Name: mirMachine: punkt kompleksowej obsługi adnotacji miRNA roślin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Poznaj automatyczny potok mirMachine do identyfikacji znanych i nowych miRNA w roślinach z wysoką czułością. To narzędzie bioinformatyczne przewyższa istniejące algorytmy w dokładności predykcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Zależności oprogramowania i instalacja
<ol>
	<li>Zainstaluj zależności oprogramowania z witryny głównej lub przy użyciu narzędzia conda.
	<ol>
		<li>Pobierz i zainstaluj Perla, jeśli nie jest jeszcze zainstalowany, z jego strony głównej (https://www.perl.org/get.html). 
		UWAGA: Reprezentowane wyniki zostały przewidziane przy użyciu Perla v5.32.0.</li>
		<li>Pobierz Blast+, program wyrównujący, ze swojej strony domowej (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279671/) jako plik wykonywalny i jako kod źródłowy. 
		UWAGA: Reprezentowane wyniki zostały przewidziane przy użyciu BLAST 2.6.0+.</li>
		<li>Zainstaluj prekompilowany pakiet RNAfold z https://www.tbi.univie.ac.at/RNA/.</li>
		<li>Alternatywnie zainstaluj te oprogramowanie za pomocą następującej konfiguracji: i) conda install -c bioconda blast; ii) conda install -c bioconda viennarna.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Konfiguracja i testowanie mirMachine
<ol>
	<li>Pobierz najnowszą wersję skryptów mirMachine i skryptu przesyłania mirMachine z usługi GitHub https://github.com/hbusra/mirMachine.git, a następnie ustaw ścieżkę skryptów w PATH.</li>
	<li>Skorzystaj z danych testowych udostępnionych na GitHubie, aby upewnić się, że mirMachine wraz ze wszystkimi jego zależnościami został poprawnie pobrany.</li>
	<li>Uruchom mirMachine na danych testowych pokazanych poniżej. 
	bash mirMachine_submit.sh -f iwgsc_v2_chr5A.fasta -i mature_high_conf_v22_1.fa.filtered.fasta -n 10 
	UWAGA: Ustaw opcję -n na 10, ponieważ dane testowe zawierają tylko jeden chromosom genomu pszenicy. Domyślnie opcja -n jest ustawiona na 20.</li>
	<li>Kontroluj pliki wyjściowe hairpins.tbl.out.tbl dla przewidywanych dojrzałych miRNA, ich przewidywanych prekursorów i ich lokalizacji na chromosomach.</li>
	<li>Sprawdź pliki dziennika pod kątem danych wyjściowych i ostrzeżeń programu.</li>
</ol>
3. Identyfikacja miRNA na podstawie homologii
<ol>
	<li>Uruchom mirMachine za pomocą skryptu bash pokazanego poniżej: 
	bash mirMachine_submit.sh -f plik_$genome -i plik_$input -m $mismatches -n $number_trafień</li>
