Name: Tworzenie i manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Poznaj techniki kultury organoidów hepatocytów mysich i ich modyfikacji genetycznej przy użyciu lentiwirusa, siRNA oraz CRISPR-Cas9. Ta metoda umożliwia długoterminowe badania biologii wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy profesorowi Hansowi Cleversowi za uprzejme dostarczenie linii komórkowych do produkcji rekombinowanej R-spondyny1. Prace te były wspierane przez granty z Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (2019YFA0111400), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31970779) dla H.H. oraz Funduszy dla Młodzieży Interdyscyplinarnej i Innowacyjnej Grupy Badawczej Uniwersytetu Shandong (2020QNQT003) dla H.H.

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szkoły Podstawowych Nauk Medycznych na Uniwersytecie Shandong i zostały przeprowadzone zgodnie z Licencją zgodnie z wytycznymi i przepisami Home Office (Nie. ECSBMSSDU2019-2-079).
UWAGA: Ten protokół jest głównie używany do hodowli organoidów 3D z izolowanych pierwotnych hepatocytów.
1. Założenie hodowli organoidów mysich hepatocytów
UWAGA: Macierz zewnątrzkomórkowa, taka jak Matrigel lub BME, jest używana jako macierz podstawowa do hodowli organoidów. Przechowywać macierz zewnątrzkomórkową w temperaturze -20 °C i wstępnie rozmrozić ją w temperaturze 4 °C lub na lodzie. Podczas eksperymentów utrzymuj macierz zewnątrzkomórkową na lodzie. Medium myjącym jest Advanced DMEM/F12 uzupełnione o GlutaMAX, HEPES i penicylinę/streptomycynę. Do hodowli organoidów stosuje się standardowy inkubator (37 °C, wilgotna atmosfera, 5% CO2 ).
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów
	<ol>
		<li>Przygotuj narzędzia potrzebne do eksperymentu: poduszkę pod mysz, sterylne narzędzia chirurgiczne, takie jak pęseta, nożyczki, rurki i pompę o natężeniu przepływu 2-10 ml/min.</li>
		<li>Przygotować odczynniki, w tym bufor perfuzyjny, bufor do wytrawiania i uczynić je sterylnymi w celu izolacji hepatocytów. Dodać świeżą kolagenazę typu IV (0,10 mg/ml) i CaCl2 (0,50 M) i wstępnie ogrzać bufor w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Przygotować pożywkę warunkową do produkcji R-spondyny 1 oraz wszystkich zapasów substancji chemicznych i czynników wzrostu zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Unikaj częstego zamrażania i rozmrażania pożywki warunkowej i wywarów. Przygotuj pożywkę hodowlaną na świeżo i zużyj ją w ciągu jednego miesiąca. Ma to kluczowe znaczenie dla wydajności formowania organoidów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja hepatocytów myszy metodą perfuzji i trawienia wątroby 
	UWAGA: Samce lub samice myszy w wieku od 12 tygodni do 6 miesięcy wykorzystano do hodowli organoidów. Nie stwierdzono żadnych oczywistych różnic w wydajności tworzenia organoidów w porównaniu z wiekiem myszy dawcy w tym zakresie.
	<ol>
		<li>Poddaj mysz eutanazji metodą zatwierdzoną etycznie.</li>
		<li>Przymocuj mysz do poduszki myszy i oczyść sierść i skórę brzucha 70% alkoholem. Odsłoń brzuch i unieś wątrobę ponad resztę ciała. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić wątrobę.</li>
		<li>Napełnij rurkę dołączoną do pompy buforem perfuzyjnym. Wykonaj nacięcie żyły wrotnej (około 1/3 średnicy żyły) i ostrożnie umieść w niej cewnik. Podnieś narządy trawienne, aby pomóc we włożeniu kaniuli. Krawat z linią chirurgiczną jest opcjonalny, aby uniknąć wysunięcia się i pęknięcia.</li>
		<li>Uruchom pompę i wykonaj perfuzję z natężeniem przepływu 5-7 ml/min z buforem perfuzyjnym. Jeśli wątroba natychmiast zblednie, przetnij żyłę główną dolną, aby bufor perfuzyjny mógł przepływać przez całą wątrobę i wyprowadzić krew.</li>
