Name: Przygotowanie homogenatów mięśni szkieletowych szczurów do pomiarów azotanów i azotynów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Naucz się przygotowywać homogenaty mięśni szkieletowych szczurów do pomiarów azotanów i azotynów. Protokół zapewnia dokładną kwantyfikację metabolitów tlenku azotu w małych próbkach tkankowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez wewnętrzny grant NIH/NIDDK ZIA DK 0251041-14 dla Alana N Schechtera, MD.

Protokół dla zwierząt został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NIDDK (ASP K049-MMB-20). Zwierzęta były traktowane i traktowane zgodnie z aktualnym Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, dostępnym bezpłatnie na stronie internetowej AAALAC.
1. Kolekcja mięśni szkieletowych szczura
<ol>
	<li>Podczas gdy szczur jest w głębokim znieczuleniu (5% izofluranu, potwierdzone brakiem reakcji na szczypanie ogona/nogi), rozpocznij perfuzję solą fizjologiczną zawierającą heparynę, umieszczając igłę 19 G w wierzchołku lewej komory i robiąc nacięcie na prawym przedsionku. Pozwól, aby sól fizjologiczna z heparyną przeniknęła przez narządy wewnętrzne, aż co najmniej 1,5 litra/kg przepłynie przez tkankę. W tym momencie zwierzęta są martwe w wyniku wykrwawienia, a tusze są gotowe do przetworzenia w celu pobrania próbki. 
	UWAGA: Osiągnięcie dobrej perfuzji ma kluczowe znaczenie, szczególnie dla dokładnych pomiarów azotynów, ponieważ azotyny są utleniane do azotanów przez pozostałą hemoglobinę.</li>
	<li>Zidentyfikuj docelowe tkanki mięśniowe i wytnij je z tylnych nóg22 za pomocą czystych narzędzi chirurgicznych. Usuń jak najwięcej tłuszczu i tkanki łącznej z tkanek mięśniowych.</li>
	<li>Umieść żądaną ilość mięśni w probówce mikrowirówkowej, a następnie umieść na suchym lodzie. Probówki wypełnione chusteczką należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: W przypadku próbek z biopsji ludzkiej należy je dokładnie osuszyć natychmiast po pobraniu czystą gazą, aby usunąć nadmiar krwi.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do homogenizacji
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu konserwującego azotyny (roztwór zatrzymujący)
	<ol>
		<li>Przygotować klarowny żółty roztwór zawierający 890 mM żelazocyjanku potasu (K3Fe(CN)6) i 118 mM NEM (N-etylomaleimid) w wodzie destylowanej, upewniając się, że nie ma kryształów. Dodaj niejonowy środek powierzchniowo czynny (detergent) w stosunku 1:9 (v/v, tabela materiałów) i delikatnie wymieszaj, aby uniknąć pienienia.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór zatrzymujący w stosunku 1:9 wodą destylowaną. Umieścić rozcieńczony roztwór zatrzymujący (stosunek tkanki mięśniowej 1:5 do rozcieńczonego roztworu zatrzymującego) w probówce homogenizującej. 
		UWAGA: Dwadzieścia miligramów tkanki będzie wymagało 100 μl roztworu zatrzymującego, a 200 mg tkanki będzie wymagało 1000 μl roztworu zatrzymanego w probówce. Obecność detergentu w dodanym roztworze ma kluczowe znaczenie dla przerwania błon komórkowych. Można użyć dowolnego detergentu niejonowego, ale należy zadbać o to, aby sprawdzić, czy nie koliduje on z metodą chemiluminescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie tkanek
