Tworzenie i manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów

Wątroba jest największym narządem u ssaków. Odgrywa bardzo ważną rolę w metabolizmie i detoksykacji. Chociaż wątroba ma niezwykłe zdolności regeneracji in vitro, hodowla hepatocytów in vitro jest nadal bardzo dużym wyzwaniem na dłuższą metę.

Tutaj ustalamy organoidy hepatocytów z dojrzałych hepatocytów. Zachowuje główne cechy hepatocytów w morfologii i funkcji. W tym filmie przedstawimy, jak hodować i pasować te organoidy oraz jak szczegółowo przeprowadzić genetyczną modyfikację tych organoidów.

Po pierwsze, perfuzja i trawienie wątroby. Przygotuj wszystkie regiony i instrumenty i spraw, aby były sterylne. Umyj mysz i otwórz naskórek i skórę, a następnie spróbuj znaleźć woreczek z wątrobą.

Wstrzyknij do niego igły, a następnie uchwyć to. Wykonuj perfuzję z prędkością pięciu mililitrów na minutę, aż wątroba stanie się blada. Przełóż je do buforu perfuzyjnego, ułóż ostrożnie, obserwuj wątrobę, aż stanie się miękka.

Zwykle zajmuje to od trzech do pięciu minut, następnie pokrój wątrobę i włóż ją do talerzy, a nożyczkami pokrój na małe kawałki. Często poruszaj go w górę iw dół. Zwykle przekształcenie ich w pojedynczą komórkę zajmuje od 10 do 15 minut.

A następnie napędzaj go w górę iw dół przez 10 do 15 minut i przepuszczaj je przez monter. Przekształć je w pojedyncze komórki. Zbierz wszystkie komórki w probówce o pojemności 50 mililitrów i odwiruj je z prędkością, a następnie zbierz wszystkie na płytki.

Staraj się trzymać je zawsze w zimnym lodzie. Zrób zawiesiny pojedynczych komórek i policz je za pomocą licznika komórek. Zwykle hepatocyty, jeśli są szczęśliwe, mają żywą fluorescencyjną.

Druga część polega na tym, że próbujemy usiąść na komórkach i przeprowadzić hodowlę organoidów. Zbieramy wszystkie zawiesiny komórek i liczymy komórki z pewną fuzją koncentryczną, a następnie mieszamy. Metrogel. i nośnik kodu.

Zwykle bierzemy z pożywką i metrogelami w stosunku 1 do 2 lub 1 do 3. Po dokładnym wymieszaniu układamy je na płytkach gradientowych. Zwykle dodajemy 100 mikrolitrów do dołka na 24 płytki.

Umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni. Po 20 minutach kładziemy je odwrotnie do przodu z dnem na dole, a następnie na podłożu. Po dwóch lub trzech dniach przeciwdziałania zwykle widzimy, jak wychodzą organoidy.

Jest to typowy obraz naszych organoidów. Zwykle potrzebujemy pojedynczych komórek z organoidów, jeśli chcemy przeprowadzić pasaż lub zastosować jakąś metodę modyfikacji genetycznej Zbieramy wszystkie organoidy z płytek przeciwstawnych za pomocą bufora do płukania sierści. Wrzucamy supernatant, a następnie na bufor do mycia sierści na płytkę, mieszamy je, więc pobudzamy go w górę iw dół.

A następnie zwykle wstępnie pierzemy wszystkie końcówki za pomocą bufora do taśm myjących. Aby uniknąć wszystkich organoidów, przechyl się na końcówki. A następnie, z nową partią na lodzie lub bez niego, zbieramy wszystkie organoidy przez centrofuzję.

Leczymy je, jest coning radients, aby usunąć wszystkie metrogele. Po 20 do 30 minutach inkubacji na lodzie wszystkie metrożele są usuwane. Zbieramy wszystkie czyste organoidy i dodajemy trypsynę, aby przekształcić je w pojedyncze komórki.

Po dodaniu trypsyny wnosimy organoidy do inkubatora. Potrzeba od 5 do 10 minut, aby organoidy wątroby stały się pojedynczymi komórkami. Dodajemy więcej do płukania, aby zatrzymać tryplatynę.

