Name: Badanie epitranskryptomów m6A i m5C po infekcji wirusowej: przykład z HIV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Poznaj metodę analizy modyfikacji RNA m6A i m5C w komórkach zakażonych wirusem HIV. Technika ta pozwala odkryć nowe mechanizmy interakcji wirus-gospodarz na poziomie molekularnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (granty 31003A_166412 i 314730_188877).

<ol><li>Machnicka, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODOMICS%3A+a+database+of+RNA+modification+pathways--2013+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 262-267 (2013).</li>
<li>Zaccara, S., Ries, R. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading%2C+writing+and+erasing+mRNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reading, writing and erasing mRNA methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 608-624 (2019).</li>
<li>Davalos, V., Blanco, S., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Messenger+RNA+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Messenger RNA Modifications.</a> Cell. 174 (2), 498(2018).</li>
<li>Saletore, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+birth+of+the+Epitranscriptome%3A+deciphering+the+function+of+RNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), 175(2012).</li>
<li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2017).</li>
<li>Netzband, R., Pager, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitranscriptomic+marks%3A+Emerging+modulators+of+RNA+virus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Epitranscriptomic marks: Emerging modulators of RNA virus gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (3), 1576(2020).</li>
<li>Pereira-Montecinos, C., Valiente-Echeverria, F., Soto-Rifo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitranscriptomic+regulation+of+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Epitranscriptomic regulation of viral replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (4), 460-471 (2017).</li>
<li>Lichinchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+human+and+viral+m%286%29A+RNA+methylomes+during+HIV-1+infection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the human and viral m(6)A RNA methylomes during HIV-1 infection of T cells.</a> Nature Microbiology. 1, 16011(2016).</li>
<li>Courtney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitranscriptomic+Addition+of+m%285%29C+to+HIV-1+Transcripts+Regulates+Viral+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Epitranscriptomic Addition of m(5)C to HIV-1 Transcripts Regulates Viral Gene Expression.</a> Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li>
<li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+m%286%29A+Editing+of+HIV-1+mRNAs+Enhances+Viral+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional m(6)A Editing of HIV-1 mRNAs Enhances Viral Gene Expression.</a> Cell Host & Microbe. 19 (5), 675-685 (2016).</li>
<li>Tirumuru, N., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+envelope+proteins+up-regulate+N+%286%29-methyladenosine+levels+of+cellular+RNA+independently+of+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">HIV-1 envelope proteins up-regulate N (6)-methyladenosine levels of cellular RNA independently of viral replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3249-3260 (2019).</li>
<li>Tirumuru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%286%29-methyladenosine+of+HIV-1+RNA+regulates+viral+infection+and+HIV-1+Gag+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">N(6)-methyladenosine of HIV-1 RNA regulates viral infection and HIV-1 Gag protein expression.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Virology%22%5BJournal%5D)">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> Frontiers in Virology. 1 (11), (2021).</li>
<li>Khoddami, V., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+target+profiling+of+RNA+cytosine+methyltransferases+using+the+mechanism-based+enrichment+procedure+Aza-IP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP.</a> Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).</li>
<li>Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (11), 215(2013).</li>
<li>Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+of+N6-methyladenosine+by+m6A-seq+based+on+immunocapturing+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li>
<li>Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (215), (2013).</li>
<li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly%28A%29+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1(2017).</li>
<li>Endrullat, C., Glökler, J., Franke, P., Frohme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+quality+management+in+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+%26+Translational+Genomics%22%5BJournal%5D)">Standardization and quality management in next-generation sequencing.</a> Applied & Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).</li>
<li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 12(2009).</li>
<li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22biorxiv%22%5BJournal%5D)">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> biorxiv. 1 (11), (2021).</li>
<li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li>
<li>Aschenbrenner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+DNA+Polymerase+for+Direct+m%286%29+A+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).</li>
<li>Bioinformatics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2021).</li>
<li>Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atropos%3A+specific%2C+sensitive%2C+and+speedy+trimming+of+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Atropos: specific, sensitive, and speedy trimming of sequencing reads.</a> PeerJ. 5, 3720(2017).</li>
<li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISAT%3A+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Okonechnikov, K., Conesa, A., García-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualimap+2%3A+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), Oxford, England. 292-294 (2016).</li>
<li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiQC%3A+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), Oxford, England. 3047-3048 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137(2008).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet+Journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet Journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeqKit%3A+A+Cross-Platform+and+Ultrafast+Toolkit+for+FASTA%2FQ+File+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0163962(2016).</li>
<li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((meRanTK%3A+methylated+RNA+analysis+ToolKit%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rola modyfikacji RNA w infekcji wirusowej jest nadal w dużej mierze nieznana. Lepsze zrozumienie roli modyfikacji epitranskryptomicznych w kontekście infekcji wirusowej może przyczynić się do poszukiwania nowych celów leczenia przeciwwirusowego.
W tej pracy zapewniamy kompletny przepływ pracy, który umożliwia badanie epitranskryptomów m6A i m5C zakażonych komórek. W zależności od kwestii biologicznej zalecamy użycie RNA wyselekcjonowanego przez poli-A jako materiału wyjściowego. Chociaż jest to opcjonalne, ponieważ rurociąg może być używany z całkowitym RNA, ważne jest, aby pamiętać, że rRNA, jak również małe RNA, są wysoce zmodyfikowane i zawierają znaczną liczbę metylowanych reszt. Może to skutkować obniżeniem jakości i ilości istotnych danych sekwencjonowania.
Jeśli jednak badanie koncentruje się na niepoli-adenylowanym RNA, etap ekstrakcji RNA powinien być dostosowany, aby uniknąć odrzucenia małego RNA (w przypadku ekstrakcji RNA na podstawie kolumny) i uprzywilejować techniki dezubożenia rybosomów, a nie selekcję poli-A do wejścia do rurociągu.
W celu zapewnienia wysokiej jakości RNA, prawidłowej fragmentacji oraz odpowiedniej jakości RNA wzbogaconego w m6A i przetworzonego BS do przygotowania biblioteki, zdecydowanie zalecamy użycie analizatora fragmentów lub bioanalizatora. Jednak ten sprzęt nie zawsze jest dostępny. Alternatywnie, jakość RNA, mRNA i wielkość rozdrobnionego RNA można również ocenić za pomocą wizualizacji na żelu agarozowym. Alternatywnie, przygotowanie biblioteki można przeprowadzić bez wcześniejszej oceny ilości RNA.
Użyliśmy techniki MeRIP-Seq16 opartej na przeciwciałach, aby zbadać epitranskryptomiczny krajobraz m6A. Technika ta opiera się na immunoprecypitacji RNA i jest skuteczna; Jednak niektóre kroki wymagają starannej optymalizacji i mogą być krytyczne. Chociaż opisano metylacjęm6A zachodzącą głównie w sekwencji konsensusu RRA*CH, motyw ten jest bardzo częsty wzdłuż cząsteczek mRNA i nie pozwala na precyzyjną identyfikację miejsca metylacji. Dlatego tak ważne jest osiągnięcie powtarzalnej i spójnej fragmentacji RNA, generującej małe fragmenty RNA, w celu poprawy rozdzielczości opartej na RIP. W tym protokole zalecamy zoptymalizowaną procedurę, zapewniającą powtarzalne i spójne wyniki w naszych warunkach eksperymentalnych; Jednak ten etap fragmentacji może wymagać dalszej optymalizacji zgodnie z określonymi przykładowymi funkcjami.
Niedawno opisano nową technikę pozwalającą na bezpośrednie sekwencjonowanie m6A. Opiera się na wykorzystaniu specyficznych wariantów odwrotnej transkryptazy, które wykazują unikalne sygnatury RT w odpowiedzi na napotkanie modyfikacji RNA m6A24. Technologia ta, po starannej optymalizacji, może obejść główne ograniczenie stojące przed MeRIP-Seq (zmniejszenie ilości materiału wyjściowego i umożliwienie wyższej rozdzielczości). Aby zbadać modyfikację m5C, zdecydowaliśmy się użyć techniki konwersji wodorosiarczynu w celu wykrycia z rozdzielczością nukleotydową zmodyfikowanych reszt C. W celu zmniejszenia odsetka wyników fałszywie dodatnich ze względu na obecność struktur drugorzędowych RNA, przeprowadziliśmy 3 cykle denaturacji/konwersji wodorosiarczynu i dalej kontrolowaliśmy wydajność współczynnika konwersji wodorosiarczynu dzięki zastosowaniu kontroli ERCC z impulsami skokowymi. Jednym z ograniczeń związanych z tą techniką jest to, że konwersja wodorosiarczynu jest bardzo ostra, a trzy cykle denaturacji/konwersji wodorosiarczynu mogą zdegradować część RNA, a tym samym zmniejszyć rozdzielczość. Jednak w naszym otoczeniu zdecydowaliśmy się zadowolić potencjalnie nieco niższą rozdzielczością, aby zwiększyć jakość zestawu danych.
Dzięki tym optymalizacjom i kontrolom byliśmy w stanie zapewnić niezawodny i solidny przepływ pracy, który można wykorzystać do zbadania krajobrazu epitranskryptomicznego i jego zmian w kontekście infekcji wirusowych, interakcji gospodarz-patogen lub jakiejkolwiek ekspozycji na określone terapie.