		<li>Gdy odpływ stanie się czysty, wyjmij kaniulę. Zajmuje to około 5-10 minut.</li>
		<li>Zmienić bufor perfuzyjny na wstępnie podgrzany bufor do wytrawiania z szybkością 5 ml/min. Nie należy przerywać pompy, dopóki wątroba nie stanie się miękka i nie puchnie. Usuń cewnik, gdy wątroba przestanie puchnąć. 
		UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zachować odpowiedni czas trawienia, aby uniknąć nadmiernego trawienia i uzyskać pojedyncze komórki wątroby.</li>
		<li>Odetnij wątrobę i umieść ją na talerzu o średnicy 100 mm wypełnionym 15 ml zimnego środka do mycia. Przetnij więzadła małymi nożyczkami. Rozerwij wątrobę na kawałki za pomocą końcówek pipet lub kleszczy.</li>
		<li>Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby uwolnić komórki, aż bufor zostanie nasycony komórkami (12-15 razy). Wlać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml przez filtry 70 μm.</li>
		<li>Wirować przez 1-3 minuty w temperaturze 50 x g i temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant. Opcjonalnie należy ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki płuczącej lub ponownie zawiesić komórki bezpośrednio za pomocą pożywki hodowlanej. Policz komórki za pomocą hemacytometru.</li>
		<li>Odróżnij żywe lub martwe komórki za pomocą licznika komórek po barwieniu barwnikiem żywych komórek. 
		UWAGA: Hepatocyty najlepiej oczyszczać za pomocą zimnego 40% Percollu. Po tym kroku żywotne hepatocyty znajdą się na dnie probówek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla i pasaż organoidów
	<ol>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić hepatocyty mieszaniną macierzy zewnątrzkomórkowej i pożywki hodowlanej w stosunku 3:1, 
		UWAGA: Zaleca się 10 000-20 000 komórek w mieszaninie 50-60 μl na dołek dla płytki 24-dołkowej. Ważne jest, aby pracować szybko i utrzymywać mieszaninę na lodzie przez cały proces. W tym stężeniu może powstać 200-500 organoidów.</li>
		<li>Dodaj kroplę komórki/mieszaniny na płytkę z małymi kropelkami, aby zapobiec łączeniu się kropel. Inkubować płytkę w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5-10 minut, a następnie wyjmować płytkę na 20-25 minut, aż macierz zewnątrzkomórkowa stanie się twarda.</li>
		<li>Dodać pożywkę hodowlaną (500 μl na studzienkę dla płytki 24-dołkowej) do studzienek i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w celu hodowli organoidów. Zmieniaj podłoże co 3-4 dni. Obserwuj organoidy, aż osiągną wystarczająco duże rozmiary, aby można je było przejść. 
		UWAGA: Średnica około 400-500 μm jest odpowiednia do pasażu organoidów hepatocytów.</li>
		<li>Wyizoluj organoidy z macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą szczegółowego procesu poniżej. Trzymaj szklaną pipetę Pasteura w płomieniu, aby zwęzić jej otwór (o ~1/2). Mechanicznie pipetować w górę i w dół 5-10 razy, aby rozdzielić organoidy na mniejsze organoidy podczas pasażu. 
		UWAGA: Podczas pasażowania należy przygotować wstępnie umyte końcówki i probówki do mikropipet z buforem do płukania końcówek, aby uniknąć utraty organoidów przyklejających się do probówek lub końcówek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów
<ol>
	<li>Pojedyncze komórki z organoidów hepatocytów
	<ol>