	<li>Sprawdź przewidywane miRNA. Znajdź plik wyjściowy o nazwie $input_file.results.tbl.hairpins.tbl.out.tbl dla przewidywanych miRNA. Znajdź plik wyjściowy o nazwie $input_file.results.tbl.hairpins.fsa dla sekwencji pre-miRNA FASTA. Znajdź plik wyjściowy o nazwie $input_file.results.tbl.hairpins.log dla pliku dziennika spinki do włosów.</li>
</ol>
4. Identyfikacja nowego miRNA
<ol>
	<li>Wstępnie przetwórz pliki sRNA-seq FASTQ do odpowiedniego formatu FASTA. W razie potrzeby przytnij adaptery. Nie przycinaj odczytów o niskiej jakości; zamiast tego usuń je. Usuń odczyty zawierające N. Przekonwertuj plik FASTQ na plik FASTA ($input_plik).</li>
	<li>Uruchom mirMachine za pomocą skryptu bash pokazanego poniżej. 
	bash mirMachine_submit.sh -f plik_$genome -i plik_$input -n $number_z_trafień -sRNAseq -lmax $lmax -lmin $lmin -rpm $rpm 
	UWAGA: $mismatches została ustawiona na 0 dla prognoz opartych na sekwencji sRNA.</li>
	<li>Sprawdź przewidywane miRNA. Znajdź plik wyjściowy o nazwie $input_file.results.tbl.hairpins.tbl.out.tbl dla przewidywanych miRNA. Znajdź plik wyjściowy o nazwie $input_file.results.tbl.hairpins.fsa dla sekwencji pre-miRNA FASTA. Znajdź plik wyjściowy o nazwie $input_file.results.tbl.hairpins.log dla pliku dziennika spinki do włosów.</li>
</ol>
5. Zaawansowane parametry
UWAGA: Wartości domyślne są zdefiniowane dla wszystkich parametrów z wyjątkiem pliku genomu i pliku wejściowego miRNA.
<ol>
	<li>Ustaw opcję -db na bazę danych blast, aby pominąć bazę danych odwołania do budynku w potoku.</li>
	<li>Ustaw opcję -m na dozwoloną liczbę niezgodności. 
	UWAGA: Domyślnie opcja -m była ustawiona na 1 dla przewidywań opartych na homologii i 0 dla przewidywań opartych na sekwencjach sRNA.</li>
	<li>Ustawia -n na liczbę trafień do wyeliminowania po wyrównaniu (domyślnie 20). Zmień to w zależności od gatunku.</li>
	<li>Użyj -long , aby ocenić struktury drugorzędne dla listy podejrzanych.</li>
	<li>Użyj -s, aby aktywować nowe przewidywanie miRNA na podstawie danych sekwencyjnych sRNA.</li>
	<li>Ustaw opcję -lmax na maksymalną długość odczytów sekwencyjnych sRNA, które mają być uwzględnione w badaniu przesiewowym.</li>
	<li>Ustaw opcję -lmax na minimalną długość odczytów sekwencji sRNA, które mają być uwzględnione w badaniu przesiewowym.</li>
	<li>Użyj opcji -rpm, aby ustawić próg odczytów na milion (RPM). 
	UWAGA: W przypadku zaawansowanych parametrów, takich jak długość pri-miRNA/pre-miRNA, doświadczeni użytkownicy są zachęcani do modyfikowania skryptów dla swoich interesujących ich badań. Dodatkowo, jeśli użytkownicy zamierzają pominąć niektóre kroki lub wolą używać zmodyfikowanych danych wyjściowych, skrypt przesyłania można zmodyfikować, po prostu dodając # na początku wierszy, aby pominąć te wiersze.</li>
</ol>