	<ol>
		<li>Wyjmij chusteczkę z zamrażarki o temperaturze -80 °C i powoli rozmrażaj w lodzie. Usuń pozostały tłuszcz i tkankę łączną z mięśni szkieletowych. Odetnij kawałki mięśni szkieletowych i osusz gazę do wyschnięcia.</li>
		<li>Odważyć ilość tkanki (20, 50 i 200 mg). Umieść wstępnie zważone mięśnie szkieletowe w roztworze zatrzymującym w probówkach homogenizacyjnych lub umieść wstępnie zważoną tkankę w czystej probówce do mikrowirówki do późniejszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Homogenizacja
<ol>
	<li>Homogenizator obrotowy (<klasa silna="xfig">Rysunek 1)
	<ol>
		<li>Umieść rurkę typu M zawierającą wstępnie zważony mięsień szkieletowy i odmierzony roztwór zatrzymujący do maszyny. Homogenizować każdą próbkę dwukrotnie (ustawiając najbardziej destrukcyjny cykl homogenizacji) i umieścić probówkę na lodzie natychmiast po każdej homogenizacji na 5 minut, aby ostygła.</li>
		<li>Odwirować krótko w temperaturze 2 000 × g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Umieścić pełną probówkę z powrotem na lodzie i dodać odpowiednią objętość metanolu (≥ 99,9 %, 10x masy tkanki). Dokładnie wirować przez 15 s. 
		UWAGA: Na 20 mg tkanki użyj 200 μl metanolu. Metanol służy do wytrącania białek z homogenatu tkankowego i nie koliduje z metodą chemiluminescencji. Jeśli stosowana jest inna metoda wytrącania białek, należy sprawdzić jej zgodność z chemiluminescencją.</li>
		<li>Ponownie przeprowadzić homogenizację i inkubować na lodzie przez 30 minut. Odwirowywać próbki przez 35 minut w temperaturze 4 °C i 3 500 × g. Zassać supernatant i zmierzyć poziom azotynów/azotanów lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenizator kulek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
	<ol>
		<li>Umieść tkankę mięśni szkieletowych w probówce zawierającej kulki (stosunek 1:5 dla tkanki: rozcieńczony roztwór zatrzymujący) i homogenizuj dwukrotnie przez 45 sekund z najwyższą prędkością dostępną dla używanego instrumentu. Umieść probówkę na lodzie natychmiast po każdej homogenizacji na 5 minut, aby ostygła.</li>
		<li>Krótko odwirować za pomocą małej wirówki biurkowej (2 000 x g) przez 5 sekund. Umieścić probówkę z powrotem na lodzie i dodać odpowiednią objętość metanolu (czystość ≥ 99,9 %, 10 razy więcej masy tkanki). Dokładnie wirować przez 15 s. 
		UWAGA 1: Na 20 mg tkanki należy użyć 200 μl metanolu. 
		UWAGA 2: Metanol służy do wytrącania białek z homogenatu tkankowego i nie koliduje z metodą chemiluminescencji. Jeśli stosowana jest inna metoda wytrącania białek, należy sprawdzić jej zgodność z chemiluminescencją.</li>
		<li>Homogenizować jeszcze raz przez 45 s z najwyższą prędkością dostępną w używanym urządzeniu. Inkubować na lodzie przez 30 minut. Wirować przy 17 000 x g, 4 °C, 30 min. Zassać supernatant i zmierzyć poziom azotynów/azotanów lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pulverizer (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