Od dawna wiadomo, że cząsteczki RNA mogą być modyfikowane, a do tej pory opisano ponad 150 modyfikacji potranskrypcyjnych1. Polegają one na dodawaniu grup chemicznych, głównie grup metylowych, do praktycznie dowolnej pozycji pierścieni pirymidynowych i purynowych cząsteczek RNA2. Wykazano już, że takie modyfikacje potranskrypcyjne są wysoce wzbogacone w transferowy RNA (tRNA) i rybosomalny RNA (rRNA), a ostatnio opisano je również w cząsteczkach mRNA.
Rozwój nowych technologii, takich jak sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), oraz produkcja specyficznych przeciwciał rozpoznających określone modyfikacje chemiczne pozwoliły, po raz pierwszy, na zbadanie lokalizacji i częstotliwości specyficznych modyfikacji chemicznych na poziomie całego transkryptomu. Postępy te doprowadziły do lepszego zrozumienia modyfikacji RNA i mapowania kilku modyfikacji cząsteczek mRNA3,4.
Podczas gdy epigenetyka bada rolę modyfikacji DNA i histonów w regulacji transkryptomu, epitranskryptomika w podobny sposób skupia się na modyfikacjach RNA i ich roli. Badanie modyfikacji epitranskryptomicznych stwarza nowe możliwości zwrócenia uwagi na nowe mechanizmy regulacji, które mogą dostrajać różne procesy komórkowe (tj. splicing RNA, eksport, stabilność i translację)5. Nie było więc wielkim zaskoczeniem, że ostatnie badania ujawniły wiele modyfikacji epitranskryptomicznych po infekcji wirusowej zarówno w komórkowych, jak i wirusowych RNAs6. Wirusy przebadane do tej pory obejmują zarówno wirusy DNA, jak i RNA; wśród nich HIV można uznać za pionierski przykład. Podsumowując, odkrycie metylacji RNA w kontekście infekcji wirusowych może pozwolić na zbadanie jeszcze nieopisanych mechanizmów ekspresji lub replikacji wirusa, dostarczając w ten sposób nowych narzędzi i celów do ich kontrolowania7.
W dziedzinie epitranskryptomiki HIV, modyfikacje transkryptów wirusowych były szeroko badane i wykazały, że obecność tej modyfikacji była korzystna dla replikacji wirusa8,9,10,11,12,13. Do tej pory można stosować różne techniki wykrywania znaczników epitranskryptomicznych na poziomie całego transkryptomu. Najczęściej stosowane techniki identyfikacji m6A opierają się na technikach wytrącania immunologicznego, takich jak MeRIP-Seq i miCLIP. Podczas gdy MeRIP-Seq opiera się na fragmentacji RNA w celu wychwycenia fragmentów zawierających metylowane reszty, miCLIP opiera się na generowaniu mutacji sygnatury specyficznych dla przeciwciała α-m6A po sieciowaniu UV RNA-przeciwciało, umożliwiając w ten sposób bardziej precyzyjne mapowanie.
Wykrycie modyfikacji m5C może być osiągnięte albo za pomocą technologii opartych na przeciwciałach, podobnych do detekcji m6A (m5C RIP), albo przez konwersję bisulfitu, albo przez AZA-IP lub przez miCLIP. Zarówno Aza-IP, jak i m5C miCLIP wykorzystują specyficzną metylotransferazę jako przynętę do celowania w RNA podczas przechodzenia metylacji RNA. W Aza-IP komórki docelowe są wystawione na działanie 5-azacytydyny, co powoduje losowe wprowadzenie miejsc analogu 5-azacytydyny cytydyny do powstającego RNA. W miCLIP metylotransferaza NSun2 jest genetycznie modyfikowana tak, aby zawierała mutację C271A14,15.
W tej pracy skupiamy się na podwójnej charakterystyce modyfikacji m6A i m5C w zakażonych komórkach, używając HIV jako modelu. Po optymalizacji metodologicznej opracowaliśmy przepływ pracy, który łączy immunoprecypitację metylowanego RNA (MeRIP) i konwersję wodorosiarczynu RNA (BS), umożliwiając jednoczesną eksplorację znaczników epitranskryptomicznych m6A i m5C na poziomie całego transkryptomu, zarówno w kontekście komórkowym, jak i wirusowym. Ten przepływ pracy można zaimplementować na komórkowych ekstraktach RNA, a także na RNA wyizolowanym z cząstek wirusa.
Podejście do immunoprecypitacji metylowanego RNA (MeRIP)16 pozwalające na badanie m6A na poziomie transkryptomu jest dobrze ugruntowane, a tablica przeciwciał specyficznych dla m<sup="xref">6A jest dostępna na rynku17. Metoda ta polega na selektywnym wychwytywaniu fragmentów RNA zawierających m6A przy użyciu przeciwciała swoistego dla m6A. Dwie główne wady tej techniki to (i) ograniczona rozdzielczość, która w dużym stopniu zależy od wielkości fragmentów RNA, a tym samym zapewnia przybliżoną lokalizację i region zawierający metylowaną resztę, oraz (ii) dużą ilość materiału potrzebnego do przeprowadzenia analizy. W poniższym zoptymalizowanym protokole ustandaryzowaliśmy rozmiar fragmentu do około 150 nt i zmniejszyliśmy ilość materiału wyjściowego z 10 μg RNA wyselekcjonowanego przez poli-A, co jest obecnie zalecaną ilością materiału wyjściowego, do zaledwie 1 μg RNA wyselekcjonowanego przez poli-A. Zmaksymalizowaliśmy również wydajność odzyskiwania fragmentów RNA m6A związanych ze specyficznymi przeciwciałami za pomocą elucji metodą konkurencji z peptydem m6A zamiast bardziej konwencjonalnych i mniej specyficznych metod elucji przy użyciu technik opartych na fenolu lub proteinazie K. Głównym ograniczeniem tego testu opartego na RIP pozostaje jednak nieoptymalna rozdzielczość, która nie pozwala na identyfikację precyzyjnego zmodyfikowanego nukleotydu A.
Analiza znaku C m5C może być obecnie przeprowadzona przy użyciu dwóch różnych podejść: metody opartej na RIP z przeciwciałami specyficznymi dla m5C i konwersją wodorosiarczynu RNA. Ponieważ RIP oferuje tylko ograniczoną rozdzielczość identyfikacji metylowanej pozostałości, zastosowaliśmy konwersję wodorosiarczynu, która może zapewnić rozdzielczość pojedynczego nukleotydu. Narażenie RNA na wodorosiarczyn (BS) prowadzi do deaminacji cytozyny, przekształcając w ten sposób resztę cytozyny w uracyl. Tak więc podczas reakcji konwersji wodorosiarczynu RNA każda niemetylowana cytozyna jest deaminowana i przekształcana w uracyl, podczas gdy obecność grupy metylowej w pozycji 5 cytozyny ma działanie ochronne, zapobiegając deaminacji wywołanej przez BS i zachowując resztę cytozyny. Podejście oparte na BS pozwala na wykrycie nukleotydu zmodyfikowanego m5C w rozdzielczości pojedynczej zasady oraz na ocenę częstotliwości metylacji każdego transkryptu, zapewniając wgląd w dynamikę modyfikacji m5C18. Główne ograniczenie tej techniki polega jednak na fałszywie dodatnim odsetku metylowanych pozostałości. Rzeczywiście, konwersja BS jest skuteczna w przypadku jednoniciowego RNA z dostępnymi resztami C. Jednak obecność ścisłej struktury drugorzędowej RNA może maskować pozycję N5C i utrudniać konwersję BS, co skutkuje niemetylowanymi resztami C, które nie są przekształcane w reszty U, a tym samym fałszywie dodatnimi. Aby obejść ten problem i zminimalizować odsetek wyników fałszywie dodatnich, zastosowaliśmy 3 rundy cykli denaturacji i konwersji wodorosiarczynu19. Wprowadziliśmy również 2 kontrole w próbkach, aby umożliwić oszacowanie wydajności konwersji wodorosiarczynu: zwiększyliśmy kontrolę sekwencjonowania ERCC (niemetylowane standaryzowane i dostępne na rynku sekwencje)20, a także RNA zubożone w poli-A, aby ocenić współczynnik konwersji wodorosiarczynu z jednej strony, a z drugiej strony zweryfikować za pomocą RT-PCR obecność znanego i dobrze zachowanego miejsca metylacji, C4447, z drugiej strony na rybosomalnym RNA 28S21.
W dziedzinie wirusologii, połączenie tych dwóch metod badań epitranskryptomicznych z sekwencjonowaniem nowej generacji i dokładną analizą bioinformatyczną pozwala na dogłębne badanie dynamiki m6A i m5C (tj. modyfikacji RNA, zmian czasowych, które mogą wystąpić po infekcji wirusowej i mogą odkryć szereg nowych terapeutycznie istotnych celów do użytku klinicznego).

