Name: Model danio pręgowanego z przerzutami nerwiaka zarodkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Odkryj model nerwiaka zarodkowego z przerzutami u Danio rerio z ekspresją MYCN i LMO1. Technika umożliwia obrazowanie in vivo rozprzestrzeniania nowotworu w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem R01 CA240323 (S.Z.) z National Cancer Institute; grantem W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) z Departamentu Obrony Stanów Zjednoczonych (DoD); nagrodą V Scholar od V Foundation for Cancer Research (S.Z.) oraz grantem platformowym z Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); oraz wsparciem z Mayo Clinic Cancer Center i Center for Individualized Medicine (S.Z.).

<ol><li>Veldman, M., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).</li>
<li>Feitsma, H., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a cancer model.</a> Molecular Cancer Research. 6 (5), 694(2008).</li>
<li>Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).</li>
<li>Benjamin, D. C., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastasis+in+adult+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish.</a> BMC Cancer. 17 (1), 660(2017).</li>
<li>Kim, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-derived+factors+driving+metastatic+plasticity+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma.</a> Nature Communications. 8, 14343(2017).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+ALK+collaborates+with+MYCN+in+neuroblastoma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li>
<li>Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma.</a> Lancet. 369 (9579), London, England. 2106-2120 (2007).</li>
<li>Park, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Children%27s+oncology+group%27s+2013+blueprint+for+research%3A+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Blood+and+Cancer%22%5BJournal%5D)">Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma.</a> Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).</li>
<li>Hoehner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+model+of+neuroblastoma%3A+differentiating+stroma-poor+tumors%27+progress+along+an+extra-adrenal+chromaffin+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3A+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).</li>
<li>Tsubota, S., Kadomatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+initiation+mechanisms+of+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).</li>
<li>Tolbert, V. P., Matthay, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma%3A+Clinical+and+biological+approach+to+risk+stratification+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment.</a> Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).</li>
<li>Maris, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recent advances in neuroblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMO1+Synergizes+with+MYCN+to+promote+neuroblastoma+initiation+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis.</a> Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).</li>
<li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Tao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28B+regulates+transcription+and+potentiates+MYCN-induced+neuroblastoma+through+binding+to+ZNF143+at+target+gene+promotors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).</li>
<li>Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+zebrafish+transgenesis+for+functional+genomic+analysis+of+candidate+cooperative+genes+in+tumor+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52567(2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+GAB2+in+neuroblastoma+pathogenesis+through+the+promotion+of+SHP2%2FMYCN+cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation.</a> Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).</li>
<li>Zimmerman, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYC+drives+a+subset+of+high-risk+pediatric+neuroblastomas+and+is+activated+through+mechanisms+including+enhancer+hijacking+and+focal+enhancer+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification.</a> Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).</li>
<li>Koach, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugging+MYCN+oncogenic+signaling+through+the+MYCN-PA2G4+binding+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface.</a> Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>DuBois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+sites+in+stage+IV+and+IVS+neuroblastoma+correlate+with+age%2C+tumor+biology%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pediatric+hematology%2Foncology%22%5BJournal%5D)">Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival.</a> Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).</li>
<li>Wattrus, S. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+safe+harbor%3A+The+hematopoietic+stem+cell+niche+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish.</a> Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).</li>
<li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li>
<li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+450+million+years+in+the+making%3A+Zebrafish+and+vertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).</li>
<li>Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+staining+of+collagens+type+I%2C+II+and+III+by+Sirius+Red+and+polarization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Archivum+histologicum+Japonicum+%28Nihon+Soshikigaku+Kiroku%29%22%5BJournal%5D)">Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy.</a> Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).</li>
<li>Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirius+red+F3BA+as+a+stain+for+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Sirius red F3BA as a stain for connective tissue.</a> Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).</li>
<li>Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+cancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of cancer in zebrafish.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).</li>
<li>Howe, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).</li>
<li>Yoganantharjah, P., Gibert, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+the+zebrafish+model+to+aid+in+drug+discovery+and+target+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).</li>
<li>Ignatius, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tumor-propagating+cells%2C+regional+tumor+heterogeneity%2C+and+dynamic+cell+movements+in+embryonal+rhabdomyosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).</li>
<li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+the+dynamic+tumor+cell+vascular+interface+in+transparent+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).</li>
<li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma+with+orbital+metastasis%3A+ophthalmic+presentation+and+role+of+ophthalmologists%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists.</a> Eye. 20 (4), London, England. 466-470 (2006).</li>
<li>Papaioannou, G., McHugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma+in+childhood%3A+review+and+radiological+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Imaging+Society%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings.</a> Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li>
<li>Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmores%2C+A+%22Science%22">Science</a>. 282 (5394), New York, N.Y. 1711-1714 (1998).</li>
<li>Postlethwait, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+genome+evolution+and+the+zebrafish+gene+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map.</a> Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).</li>
<li>Opazo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+duplication+and+the+functional+diversification+of+teleost+fish+hemoglobins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Danio pręgowany jest powszechnie stosowany w badaniach naukowych od kilku dekad, zwłaszcza w badaniach nad rakiem, z oczywistych powodów, takich jak łatwość konserwacji, solidna reprodukcja i wyraźne zalety obrazowania in vivo 1,28. Model danio pręgowanego może być łatwo manipulowany embrionalnie ze względu na ich zewnętrzne zapłodnienie i rozwój, co dobrze uzupełnia organizmy modelowe ssaków, takich jak szczury i myszy, do badań genetycznych na dużą ska...

