Badanie epitranskryptomów m⁶A i m⁵C po infekcji wirusowej: przykład z HIV

Cześć, w tym filmie pokażemy, jak zbadać epitranskryptomy m6A i m5C po infekcji wirusowej. Aby rozpocząć eksperyment, potrzebujesz 50 milionów komórek dla osób niezakażonych i 50 milionów dla zainfekowanych schorzeń. Aby uzyskać wysokiej jakości zestaw danych po analizie, musisz osiągnąć uniwersalną infekcję.

Tutaj infekujemy te komórki wektorem opartym na HIV i mierzymy kodowany wirusowo GFP za pomocą FACS. W tym przypadku mieliśmy 80% zainfekowanych komórek i kontynuowaliśmy proces pracy, zaczynając od całkowitej ekstrakcji RNA. Podzieliliśmy więc komórki na podwielokrotności po 10 milionów każda i poddaliśmy je lizie w 1 ml Trizolu.

Następnie dodaliśmy 200 mikrolitrów chloroformu do lizatu komórkowego i wymieszaliśmy przez inwersję. W tym momencie pozostawiamy lizat na trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odwirowujemy wszystkie próbki z dużą prędkością przez 15 minut w temperaturze czterech stopni. Spodziewasz się separacji faz w trzech różnych fazach, jak pokazano tutaj.

RNA jest osadzone w górnej fazie, więc ostrożnie przenieś fazę wodną do świeżej probówki, zwracając uwagę, aby nie przenieść warstwy organicznej. W tym momencie dodać 0,5 ml izopropanolu do fazy wodnej i dokładnie wymieszać przez odwrócenie. Próbki można następnie inkubować przez godzinę w temperaturze 80 stopni, aby zapewnić wytrącanie RNA.

Po odwirowaniu z dużą prędkością powinieneś być w stanie zobaczyć ładną osadę RNA, jak pokazano tutaj. Ostrożnie usunąć supernatant przez odwrócenie lub pipetowanie, zwracając uwagę, aby nie rozerwać osadu. Następnie przemyj osad RNA jednym ml 75% etanolu o jakości cząsteczkowej.

I krótko wymieszaj próbkę. Po odwirowaniu upewnij się, że odzyskałeś ładną białą pastylkę RNA. Wyrzucić supernatant i pozostawić osad RNA do wyschnięcia przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Ponownie zawiesić każdą granulkę w 20 mikrolitrach wody i zebrać razem wszystkie próbki z tego samego stanu. Całkowite RNA jest teraz gotowe do izolacji mRNA przez selekcję poli-A. Dla każdej próbki 75 mikrogramów RNA przygotuj 200 mikrolitrów kulek magnetycznych oligo-DT i umyj je w jednym ml buforu wiążącego.

Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i pozwól, aby koraliki związały się z magnesem podczas jednego mieszania. Odrzucić supernatant i powtórzyć procedurę dla drugiego przemycia. Następnie wyjmij kulki ze stojaków magnetycznych i ostrożnie zawieś je ponownie w 100 mikrolitrach bufora wiążącego.

W tym momencie przygotuj próbkę RNA, dzieląc ją na 75 mikrogramów RNA na podwielokrotność zawieszoną w 100 mikrolitrach wody. Dodać 100 mikrolitrów buforu wiążącego i inkubować przez dwie minuty w temperaturze 65 stopni. Następnie odwirować próbki i inkubować na lodzie.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów przemytych kulek magnetycznych do każdej próbki RNA i pozostaw do wiązania na obracającym się kole przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umieść probówkę z powrotem w stojaku magnetycznym i pozwól im inkubować przez minutę. Następnie odzyskać supernatant do świeżej probówki i odłożyć go na bok do drugiej rundy izolacji.

Umyj kulki dwukrotnie 200 mikrolitrami buforu myjącego, a następnie przystąp do elucji. W celu wymycia wybranego poli-A RNA z kulek magnetycznych, dodaj 20 mikrolitrów lodowatego HCl TRIS do każdej próbki i ostrożnie pipetuj. Następnie inkubuj próbki w temperaturze 80 stopni przez dwie minuty, aby uwolnić RNA z kulek.

Przenieś supernatant zawierający wybrane RNA poli-A do świeżej probówki, uważając, aby uniknąć przeniesienia kulek. Etap elucji, a także etap izolacji należy powtórzyć dwukrotnie w celu zwiększenia wydajności mRNA. mRNA jest teraz gotowe do wejścia do rurociągu meRIP-Seq na etapie fragmentacji lub przejścia bezpośrednio do konwersji wodorosiarczynu.

Pierwszym krokiem do wejścia do rurociągu meRIP-Seq jest fragmentacja mRNA. W tym celu potrzebujesz pięciu mikrogramów mRNA podzielonych na podwielokrotności po 18 mikrolitrów w probówkach o pojemności 0,2 ml. Aby zapewnić spójne dane, bardzo ważna jest szybka praca i praca z niewielką liczbą próbek w tym samym czasie.