	<ol>
		<li>Przygotować probówki zawierające rozcieńczony roztwór zatrzymujący (5 razy więcej niż masa tkanki) i zważyć je. Zapisz masę (probówka + roztwór zatrzymujący).</li>
		<li>Umieść narzędzie do rozdrabniania ciekłego azotu na suchym lodzie i odczekaj około 30 minut, aż osiągnie żądaną temperaturę.</li>
		<li>Za pomocą pęsety schłodzonej w ciekłym azocie przenieś jedną próbkę (masa tkanki została już zmierzona) do rozdrabniacza. Dodaj małą łyżkę ciekłego azotu, aby upewnić się, że tkanka ma temperaturę ciekłego azotu.</li>
		<li>Po odparowaniu 95% ciekłego azotu umieść narzędzie do kruszenia na chusteczce i mocno dociśnij. Powinieneś poczuć, jak próbka się miażdży. Za pomocą młotka uderz w narzędzie do kruszenia 3-5x.</li>
		<li>Sprawdź próbkę pod kątem pozostałych kawałków za pomocą łyżki schłodzonej w ciekłym azocie. Po schłodzeniu w ciekłym azocie użyj kawałka bibuły, aby wytrzeć zamarzniętą wodę przed dotknięciem tkanki. Jeśli kawałek jest obecny, przesuń go do środka, a następnie uderz młotkiem jeszcze 5-6 razy.</li>
		<li>Gdy cała próbka zostanie sproszkowana, należy użyć łyżki chłodzonej ciekłym azotem, aby bezpośrednio przenieść rozdrobnioną tkankę do wstępnie zważonej probówki zawierającej rozcieńczony roztwór zatrzymujący (krok 3.3.1). Pamiętaj, aby wykonać ten krok szybko, ponieważ gdy zmiażdżony mięsień szkieletowy nagrzewa się, staje się lepki i trudny do przeniesienia.</li>
		<li>Wiruj przez 15 sekund. Sprawdź, czy żadna chusteczka nie utknęła w górnej części probówki, otwierając probówkę. Jeśli tak, spróbuj go usunąć, a następnie ponownie wiruj.</li>
		<li>Odwirowywać próbkę przez 2-3 sekundy za pomocą małej wirówki stołowej. Ponownie zważyć probówkę. Obliczyć masę tkanki, odejmując pierwotną masę rurki (krok 3.3.1) od tej nowej masy. Umieść probówkę na lodzie. 
		UWAGA: Dokładne wagi pomogą określić dokładną masę tkanki i ilość tkanki utraconej podczas proszkowania.</li>
		<li>Po przetworzeniu wszystkich próbek zgodnie z krokiem 3.3.8 dodać odpowiednią objętość metanolu (≥ 99,9 %, 10-krotność masy tkanki). Dokładnie wirować przez 15 s i inkubować na lodzie przez 30 min. 
		UWAGA: Na 20 mg tkanki użyj 200 μl metanolu. Metanol służy do wytrącania białek z homogenatu tkankowego i nie koliduje z metodą chemiluminescencji. Jeśli stosowana jest inna metoda wytrącania białek, należy sprawdzić jej zgodność z chemiluminescencją.</li>
		<li>Odwirować w temperaturze 17 000 × g, 4 °C, 30 min. Odessać supernatant i zmierzyć poziom azotynów/azotanów lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiar azotynów/azotanów za pomocą analizatora tlenku azotu (NOA)
<ol>
	<li>Przygotować wszystkie próbki za pomocą jednej z trzech różnych metod homogenizacji opisanych powyżej i wstrzyknąć je do NOA w celu pomiaru azotanów i azotynów. 
	UWAGA: Szczegółowe protokoły dotyczące stosowania NOA zostały opublikowane wcześniej19.</li>
</ol>