<ol><li>Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+biogenesis%2C+and+activity+of+plant+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs.</a> Cell. 136 (4), 669-687 (2009).</li>
<li>Budak, H., Akpinar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+miRNAs%3A+biogenesis%2C+organization+and+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+%26+Integrative+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plant miRNAs: biogenesis, organization and origins.</a> Functional & Integrative Genomics. 15 (5), 523-531 (2015).</li>
<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+plant+MIR168a+specifically+targets+mammalian+LDLRAP1%3A+evidence+of+cross-kingdom+regulation+by+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA.</a> Cell Research. 22 (1), 107-126 (2012).</li>
<li>Pang, K. C., Frith, M. C., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+noncoding+RNAs%3A+Lack+of+conservation+does+not+mean+lack+of+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of noncoding RNAs: Lack of conservation does not mean lack of function.</a> Trends in Genetics. 22 (1), 1-5 (2006).</li>
<li>Guleria, P., Mahajan, M., Bhardwaj, J., Yadav, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+small+RNAs%3A+biogenesis%2C+mode+of+action+and+their+roles+in+abiotic+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%2C+Proteomics+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Plant small RNAs: biogenesis, mode of action and their roles in abiotic stresses.</a> Genomics, Proteomics and Bioinformatics. 9 (6), 183-199 (2011).</li>
<li>Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+their+regulatory+roles+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and their regulatory roles in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+small+RNAs%3A+advancement+in+the+understanding+of+biogenesis+and+role+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Plant small RNAs: advancement in the understanding of biogenesis and role in plant development.</a> Planta. 248 (3), 545-558 (2018).</li>
<li>Lucas, S. J., Budak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+the+wheat+from+the+chaff%3A+identifying+miRNAs+in+genomic+survey+sequences+of+Triticum+aestivum+chromosome+1AL%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Sorting the wheat from the chaff: identifying miRNAs in genomic survey sequences of Triticum aestivum chromosome 1AL.</a> PloS One. 7 (7), 40859(2012).</li>
<li>Li, S., Castillo-González, C., Yu, B., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+plant+small+RNAs+in+development+and+in+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The functions of plant small RNAs in development and in stress responses.</a> Plant Journal. 90 (4), 654-670 (2017).</li>
<li>Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+maturation%3A+Stepwise+processing+and+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization.</a> EMBO Journal. 21 (17), 4663-4670 (2002).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+genes+are+transcribed+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II.</a> EMBO Journal. 23 (2), 4051-4060 (2004).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+Genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+RNase+III+Drosha+initiates+microRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing.</a> Nature. 425 (6956), 415-419 (2003).</li>
<li>Meyers, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Criteria+for+annotation+of+plant+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Criteria for annotation of plant microRNAs.</a> Plant Cell. 20 (12), 3186-3190 (2008).</li>
<li>Sanei, M., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+microRNA+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of microRNA turnover.</a> Current Opinion in Plant Biology. 27, 199-206 (2015).</li>
<li>Li, J., Yang, Z., Yu, B., Liu, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+protects+miRNAs+and+siRNAs+from+a+3%E2%80%B2-end+uridylation+activity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Methylation protects miRNAs and siRNAs from a 3′-end uridylation activity in Arabidopsis.</a> Current Biology. 15 (16), 1501-1507 (2005).</li>
<li>Rogers, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+turnover%2C+and+mode+of+action+of+plant+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, turnover, and mode of action of plant microRNAs.</a> Plant Cell. 25 (7), 2383-2399 (2013).</li>
