Name: Izolacja ludzkich pierwotnych komórek zastawki do modelowania chorób in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Naucz się izolować ludzkie pierwotne komórki zastawki aortalnej do modelowania chorób in vitro. Ta metoda zapewnia około 40% żywotności komórek do 61 godzin po ekstrakcji, wspierając badania nad patogenezą zwapnienia zastawki aortalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Jasonowi Dobbinsowi za wnikliwą dyskusję i krytyczną lekturę tego rękopisu. Chcielibyśmy podziękować Centrum Odzyskiwania i Edukacji Narządów za pomoc i wsparcie oraz podziękować dawcom tkanek i ich rodzinom za umożliwienie przeprowadzenia tego badania. Wszystkie próbki od pacjentów pobierane są od osób biorących udział w badaniach zatwierdzonych przez instytucjonalną komisję rewizyjną Uniwersytetu w Pittsburghu zgodnie z Deklaracją Helsińską. Tkanki zwłok uzyskane za pośrednictwem Centrum Odzyskiwania i Edukacji Narządów (CORE) zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Nadzoru nad Badaniami i Szkoleniem Klinicznym z udziałem Zmarłych Uniwersytetu w Pittsburghu (CORID).
Niektóre figurki stworzone za pomocą Biorender.com.
CSH jest wspierany przez National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 i R01 HL142932, American Heart Association 20IPA35260111.

<ol><li>Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+behaviors+and+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Amercan+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Health behaviors and calcific aortic valve disease.</a> Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).</li>
<li>Nishimura, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHA%2FACC+guideline+for+the+management+of+patients+with+valvular+heart+disease%3A+executive+summary%3A+A+report+of+the+American+College+of+Cardiology%2FAmerican+Heart+Association+Task+Force+on+practice+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines.</a> Circulation. 129, 2440-2492 (2014).</li>
<li>Clark, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+economic+outcomes+after+surgical+aortic+valve+replacement+in+Medicare+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Risk+Manag+Healthc+Policy%22%5BJournal%5D)">Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients.</a> Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).</li>
<li>Misfeld, M., Sievers, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+macro-+and+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+Royal+Society+of+London+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Heart valve macro- and microstructure.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).</li>
<li>Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+maturation+of+heart+valves+leads+to+changes+in+endothelial+cell+distribution%2C+impaired+function%2C+decreased+metabolism+and+reduced+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cell+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation.</a> Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).</li>
<li>Mahler, G. J., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+regulation+of+valvular+remodeling%3A+the+good%28%3F%29%2C+the+bad%2C+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly.</a> Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419(2011).</li>
<li>Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+valvular+endothelial+cell+paracrine+signaling+and+matrix+elasticity+on+valvular+interstitial+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation.</a> Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).</li>
<li>Leopold, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+aortic+valve+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Cardiovascular+Intervention%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of aortic valve calcification.</a> Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).</li>
<li>Chen, J. H., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+interactions+in+the+pathobiology+of+calcific+aortic+valve+disease%3A+Critical+roles+for+matricellular%2C+matricrine%2C+and+matrix+mechanics+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues.</a> Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).</li>
<li>Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+challenges+for+heart+valve+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).</li>
<li>Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+valve+interstitial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cardiac valve interstitial cell.</a> Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).</li>
<li>Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+characterization+of+interstitial+cells+from+human+heart+valves%2C+pericardium+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Heart+Valve+Disease%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin.</a> Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).</li>
<li>Rajamannan, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+aortic+valve+disease%3A+not+simply+a+degenerative+process%3A+A+review+and+agenda+for+research+from+the+National+Heart+and+Lung+and+Blood+Institute+Aortic+Stenosis+Working+Group.+Executive+summary%3A+Calcific+aortic+valve+disease-2011+update%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update.</a> Circulation. 124, 1783-1791 (2011).</li>
<li>Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+valve+cells+and+their+microenvironment--insights+from+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies.</a> Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).</li>
<li>Yutzey, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+aortic+valve+disease%3A+a+consensus+summary+from+the+Alliance+of+Investigators+on+Calcific+Aortic+Valve+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).</li>
<li>Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immune+cells+in+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).</li>