<table><tbody><tr><td>AccuPrime Pfx SuperMix</td><td>Invitrogen</td><td>12344-040</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-m6A _Clone 17-3-4-1</td><td>Millipore</td><td>MABE1006</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>ERCC</td><td>Invitrogen</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>EZ</td> Zestaw do analizy fragmentów <td>Zymo Research</td><td>EZR5001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNA - Zestaw HS RNA</td><td>Agilent</td><td>DNF-472-0500</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw analizatora fragmentów RNA - Zestaw RNA</td><td>Agilent</td><td>DNF-471-0500</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>Applied Biosystem</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq Nici mRNA</td><td>Illumina</td><td>20020594</td><td></td></tr><tr><td>Kulki magnetyczne Mieszanka A/G</td><td>Merck</td><td>16-663</td><td></td></tr><tr><td>N6-metyloadenozyna, sól sodowa 5&prime;-monofosforanu (m6A)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2780-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Normalna mysia IgG</td><td>Merk</td><td>12371</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)25</td><td>Life Technologies</td><td>61005,</td><td></td></tr> <tr><td>PCRapace</td><td></td><td>Stratec 1020220300</td><td></td></tr><tr><td>Szybki zestaw wirusowy RNA</td><td>Zymo Research</td><td>1034</td><td></td></tr><tr><td>RNA Czystość & Koncentrator</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do fragmentacji RNA</td><td>Ambion</td><td>AM8740</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>Ambion</td><td>AM2684</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Trizol TRIzol</td><td>Odczynnik 15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie epitranskryptomów m6a i m5c po infekcji wirusowej: przykład z hiv