Na potrzeby tego eksperymentu fragmentacja została zoptymalizowana w celu uzyskania fragmentu o wielkości od 115 do 200 nukleotydów. Następnie dodaj dwa mikrolitry odczynnika fragmentacyjnego do każdej probówki zawierającej 18 mikrolitrów mRNA, zachowując ostrożność przy osadzaniu kropli na ściance probówki. Odwirować wszystkie próbki, aby umożliwić kontakt między odczynnikiem a RNA w tym samym czasie i inkubować w temperaturze 70 stopni przez 15 minut.

Po zakończeniu inkubacji zatrzymaj reakcję, dodając dwa mikrolitry 0,5 M EDTA. W tym momencie możesz oczyścić swoje pofragmentowane mRNA wybraną metodą i przejść do kontroli jakości RNA za pomocą analizatora fragmentów. Ten krok jest opcjonalny, ale pozwoli ocenić rozmiar fragmentu przed zaangażowaniem się w wytrącanie RNA.

Jak widać tutaj na czwartym pasie, otrzymujemy dla obu naszych próbek fragment około 150 nukleotydów każdy. Następnie przystąpiliśmy do meRIP-Seq. Pierwszy etap polega na kilku kulkach magnetycznych A / G z przeciwciałami anty-m6A lub kontrolami IgG.

Dla każdego planu reakcji przenieś 25 mikrolitrów kulek magnetycznych do świeżej probówki. Należy pamiętać, że potrzebny będzie co najmniej jeden warunek specyficzny dla m6A i jeden warunek kontrolny. Umyj każde 25 mikrolitrów kulek 250 mikrolitrami bufora IP.

Delikatnie zawiesić kulki, pipetując w górę i w dół, a następnie umieścić probówkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby umożliwić oddzielenie kulek. Usunąć i wyrzucić supernatant, zwracając uwagę, aby nie zasysać kulek magnetycznych i powtórzyć etap płukania raz. Następnie ponownie zawieś kulki magnetyczne w 100 mikrolitrach bufora IP na każde 25 mikrolitrów oryginalnej objętości kulek.

Przygotuj i oznacz jedną tubkę na każdy warunek. W naszym przypadku będziemy mieli dwie probówki dla stanu zakażonego, jedną dla m6A i jedną do kontroli IgG oraz dwie probówki dla stanu niezakażonego. Następnie dodaj 100 mikrolitrów umytych koralików do każdej tuby.

Kulki są teraz gotowe do sprzężenia ze specyficznymi przeciwciałami lub kontrolami IgG. Dodaj pięć mikrogramów swoistego przeciwciała anty-m6A lub przeciwciała kontrolnego anty-IgG do każdej probówki zawierającej 100 mikrolitrów przemytych kulek magnetycznych. Pozwól na koniugację przeciwciało-kulki poprzez inkubację probówki przez 30 minut na obracającym się kole.

W międzyczasie przystąp do przygotowania próbki. Dla każdego planowanego stanu, swoistego dla m6A lub kontroli IgG, materiałem wyjściowym będzie 2,5 mikrograma rozdrobnionego mRNA zawieszonego w 100 mikrolitrach wody. Aby uzyskać końcową objętość reakcji 500 mikrolitrów, dodaj 295 mikrolitrów wody do każdej próbki.

Następnie dodać pięć mikrolitrów inhibitora RNAazy stężonego w 40 jednostkach na mikrolitr, co daje łączną ilość 200 jednostek na próbkę i delikatnie wymieszać. Na koniec dodaj 100 mikrolitrów 5X stężonego bufora IP do każdej probówki. Próbki są teraz gotowe do reakcji wytrącania immunologicznego.

Wyjmij kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałem z obracającego się koła i przekręć je w dół. Następnie dodać 500 mikrolitrów wcześniej przygotowanych próbek do każdych 100 mikrolitrów kulek sprzężonych ze specyficznymi przeciwciałami. Delikatnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, aby całkowicie zawiesić kulki.

Inkubuj je lub swoją reakcję meRIP na obracającym się kole pod czterema stopniami przez dwie godziny. Po zakończeniu inkubacji odkręć każdą probówkę i umieść je na stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby umożliwić oddzielenie kulek. Następnie usuń niezwiązaną frakcję i umieść ją na świeżej probówce i zachowaj do dalszej analizy, jeśli to konieczne.

Wyjmij magnes ze stojaka i ponownie zawieś wszystkie próbki w 500 mikrolitrach bufora IP. Ostrożnie zawiesić każdą próbkę, pipetując w górę i w dół. Włóż magnes do stojaka, inkubuj przez minutę, a następnie ostrożnie usuń supernatant.