<ol><li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system%3A+a+historical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).</li>
<li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-arginine-nitric+oxide+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li>
<li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+lifetime+of+nitric+oxide%3A+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li>
<li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li>
<li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li>
<li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li>
<li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li>
<li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li>
<li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomach+NO+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502(1994).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans%3A+measurements+in+expelled+air%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li>
<li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li>
<li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans%3A+role+for+nitrite-derived+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li>
<li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).</li>
<li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li>
<li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+nitrate+store%3A+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li>
<li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Nitrite+and+Nitrate%2C+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway%2C+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879(2016).</li>
<li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li>
<li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li>
<li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li>
<li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA%28y%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów. Alan N. Schechter jest wymieniony jako współwynalazca w kilku patentach wydanych dla National Institutes of Health na stosowanie soli azotynów w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych. Otrzymuje tantiemy na podstawie licencji NIH na te patenty na rozwój kliniczny, ale nie otrzymuje żadnego innego wynagrodzenia. Ustalenia te nie mają wpływu na jego przestrzeganie zasad czasopisma JoVe.

Aby monitorować zmiany metabolitów NO, azotanów i azotynów, w funkcji interwencji fizjologicznych, konieczne jest zmierzenie poziomów tych jonów w różnych narządach, które mają kluczowe znaczenie w ich metabolizmie. Ponieważ hemoglobina we krwi będzie reagować z NO i jego metabolitami, ważne jest również, aby jak najszybciej usunąć krew z próbek tkanek. W ten sposób zwierzęta były perfundowane solą fizjologiczną przed pobraniem tkanek mięśni szkieletowych (pośladki, TA, EDL, mięsień brzuchaty łydki), a tkanka łączna i tł...

Tlenek azotu (NO), mała gazowa cząsteczka sygnałowa, odgrywa kluczową rolę w procesach fizjologicznych i patofizjologicznych1. NO może być wytwarzany z L-argininy przez endogenne enzymy z rodziny syntazy tlenku azotu (NOS) przed poddaniem szybkiemu utlenianiu do azotanu (NO3-) i ewentualnie azotynu (NO2-) we krwi i tkankach2,3. Ostatnio wykazano, że aniony te są zredukowane z powrotem do NO w systemach ssaków4. Azotany są przekształcane w azotyny, głównie przez komensalne bakteryjne reduktazy azotanowe w jamie ustnej, działające na jony wydzielane przez gruczoły ślinowe i bezpośrednio spożywane 5, a do pewnego stopnia przez enzymy ssaków, takie jak oksydoreduktaza ksantynowa6,7. Azotyn może być dalej redukowany do NO przez kilka mechanizmów, w tym deoksyhemoglobinę8, deoksymioglobinę9, enzymy zawierające molibden10, oraz nieenzymatyczną redukcję w obecności protonów11,12.
Ten szlak azotan-azotyn-NO jest wzmocniony w warunkach niedotlenienia, w których aktywność NOS jest zmniejszona, ponieważ NOS wymaga tlenu do wytwarzania NO4. Wiele ostatnich badań wykazało korzystny wpływ azotanów w diecie na regulację ciśnienia krwi i wydajność ćwiczeń, sugerując, że szlaki redukcji azotanów przyczyniają się do zwiększenia sygnalizacji NO13,14,15. Wcześniejsze badania wykazały, że niektóre mięśnie szkieletowe są prawdopodobnie głównymi miejscami magazynowania azotanów w organizmie16. W porównaniu z krwią lub innymi narządami wewnętrznymi, takimi jak wątroba, mięśnie szkieletowe (gluteus maximus) zawierają znacznie wyższy poziom azotanów i mają znaczną masę w ciele ssaka. Wykazano, że ćwiczenia na bieżni zwiększają redukcję azotanów do azotynów i do NO w pośladkach w modelu szczura7. Wyniki te sugerują, że niektóre mięśnie szkieletowe mogą być ważnymi źródłami NO poprzez szlaki redukcji azotanów w sytuacjach fizjologicznych. Nowsze badania sugerują, że te odkrycia, w tym zmiany poziomu azotanów w mięśniach podczas ćwiczeń, występują również u ludzi17.
Dwóch z obecnych autorów wcześniej ustaliło metodę pomiaru poziomu azotanów i azotynów w próbkach krwi i innych cieczy18. Jednak, gdy początkowo analizowano poziomy tych anionów w homogenatach tkankowych, szczegółowe protokoły nie były dostępne. Aby zrozumieć dynamikę azotanów-azotynów-NO w kilku różnych narządach, naszym celem było opracowanie dokładnej i wydajnej metody pomiaru poziomów azotanów i azotynów w tkankach ssaków, w tym w mięśniach szkieletowych. We wcześniejszych badaniach tkanki gryzoni wykorzystano do opracowania wiarygodnych procesów homogenizacji, a następnie do analizy zawartości azotanów i azotynów w tych homogenatach7,16,19. Zastosowanie tej metody homogenizacji zostało rozszerzone na próbki biopsji ludzkich mięśni szkieletowych, w wyniku czego wartości zostały potwierdzone i, co ważne, wartości obserwowane dla mięśni w porównaniu z krwią/osoczem były w podobnych zakresach i proporcjach do tych obserwowanych u gryzoni17. W ostatnich latach inne grupy również zaczęły mierzyć poziomy azotanów i azotynów w homogenatach mięśni szkieletowych, podając wartości porównywalne do tych zgłoszonych przez naszą grupę20,21.
Celem tego artykułu jest szczegółowe opisanie przygotowania homogenatów mięśni szkieletowych przy użyciu trzech różnych metod homogenizacji do późniejszego pomiaru poziomów azotanów i azotynów. Dodatkowo zbadano wpływ masy tkanki użytej do homogenizacji na wartości azotanów i azotynów w próbkach mięśni szkieletowych. Uważamy, że metody te można łatwo zastosować do innych typów tkanek ssaków. Ostatnio, zwłaszcza w dziedzinie fizjologii wysiłku fizycznego, zwrócono uwagę na możliwe różnice w fizjologii azotanów/azotynów/NO w zależności od grup mięśniowych. Podajemy również ilości azotanów i azotynów w czterech różnych mięśniach gryzoni i znajdujemy nierównomierny rozkład obu jonów w tych różnych mięśniach; Obserwacja, która wymaga dalszych badań.