		<li>Do każdej studzienki dodać 500 μl pożywki do płukania na zimno/roztworu do odzyskiwania komórek. Pipetować w górę i w dół, aby zniszczyć mieszaninę komórka/macierz zewnątrzkomórkowa za pomocą mikropipety, a następnie przenieść zawiesinę organoidów do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml na lodzie. Opcjonalnie od czasu do czasu obracaj rurkę w górę i w dół, aby dokładnie rozmrozić mieszankę.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut przy 500-800 x g i temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Dodaj 1 ml roztworu trypsyny do granulki i odpipetuj ją do wymieszania. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut, a następnie zatrzymać trawienie, dodając 2x większą objętość pożywki myjącej.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 800 x g i temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić osad z pożywką hodowlaną i policzyć komórki za pomocą hemacytometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>siRNA lub transfekcja plazmidowa 
	UWAGA: Mniejsze organoidy o średnicy mniejszej niż 50 μm lub pojedyncze komórki z organoidów hepatocytów są transfekowane siRNA przy użyciu Lipofectaminy lub plazmidów przy użyciu odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Wymieszaj siRNA lub plazmidy z odczynnikiem do transfekcji. Dodać pojedyncze komórki z organoidów i mieszaninę lipofektaminy-RNA/lipo-plazmidu (np. RNAiMAX) do 1-2 dołków na płytce 24-dołkowej i wirować przez 1 godzinę w temperaturze 500 x g i temperaturze 32 °C. Po odwirowaniu inkubować płytkę w inkubatorze przez 4-5 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zebrać komórki i nasiona w macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą pożywki hodowlanej o stężeniu 10 000 komórek na studzienkę. Zmień pożywkę na stan selekcji dwa dni po transfekcji. Oceń skuteczność tworzenia organoidów po 10 dniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie lentiwirusowe 
	UWAGA: Małe organoidy o średnicy mniejszej niż 50 μm lub pojedyncze komórki z organoidów hepatocytów są zakażone lentiwirusem przy użyciu pożywki z odczynnikami do infekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Wymieszać 250 μl zawiesiny jednokomórkowej z organoidu i 250 μl cząstek wirusa w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Mieszaninę należy rozlać na płytki i odwirowywać przez 1 godzinę w temperaturze 500 x g i temperaturze 32 °C. Inkubować przez 4-5 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zbierz komórki i nasiona w macierzy zewnątrzkomórkowej z pożywką hodowlaną. Zmień pożywkę na stan selekcji dwa dni po transfekcji. Oceń skuteczność tworzenia organoidów po 10 dniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inżynieria genetyczna według CRISPR/Cas9 
	UWAGA: Wideo z tego występu udostępniamy w materiałach dodatkowych. Pojedyncze komórki z organoidów zostały zakażone lentiwirusem lub transfekowane plazmidami przenoszącymi sgRNA i Cas9.
	<ol>
		<li>Trawić pojedyncze komórki z hodowanych organoidów hepatocytów i pasaż zgodnie z powyższą metodą.</li>
		<li>Zakażone pojedyncze komórki sgRNA za pomocą pożywki Opti-MEM i odczynników infekcyjnych zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Wymieszaj 250 μl zawiesiny jednokomórkowej i 250 μl cząstek wirusa w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę o objętości 500 μl przez 1 godzinę w temperaturze 500 x g i temperaturze 32 °C, a następnie inkubować przez 4-5 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zebrać zawiesinę komórkową i nasiona w macierzy zewnątrzkomórkowej. Oceń skuteczność tworzenia organoidów po 10 dniach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li>
<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regenerative+medicine%3A+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li>
<li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+%2B+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li>
<li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li>
<li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li>
<li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li>
<li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają żadnych konfliktów.