<li>Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+valve+interstitial+cell+phenotypes+in+regulating+heart+valve+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology.</a> American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).</li>
<li>Liu, A. C., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cell+motility+in+single+heart+valve+interstitial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro.</a> Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).</li>
<li>Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcification+by+valve+interstitial+cells+is+regulated+by+the+stiffness+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).</li>
<li>Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epigenetic+regulatory+loop+controls+pro-osteogenic+activation+by+TGF-beta1+or+bone+morphogenetic+protein+2+in+human+aortic+valve+interstitial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).</li>
<li>Xu, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+the+adenosine+A2A+receptor+confers+pulmonary+arterial+hypertension+and+increased+pulmonary+vascular+remodeling+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice.</a> Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).</li>
<li>Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+aortic+valve+stenosis%3A+TGF-beta1+is+present+in+calcified+aortic+valve+cusps+and+promotes+aortic+valve+interstitial+cell+calcification+via+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis.</a> Annals of Thoracic Surgery. 75, 465(2003).</li>
<li>Bogdanova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+cells+in+calcified+aortic+valves+have+reduced+differentiation+potential+and+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties.</a> Science Reports. 9, 12934(2019).</li>
<li>Gendron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aortic+valve+interstitial+cells+display+proangiogenic+properties+during+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).</li>
<li>Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+transcriptional+regulatory+mechanisms+in+aortic+valve+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).</li>
<li>Honda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+model+of+aortic+valve+stenosis+induced+by+direct+wire+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).</li>
<li>Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Animal models of calcific aortic valve disease.</a> International Journal of Inflammation. 2011, 364310(2011).</li>
<li>Gould, R. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+valvular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of valvular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2158(2010).</li>
<li>Miller, L. J., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+valve+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine valve endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51860(2014).</li>
<li>Selig, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+hyperinsulinemia+and+hyperglycemia+on+valvular+interstitial+cells+-+A+link+between+aortic+heart+valve+degeneration+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells - A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes.</a> Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Martinsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+trends+in+the+incidence+and+prognosis+of+aortic+stenosis%3A+A+nationwide+study+of+the+Swedish+population%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population.</a> Circulation. 131, 988-994 (2015).</li>
<li>Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+reversible+changes+of+interstitial+cell+phenotype+during+remodeling+of+cardiac+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Heart+Valve+Diseases%22%5BJournal%5D)">Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves.</a> Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).</li>
<li>St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+induction+of+adenosine+receptor+genes+and+its+functional+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance.</a> Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).</li>
<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+transcriptome+atlas+of+human+aortic+valves+reveal+cell+heterogeneity+and+endothelial+to+mesenchymal+transition+involved+in+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).</li>
</ol>

Państwo Islamskie otrzymuje instytucjonalne wsparcie badawcze od firm Atricure i Medtronic oraz pełni funkcję konsultanta dla firmy Medtronic Vascular. Żaden z tych konfliktów nie jest związany z tą pracą. Wszyscy pozostali Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Uzyskanie tkanek kontrolnych i chorobowych od ludzi ma kluczowe znaczenie dla modelowania chorób in vitro i ex vivo; Jednak, podczas gdy często mówi się o wyzwaniach związanych z wypełnieniem luki między ławką a łóżkiem pacjenta, odwrotna kolejność - przejście z sali operacyjnej na ławkę - jest często równie zniechęcająca. Niezbędne dla podstawowego naukowca w celu uzyskania pierwotnych próbek tkanek ludzkich jest współpraca z zaangażowanym naukowcem chirurgiem, który ma zespół pielęgniarek, techników chirurgicznych, asy...

Zwapnienie zastawki aortalnej (CAVD) jest przewlekłą patologią charakteryzującą się stanem zapalnym, zwłóknieniem i makrozwapnieniem płatków zastawki aortalnej. Postępująca przebudowa i zwapnienie płatków (określane jako stwardnienie aorty) może prowadzić do utrudnienia przepływu krwi (zwężenia zastawki aortalnej), co przyczynia się do udaru mózgu i prowadzi do niewydolności serca. Obecnie jedynym sposobem leczenia CAVD jest chirurgiczna lub przezcewnikowa wymiana zastawki aortalnej (odpowiednio SAVR i TAVR). Nie ma niechirurgicznej możliwości zatrzymania lub odwrócenia progresji CAVD, a bez wymiany zastawki śmiertelność zbliża się do 50% w ciągu 2-3 lat1,2,3. Zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tej patologii pozwoli zidentyfikować potencjalne nowe podejścia terapeutyczne.