A potem pchaj go w górę iw dół w ich kierunku. W przypadku procesu opcji możesz umyć je jeszcze raz, aby usunąć całą trypsynę. Po umyciu metodą centrofuzji możemy je policzyć pod ladą komórek.

Następnie pokażemy, jak przeprowadzić transakcję lub transfekcję tych organoidów hepatocytów. Najpierw oznacz rurki tym, co zamierzasz zrobić, a następnie wykonamy transfekcję wzroku zgodnie z instrukcjami producenta. Potrzebujesz, regent lipoyl fakt oswajający INI MaX.

Dodajemy kontrolny i specyficzny gen siRNA i inkubujemy je z optymalnym wynikiem, zgodnie z instrukcjami producenta. A następnie, w zależności od stężenia komórek, dodajemy RAN max i dokładnie je mieszamy.

Następnie dodajemy również osobno RAN max z optimum i kładziemy je na lodzie. Po 5 minutach wydzielamy oddzielną mieszaninę RAN max z różnymi siRNA, oddzielnie kontrolujemy specyficzny gen RANi i II i dokładnie je mieszamy. Umieść je ponownie na lodzie, a następnie zbieramy wszystkie organoidy, powolną centrofuzję, upuszczamy cały supernatant, dodajemy RNAi max, mieszaninę siRNA do tej płytki komórkowej i dokładnie ją przesuwamy w górę iw dół.

Krótko mówiąc, komórki i mieszanina znakowanych RNAi max i siRNA poddano gentryfikacji i inkubowano przez 4 do 5 godzin w temperaturze 37 stopni. Wreszcie, te organoidy hepatocytów mogą być również zakażone wirusem Lenti. Podobną wiadomość wykonano jako transfekcję siRNA.

Probówki kontrolne i wirusa siRNA były dobrze przygotowane, a optimum zostało dodane zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie z regionami infekcji, takimi jak poly green, a następnie dodajemy innego wirusa Lenti, zgodnie z instrukcją producenta. Połącz zawiesiny pojedynczych komórek w kulturze organoidów i różne cząstki w 1,5 mililitrowych probówkach eppendorfa, dodaj, dobrze, wymieszaj je Płytuj tę mieszaninę i zagęszczaj je przez 1 godzinę w 32 stopniach.

Fuzja koncentratu zostanie przeprowadzona w temperaturze 500 G. A po 4 do 5 godzinach inkubacji w temperaturze 37 stopni zawiesina komórek zostanie pobrana i osadzona w metrożelu. I włóż je ponownie do inkubatora. Narząd dotyczący wydajności tworzenia lub innej analizy funkcjonalnej można wykonać 7 do 10 dni później.

Oto nasze reprezentatywne wyniki. Na rysunku 1A można zobaczyć nasz organoid hepatocytów ALB-Cre Rosa 26-GFP lub RFP od myszy. Na rycinie 1B można było zobaczyć pozytywny sygnał Ki67 w barwieniu, który wykazał, że nasze organoidy hepatocytów proliferują.

Na rycinach 2A i 2B znajduje się reprezentatywna ekspresja genów naszej zakłócającej ekspresji naszych genów. Po manipulacji genetycznej w organoidach hepatocytów, skuteczność interferencyjna jest bardzo wydajna. Oto rysunek 2C, który można było zobaczyć po manipulacji genetycznej za pomocą technologii karsonitu w naszych mysich organoidach.

Podsumowując, nasze wyniki wykazały, że organoidy hepatocytów mogą być namnażane in vitro i manipulowane genetycznie. Podsumowując, w tym filmie pokazujemy, jak przeprowadzić perfuzję i trawienie wątroby, aby uzyskać hepatocyty. Jak uchwycić hepatocyty i przejść organoidy hepatocytów.

Pokazaliśmy również, jak przeprowadzić transfekcję siRNA i wektora lub infekcję wirusem Lenti, aby dokonać modyfikacji genetycznej tych organoidów. Ponadto mamy dwa niedobory w naszych organoidach. Po pierwsze, nie używaliśmy rdzenia na rdzeń lub rdzeń futra do oczyszczania hepatocytów.

Po drugie, myślę, że należy spróbować więcej czynników wzrostu i sygnalizacji, aby poprawić czas wzrostu organoidów.