyraźny żółtawozielony kolor. Większość fluoresceiny jest wydalana przez młode w ciągu jednego dnia. Wstrzykiwanie fluoresceiny sodowej dootrzewnowo co drugi dzień przez sześć razy nie powoduje znaczących skutków ubocznych37.</li>
	<li>Przesuń głowę nerwu wzrokowego do środka obszaru akwizycji obrazu i zrób pierwsze zdjęcie centralnej siatkówki. Następnie przesuń soczewkę urządzenia do obrazowania poziomo na nosową stronę oka, aż głowa nerwu wzrokowego znajdzie się w środku jednej strony obszaru akwizycji obrazu i wykonaj drugi obraz. Kontynuuj wykonywanie zdjęć siatkówki skroniowej, górnej i dolnej, odpowiednio za pomocą tej metody (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). 
	UWAGA: Wykonaj zdjęcia w "pięciu orientacjach" w ciągu 12 minut, gdy następuje faza regresji. Pozycja głowy nerwu wzrokowego na dolnym obrazie nie może spaść na linię boczną ze względu na ograniczoną regulację kąta soczewki.</li>
	<li>Zapisz obrazy i użyj programu do przetwarzania obrazu do zszywania.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie obrazu angiografii dna oka metodą fluoresceiny (FFA)
<ol>
	<li>Otwórz program do przetwarzania obrazów i kliknij Nowy w pliku, aby utworzyć nowe płótno z czarnym tłem (Rysunek 4A).</li>
	<li>Otwórz najpierw obraz centralnej siatkówki w warstwie tła. Kliknij Plik i dodaj drugi obraz. Dostosuj krycie drugiego obrazu do 60%, przesuń i zmień rozmiar drugiego obrazu, aż te same części obu obrazów będą się na siebie nakładać. Kliknij przycisk Przełącz między trybami swobodnej transformacji i wypaczania i w razie potrzeby dokonaj subtelnych korekt naczyń. Następnie zmniejsz krycie drugiego obrazu z powrotem do 100% (Rysunek 4A,B).</li>
	<li>Wybierz dwa obrazy w tym samym czasie i kliknij Warstwy automatycznego mieszania. Zaznacz opcję Panorama jako metodę mieszania, a także zaznacz następujące dwa zdania. Kliknij OK i zakończ zszywanie pierwszych dwóch obrazów (Rysunek 4C,D).</li>
	<li>Weź pierwsze dwa zszyte obrazy jako całość, dodaj trzeci obraz i kontynuuj mieszanie. Powtórz powyższe metody, aby zakończyć zszywanie pięciu obrazów (<silna klasa="xfig">Rysunek 4E).</li>
	<li>Użyj narzędzia Kadrowanie, aby przyciąć obrazy FFA w różnych punktach czasowych do jednolitego rozmiaru i obserwować dynamiczne zmiany unaczynienia siatkówki od P15 do P25 zarówno u szczeniąt normalnych, jak i OIR.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wartości bieżące jako średnia ± odchylenie standardowe (s.d.).</li>
	<li>Użyj testu t-Studenta, aby porównać dwie niezależne próby. Użyj jednokierunkowej ANOVA, aby porównać wiele zestawów danych i połączyć z testem Dunnetta lub Tukeya, który jest powszechnie używanym testem wielokrotnego porównania.</li>
	<li>W przypadku danych o rozkładzie nienormalnym należy użyć testu U Manna-Whitneya lub testu Kruskala Wallisa. Rozważ istotne różnice statystyczne, gdy P < 0,05.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Na podatność myszy na OIR wpływa wiele czynników. Nie można porównywać szczeniąt o różnym pochodzeniu genetycznym i szczepach. U myszy albinosów BALB/c naczynia szybko odrastają w obszar VO ze znacznie zmniejszonymi kępkami neowaskularnymi38, co powoduje pewne trudności w badaniach. U myszy C57BL / 6 występuje zwiększone uszkodzenie fotoreceptorów w porównaniu ze szczepem myszy BALB / cJ39,40. To samo dotyczy różnych typów myszy transgenic...