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Rola modyfikacji RNA w procesach biologicznych była przedmiotem coraz większej liczby badań w ciągu ostatnich kilku lat i jest obecnie znana jako epitranskryptomika. Na cząsteczkach mRNA opisano m.in. modyfikacje RNA N6-metyloadenozyny (m6A) i 5-metylocytozyny (m5C), które mogą odgrywać rolę w modulowaniu procesów komórkowych. Epitranskryptomika jest zatem nową warstwą regulacji, którą należy wziąć pod uwagę oprócz analiz transkryptomicznych, ponieważ może być również zmieniana lub modulowana przez ekspozycję na dowolny czynnik chemiczny lub biologiczny, w tym infekcje wirusowe.
Tutaj prezentujemy przepływ pracy, który pozwala na analizę wspólnego komórkowego i wirusowego krajobrazu epitranskryptomicznego znaczników m6A i m5C jednocześnie, w komórkach zakażonych lub nie ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV). Po izolacji i fragmentacji mRNA z komórek zakażonych wirusem HIV i niezakażonych, zastosowaliśmy dwie różne procedury: MeRIP-Seq, technikę opartą na immunoprecypitacji RNA, w celu wzbogacenia o fragmenty RNA zawierające znacznik m6A oraz BS-Seq, technikę opartą na konwersji wodorosiarczynu, w celu identyfikacji znaku m5C w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Po wychwyceniu specyficznym dla metylacji biblioteki RNA są przygotowywane do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Opracowaliśmy również dedykowany potok bioinformatyczny w celu identyfikacji transkryptów metylowanych różnicowo (DM) niezależnie od ich podstawowego profilu ekspresji.
Ogólnie rzecz biorąc, metodologia pozwala na jednoczesną eksplorację wielu znaczników epitranskryptomicznych i dostarcza atlas transkryptów DM w przypadku infekcji wirusowej lub innych zaburzeń komórkowych. Podejście to stwarza nowe możliwości identyfikacji nowych graczy i nowych mechanizmów odpowiedzi komórek, takich jak czynniki komórkowe promujące lub ograniczające replikację wirusa.