Danio pręgowany był szeroko stosowany i stosowany w wielu dziedzinach badań, zwłaszcza w raku. Model ten zapewnia wiele zalet - takich jak solidna reprodukcja, ekonomiczna konserwacja i wszechstronna wizualizacja wzrostu guza i przerzutów - z których wszystkie sprawiają, że danio pręgowany jest potężnym narzędziem do badania i badania komórkowych i molekularnych podstaw nowotworzenia i przerzutów. Nowe techniki mapowania genomu na dużą skalę, transgenezy, nadekspresji lub nokautowania genów, przeszczepu komórek i chemicznych badań przesiewowych ogromnie zwiększyły możliwości modelu danio pręgowanego1. W ciągu ostatnich kilku lat opracowano wiele linii danio pręgowanego do badania nowotworzenia i przerzutów różnych nowotworów u ludzi, w tym między innymi białaczki, czerniaka, mięsaka prążkowanokomórkowego i raka wątrobowokomórkowego2,3,4,5. Ponadto pierwszy model nerwiaka zarodkowego (NB) zebrywanego został wygenerowany przez nadekspresję onkogenu MYCN w obwodowym współczulnym układzie nerwowym (PSNS) pod kontrolą promotora dopaminy-beta-hydroksylazy (dβh). Dzięki temu modelowi wykazano ponadto, że aktywowany ALK może działać synergicznie z MYCN w celu przyspieszenia wystąpienia guza i zwiększenia penetracji guza in vivo6.
NB wywodzi się z linii współczulno-nadnerczowej komórek grzebienia nerwowego i jest wysoce przerzutowym nowotworem u dzieci7. Jest odpowiedzialny za 10% zgonów związanych z nowotworami u dzieci8. Szeroko przerzutowe w momencie rozpoznania, NB może być klinicznie prezentowane jako guzy pochodzące głównie wzdłuż łańcucha zwojów współczulnych i rdzenia nadnerczy PSNS9,10. Amplifikacja MYCN jest często związana ze słabymi wynikami u pacjentów z NB11,12. Co więcej, LMO1 został zidentyfikowany jako krytyczny gen podatności na NB w przypadkach wysokiego ryzyka13,14. Badania wykazały, że transgeniczna koekspresja MYCN i LMO1 w PSNS modelu danio pręgowanego nie tylko sprzyja wcześniejszemu wystąpieniu NB, ale także indukuje rozległe przerzuty do tkanek i narządów, które są podobne do miejsc powszechnie obserwowanych u pacjentów z klasą wysokiego ryzyka NB<sup="xref">13. Całkiem niedawno, inny przerzutowy fenotyp NB zaobserwowano również w nowszym modelu NB danio pręgowanego, w którym zarówno MYCN, jak i Lin28B, kodujące białko wiążące RNA, ulegają nadekspresji pod kontrolą promotora dβh16.
Stabilne podejście transgeniczne u danio pręgowanego jest często wykorzystywane do badania, czy nadekspresja interesującego genu może przyczynić się do normalnego rozwoju i patogenezy choroby14,15. Technika ta została z powodzeniem wykorzystana do zademonstrowania znaczenia wielu genów i szlaków w nowotworzeniu NB6,16,17,18,19,20. W tym artykule przedstawimy, w jaki sposób powstała transgeniczna linia ryb, która wykazuje nadekspresję zarówno MYCN, jak i LMO1 w PSNS oraz jak wykazano, że współpraca tych dwóch onkogenów przyspiesza początek nowotworzenia NB i przerzutów13. Po pierwsze, linia transgeniczna, która wykazuje nadekspresję EGFP-MYCN pod kontrolą promotora dβh (oznaczonej linii MYCN), została opracowana przez wstrzyknięcie konstruktu dβh-EGFP-MYCN do jednokomórkowego stadium zarodków AB typu dzikiego (WT), jak opisano wcześniej6,17. Oddzielna linia transgeniczna, która ulega nadekspresji LMO1 w PSNS (oznaczona linia LMO1) została opracowana przez jednoczesne wstrzyknięcie dwóch konstruktów DNA, dβh-LMO1 i dβh-mCherry, do zarodków WT w stadium jednokomórkowym13. Wcześniej wykazano, że współwstrzykiwane podwójne konstrukty DNA mogą być współzintegrowane z genomem ryby; w związku z tym LMO1 i mCherry ulegają koekspresji w komórkach PSNS zwierząt transgenicznych. Gdy wstrzyknięte zarodki F0 osiągną dojrzałość płciową, zostały następnie skrzyżowane z rybami WT w celu identyfikacji ryb z dodatnim wynikiem integracji transgenów. Krótko mówiąc, potomstwo F1 zostało najpierw przebadane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pod kątem ekspresji mCherry w komórkach PSNS. Integracja LMO1 z linią zarodkową u ryb mCherry-dodatnich została dodatkowo potwierdzona za pomocą genomowego PCR i sekwencjonowania. Po pomyślnej identyfikacji każdej linii transgenicznej, potomstwo heterozygotycznych ryb transgenicznych MYCN i LMO1 zostało skrzyżowane w celu wytworzenia złożonej linii ryb wyrażającej zarówno MYCN, jak i LMO1 (oznaczonej jako MYCN; Linia LMO1). MYCN z nowotworem; Ryby LMO1 monitorowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej co dwa tygodnie pod kątem dowodów na przerzuty guzów w regionach odległych od miejsca pierwotnego, regionu gruczołu międzynerkowego (IRG, odpowiednik ludzkiego nadnercza)13. Aby potwierdzić przerzuty nowotworów w MYCN; Zastosowano analizy ryb LMO1, histologiczne i immunohistochemiczne.