Neowaskularyzacja siatkówki (RNV), która jest definiowana jako stan, w którym nowe patologiczne naczynia pochodzą z istniejących żył siatkówki, zwykle rozciąga się wzdłuż wewnętrznej powierzchni siatkówki i rozrasta się do ciała szklistego (lub przestrzeni podsiatkówkowej w pewnych warunkach)1. Jest to cecha charakterystyczna i wspólna wielu retinopatii niedokrwiennych, w tym retinopatii wcześniaków (ROP), niedrożności żył siatkówki (RVO) i proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR)2.
Liczne obserwacje kliniczne i eksperymentalne wykazały, że główną przyczyną neowaskularyzacji siatkówki jest niedokrwienie3,4. W ROP noworodki są narażone na działanie tlenu na wysokim poziomie w zamkniętych inkubatorach w celu zwiększenia przeżywalności, co jest również ważnym czynnikiem hamującym wzrost naczyń krwionośnych. Po zakończeniu leczenia siatkówki noworodków doświadczają względnego okresu niedotlenienia5. Inne sytuacje obserwuje się w niedrożności centralnych lub rozgałęzionych żył siatkówki w RVO, obserwuje się również uszkodzenie naczyń włosowatych siatkówki, które jest spowodowane mikroangiopatią w PDR2. Niedotlenienie dodatkowo zwiększa ekspresję czynników angiogennych, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), poprzez szlak sygnałowy czynnika 1α indukowanego hipoksją (HIF-1α), który z kolei kieruje komórkami śródbłonka naczyniowego do wzrostu w obszarze niedotlenienia i tworzenia nowych naczyń6,7.
ROP to rodzaj retinopatii proliferacyjnej naczyń krwionośnych u wcześniaków i główna przyczyna ślepoty dziecięcej8,9, która charakteryzuje się niedotlenieniem siatkówki, neowaskularyzacją siatkówki i przerostem włóknistym10,11,12. W latach pięćdziesiątych XX wieku naukowcy odkryli, że wysokie stężenie tlenu może znacznie poprawić objawy oddechowe u wcześniaków13,14. W związku z tym w tamtym czasie tlenoterapia była coraz częściej stosowana u wcześniaków15. Jednak równolegle z powszechnym stosowaniem tlenoterapii u wcześniaków, częstość występowania ROP wzrastała z roku na rok. Od tego czasu naukowcy powiązali tlen z ROP, badając różne modele zwierzęce, aby zrozumieć patogenezę ROP i RNV16.
U człowieka większość rozwoju unaczynienia siatkówki jest zakończona przed urodzeniem, podczas gdy u gryzoni unaczynienie siatkówki rozwija się po urodzeniu, dostarczając dostępnego systemu modelowego do badania angiogenezy w unaczynieniu siatkówki2. Wraz z ciągłym postępem badań, modele retinopatii indukowanej tlenem (OIR) stały się głównymi modelami naśladowania patologicznej angiogenezy wynikającej z niedokrwienia. W badaniu modelu OIR nie ma konkretnych gatunków zwierząt, a model został opracowany dla różnych gatunków zwierząt, w tym kitten17, rat18, mouse19, beagle puppy20 i zebrafish21. Wszystkie modele mają ten sam mechanizm, dzięki któremu są narażone na hiperoksję podczas wczesnego rozwoju siatkówki, a następnie wracają do środowiska normoksycznego. Smith i wsp. zaobserwowali, że wystawienie młodych myszy na hiperoksję z P7 przez 5 dni wywołało ekstremalną formę regresji naczyń w centralnej siatkówce i sprowadzenie ich z powrotem do powietrza w pomieszczeniu w P12 stopniowo wywołało kępki neowaskularne, które rosły w kierunku ciała szklistego19. Był to ustandaryzowany model myszy OIR, zwany również modelem Smitha. Connor i in. jeszcze bardziej zoptymalizowali protokół i w 2009 roku opracowali uniwersalną metodę ilościowego określania obszaru VO (obliteracja naczyń krwionośnych) i NV (neowaskularyzacja), co zwiększyło akceptację i wykorzystanie modelu22. Model myszy OIR jest obecnie nadal najczęściej używanym modelem ze względu na jego niewielkie rozmiary, szybką reprodukcję, wyraźne tło genetyczne, dobrą powtarzalność i wysoki wskaźnik sukcesu.
U myszy unaczynienie siatkówki zaczyna się po urodzeniu wraz z wrastaniem naczyń od głowy nerwu wzrokowego do wewnętrznej siatkówki w kierunku ora serrata. Podczas normalnego rozwoju siatkówki pierwsze naczynia siatkówki wyrastają z głowy nerwu wzrokowego około porodu, tworząc rozszerzającą się sieć (splot pierwotny), która dociera do obwodu około 7 dnia po urodzeniu (P7)23. Następnie naczynia zaczynają wrastać w siatkówkę, tworząc głęboką warstwę, penetrując siatkówkę i tworząc sieć laminarną wokół wewnętrznej warstwy jądrowej (INL), jak w human24. Pod koniec trzeciego tygodnia po porodzie (P21) głębszy rozwój splotu jest prawie zakończony. W przypadku mysiego modelu OIR niedrożność naczyń zawsze pojawia się w centralnej siatkówce z powodu szybkiej degeneracji dużej liczby niedojrzałych sieci naczyniowych w obszarze centralnym podczas ekspozycji na hiperoksję. Tak więc wzrost patologicznej neowaskularyzacji występuje również w środkowej siatkówki obwodowej, która jest granicą obszaru nieperfuzyjnego i obszaru naczyniowego. Jednak ludzkie naczynia siatkówkowe prawie uformowały się przed urodzeniem. Jeśli chodzi o wcześniaki, siatkówka obwodowa nie jest całkowicie unaczyniona pod wpływem hiperoksji25,26. Tak więc okluzja naczyń krwionośnych i neowaskularyzacja pojawiają się głównie w siatkówce obwodowej27,28. Pomimo tych różnic, mysi model OIR dokładnie podsumowuje patologiczne zdarzenia, które występują podczas neowaskularyzacji wywołanej niedokrwieniem.
Indukcję modelu OIR można podzielić na dwie fazy29: w fazie 1 (faza hiperoksji) rozwój naczyń krwionośnych siatkówki jest zatrzymany lub opóźniony z powodu niedrożności i regresji naczyń krwionośnych w wyniku spadku VEGF i apoptozy komórek śródbłonka24,30; w fazie 2 (faza niedotlenienia) dopływ tlenu do siatkówki stanie się niewystarczający w warunkach powietrza w pomieszczeniu29, który jest niezbędny dla rozwoju neuronów i homeostazy19,31. Ta sytuacja niedokrwienna zwykle prowadzi do nieuregulowanej, nieprawidłowej neowaskularyzacji.
Obecnie powszechnie stosowaną metodą modelowania jest naprzemienne narażenie na wysoki / niski poziom tlenu: matki i ich młode są wystawione na działanie 75% tlenu przez 5 dni w P7, a następnie 5 dni w powietrzu w pomieszczeniu, aż P17 wykaże porównywalne wyniki22, co jest punktem końcowym indukcji modelu myszy OIR. (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Oprócz symulacji ROP, ta patologiczna neowaskularyzacja za pośrednictwem niedokrwienia może być również wykorzystywana do badania innych chorób niedokrwiennych siatkówki. Główne pomiary tego modelu obejmują ilościowe określenie obszaru VO i NV, które są analizowane z płaskich mocowań siatkówki za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego lub perfuzji FITC-dekstranu. Każda mysz może być przebadana tylko raz ze względu na śmiertelną operację. Obecnie istnieje kilka metod obserwacji dynamicznych zmian unaczynienia siatkówki w sposób ciągły podczas procesu regresji naczyniowej i patologicznej angiogenezy32. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół indukcji modelu OIR, analizę płaskich mocowań siatkówki, a także przebieg pracy angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) na myszach, co byłoby pomocne w uzyskaniu bardziej wszechstronnego zrozumienia dynamicznych zmian naczyniowych podczas dwóch faz mysiego modelu OIR.