<table><tbody><tr><td>dysocjator gentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>delikatna rurka MACS M</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td>Długość: 87 mm; Średnica: 30 mm</td></tr><tr><td>Heparyna Sodowa</td><td>Hospira</td><td>NDC-0409-7620-13</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>NDC-10019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>646377</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator kulkowy Minilys</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-etylomaleimid</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>Analizator tlenku azotu</td><td>GE</td><td>Sievers NOA 280i</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; Glikol 4-nonylofenylopolietylenowy</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu; K3Fe(CN)6</td><td>Zestaw</td><td></td> do lizowania Sigma 702587 <td></td></tr><tr><td>Precellys</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000911-LYSK0-A</td><td>zawiera 2 ml probówki z kulkami ceramicznymi (tlenek cyrkonu) o średnicy 2,8 mm do homogenizacji</td></tr><tr><td>Zestaw do rozdrabniania</td><td>Cellcrusher</td> Zestaw <td></td>do <td>rozdrabniania</td></tr></tbody></table>

przygotowanie homogenatów mięśni szkieletowych szczurów do pomiarów azotanów i azotynów

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Jony azotanowe (NO3-) były kiedyś uważane za obojętne produkty końcowe metabolizmu tlenku azotu (NO). Jednak wcześniejsze badania wykazały, że jony azotanowe mogą być przekształcane z powrotem w NO u ssaków poprzez dwuetapowy mechanizm redukcji: azotany są redukowane do azotynów (NO2-) głównie przez doustne bakterie komensalne, a następnie azotyny są redukowane do NO przez kilka mechanizmów, w tym przez białka zawierające hem lub molibden. Ten redukcyjny szlak azotanowy przyczynia się do wzmocnienia szlaków sygnałowych za pośrednictwem NO, szczególnie w układzie sercowo-naczyniowym i podczas ćwiczeń mięśniowych. Poziom azotanów w organizmie przed takim wykorzystaniem jest określany przez dwa różne źródła: endogenne utlenianie NO i spożycie azotanów w diecie, głównie z roślin. Aby wyjaśnić złożony cykl NO w warunkach fizjologicznych, zbadaliśmy dalej dynamikę jego metabolitów, jonów azotanowych i azotynowych, które są stosunkowo stabilne w porównaniu z NO. W poprzednich badaniach mięśnie szkieletowe zostały zidentyfikowane jako główny narząd magazynujący jony azotanowe u ssaków, a także bezpośrednie źródło NO podczas ćwiczeń. W związku z tym ważne jest ustanowienie wiarygodnej metodologii pomiaru poziomów azotanów i azotynów w mięśniach szkieletowych, która powinna być pomocna w rozszerzeniu jej zastosowania na inne próbki tkanek. W artykule szczegółowo wyjaśniono sposób przygotowania próbek mięśni szkieletowych przy użyciu trzech różnych metod homogenizacji do pomiarów azotanów i azotynów oraz omówiono ważne zagadnienia związane z procesami homogenizacji, w tym wielkość próbek. Porównano również stężenia azotanów i azotynów w czterech różnych grupach mięśni.

Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, wykorzystano tkankę mięśnia szkieletowego od 8 szczurów Wistar (samców i samic, masa ciała 250 ± 50 g). Homogenaty mięśni szkieletowych szczura (50 mg mięśnia pośladkowego większego dla każdej metody) przygotowano przy użyciu trzech różnych narzędzi do homogenizacji (homogenizatora rotacyjnego, homogenizatora kuleczkowego i pulweryzatora). Następnie zawartość azotanów i azotynów w tych homogenatach określono za pomocą analizatora tlenku azotu (NOA) (Rysunek 4</stro...

Przedstawiamy protokoły dla trzech różnych metod homogenizacji czterech różnych grup mięśni szkieletowych tkanki mięśniowej szczura do pomiaru i porównania poziomów azotanów i azotynów. Ponadto porównujemy różne masy próbek, aby zbadać, czy wielkość próbki tkanki wpływa na wyniki homogenizacji.

Przygotowanie homogenatów mięśni szkieletowych szczurów do pomiarów azotanów i azotynów

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Mięśnie szkieletowe służą jako główny rezerwuar azotanów, które po przekształceniu w azotyny służą jako źródło NO podczas ćwiczeń. W tym miejscu przedstawiamy metodologię pomiaru tych jonów w tkankach mięśniowych i innych. Na początek przygotuj roztwór konserwujący lub zatrzymujący azotany, łącząc 890-milimolowy żelazocyjanek potasu i 118-milimolowy n-metylomaleimid w wodzie destylowanej, upewniając się, że w roztworze nie pozostały żadne kryształy, a następnie dodaj niejonowy środek powierzchniowo czynny w stosunku 1 do 9 i delikatnie wymieszaj, aby uniknąć pienienia.Rozcieńczyć roztwór zatrzymujący w stosunku 1 do 9 wodą destylowaną i dodać rozcieńczony roztwór zatrzymujący do probówki homogenizacyjnej. Następnie rozmrozić poprzednią izolowaną i zamrożoną tkankę mięśniową szczura na lodzie. Po rozmrożeniu tkanki usuń pozostały tłuszcz i tkankę łączną z mięśni szkieletowych.Odetnij kawałki mięśni szkieletowych i osusz je na gazie do wyschnięcia. Odważyć odpowiednią ilość tkanki mięśni szkieletowych, a następnie umieścić tkankę o masie wstępnej w probówkach homogenizacyjnych zawierających roztwór zatrzymujący. W celu homogenizacji w homogenizatorze obrotowym należy umieścić w maszynie rurkę typu M zawierającą wstępnie zważony mięsień szkieletowy i odmierzony roztwór zatrzymujący.Homogenizować każdą próbkę dwukrotnie, a po każdej homogenizacji natychmiast umieścić probówkę na lodzie na 5 minut, aby ostygła. Po homogenizacji krótko odwirować probówkę. Umieść probówkę z powrotem na lodzie i dodaj odpowiednią ilość metanolu przed wirowaniem przez 15 sekund.Ponownie homogenizować próbkę i inkubować ją na lodzie przez 30 minut, następnie odwirować próbkę, zassać supernatant i przystąpić do pomiaru poziomu azotynów i azotanów. W celu homogenizacji kulek umieść tkankę mięśni szkieletowych w probówce zawierającej kulki i homogenizuj dwukrotnie przez 45 sekund z najwyższą prędkością dostępną na instrumencie. Po każdej homogenizacji natychmiast umieść probówkę na lodzie na 5 minut, aby