<li>Axtell, M. J., Meyers, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+criteria+for+plant+microRNA+annotation+in+the+Era+of+big+data%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting criteria for plant microRNA annotation in the Era of big data.</a> Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%2B%3A+architecture+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 421(2009).</li>
<li>Markham, N. R. N., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNAFold%3A+Software+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">UNAFold: Software for nucleic acid folding and hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 453, 3-31 (2008).</li>
<li>Alptekin, B., Akpinar, B. A., Budak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+prescription+for+plant+miRNA+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A comprehensive prescription for plant miRNA identification.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 2058(2017).</li>
<li>Zhang, B., Pan, X., Cannon, C. H., Cobb, G. P., Anderson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+divergence+of+plant+microRNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Conservation and divergence of plant microRNA genes.</a> Plant Journal. 46 (2), 243-259 (2006).</li>
<li>Appels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifting+the+limits+in+wheat+research+and+breeding+using+a+fully+annotated+reference+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome.</a> Science. 361 (6403), 7191(2018).</li>
<li>Wang, Y., Kuang, Z., Li, L., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioinformatics+pipeline+to+accurately+and+efficiently+analyze+the+microRNA+transcriptomes+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A bioinformatics pipeline to accurately and efficiently analyze the microRNA transcriptomes in plants.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e59864(2020).</li>
<li>Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRBase%3A+Annotating+high+confidence+microRNAs+using+deep+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MiRBase: Annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 42, 68-73 (2014).</li>
<li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ViennaRNA+Package+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Algorithms+for+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ViennaRNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).</li>
<li>Wicker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+transposable+elements+on+genome+structure+and+evolution+in+bread+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of transposable elements on genome structure and evolution in bread wheat.</a> Genome Biology. 19 (1), 103(2018).</li>
<li>Flavell, R. B., Bennett, M. D., Smith, J. B., Smith, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+size+and+the+proportion+of+repeated+nucleotide+sequence+DNA+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome size and the proportion of repeated nucleotide sequence DNA in plants.</a> Biochemical Genetics. 12 (4), 257-269 (1974).</li>
<li>Wicker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repetitive+landscape+of+the+5100+Mbp+barley+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">The repetitive landscape of the 5100 Mbp barley genome.</a> Mobile DNA. 8, 22(2017).</li>
<li>Yang, Q., Ye, Q. A., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+siRNA+production+from+repetitive+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanism of siRNA production from repetitive DNA.</a> Genes and Development. 29 (5), 526-537 (2015).</li>
<li>Lam, J. K. W., Chow, M. Y. T., Zhang, Y., Leung, S. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+versus+miRNA+as+therapeutics+for+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">siRNA versus miRNA as therapeutics for gene silencing.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4 (9), 252(2015).</li>
<li>Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+directing+siRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs directing siRNA biogenesis.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 12 (7), 569-571 (2005).</li>
<li>Meng, Y., Shao, C., Wang, H., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+all+the+miRBase-registered+microRNAs+true%3F+A+structure-+and+expression-based+re-examination+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Are all the miRBase-registered microRNAs true? A structure- and expression-based re-examination in plants.</a> RNA Biology. 9 (3), 249-253 (2012).</li>
<li>Berezikov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+flux+of+canonical+microRNAs+and+mirtrons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary flux of canonical microRNAs and mirtrons in Drosophila.</a> Nature Genetics. 42 (1), author reply 9-10 6-9 (2010).</li>
</ol>