<table><tbody><tr><td>1 ml sterylna strzykawka</td><td>Solarbio</td><td>YA0550</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki i iniekcji dootrzewnowej</td></tr><tr><td>1 i razy; Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Transgen Biotech</td><td>&nbsp; FG701-01</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>2 ml Probówka do mikrowirówek</td><td>Corning</td><td>MCT-200-C</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>48 Well Clear Płytki wielodołkowe z powłoką TC</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>Samoprzylepne szkiełka mikroskopowe</td><td>Różne</td><td></td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CC 2019</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Gazowy dwutlenek węgla</td><td>Różne</td><td></td><td>Na ofiarę</td></tr><tr><td>Szkiełko okładkowe</td><td>Różne</td><td></td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione</td><td>World Precision Instruments</td><td>14127</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab228549</td><td>Do etykietowania jądra na płaskich mocowaniach siatkówki</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>Fluoresceina sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td>Do obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>&nbsp; Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td>Do akwizycji obrazów fluorescencyjnych płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Podłoże montażowe</td><td>SouthernBiotech</td><td>&nbsp; 0100-01</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>Hydroksypropylometyloceluloza</td><td>Maya</td><td>89161</td><td>Do obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>Przeciwciało izoloktyny B4 594</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>Do oznaczania unaczynienia siatkówki na płaskich mocowaniach siatkówki</td></tr><tr><td>Myszy C57 / BL6J</td><td>GemPharmatech z prowincji Jiangsu Do</td><td></td><td>indukcji modelu OIR</td></tr><tr><td>Mikropreparowanie nożyczki-ostrze proste</td><td>World Precision Instruments</td><td>503242</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>Kleszcze proste nr 4</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 501978-6</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Abcam</td><td>ab7475</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>Czujnik O2</td><td>Różne</td><td></td><td>Do monitorowania poziomu O2</td></tr><tr><td>OxyCycler</td><td>Biospherix</td><td>A84XOV</td><td>Do indukcji modelu OIR</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Do utrwalania tkanek</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Różne</td><td></td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Wapno sodowane</td><td>Różne</td><td></td><td>Do pochłaniania nadmiaru CO2 w komorze tlenowej</td></tr><tr><td>SPECTRALIS HRA+OCT</td><td>Heidelberg</td><td>HC00500002</td><td>Do obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>SPSS Statistics 22.0</td><td>IBM</td><td></td><td>Do analizy statystycznej</td></tr><tr><td>Wytrząsarka do defilacji Tansference</td><td>Kylin-Bell</td><td>ZD-2008</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych (niskie nasadki)</td><td>Corning</td><td>3261-20EA</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań</td></tr><tr><td>siatkówki Pipety transferowe</td><td>Różne</td><td></td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; SLBW6818</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki</td></tr><tr><td>Różne</td><td></td><td></td><td>Do obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania ZEN</td><td>ZEISS</td><td></td><td>Do akwizycji i eksportu obrazów</td></tr></tbody></table>

monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Retinopatia indukowana tlenem (OIR) jest szeroko stosowana do badania nieprawidłowego wzrostu naczyń krwionośnych w chorobach niedokrwiennych siatkówki, w tym retinopatii wcześniaków (ROP), proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR) i niedrożności żył siatkówki (RVO). Większość badań OIR obserwuje neowaskularyzację siatkówki w określonych punktach czasowych; jednak dynamiczny wzrost naczyń krwionośnych u żywych myszy w czasie, który jest niezbędny do zrozumienia chorób naczyń związanych z OIR, był niedostatecznie zbadany. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół indukcji mysiego modelu OIR, podkreślając potencjalne pułapki i zapewniając ulepszoną metodę szybkiego ilościowego określania obszarów obliteracji naczyń krwionośnych (VO) i neowaskularyzacji (NV) za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Co ważniejsze, monitorowaliśmy odrastanie naczyń krwionośnych u żywych myszy od P15 do P25, wykonując angiografię dna oka fluoresceiny (FFA) w mysim modelu OIR. Zastosowanie FFA do mysiego modelu OIR pozwala nam obserwować proces przebudowy podczas odrastania naczyń.

W mysim modelu OIR najważniejszym i podstawowym wynikiem jest ilościowe określenie obszaru VO i NV. Po przebywaniu w środowisku hiperoksycznym przez 5 dni od P7, w centralnej części siatkówki szczeniąt zaobserwowano największy obszar braku perfuzji. Pod wpływem stymulacji hipoksją przez kolejne 5 dni stopniowo powstawały nowotwory naczyniowe siatkówki, które fluorescowały intensywniej niż otaczające je naczynia prawidłowe. Po P17 sygnał fluorescencyjny patologicznej neowaskularyzacji szybko zanikał w miarę przebudowy sia...