<table><tbody><tr><td>Zestaw wektorów 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)</td><td>Vector</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Scientific / Acros Organic</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza GP2</td><td>Midwest Scientific</td><td>009012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozyny (TH)</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw blokujący awidynę/biotynę</td><td>Vector</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>Detekcja BOND Intense R Leica</td><td>Biosystems</td><td>DS9263</td><td></td></tr><tr><td>BOND Rozcieńczalnik przeciwciał pierwotnych</td><td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td><td>Instrument AR9352</td><td></td></tr><tr><td>BOND-MAX IHC</td><td>Leica Biosystems Newcastle, Ltd.</td><td>Nie dotyczy</td><td>w pełni zautomatyzowany system barwienia IHC</td></tr><tr><td>CH211-270H11 Klon BAC</td><td>Centrum zasobów BACPAC (BRFC)</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop złożony wyposażony w kamerę DP71</td><td>Olympus</td><td>AX70</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL (medium montażowe na bazie ksylenu)</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica</td><td>3801601</td><td>gotowy do użycia (nie wymaga przygotowania)</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carolina</td><td>86-1263</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiń system PCR z długimi matrycami</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Mieszanka enzymów klonazy II</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>Brama LR Mieszanka enzymów klonazy II</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne kozie anty-Rb (biotynylowane)</td><td>Dako</td><td>E0432</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny, Harris Modified</td><td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td><td>HHS-32-1L</td><td></td></tr><tr><td>HRP Avidin D</td><td>Vector</td><td>A-2004</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Aqua Solutions</td><td>4360-1L</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 3%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>H324-500</td><td></td></tr><tr><td>Enzym SceI</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>R0694L</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Teknova, Inc.</td><td>K2150</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Węglan litu</td><td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td><td>554-13-2</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom do cięcia</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny&nbsp;E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>p3E-polyA</td><td>&nbsp;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td><td>N/A</td><td>hojny dar (Proszę zapoznać się ze stroną internetową http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page, aby uzyskać materiał, który jest swobodnie rozpowszechniany zgodnie z opisem.)</td></tr><tr><td>Wosk parafinowy</td><td>Surgipath Paraplast</td><td>39603002</td><td>Parrafin do parafiny</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>wektor pDEST (zmodyfikowany wektor docelowy zawierający miejsca rozpoznawania I-SceI)</td><td>Dr. C. Grabher, Instytut Technologii w Karlsruhe, Karlsruhe, Niemcy</td><td>Nie dotyczy</td><td>hojny prezent</td></tr><tr><td>pDONR 221 wektor dawcy bramki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12536-017</td><td></td></tr><tr><td>Wektor dawcy pDONRP4-P1R</td><td>&nbsp;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td><td>N/A</td><td>hojny dar</td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa, 0,5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; P0290</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10X</td><td>BioRad</td><td>1610780</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw czerwonych plam Picrosirrius</td><td>Polysciences</td><td>24901-250</td><td></td></tr><tr><td>pME-mCherry</td><td>Addgene</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCR</td><td>Roche</td><td>21712520</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>RDO Szybki odkamieniacz</td><td>Apex Enginerring</td><td>RDO04</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>MZ10F</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny wyposażony w cyfrowy celownik Kamera DS-U1 do obrazowania</td><td>Nikon</td><td>SMZ-1500</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraza</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP&reg; &nbsp; 6 Procesor infiltracji próżniowej AI</td><td>Sakura</td><td>N/A</td><td>Model #: VIP-6-A1</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical Incorporated</td><td>20513</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X3P1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