Zdolność do hodowli dojrzałych hepatocytów przez długi czas ma fundamentalne znaczenie w badaniach podstawowych nauk o wątrobie, toksykologii leków i hepatotropowych zakażeń mikrobiologicznych gospodarza, takich jak malaria i wirusy zapalenia wątroby. Z dobrze zdefiniowaną niszą, protokół tutaj ustanawia system hodowli hepatocytów. Protokół ten napędza dojrzałe hepatocyty do ekspansji w hodowli 3D z niejednorodnością, która podsumowuje interakcję komórka-komórka, większość funkcji hepatocytów i modyfikacje genetyczne, um...

Organoidy to samoorganizujące się, trójwymiarowe (3D) klastry in vitro, które zawierają samoodnawiające się komórki macierzyste i komórki zróżnicowane wieloliniowo1,2. Organoidy wielu narządów zostały utworzone z pluripotencjalnych lub dorosłych komórek macierzystych przez dobrze zdefiniowane czynniki niszowe, w tym jelita, mózg, okrężnicę, nerki, wątrobę, trzustkę, tarczycę, żołądek, skórę i płuca3,4,5,6,7. Organoidy podsumowują funkcje fizyczne komórek, naśladując ich rozwój (wywodzący się z embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) lub homeostazy/regeneracji (pochodzących z dorosłych komórek macierzystych, ASC), co otwiera nowe możliwości w badaniach i terapii chorób8,9.
Jako największy organ u ssaków, wątroba jest głównie odpowiedzialna za magazynowanie, metabolizm i detoksykację. Dwa rodzaje komórek nabłonkowych, hepatocyty i cholangiocyty, budują podstawową jednostkę zrazika wątroby. Hepatocyty są odpowiedzialne za 70-80% funkcji wątroby10. Chociaż wątroba ma niezwykłą zdolność regeneracji, szybka utrata cech hepatocytów następuje podczas tradycyjnej hodowli jednowarstwowej przez rozregulowaną polaryzację komórek i dedyferencjację, co zwiększa potrzebę badaczy i klinicystów do budowania modeli wątroby "wypełniających luki" w naczyniu. Jednak do niedawna modele ekspansji ex vivo z pierwotnych hepatocytów nie były dobrze ugruntowane11,12,13,14,15. Organoidy wątroby można ustalić z embrionalnych/indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, konwersji fibroblastów w komórki podobne do hepatocytów i komórek pochodzących z tkanki. Rozwój organoidów wątrobowych przyspiesza stosowanie modelu in vitro do badań przesiewowych leków i testów toksyczności wątroby16,17.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół tworzenia organoidów wątrobowych z mysich pierwotnych hepatocytów. Korzystając z tego protokołu, stworzyliśmy system hodowli in vitro organoidów hepatocytów z dwiema perfuzjami kolagenazy. Te organoidy mogą być pasażowane w celu długotrwałej ekspansji przez wiele miesięcy. Ich funkcja fizjologiczna jest wysoce zgodna z hepatocytami. Ponadto podajemy również szczegółowy opis, jak wykonywać manipulacje genetyczne, takie jak infekcja lentiwirusem, transdukcja siRNA i inżynieria CRISPR-Cas9 przy użyciu organoidów. Rozmnażanie organoidów hepatocytów rzuciło światło na możliwość wykorzystania organoidów do zrozumienia biologii wątroby i opracowania spersonalizowanych i translacyjnych podejść medycznych.