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

Protokół ten może pomóc naukowcom w łatwym oddzieleniu siatkówki myszy i obserwowaniu dynamicznych zmian w unaczynieniu siatkówki w mysim modelu OIR. Głównymi zaletami tej metody jest zachowanie integralności oddzielonych siatkówk i umożliwienie każdej myszy służenia jako osobna kontrola, co sprawia, że wyniki są bardziej porównywalne. Naukowcy próbujący tej metody po raz pierwszy mogą mieć trudności podczas wykonywania pięciu obrazowań orientacyjnych, ponieważ nieco trudno jest ustawić szczenięta we właściwej pozycji.Aby pobrać tkankę do montażu całej siatkówki, użyj zakrzywionych nożyczek, aby odłączyć gałki oczne od tkanki oczodołu poddanego eutanazji szczeniaka C57-Black/6. Następnie włóż zakrzywione kleszcze do tylnej części gałki ocznej, zaciskając nerw wzrokowy i szybko podnosząc oko z oczodołu. Umieść gałki oczne we wstępnie schłodzonym PBS, aby usunąć wszelkie włosy i krew z powierzchni.Po zebraniu wszystkich gałek ocznych przenieś oczyszczone gałki oczne do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej 4% paraformaldehydu i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej i 12 do 15 obrotów na minutę. Pod koniec inkubacji dodaj kroplę PBS do środka naczynia hodowlanego pod mikroskopem preparacyjnym i umieść jedną gałkę oczną w kropli. Trzymając gałkę oczną za pomocą kleszczy, użyj jednomililitrowej igły strzykawki, aby ostrożnie nakłuć rogówkę na rąbku rogówki.Włóż końcówkę nożyczek do nakłucia i przetnij rogówkę wzdłuż rąbka rogówki, uważając, aby nie przeciąć siatkówki. Użyj kleszczyków, aby usunąć tęczówkę i soczewkę, a pozostałą muszlę oczną umieść w 4% paraformaldehydzie na 45-minutową inkubację w temperaturze pokojowej na shakerze. Pod koniec inkubacji umieść zamocowaną muszlę oczną w świeżej kropli PBS w środku nowej szalki hodowlanej.Trzymając muszlę oczną jedną parą kleszczy, użyj drugiej pary kleszczyków, aby delikatnie oddzielić warstwy siatkówki i twardówki. Umieść końcówkę nożyczek między warstwami siatkówki i twardówki i przetnij twardówkę w kierunku nerwu wzrokowego. Oderwij twardówkę od siatkówki, aby uzyskać miseczkę siatkówki.Za pomocą kleszczy zwolnij połączenie między promieniowymi naczyniami hialoidalnymi a siatkówką obwodową. Użyj dwumililitrowej pipety z odciętą końcówką, aby przenieść kubek siatkówki do jednego dołka na 48-dołkowej płytce na trzy pięciominutowe płukania w temperaturze pokojowej PBS na shakerze. Po ostatnim umyciu inkubuj kubek w 1% Triton X-100 i 5% normalnej surowicy osła w PBS przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Aby oznaczyć unaczynienie siatkówki izoloktyną B4, inkubuj siatkówkę w jednym dołku 48-dołkowej płytki w 400 mikrolitrach 0,1% normalnej surowicy osła uzupełnionej izolektyną B4-594 przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na shakerze. W razie potrzeby w tym samym czasie można dodać inne przeciwciało pierwszorzędowe. Następnego dnia przemyj siatkówkę trzema 20-minutowymi płukaniami w 0,1% PBST na shakerze.Po ostatnim płukaniu inkubować siatkówkę z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym o wysokim powinowactwie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie znakować próbkę DAPI przez 20 do 25 minut. Pod koniec inkubacji przemyć siatkówkę trzema 30-minutowymi płukaniami w 0,1% PBST w temperaturze pokojowej z potrząsaniem. Po ostatnim przemyciu przenieś miseczkę siatkówki na czyste szkiełko z otworem skierowanym do góry i użyj mikroskopu, aby przeciąć siatkówkę promieniście w pozycjach godziny trzeciej, sześciu, dziewięciu i dwunastej od obwodu w kierunku środka, do jednego do 1,5 milimetra od głowy nerwu wzrokowego.Przepłucz siatkówkę trzy razy kilkoma kroplami PBS na pranie przed użyciem papieru wyłożonego powietrzem do wysuszenia i spłaszczenia siatkówki. Dodaj kroplę podłoża montażowego do środka