Ten schemat postępowania okazał się użyteczny w badaniu roli metylacji m6A i m5C w kontekście zakażenia HIV. W tym celu wykorzystaliśmy model linii komórkowej limfocytów T CD4+ (SupT1), które poddano zakażeniu HIV lub pozostawiono nieleczone. Procedurę rozpoczęliśmy od 50 milionów komórek na każdą kondycję, uzyskując średnio 500 µg całkowitego RNA o wskaźniku jakości RNA wynoszącym 10 (Rycina 1A-B). Po selekcji poly-A odzyskaliśmy od 10 do 12 µg mRNA na kondycję (co stanowi około 2% całkowitego RNA) (Rycina 1B). Na tym etapie wykorzystaliśmy 5 µg RNA wyselekcjonowanego metodą poly-A do procedury MeRIP-Seq oraz 1 µg do procedury BS-Seq. Ponieważ RNA HIV jest poliadenylowane, nie są wymagane żadne dodatkowe działania i procedury MeRIP-Seq oraz BS-Seq mogą być zastosowane bezpośrednio.
<img alt="Schemat procesu ekstrakcji RNA; kroki selekcji i sekwencjonowania mRNA; wykres danych przedstawia czystość RNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie RNA do dalszych zastosowań. A) Schemat blokowy przedstawiający przygotowanie i rozdział RNA dla równoległych procesów MeRIP-Seq i BS-Seq. Każdy wypełniony sześciokąt reprezentuje typ modyfikacji RNA, np. m6A (zielony) lub m5C (różowy). Wskazano ilości materiału RNA niezbędne do przeprowadzenia eksperymentu. B) Reprezentatywne wyniki przedstawiające oczekiwane profile rozkładu RNA (rozmiar i ilość) po ekstrakcji całkowitego RNA (górny panel) oraz selekcji poly-A (dolny panel). Próbki wprowadzono do analizatora fragmentów z zestawem o standardowej czułości w celu oceny jakości RNA przed przystąpieniem do specyficznych procedur MeRIP-Seq i BS-Seq. RQN: wskaźnik jakości RNA; nt: nukleotydy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Procedura MeRIP-Seq to technika oparta na immunoprecypitacji RNA, która umożliwia badanie modyfikacji m6A w cząsteczkach RNA. W tym celu RNA jest najpierw fragmentowane, a następnie inkubowane z przeciwciałami specyficznymi dla m6A sprzężonymi z kulkami magnetycznymi w celu immunoprecypitacji i wychwytu. Fragmenty RNA wzbogacone w MeRIP oraz frakcja niepoddana immunoprecypitacji (input) są następnie sekwencjonowane i porównywane w celu zidentyfikowania regionów RNA zmodyfikowanych przez m6A, a tym samym transkryptów zmetylowanych w pozycji m6A (Rysunek 2A). Rozdzielczość tej techniki zależy od wydajności fragmentacji RNA. W rzeczywistości krótsze fragmenty pozwalają na dokładniejszą lokalizację reszty m6A. W tym przypadku komórkowe RNA wyselekcjonowane pod kątem ogona poly-A oraz RNA wirusowe poddano fragmentacji jonowej z użyciem buforu do fragmentacji RNA przez 15 min w końcowej objętości 20 µL, aby uzyskać fragmenty RNA o długości 100-150 nt. Zaczynając od 5 µg mRNA, odzyskano 4,5 µg sfragmentowanego RNA, co odpowiada wydajności odzysku na poziomie 90% (Rysunek 2B). Jako kontrolę input wykorzystano 100 ng sfragmentowanego, oczyszczonego RNA, który poddano bezpośrednio przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowaniu. Pozostałe RNA (~4,4 µg) przetworzono zgodnie z procedurą MeRIP-Seq, która rozpoczyna się od inkubacji sfragmentowanego RNA z kulkami związanymi albo z przeciwciałami specyficznymi przeciwko m6A, albo z przeciwciałami anty-IgG jako kontrolą. Specyficzne RIP dla m6A (MeRIP) z 2,5 µg sfragmentowanego RNA pozwoliło na odzyskanie około 15 ng materiału wzbogaconego w m6A, który poddano przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowaniu (Rysunek 2B). RIP z kontrolą anty-IgG, zgodnie z oczekiwaniami, nie dostarczyło wystarczającej ilości RNA, aby umożliwić dalszą analizę (Rysunek 2B).
<img alt="Analiza mRNA metodą MeRIP-Seq; schemat m⁶A RIP przedstawia metodę sekwencjonowania, analizę danych i wyniki porównawcze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat procedury MeRIP-Seq. A) Schematyczny przebieg procesu MeRIP-Seq i kontroli wejściowej (input control). Po selekcji poli-A próbki sfragmentowano na fragmenty o długości 120-150 nt, a następnie poddano je bezpośrednio sekwencjonowaniu (100 ng, kontrola wejściowa) lub wykorzystano do immunoprecypitacji RNA (2,5 µg, RIP) z użyciem przeciwciała specyficznego dla m6A lub przeciwciała anty-IgG jako kontroli negatywnej przed sekwencjonowaniem. B) Reprezentatywne wyniki pokazujące oczekiwane profile rozkładu RNA (rozmiar i ilość) po fragmentacji (panel górny) oraz RIP (panele dolne, MeRIP: lewo, kontrola IgG: prawo). Próbki naniesiono na analizator fragmentów w celu oceny jakości i stężenia RNA przed dalszym przetwarzaniem w ramach przygotowania bibliotek i sekwencjonowania. Analiza sfragmentowanego RNA została przeprowadzona przy użyciu zestawu RNA standard sensitivity, natomiast w przypadku RNA immunoprecypitowanego zastosowano zestaw high sensitivity. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Procedura BS-Seq umożliwia badanie modyfikacji m5C RNA z rozdzielczością pojedynczych nukleotydów i prowadzi do identyfikacji transkryptów zmetylowanych w pozycji m5C. W wyniku konwersji pirosiarczynowej niezmetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl, podczas gdy zmetylowane cytozyny pozostają niezmienione (Rycyna 3A). Ze względu na drastyczne warunki procedury konwersji pirosiarczynowej (tzn. wysoką temperaturę i niskie pH), przekonwertowane mRNA ulegają znacznej degradacji (Rycina 3B), jednak nie koliduje to z przygotowaniem biblioteki i sekwencjonowaniem. Konwersja pirosiarczynowa jest wydajna wyłącznie w przypadku jednoniciowego RNA, zatem może być potencjalnie utrudniona przez wtórne dwuniciowe struktury RNA. Aby ocenić wydajność konwersji C-U, wprowadziliśmy dwie kontrole. Jako kontrolę pozytywną wykorzystaliśmy wcześniej opisaną obecność silnie zmetylowanej cytozyny w pozycji C4447 28S rRNA23. Po amplifikacji RT-PCR i sekwencjonowaniu fragmentu o długości 200 bp otaczającego miejsce metylacji zaobserwowaliśmy, że wszystkie cytozyny zostały pomyślnie przekonwertowane na uracyle, pojawiając się zatem jako tymidyny w sekwencji DNA, z wyjątkiem cytozyny w pozycji 4447, która pozostała niezmieniona. Jako kontrolę stopnia konwersji pirosiarczynowej użyliśmy dostępnych komercyjnie syntetycznych sekwencji RNA ERCC. Mieszanina ta składa się z puli znanych, niezmetylowanych i poliadenylowanych sekwencji RNA o zróżnicowanych długościach i strukturach wtórnych. Po przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowaniu skupiliśmy się na tych sekwencjach ERCC, aby obliczyć stopień konwersji, co można zrobić poprzez zliczenie liczby przekonwertowanych C spośród wszystkich reszt C we wszystkich sekwencjach ERCC w każdej próbce. Uzyskaliśmy stopień konwersji na poziomie 99,5%, co potwierdza wydajność i powodzenie reakcji konwersji pirosiarczynowej (Rycina 3D).
<img alt="Proces konwersji pirosiarczynowej, schemat sekwencjonowania mRNA, analiza DNA, wykres wydajności konwersji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Procedura BS-Seq. A) Schematyczny przebieg procesu BS-Seq. Po selekcji poly-A próbki poddawane są działaniu pirosiarczynu, co prowadzi do konwersji C na U (w wyniku deaminacji) w przypadku niezmetylowanych reszt C. Z kolei zmetylowane reszty C (m5C) nie ulegają działaniu pirosiarczynu i pozostają niezmienione. B) Reprezentatywny wynik profilu rozkładu RNA poddanego konwersji pirosiarczynowej (rozmiar i ilość) w analizie na analizatorze fragmentów z zestawem o standardowej czułości. C) Elektroferogram przedstawiający reprezentatywny wynik sekwencjonowania amplikonu RT-PCR regionu otaczającego 100% zmetylowaną cytyzynę C w pozycji 4447 w 28S rRNA (zaznaczoną na niebiesko). W przeciwieństwie do niej, reszty C z sekwencji referencyjnej zostały zidentyfikowane jako reszty T w sekwencji amplikonu ze względu na poprawną konwersję pirosiarczynową. D) Ocena wydajności konwersji C-U poprzez analizę sekwencji spike-in ERCC w komórkach zakażonych i niezakażonych HIV. Średnia wydajność konwersji wynosi 99,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Próbki wzbogacone w M6A, próbki poddane konwersji pirosiarczynowej oraz kontrole wejściowe są następnie przetwarzane w celu przygotowania bibliotek, sekwencjonowania i analizy bioinformatycznej (Rysunek 4). W zależności od projektu eksperymentalnego i stawianych pytań biologicznych można zastosować wiele analiz bioinformatycznych. Jako dowód koncepcji przedstawiamy tutaj reprezentatywne wyniki z jednej potencjalnej aplikacji (t.j. analizy różnicowego metylowania), która koncentruje się na identyfikacji transkryptów o różnym stopniu metylowania indukowanych po infekcji HIV. W skrócie zbadaliśmy poziom metylowania m6A lub m5C transkryptów, niezależnie od ich poziomu ekspresji genów, zarówno w komórkach niezinfekowanych, jak i zakażonych HIV, aby lepiej zrozumieć rolę metylacji RNA w cyklu życiowym wirusa. Po normalizacji ekspresji genów zidentyfikowano, że transkrypt ZNF469 był różnicowo metylowany pod kątem m6A w zależności od stanu zakażenia; w rzeczywistości transkrypt ten nie był metylowany w komórkach niezinfekowanych, podczas gdy po infekcji HIV wykazywał kilka pików metylowania (Rysunek 5A). Podobna analiza różnicowego metylowania m5C wykazała, że transkrypt PHLPP1 zawierał kilka reszt zmetylowanych, które wykazują tendencję do częstszego metylowania w warunkach zakażenia HIV (Rysunek 5B). W tym kontekście obie analizy sugerują, że infekcja HIV wpływa na komórkowy epitranskryptom.
<img alt="Potoki sekwencjonowania RNA m6A i m5C; schemat blokowy, przetwarzanie plików FASTQ, dopasowanie, wyznaczanie pików." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Schematyczna reprezentacja bioinformatycznego procesu analizy danych m6A i m5C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mapowanie genomiczne ZNF469, PHLPP1; integracja HIV, wykres zmienności sekwencji, analiza chromosomowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Przykład transkryptów o różnym stopniu metylacji po infekcji. A) Reprezentatywny wynik pokazujący metylację m6A transkryptu ZNF459 w komórkach zainfekowanych HIV (zielone) i niezinfekowanych (szare). Intensywność piku (po odjęciu ekspresji wejściowej) jest przedstawiona na osi y, a pozycja w chromosomie na osi x. Analiza różnicowej metylacji wykazuje, że transkrypt ZFN469 jest hipermetylowany po infekcji HIV. B) Reprezentatywny wynik dla genu z metylacją m5C w komórkach zainfekowanych HIV (górna ścieżka) i niezinfekowanych (dolna ścieżka). Wysokość każdego słupka reprezentuje liczbę odczytów na nukleotyd i pozwala na ocenę pokrycia. Każdy reszt C jest zaznaczony na czerwono, a proporcja zmetylowanego C jest przedstawiona na niebiesko. Dokładny stopień metylacji (%) jest podany nad każdą resztą C. Strzałki wskazują statystycznie istotne różnice w metylacji C. Próbki wizualizowano za pomocą przeglądarki IGV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Rola modyfikacji RNA w infekcjach wirusowych dopiero zaczyna być badana i może uwypuklić nowe mechanizmy interakcji wirus-gospodarz. W tej pracy przedstawiamy proces badania modyfikacji RNA m6A i m5C w kontekście infekcji wirusowych.