Nasz rurociąg miRNA, SUmir, był używany do identyfikacji wielu roślinnych miRNA w ciągu ostatniej dekady. W tym miejscu opracowaliśmy nowy, w pełni zautomatyzowany i ogólnodostępny potok identyfikacji i adnotacji miRNA, mirMachine. Co więcej, wiele rurociągów identyfikacji miRNA, w tym między innymi poprzedni rurociąg, było zależnych od oprogramowania UNAfold21, które z czasem stało się oprogramowaniem komercyjnym, chociaż kiedyś było swobodnie dostępne. Ta nowa i w pełni zautomatyzowana maszyna m...

Postępy w technologiach sekwencjonowania nowej generacji poszerzyły zrozumienie struktur RNA i elementów regulatorowych, ujawniając funkcjonalnie ważne niekodujące RNA (ncRNA). Wśród różnych typów ncRNA, mikroRNA (miRNA) stanowią podstawową klasę regulatorową małych RNA o długości od 19 do 24 nukleotydów w roślinach1,2. Od czasu odkrycia pierwszego miRNA u nicienia Caenorhabditis elegans3, obecność i funkcje miRNA były szeroko badane również w genomach zwierzęcych i roślinnych4,5,6. miRNA działają poprzez celowanie w mRNA w celu rozszczepienia lub represji translacyjnej7. Zgromadzone dowody wykazały również, że miRNA są zaangażowane w szeroki zakres procesów biologicznych w roślinach, w tym we wzroście i rozwoju8, autobiogenezie9 oraz kilku biotycznych i abiotycznych reakcjach na stres10.
U roślin miRNA są początkowo przetwarzane z długich pierwotnych transkryptów zwanych pri-miRNAs11. Te pri-miRNA generowane przez polimerazę RNA II wewnątrz jądra są długimi transkryptami tworzącymi niedoskonałą strukturę składania12. Pri-miRNA przechodzą później proces rozszczepienia w celu wytworzenia endogennych jednoniciowych (ss) prekursorów spinki do włosów miRNA, zwanych pre-miRNAs11. Pre-miRNA tworzy strukturę podobną do spinki do włosów, w której pojedyncza nić składa się w strukturę dwuniciową, aby wyciąć dupleks miRNA (miRNA/miRNA*)13. Białko podobne do dicera przecina obie nici dupleksu miRNA/miRNA*, pozostawiając 2-nukleotydowe 3'-zwisające14,15. Duplex miRNA jest metylowany wewnątrz jądra, co chroni koniec 3' miRNA przed degradacją i aktywnością urydylacyjną16,17. Helikaza rozwija metylowany dupleks miRNA po eksporcie i wystawia dojrzałe miRNA na działanie indukowanego RNA kompleksu wyciszającego (RISC) w klasie cytozolu<sup="xref">18. Jedna nić dupleksu to dojrzałe miRNA włączone do RISC , podczas gdy druga nić, miRNA *, jest zdegradowana. Kompleks miRNA-RISC wiąże się z sekwencją docelową, prowadząc do degradacji mRNA w przypadku pełnej komplementarności lub represji translacyjnej w przypadku częściowej komplementarności13.
Na podstawie cech ekspresji i biogenezy, opisano wytyczne dotyczące adnotacji miRNA15,19. Mając zdefiniowane wytyczne, Lucas i Budak opracowali potok SUmir w celu przeprowadzenia opartej na homologii identyfikacji miRNA in silico w roślinach9. Pipeline SUmir składał się z dwóch skryptów: SUmirFind i SUmirFold. SUmirFind przeprowadza wyszukiwanie podobieństw w znanych zestawach danych miRNA za pomocą narzędzia National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search (BLAST) ze zmodyfikowanymi parametrami, aby uwzględnić trafienia z tylko 2 lub mniej niezgodnościami i uniknąć stronniczości w kierunku krótszych trafień (blastn-short-ungapped -kara -1 -nagroda 1). SUmirFold ocenia drugorzędową strukturę przypuszczalnych sekwencji miRNA z wyników BLAST20 przy użyciu UNAfold21. SUmirFold odróżnia miRNA od małych interferujących RNA poprzez identyfikację cech charakterystycznych struktury spinki do włosów. Ponadto odróżnia miRNA od innych ssRNA, takich jak tRNA i rRNA, parametrami, minimalnym wskaźnikiem energii krotności > 0,67 i zawartością GC 24-71%. Ten potok został niedawno zaktualizowany poprzez dodanie dwóch dodatkowych kroków w celu (i) zwiększenia czułości, (ii) zwiększenia dokładności adnotacji oraz (iii) zapewnienia genomowej dystrybucji przewidywanych genów miRNA22. Biorąc pod uwagę wysoką konserwację sekwencji miRNA roślin23, ten potok został pierwotnie zaprojektowany do przewidywania miRNA opartego na homologii. Nowe miRNA nie mogły być jednak dokładnie zidentyfikowane za pomocą tej analizy bioinformatycznej, ponieważ w dużej mierze opierała się ona na zachowaniu sekwencji miRNA między blisko spokrewnionymi gatunkami.
Ten artykuł przedstawia nowy i w pełni zautomatyzowany potok miRNA, mirMachine, który 1) może dokładniej identyfikować znane i nowe miRNA (na przykład, teraz wykorzystuje nowe prognozy miRNA oparte na sRNA-seq, jak również identyfikację miRNA opartą na homologii) i 2) jest w pełni zautomatyzowany i swobodnie dostępny. Wyniki obejmowały również rozkłady genomowe przewidywanych miRNA. mirMachine został przetestowany zarówno pod kątem przewidywań opartych na homologii, jak i sekwencjonowaniu sRNA w genomach pszenicy i rzodkiewnika. Chociaż początkowo wydany jako wolne oprogramowanie, UNAfold stał się oprogramowaniem komercyjnym w ostatniej dekadzie. Dzięki tej aktualizacji narzędzie do przewidywania struktury wtórnej zostało zmienione z UNAfold na RNAfold, dzięki czemu mirMachine może być swobodnie dostępny. Użytkownicy mogą teraz wykonać krótki skrypt przesyłania, aby uruchomić w pełni zautomatyzowany potok mirMachine (przykłady znajdują się na stronie https://github.com/hbusra/mirMachine.git).