model danio pręgowanego z przerzutami nerwiaka zarodkowego

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Danio pręgowany stał się ważnym modelem zwierzęcym do badania ludzkich chorób, zwłaszcza raka. Wraz z solidnymi technologiami transgenicznymi i edycji genomu stosowanymi w modelowaniu danio pręgowanego, łatwość konserwacji, wysoka wydajność i potężne obrazowanie na żywo sprawiają, że danio pręgowany jest cennym systemem modelowym do badania przerzutów oraz podstaw komórkowych i molekularnych leżących u podstaw tego procesu in vivo. Pierwszy model przerzutów nerwiaka zarodkowego danio pręgowanego (NB) został opracowany przez nadekspresję dwóch onkogenów, MYCN i LMO1, pod kontrolą promotora dopaminy-beta-hydroksylazy (dβh). Jednoczesna nadekspresja MYCN i LMO1 doprowadziła do zmniejszenia latencji i zwiększonej penetracji neuroblastomagenezy, a także przyspieszonego odległego przerzutowania komórek nowotworowych. Ten nowy model wiarygodnie powtarza wiele kluczowych cech przerzutowej NB u ludzi, w tym udział klinicznie istotnych i związanych z przerzutami zmian genetycznych; naturalny i spontaniczny rozwój przerzutów in vivo; i zachowane miejsca przerzutów. Dlatego model danio pręgowanego ma wyjątkowe zalety w zakresie analizy złożonego procesu przerzutów nowotworowych in vivo.

Aby ustalić, czy LMO1 synergizuje z MYCN w celu wywarcia wpływu na patogenezę NB, konstrukty transgeniczne napędzające ekspresję albo LMO1 (d&#946;h:LMO1 i d&#946;h:mCherry) lub MYCN (d&#946;h:EGFP-MYCN) w komórkach PSNS pod kontrolą d&#946;h promotory wstrzyknięto do zarodków rybek danio-ostropływych13Jak przedstawiono w Rycina 1Apo opracowaniu stabilnych linii transgenicznych i walidacji ich gen...

Ten artykuł przedstawia metodę opracowywania, charakteryzowania i śledzenia w czasie rzeczywistym przerzutów nowotworowych w modelu nerwiaka zarodkowego danio pręgowanego, szczególnie w transgenicznej linii danio pręgowanego z nadekspresją MYCN i LMO1, która rozwija przerzuty spontanicznie.