Badanie epitranskryptomów m6A i m5C po infekcji wirusowej: przykład z HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Cześć, w tym filmie pokażemy, jak zbadać epitranskryptomy m6A i m5C po infekcji wirusowej. Aby rozpocząć eksperyment, potrzebujesz 50 milionów komórek dla osób niezakażonych i 50 milionów dla zainfekowanych schorzeń. Aby uzyskać wysokiej jakości zestaw danych po analizie, musisz osiągnąć uniwersalną infekcję.Tutaj infekujemy te komórki wektorem opartym na HIV i mierzymy kodowany wirusowo GFP za pomocą FACS. W tym przypadku mieliśmy 80% zainfekowanych komórek i kontynuowaliśmy proces pracy, zaczynając od całkowitej ekstrakcji RNA. Podzieliliśmy więc komórki na podwielokrotności po 10 milionów każda i poddaliśmy je lizie w 1 ml Trizolu.Następnie dodaliśmy 200 mikrolitrów chloroformu do lizatu komórkowego i wymieszaliśmy przez inwersję. W tym momencie pozostawiamy lizat na trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odwirowujemy wszystkie próbki z dużą prędkością przez 15 minut w temperaturze czterech stopni. Spodziewasz się separacji faz w trzech różnych fazach, jak pokazano tutaj.RNA jest osadzone w górnej fazie, więc ostrożnie przenieś fazę wodną do świeżej probówki, zwracając uwagę, aby nie przenieść warstwy organicznej. W tym momencie dodać 0,5 ml izopropanolu do fazy wodnej i dokładnie wymieszać przez odwrócenie. Próbki można następnie inkubować przez godzinę w temperaturze 80 stopni, aby zapewnić wytrącanie RNA.Po odwirowaniu z dużą prędkością powinieneś być w stanie zobaczyć ładną osadę RNA, jak pokazano tutaj. Ostrożnie usunąć supernatant przez odwrócenie lub pipetowanie, zwracając uwagę, aby nie rozerwać osadu. Następnie przemyj osad RNA jednym ml 75% etanolu o jakości cząsteczkowej.I krótko wymieszaj próbkę. Po odwirowaniu upewnij się, że odzyskałeś ładną białą pastylkę RNA. Wyrzucić supernatant i pozostawić osad RNA do wyschnięcia przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Ponownie zawiesić każdą granulkę w 20 mikrolitrach wody i zebrać razem wszystkie próbki z tego samego stanu. Całkowite RNA jest teraz gotowe do izolacji mRNA przez selekcję poli-A. Dla każdej próbki 75 mikrogramów RNA przygotuj 200 mikrolitrów kulek magnetycznych oligo-DT i umyj je w jednym ml buforu wiążącego.Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i pozwól, aby koraliki związały się z magnesem podczas jednego mieszania. Odrzucić supernatant i powtórzyć procedurę dla drugiego przemycia. Następnie wyjmij kulki ze stojaków magnetycznych i ostrożnie zawieś je ponownie w 100 mikrolitrach bufora wiążącego.W tym momencie przygotuj próbkę RNA, dzieląc ją na 75 mikrogramów RNA na podwielokrotność zawieszoną w 100 mikrolitrach wody. Dodać 100 mikrolitrów buforu wiążącego i inkubować przez dwie minuty w temperaturze 65 stopni. Następnie odwirować próbki i inkubować na lodzie.Następnie dodaj 100 mikrolitrów przemytych kulek magnetycznych do każdej próbki RNA i pozostaw do wiązania na obracającym się kole przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umieść probówkę z powrotem w stojaku magnetycznym i pozwól im inkubować przez minutę. Następnie odzyskać supernatant do świeżej probówki i odłożyć go na bok do drugiej rundy izolacji.Umyj kulki dwukrotnie 200 mikrolitrami buforu myjącego, a następnie przystąp do elucji. W celu wymycia wybranego poli-A RNA z kulek magnetycznych, dodaj 20 mikrolitrów lodowatego HCl TRIS do każdej próbki i ostrożnie pipetuj. Następnie inkubuj próbki w temperaturze 80 stopni przez dwie minuty, aby uwolnić RNA z kulek.Przenieś supernatant zawierający wybrane RNA poli-A do świeżej probówki, uważając, aby uniknąć przeniesienia kulek. Etap elucji, a także etap izolacji należy powtórzyć dwukrotnie w celu zwiększenia wydajności mRNA. mRNA jest teraz gotowe do wejścia do rurociągu meRIP-Seq na etapie fragmentacji lub przejścia bezpośrednio do konwersji wodorosiarczynu.Pierwszym krokiem do wejścia do rurociągu meRIP-Seq jest fragmentacja mRNA. W tym celu potrzebujesz pięciu mikrogramów mRNA podzielonych na podwielokrotności po 18 mikrolitrów w probówkach o pojemności 0,2 ml. Aby zapewnić spójne dane, bardzo ważna jest szybka praca i praca z niewielką liczbą próbek w tym samym czasie.Na potrzeby tego eksperymentu fragmentacja została zoptymalizowana w celu uzyskania fragmentu o wielkości od 115 do 200 nukleotydów. Następnie dodaj dwa mikrolitry odczynnika fragmentacyjnego do każdej probówki zawierającej 18 mikrolitrów mRNA, zachowując ostrożność przy osadzaniu kropli na ściance probówki. Odwirować wszystkie próbki, aby umożliwić kontakt między odczynnikiem a RNA w tym samym czasie i inkubować w temperaturze 70 stopni przez 15 minut.Po zakończeniu inkubacji zatrzymaj reakcję, dodając dwa mikrolitry 0,5 M EDTA. W tym momencie możesz oczyścić swoje pofragmentowane mRNA wybraną metodą i przejść do kontroli jakości RNA za pomocą analizatora fragmentów. Ten krok jest opcjonalny, ale pozwoli ocenić rozmiar fragmentu przed zaangażowaniem się w wytrącanie RNA.Jak widać tutaj na czwartym pasie, otrzymujemy dla obu naszych próbek fragment około 150 nukleotydów każdy. Następnie przystąpiliśmy do meRIP-Seq. Pierwszy etap polega na kilku kulkach magnetycznych A / G z przeciwciałami anty-m6A lub kontrolami IgG.Dla każdego planu reakcji przenieś 25 mikrolitrów kulek magnetycznych do świeżej probówki. Należy pamiętać, że potrzebny będzie co najmniej jeden warunek specyficzny dla m6A i jeden warunek kontrolny. Umyj każde 25 mikrolitrów kulek 250 mikrolitrami bufora IP.Delikatnie zawiesić kulki, pipetując w górę i w dół, a następnie umieścić probówkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby umożliwić oddzielenie kulek. Usunąć i wyrzucić supernatant, zwracając uwagę, aby nie zasysać kulek magnetycznych i powtórzyć etap płukania raz. Następnie ponownie zawieś kulki magnetyczne w 100 mikrolitrach bufora IP na każde 25 mikrolitrów oryginalnej objętości kulek.Przygotuj i oznacz jedną tubkę na każdy warunek. W naszym przypadku będziemy mieli dwie probówki dla stanu zakażonego, jedną dla m6A i jedną do kontroli IgG oraz dwie probówki dla