<table><tbody><tr><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279671/</td><td></td><td></td> <td>Blast+</td></tr><tr><td>https://github.com/hbusra/mirMachine.gitmirSkrypt</td><td></td><td></td> <td>zgłoszeniowy maszyny</td></tr><tr><td>https://www.perl.org/get.html</td><td></td><td></td><td>Perl</td></tr><tr><td>https://www.tbi.univie.ac.at/RNA/</td><td></td><td></td> <td>RNAfold</td></tr><tr><td>Arabidopsis TAIR10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triticum aestivum (pszenica, IWGSC RefSeq v2)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mirmachine: punkt kompleksowej obsługi adnotacji mirna roślin

mirMachine: A One-Stop Shop for Plant miRNA Annotation

Spośród różnych typów niekodujących RNA, mikroRNA (miRNA) były prawdopodobnie w centrum uwagi w ciągu ostatniej dekady. Jako potranskrypcyjne regulatory ekspresji genów, miRNA odgrywają kluczową rolę w różnych szlakach komórkowych, w tym zarówno w rozwoju, jak i odpowiedzi na stres a/biotyczny, taki jak susza i choroby. Posiadanie wysokiej jakości referencyjnych sekwencji genomu umożliwiło identyfikację i adnotację miRNA u kilku gatunków roślin, w przypadku których sekwencje miRNA są wysoce konserwatywne. Ponieważ obliczeniowe procesy identyfikacji i adnotacji miRNA są w większości procesami podatnymi na błędy, przewidywania oparte na homologii zwiększają dokładność przewidywania. W ciągu ostatniej dekady opracowaliśmy i udoskonaliliśmy potok adnotacji miRNA, SUmir, który od tego czasu jest używany w kilku genomach roślinnych. 
To badanie przedstawia w pełni zautomatyzowany, nowy potok miRNA, mirMachine (miRNA Machine), poprzez (i) dodanie dodatkowego kroku filtrowania do przewidywań struktury drugorzędowej, (ii) uczynienie go w pełni zautomatyzowanym, oraz (iii) wprowadzenie nowych opcji do przewidywania znanych miRNA na podstawie homologii lub nowych miRNA opartych na odczytach sekwencjonowania małych RNA przy użyciu poprzedniego potoku. Nowy rurociąg miRNA, mirMachine, został przetestowany przy użyciu The Arabidopsis Information Resource, TAIR10, wydania genomu Arabidopsis i genomu referencyjnego pszenicy v2 Międzynarodowego Koncjum Sekwencjonowania Genomu Pszenicy (IWGSC).

Opisany powyżej rurociąg analityczny miRNA, mirMachine, został zastosowany do danych testowych w celu szybkiej oceny wydajności tego narzędzia. Przesiewowo analizowano wyłącznie roślinne miRNA o wysokim stopniu wiarygodności, zdeponowane w bazie miRBase v22.1, w odniesieniu do chromosomu 5A genomu referencyjnego pszenicy IWGSC RefSeq v224. Narzędzie mirMachine_find zwróciło 312 trafień dla nieredundantnej listy 189 miRNA o wysokim stopniu wiarygodności, przy dopuszczalnym maksymalnie 1 niedopasowa...

Prezentujemy nowy i w pełni zautomatyzowany potok miRNA, mirMachine, który 1) może dokładniej identyfikować znane i nowe miRNA oraz 2) jest w pełni zautomatyzowany i swobodnie dostępny. Użytkownicy mogą teraz wykonać krótki skrypt przesyłania, aby uruchomić w pełni zautomatyzowany potok mirMachine.

mirMachine: punkt kompleksowej obsługi adnotacji miRNA roślin

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of ...