Model danio pręgowanego z przerzutami nerwiaka zarodkowego

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Metody te wykorzystano do opracowania pierwszego modelu danio pręgowanego z przerzutami nerwiaka zarodkowego. I pokazać, że ten model może wiernie odtworzyć wiele cech przerzutów obserwowanych u pacjentów z wysokim ryzykiem wystąpienia nerwiaka zarodkowego. Główną zaletą tego modelu danio pręgowanego z przerzutami jest obrazowanie in vivo in vivo w czasie rzeczywistym rozsiewu guza, aby lepiej zrozumieć, kiedy i jak dochodzi do przerzutów.Ta technika nie jest specyficzna dla nerwiaka zarodkowego. Można go zastosować do modeli danio pręgowanego różnych rodzajów nowotworów, o ile komórki nowotworowe mogą być identyfikowane i śledzone, co prowadzi do szeregu możliwości. Na początek opracuj heterozygotyczną linię ryb transgenicznych z nadekspresją zarówno MYCN, jak i LMO1 poprzez krzyżowanie linii transgenicznych MYCN i LMO1.Jednego dnia po zapłodnieniu użyj stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego, aby posortować potomstwo krzyżówki pod kątem ekspresji EGFP, które przedstawia się jako punkty dodatnie EGFP. Po posortowaniu wyizoluj przesiane zarodki na oddzielnych szalkach Petriego i oznacz szalki jako MYCN dodatnie lub MYCN ujemne. Wizualizacja i sortowanie zarodków z obu grup pod kątem ekspresji LMO1 trzy do czterech dni po zapłodnieniu.Szukaj czerwonych plam fluorescencyjnych zarówno w górnym zwoju szyjnym, jak i w dopaminergicznych komórkach neuronalnych innych niż PSNS, zwłaszcza w rdzeniu przedłużonym tyłomózgowia. Wykonaj badanie przesiewowe, zanim zarodki osiągną pięć dni po zapłodnieniu. Następnie wyizoluj posortowane ryby do czterech grup o różnych genotypach i oznacz je jako tylko MYCN, tylko LMO1, MYCN i LMO1 oraz typ dziki.Wychowuj je w identycznych warunkach zgodnie ze standardowymi protokołami. Wizualizuj guzy za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego, delikatnie obracając rybę metalową szpatułką po obu stronach, aby zobaczyć guz. Po zidentyfikowaniu ryb, które mogą być nosicielami nowotworu, należy je przelać do oddzielnego zbiornika z odpowiednimi etykietami, które zawierają datę urodzenia, datę badania przesiewowego guza i genotyp.Po sześciu tygodniach od zapłodnienia powtórz poprzednie kroki, aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem ryb zawierających guz i ryb niebędących nowotworami, aby potwierdzić obecność guzów u wcześniej przebadanych ryb lub zidentyfikować nowe możliwe ryby zawierające nowotwór. Zwróć uwagę na utrzymujący się lub zwiększony rozmiar fluorescencyjnie dodatniej masy i potwierdzone ryby z nowotworem. Po zidentyfikowaniu ryb zawierających guz, monitoruj je co dwa tygodnie pod kątem dowodów na migrację komórek nowotworowych, które objawiają się jako maleńkie masy guza EGFP lub mCherry dodatnie daleko od pierwotnego miejsca genezy guza.W razie potrzeby wyizolować te ryby w oddzielnych zbiornikach i odpowiednio oznaczyć, aby wskazać możliwe przerzuty. Po interpretacji heterozygotycznego MYCN u ryb LMO1 i podczas sortowania ich potomstwa, ekspresja EGFP MYCN była wyraźna w dopaminergicznych komórkach neuronalnych innych niż PSNS w ciągu jednego dnia po zapłodnieniu. W przeciwieństwie do tego, ekspresja LMO1 była widoczna zarówno w komórkach PSNS, jak i w dopaminergicznych komórkach neuronalnych innych niż PSNS.Fluorescencyjne dodatnie masy guza wykryto w tkankach w narządach, odległych od pierwotnego miejsca guza u złożonej ryby transgenicznej z nadekspresją zarówno MYCN, jak i LMO1, ale nie u transgenicznych ryb z ekspresją samego MYCN. Barwienie H&E skrawków chirurgicznych pokazuje, że guz pierwotny powstał w okolicy gruczołu międzynerkowego, odpowiednika ludzkiego nadnercza, który jest najczęstszym miejscem choroby pierwotnej u pacjenta z nerwiakiem zarodkowym. Masy guza odległe od gruczołu międzynerkowego wykryto w wielu regionach, w tym w dystalnej części nerki, oczodołu, skrzela, śledziony i wewnętrznej ścianie komory przedsionkowej serca.Potwierdzono linię neuroblastów PSNS komórek nowotworowych w guzie pierwotnym i wszystkich miejscach przerzutów. W guzach MYCN LMO1 stwierdzono znacznie amplifikowane ilości i zwiększoną grubość włókien kolagenowych barwionych PSR w porównaniu z guzami wykazującymi ekspresję samego MYCN. Po zastosowaniu tej procedury można zastosować badania przesiewowe leków i testować nowe terapie przeciwnowotworowe, które mogą potencjalnie prowadzić do opracowania alternatywnych środków w celu zapobiegania i leczenia nowotworów z przerzutami.