stanu niezakażonego. Następnie dodaj 100 mikrolitrów umytych koralików do każdej tuby.Kulki są teraz gotowe do sprzężenia ze specyficznymi przeciwciałami lub kontrolami IgG. Dodaj pięć mikrogramów swoistego przeciwciała anty-m6A lub przeciwciała kontrolnego anty-IgG do każdej probówki zawierającej 100 mikrolitrów przemytych kulek magnetycznych. Pozwól na koniugację przeciwciało-kulki poprzez inkubację probówki przez 30 minut na obracającym się kole.W międzyczasie przystąp do przygotowania próbki. Dla każdego planowanego stanu, swoistego dla m6A lub kontroli IgG, materiałem wyjściowym będzie 2,5 mikrograma rozdrobnionego mRNA zawieszonego w 100 mikrolitrach wody. Aby uzyskać końcową objętość reakcji 500 mikrolitrów, dodaj 295 mikrolitrów wody do każdej próbki.Następnie dodać pięć mikrolitrów inhibitora RNAazy stężonego w 40 jednostkach na mikrolitr, co daje łączną ilość 200 jednostek na próbkę i delikatnie wymieszać. Na koniec dodaj 100 mikrolitrów 5X stężonego bufora IP do każdej probówki. Próbki są teraz gotowe do reakcji wytrącania immunologicznego.Wyjmij kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałem z obracającego się koła i przekręć je w dół. Następnie dodać 500 mikrolitrów wcześniej przygotowanych próbek do każdych 100 mikrolitrów kulek sprzężonych ze specyficznymi przeciwciałami. Delikatnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, aby całkowicie zawiesić kulki.Inkubuj je lub swoją reakcję meRIP na obracającym się kole pod czterema stopniami przez dwie godziny. Po zakończeniu inkubacji odkręć każdą probówkę i umieść je na stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby umożliwić oddzielenie kulek. Następnie usuń niezwiązaną frakcję i umieść ją na świeżej probówce i zachowaj do dalszej analizy, jeśli to konieczne.Wyjmij magnes ze stojaka i ponownie zawieś wszystkie próbki w 500 mikrolitrach bufora IP. Ostrożnie zawiesić każdą próbkę, pipetując w górę i w dół. Włóż magnes do stojaka, inkubuj przez minutę, a następnie ostrożnie usuń supernatant.Powtórz pranie dwukrotnie, a następnie kontynuuj elucję. Dla każdej pary próbek, specyficznych dla m6A i kontrolnych, przygotować 225 mikrolitrów buforu elucyjnego zawierającego 20 milimoli oczyszczonego m6A. Następnie dodać 100 mikrolitrów buforu elucyjnego na próbkę.Inkubować wszystkie próbki przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni na bujaku. Następnie zbierz wszystkie próbki RNA wzbogacone m6A w świeżej probówce i przystąp do drugiej rundy elucji. Oczyść RNA wzbogacone m6A wybraną metodą W tym momencie próbki są gotowe do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania.Do zbadania modyfikacji m5C używamy konwersji wodorosiarczynowej. Rozpocznij eksperyment od 500 nanogramów poliadenylowanego RNA. Chociaż jest to opcjonalne, dodanie do próbki 500 pikogramów RNA zubożonego w poli-A w celu zapewnienia reprezentacji rybosomalnej i 0,5 mikrolitra dostępnej na rynku sekwencji syntetycznej pozwoli ocenić współczynnik konwersji wodorosiarczynu podczas sekwencjonowania.Dostosuj próbkę do końcowej objętości 20 mikrolitrów w wodzie, a następnie dodaj 130 mikrolitrów odczynnika do konwersji RNA do każdej próbki. Ostrożnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie odwirować całą próbkę, aby upewnić się, że z boku probówek nie pozostały żadne kropelki. Inkubować całą próbkę w maszynie do PCR przez trzy cykle denaturacji w temperaturze 70 stopni przez pięć minut i konwersję wodorosiarczynu w temperaturze 54 stopni w ciągu 45 minut.Przeprowadź deaminację w kolumnie, dodając bezpośrednio na pustą kolumnę 250 mikrolitrów buforu wiążącego RNA, 150 mikrolitrów próbki przekształconej w wodorosiarczyn. Wymieszać próbkę, pipetując w górę i w dół, zwracając jednak uwagę, aby nie dotykać filtrów kolumnowych. Dodać 400 mikrolitrów 95-100% etanolu do próbki mieszaniny buforowej wiążącej RNA bezpośrednio w kolumnie.Zamknij nakrętkę i natychmiast wymieszaj przez odwrócenie. Obracaj próbkę przez 30 sekund i odrzuć przepływ. Umyj kolumnę buforem myjącym, a następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu odsiarczającego do środka każdej kolumny.Inkubować całą próbkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wirować próbkę przez 30 sekund, a następnie przystąpić do dwóch rund mycia. Dodać 400 mikrolitrów buforu płuczącego do każdej próbki, odwirować przez 30 sekund z pełną prędkością i odrzucić przepływ.Umieść kolumnę w nowej pustej probówce i wymyj wodorosiarczyn przekształcony RNA w 20 mikrolitrów wody. Kontroluj wydajność konwersji wodorosiarczynu za pomocą RT-qPCR, a następnie przejdź do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania. Po analizie bioinformatycznej, oto kilka przykładów wyników, które można uzyskać za pomocą tego przepływu pracy.Tutaj porównujemy epitranskryptom komórek zakażonych wirusem HIV z komórkami niezakażonymi. po 24 godzinach od zakażenia. W panelu A możesz zobaczyć wyniki, które uzyskujemy badając epitranskryptom m6A.Na tym wykresie wykreślamy wzbogacone odczyty m6A na podstawie analizy meRIP-Seq. Ładnie widzimy, że palec cynkowy jest hipermetylowany 24 godziny po zakażeniu. Przeprowadziliśmy ten sam rodzaj analizy dla badania epitranskryptomu m5C w panelu B.In tym wykresie, każda niemetylowana cytozyna jest wyświetlana na czerwono, podczas gdy proporcja cytozyny, która została zmetylowana m5C, jest pokazana na niebiesko.Jak widać, PHLPP1, wszystkie trzy cytozyny, które są hipermetylowane 24 godziny po zakażeniu wirusem HIV. Ogólnie rzecz biorąc, ten przepływ pracy pozwala na zbadanie zarówno epitranskryptomu M6A, jak i m5C zakażonych komórek i może być stosowany jako taki również do cząstek wirusa. Zrozumienie infekcji wirusowych jest w stanie zmodyfikować krajobraz epitranskryptomiczny gospodarza, co da nam dostęp do nowej warstwy regulacji.Badania nad zróżnicowanymi transkryptami metylowymi po infekcji wirusowej dostarczą oczywiście cennego zasobu dla nowej interwencji terapeutycznej. Pod poniższym linkiem można znaleźć nasze ogólnodostępne zasoby do badania różnicowego transkryptu metylowanego po zakażeniu wirusem HIV w czasie.