Powtórz pranie dwukrotnie, a następnie kontynuuj elucję. Dla każdej pary próbek, specyficznych dla m6A i kontrolnych, przygotować 225 mikrolitrów buforu elucyjnego zawierającego 20 milimoli oczyszczonego m6A. Następnie dodać 100 mikrolitrów buforu elucyjnego na próbkę.

Inkubować wszystkie próbki przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni na bujaku. Następnie zbierz wszystkie próbki RNA wzbogacone m6A w świeżej probówce i przystąp do drugiej rundy elucji. Oczyść RNA wzbogacone m6A wybraną metodą W tym momencie próbki są gotowe do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania.

Do zbadania modyfikacji m5C używamy konwersji wodorosiarczynowej. Rozpocznij eksperyment od 500 nanogramów poliadenylowanego RNA. Chociaż jest to opcjonalne, dodanie do próbki 500 pikogramów RNA zubożonego w poli-A w celu zapewnienia reprezentacji rybosomalnej i 0,5 mikrolitra dostępnej na rynku sekwencji syntetycznej pozwoli ocenić współczynnik konwersji wodorosiarczynu podczas sekwencjonowania.

Dostosuj próbkę do końcowej objętości 20 mikrolitrów w wodzie, a następnie dodaj 130 mikrolitrów odczynnika do konwersji RNA do każdej próbki. Ostrożnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie odwirować całą próbkę, aby upewnić się, że z boku probówek nie pozostały żadne kropelki. Inkubować całą próbkę w maszynie do PCR przez trzy cykle denaturacji w temperaturze 70 stopni przez pięć minut i konwersję wodorosiarczynu w temperaturze 54 stopni w ciągu 45 minut.

Przeprowadź deaminację w kolumnie, dodając bezpośrednio na pustą kolumnę 250 mikrolitrów buforu wiążącego RNA, 150 mikrolitrów próbki przekształconej w wodorosiarczyn. Wymieszać próbkę, pipetując w górę i w dół, zwracając jednak uwagę, aby nie dotykać filtrów kolumnowych. Dodać 400 mikrolitrów 95-100% etanolu do próbki mieszaniny buforowej wiążącej RNA bezpośrednio w kolumnie.

Zamknij nakrętkę i natychmiast wymieszaj przez odwrócenie. Obracaj próbkę przez 30 sekund i odrzuć przepływ. Umyj kolumnę buforem myjącym, a następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu odsiarczającego do środka każdej kolumny.

Inkubować całą próbkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wirować próbkę przez 30 sekund, a następnie przystąpić do dwóch rund mycia. Dodać 400 mikrolitrów buforu płuczącego do każdej próbki, odwirować przez 30 sekund z pełną prędkością i odrzucić przepływ.

Umieść kolumnę w nowej pustej probówce i wymyj wodorosiarczyn przekształcony RNA w 20 mikrolitrów wody. Kontroluj wydajność konwersji wodorosiarczynu za pomocą RT-qPCR, a następnie przejdź do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania. Po analizie bioinformatycznej, oto kilka przykładów wyników, które można uzyskać za pomocą tego przepływu pracy.

Tutaj porównujemy epitranskryptom komórek zakażonych wirusem HIV z komórkami niezakażonymi. po 24 godzinach od zakażenia. W panelu A możesz zobaczyć wyniki, które uzyskujemy badając epitranskryptom m6A.

Na tym wykresie wykreślamy wzbogacone odczyty m6A na podstawie analizy meRIP-Seq. Ładnie widzimy, że palec cynkowy jest hipermetylowany 24 godziny po zakażeniu. Przeprowadziliśmy ten sam rodzaj analizy dla badania epitranskryptomu m5C w panelu B.In tym wykresie, każda niemetylowana cytozyna jest wyświetlana na czerwono, podczas gdy proporcja cytozyny, która została zmetylowana m5C, jest pokazana na niebiesko.

Jak widać, PHLPP1, wszystkie trzy cytozyny, które są hipermetylowane 24 godziny po zakażeniu wirusem HIV. Ogólnie rzecz biorąc, ten przepływ pracy pozwala na zbadanie zarówno epitranskryptomu M6A, jak i m5C zakażonych komórek i może być stosowany jako taki również do cząstek wirusa. Zrozumienie infekcji wirusowych jest w stanie zmodyfikować krajobraz epitranskryptomiczny gospodarza, co da nam dostęp do nowej warstwy regulacji.

Badania nad zróżnicowanymi transkryptami metylowymi po infekcji wirusowej dostarczą oczywiście cennego zasobu dla nowej interwencji terapeutycznej. Pod poniższym linkiem można znaleźć nasze ogólnodostępne zasoby do badania różnicowego transkryptu metylowanego po zakażeniu wirusem HIV w czasie.