Identyfikacja obliczeniowa mikro RNA daje wysoką liczbę fałszywie dodatnich prognoz. Dzięki ostatnim aktualizacjom mirMachine zapewnia wysoką czułość i swoistość w znanych i nowatorskich przewidywaniach mikro RNA. Udowodniono, że MirMachine jest lepszy od najnowszych algorytmów mikro RNA pod względem czułości, a mirMachine jest teraz w pełni zautomatyzowany i swobodnie dostępny, dzięki czemu każdy może z niego korzystać zgodnie z dostarczonymi instrukcjami.MirMachine może przewidywać rozkład domniemanych mikro RNA w całym genomie bez ograniczania danych specyficznych dla tkanek i warunków. Dostępność wstępnych danych przed eksperymentem sekwencjonowania msRNA przyspieszyłaby proces weryfikacji ważnych genów mikro RNA. Przed skonfigurowaniem komputera pobierz i zainstaluj zależności oprogramowania z odpowiednich stron głównych, korzystając z linków w rękopisie tekstowym.Alternatywnie, łatwiejszym i szybszym sposobem zainstalowania zależności oprogramowania jest użycie conduct za pomocą poleceń podanych w manuskrypcie tekstowym. Pobierz najnowszą wersję skryptów mirMachine, zwykłego skryptu przesyłania maszyn z GitHub. Następnie ustaw ścieżkę skryptów na karcie ścieżki.Upewnij się, że mirMachine i jego zależności zostały poprawnie pobrane, uruchamiając mirMachine na danych testowych z GitHub. Sprawdź status zadania na ekranie za pomocą standardowego strumienia wyjściowego. Gdy pojawi się cały gotowy tekst, kontroluj pliki wyjściowe.Kontroluj spinki do włosów kropka TBL kropka out kropka TBL pliki wyjściowe. Zwróć uwagę na dojrzałe sekwencje gwiazd miRNA pre miRNA i miRNA na drugiej, trzeciej i szóstej kolumnie. Znajdź lokalizację przewidywanych miRNA na chromosomach na końcu każdej linii.Następnie sprawdź pliki dziennika pod kątem danych wyjściowych i ostrzeżeń programu. W celu identyfikacji opartej na homologii uruchom mirMachine za pomocą skryptu bash i sprawdź przewidywane mRNA. Znajdź plik wyjściowy dla dojrzałych miRNA i najszybszych sekwencji pre miRNA, a także plik wyjściowy dla pliku dziennika spinki do włosów.Aby zidentyfikować nowe miRNA, należy wstępnie przetworzyć pliki sRNA-seq Fast Q do odpowiedniego formatu FASTA. Przytnij adaptery i usuń odczyty o niskiej jakości, takie jak te zawierające N, ponieważ wstępne przetwarzanie odczytów sRNA-seq nie jest częścią mirMachine. Wybierz stabilne narzędzie do przycinania i parametry przycinania dla przesłanych danych.Przekonwertuj plik FASTQ na plik FASTA jako plik wejściowy. Jeśli podany jest plik tabeli obfitości, należy użyć skryptu modyfikującego dostarczonego ze skryptami mirMachine, aby przekonwertować plik tabeli na odpowiednie dane wejściowe FAPSA. Następnie uruchom mirMachine za pomocą skryptu bash.Sprawdź przewidywane miRNA. Znajdź plik wyjściowy dla przewidywanych sekwencji mRNA i prem miRNA FASTA oraz plik wyjściowy dla pliku dziennika spinki do włosów. Ustaw opcję dash DB na bazę danych blast, aby pominąć bazę danych odwołania do budynku w potoku.Ustaw opcję myślnika M na dozwoloną liczbę niezgodności, a kreskę N na liczbę trafień do wyeliminowania po wyrównaniu. Zmień to w zależności od gatunku. Użyj kreski długiej, aby ocenić struktury drugorzędowe dla listy podejrzanych, a kreski jako, aby aktywować nowe przewidywanie miRNA na podstawie danych sekwencyjnych sRNA.Ustaw opcję kreski L max na maksymalną długość odczytów sekwencji S RNA, które mają być uwzględnione w badaniu przesiewowym, a opcję kreski L min na minimalną długość odczytów sekwencyjnych sRNA, które mają być w badaniu przesiewowym. Użyj opcji kreski RPM, aby ustawić próg odczytów na milion. W analizie reprezentatywnej.Przedstawiono rozkład rodzin mRNA z chromosomu piątego A pszenicy IWGSC. Najliczniej reprezentowaną grupą mRNA był miR9666 z 18 zidentyfikowanymi miRNA. Wydajność mirMachine w odniesieniu do Arabidopsis thaliana i gatunków pszenicy w porównaniu z miRDP2.Porównanie czułości i liczby dwóch pozytywnych wyników wykazało, że mirMachine przewyższył miRDP2 w danych dotyczących Arabidopsis. W przypadku danych dotyczących pszenicy prognoza oparta na homologii mirMachine z dowodami ekspresji zapewniła lepszą czułość niż miRDP2. W przypadku obu genomów miRDP2 przewidywał większą liczbę prawdziwie dodatnich wyników niż przewidywania oparte na sekwencjach sRNA i homologii.Zainstalowanie wymaganej aplikacji może być uciążliwe dla niedoświadczonego użytkownika. Pomocne byłoby postępowanie zgodnie z tym samouczkiem wideo. Wizualizacja procesu instalacji zachęci badaczy niezajmujących się obliczeniami do zagłębienia się w podstawowe obliczenia.Ponadto zbadanie plików wyjściowych w filmie z pewnością pomoże użytkownikom zinterpretować ich wyniki.