exploring-m6a-m5c-epitranscriptomes-upon-viral-infection-an-example

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do wyznaczania struktur białek błonowych z wykorzystaniem krio-tomografii elektronowej oraz trójwymiarowego przetwarzania obrazów. Obejmuje on szczegóły przygotowania preparatów, gromadzenia danych, ich przetwarzania i interpretacji, a kończy się opracowaniem reprezentatywnego celu dla tej metody, jakim jest glikoproteina otoczki HIV-1. Procedury obliczeniowe zostały zaprojektowane w sposób umożliwiający badaczom i studentom pracę zdalną oraz wkład w...

Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV z wykorzystaniem krioelektronowej tomografii i zautomatyzowanego uśredniania subtomogramów

Opisujemy protokół służący do identyfikacji kluczowych ról cząsteczek sygnałowych gospodarza w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa, gamma herpeswirusa 68 (γHV68). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy oraz fibroblasty zarodkowe do litycznej replikacji γHV68, protokół ten umożliwia zarówno charakterystykę fenotypową, jak i analizę molekularną oddziaływań wirus-gospodarz podczas litycznej replikacji wirusa.

Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Opracowaliśmy model koinfekcji malarią i HIV-1 in vitro, aby zbadać wpływ Plasmodium falciparum na cykl replikacyjny HIV-1 w ludzkich pierwotnych makrofagach pochodzących z monocytów. Ten wszechstronny system można łatwo dostosować do innych typów komórek pierwotnych podatnych na zakażenie HIV-1.

Model koinfekcji In vitro do badania interakcji między Plasmodium falciparum a HIV-1 w ludzkich pierwotnych komórkach odpornościowych pochodzących z monocytów

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

Ten film pokazuje ex vivo zakażenie ludzkiej tkanki błony śluzowej macicy ludzkim wirusem niedoboru odporności typu 1, HIV-1, oraz ich utrzymanie na gąbkach żelatynowych na granicy powietrze-ciecz. Metoda ta pozwala na monitorowanie replikacji i patogenezy HIV-1 w tkankach ludzkich.

Model zakażenia błony śluzowej szyjki macicy u człowieka do badania patogenezy HIV w warunkach ex vivo

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Indywidualne sekwencjonowanie prowirusowe o pełnej długości (FLIPS) zapewnia efektywną i wysokoprzepustową metodę amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnej długości (nienaruszonych i wadliwych) prowirusów HIV-1 i pozwala na określenie ich potencjalnej zdolności replikacyjnej. Projekt FLIPS pozwala przezwyciężyć ograniczenia poprzednich testów zaprojektowanych do sekwencjonowania utajonego rezerwuaru HIV-1.

Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Tutaj opisujemy immunoprecypitację Rev w obecności replikacji HIV-1 dla spektrometrii mas. Opisane metody mogą być stosowane do identyfikacji czynników jąderkowych zaangażowanych w cykl zakaźny HIV-1 i mają zastosowanie do innych modeli chorób w celu scharakteryzowania niedostatecznie zbadanych szlaków.

Identyfikacja czynników jąderkowych podczas replikacji HIV-1 poprzez immunoprecypitację Rev i spektrometrię mas

Tutaj opisujemy kilka sprawdzonych metod określania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i aktywacji odpowiedzi na nieswojone białko (UPR), ze szczególnym naciskiem na zakażenie HIV-1. W artykule opisano również zestaw protokołów do badania wpływu stresu ER/UPR na replikację HIV-1 i zakaźność wirionu.

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Poznaj metodę analizy modyfikacji RNA m6A i m5C w komórkach zakażonych wirusem HIV. Technika ta pozwala odkryć nowe mechanizmy interakcji wirus-gospodarz na poziomie molekularnym.

Badanie epitranskryptomów m⁶A i m⁵C po infekcji wirusowej: przykład z HIV

Przeglądaj więcej filmów