<table><tbody><tr><td>Bufor perfuzyjny</td>EGTA Sangon Bitech A600077-0100 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>3,50 g/L</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100188-0500</td><td>9,00 g/L</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100395-0500</td><td>4,00 g/L</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501727-0500</td><td>1,51 g/L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501218-0001</td><td>80,0 g/L</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A610404-0500</td><td>0,78 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sangon Bitech</td><td>A500873-0500</td><td>3,50 g/L</td></tr><tr><td>Fenol Red</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100882-0025</td><td>0,06 g/L</td></tr><tr><td><silny>Bufor trawienny</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SangonBitech</td><td>A501330-0005</td><td>0,50 M</td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Sigma</td><td>C1639</td><td>0,10 mg / ml</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sangon Bitech</td><td>C621110-0010</td><td>23,80 g / L</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100395-0500</td><td>4,00 g / L</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501727-0500</td><td>1,51 g/L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501218-0001</td><td>80,0 g/L</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A610404-0500</td><td>0,78 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sangon Bitech</td><td>A500873-0500</td><td>3,50 g/L</td></tr><tr><td>Tip-wash Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bydlęca surowica</td><td>Gibco</td><td>10091148</td><td>przechowywana w temperaturze 4 & st.; C</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C14190500BT0</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Wash Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100 X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp; A600135-0025</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Culture Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Stężenie wyjściowe 500 &mikro; M, końcowe stężenie 2 i mikro; M</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>B-27 suplement 50x, bez witaminy A</td><td>Gibco</td><td>1704-044</td><td>50 X</td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>Stężenie zapasu 30 mM, końcowe stężenie 3 &mikro; M</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Gastrin I</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td>Stężenie zapasu 100 mM, stężenie końcowe 10 nM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100 X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Matrigel martix</td><td>BD</td><td>356231</td><td>przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>Stężenie magazynowe 500 mM, stężenie końcowe 1 mM</td></tr><tr><td>Niktynamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>Stężenie zapasowe 1 M, stężenie końcowe 3 mM</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp; A600135-0025</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Stężenie zapasowe 100 &mikro; g / ml, stężenie końcowe 50 ng / ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>Stężenie zapasowe 100 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>Stężenie zapasowe 100 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 25 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TGF-&alfa;</td><td>Peprotech</td><td>100-16A</td><td>Stężenie magazynowe 100 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TNF-&alpha;</td><td>Origene</td><td>TP750007-1000</td><td>Koncentracja zapasów 100 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Inhibitor kinazy Rho Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>Stężenie podstawowe 10 mM, stężenie końcowe 10 &mikro; </td></tr><tr>Pożywka <td></td><td></td><td>kondycjonowana M Rspondin-1</td><td>Stabilna linia komórkowa wytworzona w laboratorium Hu. Stężenie końcowe 15%.</td></tr><tr><td><silny>Inne</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mikro; m filtr</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>16 # rurka silikonowa</td><td>LangerPump</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 dobrze, zawieszenie</td><td>Greiner bio-one</td><td>GN662102-100EA</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Kąpiel</td><td></td><td></td><td></td>wodna</tr><tr><td>70 &mikro; m filtr</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>stemcell</td><td>AT-104</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Anti-CTNNB1</td><td>BD</td><td>610154</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>CST</td><td>5174S</td><td>Królik</td></tr><tr><td>Anti-HDAC7</td><td>Abcam</td><td>ab50212</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Anti-KI67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Królik</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania komórek</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>przechowywany przy 4 & stopniach; </td></tr><tr><td>C Wirówka 5430</td><td>eppendorf</td><td>542700097</td><td></td></tr><tr><td>inkubator CO2</td><td>ESCO</td><td>AC2-4S1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp; A100231</td><td>przechowywane w RT</td></tr><tr><td>EVOS FL Color Imaging Systems</td><td>Invitrogen</td><td>AME4300</td><td></td></tr><tr><td>Hdac3 siRNA</td><td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td><td>siG2003180909192555</td><td>przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hdac7 lentiwirus</td><td>ShanghaiGenePharmaCo., Ltd</td><td>LV2020-2364</td><td>przechowywany w temperaturze -80 stopni; C</td></tr><tr><td>Hitrans G A</td><td>Shanghai Genechem Co., Ltd.</td><td>REVG004</td><td>Zwiększona skuteczność infekcji wirusowych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Image Pro Plus</td><td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td><td>wersja 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamin RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td>Zwiększona skuteczność infekcji wirusowej</td></tr><tr><td>Barwnik z żywych komórek</td><td>Luna</td><td>F23001</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Wolnoobrotowa wirówka biurkowa</td><td></td><td>cence TD5A-WS/TD5AWS</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofactor-&alpha; 2b Urządzenie</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>przechowywane w temperaturze 4 & C</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Sangon Bitech</td><td>F621006-0001</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>LangerPump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>Aktywuj metanolem</td></tr><tr><td>PX458</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>przechowywany w temperaturze -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Thermo Scientific Heraeus</td><td>Labofuge 400</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>MCE</td><td>HY-100218A</td><td>Stężenie zapasów 10 mM, stężenie końcowe 4 i mikro; M</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibico</td><td>25200072</td><td>przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Wee1 siRNA</td><td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td><td>siG2003180909205971</td><td>przechowywany w temperaturze -20 & Z</td></tr></tbody></table>