szkiełka nakrywkowego, aż średnica kropli pokryje połowę szkiełka nakrywkowego. Następnie szybko umieść szkiełko nakrywkowe mocując medium do dołu na rozpościerającej się siatkówce.Po przygotowaniu wszystkich płaskich mocowań siatkówki próbki można obrazować za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. W przypadku obrazowania in vivo dodaj 20 mikrolitrów kropli do oczu z rozszerzaniem źrenic, aby uzyskać długotrwałe rozszerzenie źrenicy. Po pięciu minutach umieść szczenięta w stabilnej pozycji na małej poduszce grzewczej przed urządzeniem do obrazowania.Aby utrzymać wilgoć w rogówce, regularnie dodawaj sztuczne łzy przez cały czas trwania procedury obrazowania. Następnie kliknij Obrazowanie dna oka w podczerwieni na urządzeniu, aby ustawić głowę nerwu wzrokowego na środku ekranu. Dootrzewnowo wstrzyknąć 150 mikrolitrów 0,5% roztworu soli sodowej fluoresceiny i natychmiast kliknąć przyciski FA i Iniekcja na panelu dotykowym urządzenia do obrazowania, aby uruchomić timer.Po trzech minutach, gdy krążenie krwi w siatkówce wejdzie w fazę żylną, uzyskaj pierwszy obraz centralnej siatkówki. Przesuń soczewkę urządzenia do obrazowania poziomo na nosową stronę oka, aż głowa nerwu wzrokowego znajdzie się w środku jednej strony obszaru akwizycji obrazu, a następnie wykonaj drugi obraz. Kontynuuj poruszanie soczewką i uzyskuj obrazy siatkówki skroniowej, górnej i dolnej w ten sam sposób.Aby przetworzyć obrazy siatkówki w odpowiednim programie do przetwarzania obrazu, otwórz menu Plik i kliknij Nowy, aby utworzyć nowe płótno z czarnym tłem. Otwórz obraz centralnej siatkówki. Następnie kliknij Plik, aby dodać drugi obraz.Dostosuj krycie drugiego obrazu do 60%, a następnie przesuwaj i zmieniaj rozmiar obrazu, aż oba obrazy będą się nakładać. Kliknij opcję Przełącz między trybami swobodnej transformacji i wypaczenia, a w razie potrzeby dokonaj subtelnych korekt w naczyniach. Następnie ustaw krycie drugiego obrazu z powrotem na 100%Zaznacz oba obrazy i kliknij przycisk Automatyczne mieszanie warstw.Zaznacz opcję Panorama jako metodę mieszania, a także zaznacz pola wyboru Płynne odcienie i kolory oraz Przezroczyste obszary wypełnienia z uwzględnieniem zawartości. Kliknij przycisk OK, aby zakończyć zszywanie pierwszych dwóch obrazów. Następnie dodaj trzeci obraz i zszyj ten obraz z pierwszymi dwoma obrazami, jak pokazano, aż wszystkie pięć obrazów z jednej siatkówki zostanie zszytych.Po przetworzeniu wszystkich obrazów z analizy użyj narzędzia Crop Tool, aby przyciąć obrazy FFA do jednolitego rozmiaru, aby ułatwić obserwację zmian w dynamice unaczynienia siatkówki w różnych punktach czasowych rozwoju. Po pięciu dniach ekspozycji na hiperoksję środkowe siatkówki młodych po urodzeniu w 12. dniu wykazują duży obszar bez perfuzji. Po przeniesieniu do pięciodniowych warunków niedotlenienia, siatkówki stopniowo neowaskularyzują, wykazując wzrost sygnału fluorescencji silniejszy niż obserwowany w otaczających normalnych naczyniach.Po 17 dniu po urodzeniu patologiczna neowaskularyzacja szybko się cofa, a siatkówka wykazuje całkowicie normalny wygląd do 25 dnia po urodzeniu. Dobrą powtarzalność i stabilność modelu retinopatii indukowanej tlenem można osiągnąć poprzez kontrolowanie wielkości miotu i przyrostu masy ciała młodych po urodzeniu. Jak zaobserwowano, zatarcie naczyń krwionośnych zwykle osiąga szczyt w 12 dniu po urodzeniu i znika w 25 dniu po urodzeniu, podczas gdy neowaskularyzacja osiąga szczyt w 17 dniu po urodzeniu i cofa się w 25 dniu po urodzeniu.W dniu pourodzeniowym od 15 do 25 myszy z retinopatią indukowaną tlenem średnica naczynia krwionośnego siatkówki zwiększa się i staje się bardzo męcząca w porównaniu z obserwowaną w siatkówkach normalnych myszy. Kleszcze w lewej ręce pełnią głównie rolę pomocniczą. Uważaj, aby nie ścisnąć gałki ocznej, co może ją zdeformować lub pęknąć.