zebrafish-model-of-neuroblastoma-metastasis

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania komórek raka piersi do przestrzeni okołobiałkowej transgenicznych embrionów danio pręgowanego. Po inkubacji wizualizujemy zarodek pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby obserwować inwazję, rozprzestrzenianie się i przerzuty komórek rakowych.

Analiza inwazyjności zPDX: badanie inwazyjnego zachowania przerzutowych komórek rakowych w ksenoprzeszczepach zarodków danio pręgowanego

Przedstawiono szybki sposób na badanie modyfikatorów czerniaka za pomocą autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego. Wykorzystuje wektor miniCoopR, który pozwala na ekspresję genów kandydujących na czerniaka w melanocytach. Opisano metodę uzyskiwania krzywych przeżycia wolnych od czerniaka, test inwazji, protokół barwienia przeciwciałami melanocytów łuskowych oraz test przeszczepiania czerniaka.

Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego

Celem tego badania jest pokazanie, jak strategia transgenezy mozaiki może być wykorzystana u danio pręgowanego, aby szybko i skutecznie ocenić względny wkład wielu onkogenów w inicjację i progresję guza in vivo.

Mozaikowa transgeneza danio pręgowanego do funkcjonalnej analizy genomowej kandydujących genów kooperacyjnych w patogenezie nowotworu

Ta metoda wykorzystuje embriony danio pręgowanego do skutecznego testowania inwazyjnej zdolności komórek rakowych do naczyń krwionośnych. Fluorescencyjne komórki rakowe są wstrzykiwane do zatoki przedsercowej lub woreczka żółtkowego rozwijających się zarodków. Inwazję naczyniową i wynaczynienie komórek rakowych ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej obszaru ogonowego od 24 do 96 godzin później.

Badanie inwazyjnej zdolności naczyniowej komórek nowotworowych u danio pręgowanego (Danio rerio)

Tutaj opisujemy modele ksenoprzeszczepu danio pręgowanego za pomocą dwóch różnych miejsc iniekcji, tj. przestrzeni perivitelinowej i kanału Cuviera, aby zbadać inwazyjne zachowanie i ocenić potencjał wewnątrznaczyniowy i wynaczynieniowy ludzkich komórek raka piersi, odpowiednio.

Inwazyjne zachowanie ludzkich komórek raka piersi u embrionalnego danio pręgowanego

Przeszczepianie komórek nowotworowych jest ważnym narzędziem do identyfikacji mechanizmów nowotworowych i odpowiedzi terapeutycznych. Obecne techniki opierają się na zwierzętach niekompetentnych immunologicznie. W tym miejscu opisujemy metodę przeszczepiania komórek nowotworowych danio pręgowanego do zarodków kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowej analizy zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki in vivo.

Przeszczepianie pediatrycznych guzów mózgu danio pręgowanego do gospodarzy kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowego badania zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Zgłaszamy technikę pozwalającą na obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka (GBM) atakujących tkankę mózgową kręgowców. Sprzężenie ortotopowego wstrzykiwania fluorescencyjnie znakowanych komórek GBM do przezroczystego mózgu danio pręgowanego z obrazowaniem przyżyciowym o wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiar dynamiki cytoszkieletu podczas inwazji raka in situ.

Obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka atakujących mózg danio pręgowanego

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

Odkryj model nerwiaka zarodkowego z przerzutami u Danio rerio z ekspresją MYCN i LMO1. Technika umożliwia obrazowanie in vivo rozprzestrzeniania nowotworu w czasie rzeczywistym.

Model danio pręgowanego z przerzutami nerwiaka zarodkowego

Przeglądaj więcej filmów