mirmachine-a-one-stop-shop-for-plant-mirna-annotation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano prostą procedurę przeprowadzania niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA. Kroki obejmują izolację RNA, znakowanie RNA i DNA referencyjnego, hybrydyzację próbek z mikromacierzami, skanowanie mikromacierzy oraz kwantyfikację i analizę sygnałów hybrydyzacji.

Przeprowadzanie niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA

Ten artykuł opisuje procedurę identyfikacji i charakterystyki rodziny genów w winorośli zastosowanej do rodziny Arabidopsis Tóxicos w ligazach ubikwityny Levadura (ATL) E3.

Kompleksowy przepływ pracy do metaanalizy identyfikacji i ekspresji całego genomu rodziny genów ligazy ubikwityny ATL E3 w winorośli

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół efektywnego wykonywania homo- i heterograftów między tykwą arbuza a tykwy butelkowej, oprócz metod pobierania próbek, generowania i analizy danych, do badania mikroRNA reagujących na zimno.

Generowanie homo- i heteroprzeszczepów między arbuzem a tykwą butelkową w celu badania mikroRNA reagujących na zimno

Rurociąg bioinformatyczny, a mianowicie miRDeep-P2 (w skrócie miRDP2), z aktualnymi kryteriami miRNA roślin i przebudowanym algorytmem, mógłby dokładnie i efektywnie analizować transkryptomy mikroRNA u roślin, szczególnie dla gatunków o złożonych i dużych genomach.

Rurociąg bioinformatyczny do dokładnej i wydajnej analizy transkryptomów mikroRNA w roślinach

Tutaj opisujemy krok po kroku strategię izolowania małych RNA, wzbogacania mikroRNA i przygotowywania próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Następnie opisujemy, jak przetwarzać odczyty sekwencji i dopasowywać je do mikroRNA za pomocą narzędzi open source.

Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Opisany tutaj jest protokół charakteryzujący moduły biologicznie synergicznych miRNA i ich łączenie w krótkie transgeny, co pozwala na jednoczesną nadekspresję dla zastosowań terapii genowej.

Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej

Ta metoda demonstruje użycie techniki północnej hybrydyzacji do wykrywania miRNA z całkowitego ekstraktu RNA.

Analiza plam RNA w celu wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj automatyczny potok mirMachine do identyfikacji znanych i nowych miRNA w roślinach z wysoką czułością. To narzędzie bioinformatyczne przewyższa istniejące algorytmy w dokładności predykcji.

mirMachine: punkt kompleksowej obsługi adnotacji miRNA roślin

Przeglądaj więcej filmów