monitoring-dynamic-growth-retinal-vessels-oxygen-induced-retinopathy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroskopia przyżyciowe może być używana u zwierząt do wizualizacji i pomiaru średnic naczyń krwionośnych siatkówki, prędkości przepływu krwi i całkowitego przepływu krwi w siatkówce.

Przyżyciowe pomiary wideomikroskopii przepływu krwi w siatkówce u myszy

Siatkówka gryzonia od dawna jest uznawana za dostępne okno do mózgu. W tym artykule technicznym przedstawiamy protokół, który wykorzystuje mysi model retinopatii indukowanej tlenem do badania mechanizmów, które prowadzą do niepowodzenia regeneracji naczyń w ośrodkowym układzie nerwowym po urazie niedokrwiennym. Opisany system można również wykorzystać do zbadania strategii wspomagających odrastanie funkcjonalnych naczyń krwionośnych w obrębie siatkówki i ośrodkowego układu nerwowego.

Ocena regeneracji naczyń w OUN za pomocą siatkówki myszy

Wiele zagrażających wzrokowi chorób oczu jest związanych z dysfunkcyjnymi mikronaczyniami siatkówki. Dlatego pomiar odpowiedzi tętniczek siatkówki jest ważny dla zbadania podstawowych mechanizmów patofizjologicznych. W artykule opisano szczegółowy protokół izolacji i przygotowania tętniczek siatkówki myszy do oceny wpływu substancji wazoaktywnych na średnicę naczyń krwionośnych.

Etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo

Retinopatia indukowana tlenem (OIR) może być używana do modelowania chorób niedokrwiennych siatkówki, takich jak retinopatia wcześniaków i proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, a także służyć jako model dla badań potwierdzających słuszność koncepcji w ocenie leków antyangiogennych w chorobach neowaskularnych. OIR indukuje solidną i powtarzalną neowaskularyzację w siatkówce, którą można określić ilościowo.

Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół do zamykania żył siatkówki za pomocą róży bengalskiej i sterowanego laserowo systemu obrazowania siatkówki z zaleceniami maksymalizacji jego odtwarzalności w genetycznie modyfikowanych szczepach.

Optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Tutaj prezentujemy trzy protokoły analizy danych dla obrazów angiografii fluoresceinowej (FA) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) w badaniu okluzji żył siatkówki (RVO).

In vivo (in vivo) Odczyty uszkodzeń naczyniowych w siatkówce myszy w celu zwiększenia odtwarzalności

Unaczynienie siatkówki myszy jest szczególnie interesujące w zrozumieniu mechanizmów powstawania wzorców naczyniowych. Protokół ten automatycznie mierzy średnicę naczyń siatkówki myszy na podstawie obrazów dna oka angiografii fluorescencyjnej w stałej odległości od tarczy nerwu wzrokowego.

Pomiar średnicy naczynia siatkówki na podstawie obrazów angiografii fluorescencyjnej myszy

W niniejszym raporcie proponujemy nowe zastosowanie światłoutwardzalnych żywic stomatologicznych do mocowania podstawy elektrod lub sond do mikrodializy w eksperymentach chronicznych. Materiał ten umożliwia bezpośrednie wiązanie z czaszką.

Zastosowanie światlutowalnej żywicy do wiązania stomatologicznego do mocowania elektrod lub sond mikrodializacyjnych w eksperymentach przewlekłych

Ortotopowe modele zwierzęce raka jajnika lepiej odwzorowują przebieg choroby u ludzi, a tym samym zwiększają naszą wiedzę na temat progresji nowotworu i odpowiedzi guza na terapię. W modelu mysim wykonuje się wstrzyknięcie do wnętrza woreczka otrzewnej komórek nowotworu jajnika wykazujących ekspresję lucyferazy. Leczenie podaje się poprzez zgłębnik żołądkowy. Wzrost guza monitoruje się za pomocą systemu obrazowania in vivo.

Obrazowanie in vivo i leczenie terapeutyczne w ortotopowym modelu raka jajnika u myszy

Poznaj metodę preparatyki i immunofluorescencji siatkówki myszy C57-Black/6 w modelu retinopatii indukowanej tlenem. Technika umożliwia obserwację dynamicznych zmian naczyń siatkówki przy zachowaniu integralności tkanek.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Przeglądaj więcej filmów