tworzenie i manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Wątroba jest największym organem u ssaków. Odgrywa ważną rolę w magazynowaniu glukozy, wydzielaniu białek, metabolizmie i detoksykacji. Jako wykonawca większości funkcji wątroby, pierwotne hepatocyty mają ograniczoną zdolność proliferacji. Wymaga to opracowania modeli ekspansji hepatocytów ex vivo do badań fizjologicznych i patologicznych wątroby. Tutaj wyizolowaliśmy mysie hepatocyty za pomocą dwóch etapów perfuzji kolagenazy i ustaliliśmy hodowlę organoidów 3D jako "mini-wątrobę", aby podsumować interakcje komórka-komórka i funkcje fizyczne. Organoidy składają się z heterogenicznych populacji komórek, w tym komórek progenitorowych i dojrzałych hepatocytów. Szczegółowo przedstawiamy proces izolacji i hodowli mysich hepatocytów lub hepatocytów płodowych w celu utworzenia organoidów w ciągu 2-3 tygodni i pokazujemy, jak je przechodzić, mechanicznie pipetując w górę iw dół. Ponadto przedstawimy również, jak trawić organoidy do pojedynczych komórek w celu zakażenia lentiwirusem o budowie shRNA/ektopowej, transfekcji siRNA i inżynierii CRISPR-Cas9. Organoidy mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych leków, modelowania chorób i podstawowych badań wątroby poprzez modelowanie biologii i patobiologii wątroby.

Organoidy hepatocytów od samicy myszy Alb-Cre; Rosa26-GFP (8 tygodni) obserwowano pięć dni po wysiewaniu (Rysunek 1A). Organoidy proliferują, wykazując dodatnie barwienie na Ki67 (Rysunek 1B). Ekspresję reprezentatywnych genów w organoidach hepatocytów, zakłóconą poprzez transfekcję siRNA lub infekcję lentiwirusem, badano za pomocą qRT-PCR i western blot. Wyniki przedstawiono na Rysunku 2A i 2B. <strong class="xfig"...

Długoterminowy system hodowli organoidów 3D ex vitro został stworzony z mysich hepatocytów. Organoidy te mogą być pasażowane i manipulowane genetycznie przez infekcję lentiwirusem o konstrukcji shRNA/ektopowej, transfekcję siRNA i inżynierię CRISPR-Cas9.

Tworzenie i manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Wątroba jest największym narządem u ssaków. Odgrywa bardzo ważną rolę w metabolizmie i detoksykacji. Chociaż wątroba ma niezwykłe zdolności regeneracji in vitro, hodowla hepatocytów in vitro jest nadal bardzo dużym wyzwaniem na dłuższą metę.Tutaj ustalamy organoidy hepatocytów z dojrzałych hepatocytów. Zachowuje główne cechy hepatocytów w morfologii i funkcji. W tym filmie przedstawimy, jak hodować i pasować te organoidy oraz jak szczegółowo przeprowadzić genetyczną modyfikację tych organoidów.Po pierwsze, perfuzja i trawienie wątroby. Przygotuj wszystkie regiony i instrumenty i spraw, aby były sterylne. Umyj mysz i otwórz naskórek i skórę, a następnie spróbuj znaleźć woreczek z wątrobą.Wstrzyknij do niego igły, a następnie uchwyć to. Wykonuj perfuzję z prędkością pięciu mililitrów na minutę, aż wątroba stanie się blada. Przełóż je do buforu perfuzyjnego, ułóż ostrożnie, obserwuj wątrobę, aż stanie się miękka.Zwykle zajmuje to od trzech do pięciu minut, następnie pokrój wątrobę i włóż ją do talerzy, a nożyczkami pokrój na małe kawałki. Często poruszaj go w górę iw dół. Zwykle przekształcenie ich w pojedynczą komórkę zajmuje od 10 do 15 minut.A następnie napędzaj go w górę iw dół pr

establishment-and-genetic-manipulation-of-murine-hepatocyte-organoids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół opisuje produkcję mysiego pozawątrobowego przewodu żółciowego 3-wymiarowego systemu organoidowego. Te organoidy żółciowe można utrzymywać w kulturze w celu badania biologii cholangiocytów. Organoidy żółciowe wyrażają markery zarówno komórek progenitorowych, jak i żółciowych i składają się ze spolaryzowanych komórek nabłonka.

Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania wrodzonych komórek limfoidalnych typu 1 od mysiej blaszki jelita cienkiego oraz ustanawiania trójwymiarowych (3D) kokultur między oboma typami komórek w celu zbadania dwukierunkowych interakcji między komórkami nabłonka jelitowego a wrodzonymi komórkami limfoidalnymi typu 1.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Protokół ten opisuje wytwarzanie szybkich i powtarzalnych endodermalnych organoidów wątrobowych (eHEPO). Dzięki temu protokołowi eHEPO mogą być produkowane w ciągu 2 tygodni i rozwijać się w dłuższej perspektywie (ponad 1 rok) bez utraty swojego zróżnicowania i funkcjonalności.

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Ten protokół opisuje, jak ustanowić, utrzymywać, genetycznie modyfikować, różnicować, funkcjonalnie charakteryzować i przeszczepiać organoidy gruczołów łzowych pochodzące z pierwotnej tkanki mysiej i ludzkiej.

Ustalanie, utrzymywanie, różnicowanie, manipulacja genetyczna i przeszczepianie organoidów gruczołów łzowych myszy i ludzi

Organoidy rewolucjonizują spersonalizowane modelowanie tkanek do rozwoju narządów, odkrywania leków i badań nad chorobami. Inżynieria organoidowa się naprzód w tworzeniu skomplikowanych tkanek syntetycznych. Celem jest zintegrowanie morfogenezy, technologii asembloidów i biomatryc w celu poczynienia postępów w inżynierii tkankowej. Protokół ten pomaga w modelowaniu organogenezy wątroby i ustalaniu wytycznych dotyczących budowy tkanek syntetycznych.

Techniki uprawy in vitro do modelowania organogenezy wątroby, budowania asembloidów i projektowania tkanek syntetycznych przy użyciu ludzkich linii komórkowych

Organoidy generowane z guzów pacjenta są ortotopowo wstrzykiwane do wątroby myszy. Resekcja nienowotworowej tkanki wątroby prowadzi do środowiska regeneracyjnego w tkance wątroby, w której znajduje się guz.

Model ksenoprzeszczepu organoidalnego uzyskany od pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym w celu zbadania wpływu regeneracji wątroby na wzrost guza

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.

Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D

Opisujemy mikroskopię konfokalną i metody śledzenia zastosowane do dwóch strategii reporterowych: mozaikowych organoidali do rozdzielania zachowania i losu poszczególnych komórek oraz organoidali reporterowych typu komórkowego do monitorowania przemian typów komórek w ludzkich i mysich organoidach jelitowych.

Obrazowanie żywych komórek i śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania dynamiki klonalnej i przejść losu w ludzkich i mysich organoidach jelitowych

W tym filmie zaprezentowano New culture – metodę, dzięki której zarodki kurcząt są hodowane poza jajem przez maksymalnie 24 hr. Metoda ta umożliwia badanie wczesnego rozwoju (od pręgi pierwotnej do 14 som.), co odpowiada okresowi E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ oraz immunohistochemię.

Metoda hodowli wczesnych zarodków kurczaka ex vivo (nowa hodowla)

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Poznaj techniki kultury organoidów hepatocytów mysich i ich modyfikacji genetycznej przy użyciu lentiwirusa, siRNA oraz CRISPR-Cas9. Ta metoda umożliwia długoterminowe badania biologii wątroby.

Tworzenie i manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów

Przeglądaj więcej filmów