ostygła, a następnie odwiruj probówkę, umieść probówkę z powrotem na lodzie i dodaj odpowiednią objętość metanolu przed wirowaniem przez 15 sekund.Ponownie homogenizować próbkę przez 45 sekund, a następnie inkubować ją na lodzie przez 30 minut. Odwirować próbkę, odessać supernatant i przystąpić do pomiaru poziomu azotynów i azotanów. Do homogenizacji na bazie rozdrabniacza należy przygotować probówki zawierające rozcieńczony roztwór zatrzymujący, a następnie zważyć i zapisać masę probówek.Po schłodzeniu narzędzia do rozdrabniania na suchym lodzie przez 30 minut, za pomocą pęsety schłodzonej w ciekłym azocie, przenieś wstępnie zważoną próbkę tkanki do rozdrabniacza, a następnie dodaj niewielką ilość ciekłego azotu, aby upewnić się, że tkanka ma temperaturę ciekłego azotu. Po odparowaniu 95% ciekłego azotu umieść narzędzie do kruszenia na chusteczce i mocno dociśnij, aby poczuć zgniecenie próbki, a następnie za pomocą młotka uderz w narzędzie do kruszenia 3 do 5 razy. Gdy cała próbka zostanie sproszkowana, za pomocą łyżki i pęsety chłodzonej ciekłym azotem, należy bezpośrednio przenieść rozdrobnioną tkankę do wstępnie zważonej probówki zawierającej rozcieńczony roztwór zatrzymujący.Następnie obracaj probówkę przez 15 sekund, a następnie otwórz probówkę, aby sprawdzić, czy w pokrywce nie utknęła chusteczka. Jeśli tak, spróbuj go usunąć, a następnie ponownie wiruj. Krótko odwirować próbkę przez 2 do 3 sekund.Ponownie zważ probówkę i oblicz masę tkanki, odejmując pierwotną wagę probówki od tej nowej masy. Umieść rurkę na lodzie. Dodać odpowiednią objętość metanolu do probówki i dokładnie wirować probówkę przez 15 sekund przed inkubacją na lodzie przez 30 minut, następnie odwirować próbkę, odessać supernatant i przystąpić do pomiaru poziomu azotynów i azotanów.Poziomy azotanów i homogenaty mięśni szkieletowych szczurów przygotowane przy użyciu homogenizatora obrotowego, homogenizatora kulkowego i rozdrabniacza były podobne. Co ciekawe, dla poziomów azotynów najwyższą wartość wykazała próbka homogenatu przygotowana przez rozdrabniacz, która różniła się statystycznie od pozostałych dwóch wartości próbki. Porównanie poziomów azotynów i azotanów w homogenatach pośladków przygotowanych z 20, 50 i 200 miligramów tkanki przy użyciu homogenizatora kulek wykazało, że ani poziomy azotanów, ani azotynów nie różniły się znacząco między wielkościami próbek mięśni.Porównanie poziomów azotanów w różnych tkankach mięśni szkieletowych nóg gryzoni wykazało, że mięsień pośladkowy miał około dwa razy wyższy poziom azotanów niż pozostałe trzy tkanki mięśniowe. Różnice te nie osiągnęły jednak istotności statystycznej. Podobnie jak w przypadku poziomów azotanów, stężenie azotanów w mięśniu pośladkowym było również wyższe niż w pozostałych trzech tkankach mięśniowych i było znacznie wyższe niż w próbce mięśnia brzuchatego łydki.Nasza metoda jest stosunkowo prosta i dobrze nadaje się do małych próbek, zachowując azotany i azotyny podczas przygotowywania próbki.

preparation-rat-skeletal-muscle-homogenates-for-nitrate-nitrite

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy przedstawiamy sposób wytwarzania konstruktów tkankowych na bazie kolagenu zawierających mioblasty szkieletowe. Te trójwymiarowe konstrukty inżynieryjne mogą być wykorzystywane do zastępowania lub naprawy tkanek in vivo. Na potrzeby naszych badań zaprojektowaliśmy je jako przekaźnik elektryczny przedsionkowo-komorowy do leczenia całkowitego bloku serca[1].

Wytwarzanie inżynieryjnych konstruktów tkanki mięśniowej

Opisujemy protokół izolacji czystych, silnie sprzężonych mitochondriów serca szczura do funkcjonalnych lub strukturalnych badań bioenergetyki komórkowej, pomiarów biofizycznych, proteomiki oraz analizy mitochondrialnego DNA i lipidów.

Przygotowanie silnie sprzężonych mitochondriów serca szczura

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Niniejszy film prezentuje chirurgiczne przygotowanie i procedury niezbędne do badania odpowiedzi skurczowej preparatu przyśrodkowej części mięśnia brzuchatego szczura in situ. Preparat ten umożliwia pomiar właściwości skurczowych mięśnia szkieletowego w warunkach fizjologicznych. Zwierzę zostaje poddane znieczuleniu, a mięsień zostaje oddzielony od otaczających go tkanek na jego końcu dystalnym. Ścięgno Achillesa zostaje przymocowane do przetwornika siły, co pozwala na pomiar odpowiedzi...

Procedury badania właściwości kurczliwych mięśni szkieletowych szczura in situ

Endogenna produkcja tlenku azotu (NO) reguluje szeroki wachlarz funkcji biologicznych. Coraz wyraźniej staje się jasne, że zaburzenia lub dysregulacja sygnalizacji opartej na NO są zaangażowane w wiele ludzkich chorób. Metody ilościowego oznaczania odpowiednich metabolitów NO mogą dostarczyć nowych diagnostycznych lub prognostycznych biomarkerów chorób ludzkich.

Techniki analityczne do badania bioaktywności tlenku azotu

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tlenek azotu (NO) jest ważną cząsteczką sygnałową w homeostazie naczyń krwionośnych. Produkcja in vivo NIE jest zbyt niska do bezpośredniego pomiaru. Chemiluminescencja dostarcza użytecznych informacji na temat cyklu NO poprzez pomiar jego prekursorów i produktów utleniania, azotynów i azotanów. Wyjaśniono oznaczanie azotynów / azotanów w tkankach i płynach ustrojowych.

Pomiar azotynów i azotanów, metabolitów na szlaku tlenku azotu, w materiałach biologicznych metodą chemiluminescencji

Tutaj prezentujemy protokół do szybkich analiz włókien mięśniowych, który pozwala na poprawę jakości barwienia, a tym samym na automatyczne pozyskiwanie i kwantyfikację populacji włókien za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania ImageJ.

Szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny

Nienaruszona regulacja wychwytu glukozy w mięśniach jest ważna dla utrzymania homeostazy glukozy w całym organizmie. Protokół ten przedstawia ocenę wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych przy jednoczesnym określeniu wpływu różnych interwencji fizjologicznych na metabolizm glukozy w całym organizmie.

Pomiar wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych myszy

Naucz się przygotowywać homogenaty mięśni szkieletowych szczurów do pomiarów azotanów i azotynów. Protokół zapewnia dokładną kwantyfikację metabolitów tlenku azotu w małych próbkach tkankowych.

Przygotowanie homogenatów mięśni szkieletowych szczurów do pomiarów azotanów i azotynów

Przeglądaj więcej filmów