U zdrowego dorosłego, płatki zastawki aortalnej mają około jednego milimetra grubości, a ich główną funkcją jest utrzymanie jednokierunkowego przepływu krwi z lewej komory4. Każdy z trzech listków składa się z warstwy komórek śródbłonka zastawki (VEC), które wyściełają zewnętrzną powierzchnię płatka i działają jako bariera. VEC utrzymują homeostazę zastawki poprzez regulację przepuszczalności, adhezji komórek zapalnych i sygnalizacji parakrynnej5,6,7. Komórki śródmiąższowe zastawki (VIC) obejmują większość komórek w ulotce zastawki8. VIC są ułożone w trzech charakterystycznych warstwach w ulotce. Warstwy te są znane jako ventricularis, spongiosa i fibrosa9. Komora jest skierowana w stronę lewej komory i zawiera włókna kolagenu i elastyny. Środkowa warstwa, gąbczasta, zawiera wysoką zawartość proteoglikanów, które zapewniają elastyczność ścinania podczas cyklu pracy serca. Zewnętrzna warstwa zwłóknienia znajduje się blisko powierzchni odpływu po stronie aorty i jest bogata w kolagen fibrylarny typu I i III, który zapewnia siłę do utrzymania koaptacji podczas rozkurczu10,11,12. VIC znajdują się w stanie spoczynku, jednak czynniki takie jak stan zapalny, przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i stres mechaniczny mogą zakłócić homeostazę VIC8,9,13,14,15,16. Wraz z utratą homeostazy, VIC aktywują i uzyskują fenotyp podobny do miofibroblastów, zdolny do proliferacji, kurczenia się i wydzielania białek, które przebudowują zewnątrzkomórkowy millieu17. Aktywowane VIC mogą przekształcać się w komórki wapnienia, co przypomina różnicowanie mezenchymalnej komórki macierzystej (MSC) w osteoblast15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Zwapnienie wydaje się inicjować w warstwie fibrosy bogatej w kolagen z wkładu zarówno VEC, jak i VIC, ale rozszerza się i atakuje inne warstwy ulotki8. Tak więc jasne jest, że zarówno VEC, jak i VIC reagują na bodźce w celu zwiększenia ekspresji genów osteogennych, jednak dokładne zdarzenia napędzające aktywację genów osteogennych, a także złożone wzajemne oddziaływanie między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową ulotki, pozostają nieokreślone. Modele mysie nie są idealnym źródłem do badania niegenetycznych czynników patogenezy CAVD, ponieważ u myszy nie rozwija się CAVD de novo26,27, stąd konieczne jest użycie pierwotnych tkanek ludzkich i pierwotnych linii komórkowych wyizolowanych z tych tkanek. W szczególności konieczne jest uzyskanie tych komórek w dużej liczbie i dobrej jakości, ponieważ dziedzina hodowli komórkowych 3D i modelowania organoidów rozwija się i prawdopodobnie stanie się alternatywą dla modeli mysich opartą na ludziach ex vivo.
Celem obecnej metody jest udostępnienie przepływu pracy, który stworzył warunki do efektywnego izolowania i hodowania VEC i VIC uzyskanych z chirurgicznie usuniętych zastawek od ludzkich dawców. Poprzednie badania wykazały udaną izolację VEC i VIC z świń28 i mysich zastawek29, o ile nam wiadomo, jest to pierwsze opisujące izolację tych komórek w tkankach ludzkich. Opisany tutaj protokół ma zastosowanie do zastawek wycinanych przez ludzi i znacznie omija i poprawia uszkodzenia spowodowane często długim czasem pobierania między wycięciem tkanki a przetwarzaniem laboratoryjnym poprzez wprowadzenie wykorzystania roztworu do przechowywania w chłodni, roztworu buforowanego klinicznie stosowanego w przeszczepach narządów, który znacznie stabilizuje komórki wycinanej tkanki. Opisany tutaj protokół pokazuje również, w jaki sposób określić fenotyp komórki i zagwarantować wysoką skuteczność przeżycia komórki przy minimalnym zanieczyszczeniu krzyżowym komórek.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m filtr</td><td>Thermo Scientific</td><td>7211345</td><td>Przygotowanie płytki z powłoką kolagenową</td></tr><tr><td>10 cm płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>Hodowla komórkowa/ekspansja linii komórkowej</td></tr><tr><td>10 ml pipeta serologiczna</td><td>Fisher</td><td>14955234</td><td>Izolacja VEC/VIC, hodowla komórkowa, ekspansja linii komórkowej</td></tr><tr><td>1000 &mu; Końcówki filtrujące L</td><td>VWR</td><td>76322-154</td><td>Hodowla komórkowa/rozszerzanie linii komórkowej</td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące 10XL</td><td>VWR</td><td>76322-132</td><td>Hodowla komórkowa/rozszerzanie linii komórkowej</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>Przechowywanie tkanek, izolacja VIC/VEC</td></tr><tr><td>16% wodny roztwór paraformaldehydu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710S</td><td>Utrwalacz tkanek i komórek</td></tr><tr><td>190 proof etanol</td><td>Decon</td><td>2801</td><td>Dezynfekcja</td></tr><tr><td>1x DPBS: bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>roztwór soli fizjologicznej. Izolacja VIC/VEC</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Fisher</td><td>BP2944100</td><td>roztwór soli fizjologicznej. Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC</td></tr><tr><td>20 &mu; L końcówki filtracyjne</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td>Hodowla komórkowa/ekspansja linii komórkowej</td></tr><tr><td>200 proof etanol</td><td>Decon</td><td>2701</td><td>Deparafinowanie próbek tkanek</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher</td><td>A416P 4</td><td>Wytwarzanie płytek pokrytych kolagenem</td></tr><tr><td>Pipta serologiczna 5 ml</td><td>Fisher</td><td>14955233</td><td>Izolacja VEC/VIC, hodowla komórkowa, ekspansja linii komórkowej</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td>Przechowywanie tkanek, izolacja VIC/VEC</td></tr><tr><td>Naczynie 60 mm</td><td>GenClone</td><td>25-260</td><td>VEC izolacja</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>Hodowla komórkowa / ekspansja linii komórkowej</td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty</td><td>Fisher</td><td>BP2401 500</td><td>Wykonywanie płytek pokrytych kolagenem</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 falloidyna</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Fluorescencyjny Barwienie przeciwbarwiące f-aktyną</td></tr><tr><td>Belzer UW Roztwór do przeszczepów w chłodni</td><td>Bridge to Life</td><td>BUW0011L</td><td>Roztwór do przechowywania tkanek</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V - bez kwasów tłuszczowych 25g</td><td>Bioworld</td><td>220700233</td><td>potwierdzenie VEC z CD31+ Dynabeads</td></tr><tr><td>Przeciwciało kalponiny 1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab46794</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (barwienie VIC dodatnie)</td></tr> <tr><td>CD31 (PECAM-1) (89C2)</td> <td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>3528</td><td>Przeciwciało pierwotne (barwienie VEC dodatnie)</td></tr> <tr><td>CD31 + Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>11155D</td><td>Potwierdzenie VEC z CD31 + Dynabeads Sygnalizacja</td></tr><tr><td>komórkowa</td><td>CDH5</td><td>2500</td><td>Przeciwciało pierwotne (barwienie dodatnie VEC)</td></tr> <tr><td>Sitko komórkowe z 0,70 &mu; m pory</td><td>Izolacja Corning</td><td>431751</td><td>VIC</td></tr><tr><td>Kolagen 1, białko ogona szczura</td><td>Gibco</td><td>A1048301</td><td>Wytwarzanie płytek pokrytych kolagenem</td></tr><tr><td>Kolagenaza II</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004176</td><td>Trawienie tkankowe. Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC</td></tr><tr><td>Conflikt Gotowy do użycia środek dezynfekujący w sprayu</td><td>Decon</td><td>4101</td><td>Dezynfekcja</td></tr><tr><td>Countess II Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td>Automatyczny licznik komórek</td></tr><tr><td>Countess II Szkiełka nakrywkowe wielokrotnego użytku</td><td>Invitrogen</td><td>2026h</td><td>Wymagana automatyczna osłona do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>125485E</td><td>Montaż próbek zaworów</td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td>Olympus Plastics</td><td>24-202</td><td>Zamrażanie komórek/próbek tkanek</td></tr><tr><td>Wybielacz dezynfekujący z CLOROMAX - Formuła skoncentrowana&nbsp;</td><td>Clorox</td><td>N/A Dezynfekcja</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569044</td><td>Pożywka wzrostowa. Ekspansja VIC</td></tr><tr><td>EBM - Pożywka dla komórek śródbłonka, Pożywka podstawowa, wolne od czerwieni fenolowej 500</td><td>Pożywki wzrostowe Lonza Walkersville</td><td>CC3129</td><td>. Rozszerzenie VEC</td></tr><tr><td>EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 zestaw SingleQuot Kit</td><td>Lonza Walkersville</td><td>CC4176</td><td>Suplement podłoża wzrostowego. Rozszerzenie VEC</td></tr><tr><td>Mikroskop EVOS FL</td><td>Life Technologies</td><td>Numer modelu: AME3300</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Mikroskop EVOS XL</td><td>Technologie życia</td><td>AMEX1000</td><td>Wizualizacja komórek podczas ekspansji linii komórkowej</td></tr> Surowica bydlęca płodu - Premium Select R&<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> D Systems</td><td>S11550</td><td>VIC expansion</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC</td></tr><tr><td>Skrobaki komórkowe Fisherbrand</td><td>Fisher</td><td>08-100-241</td><td>Ekspansja VIC</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td>Przeciwgrzybicze: Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td>Antybiotyk: Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Globe Scientific Inc</td><td>1358L</td><td>Próbki zaworów montażowych</td></tr><tr><td>Koza anty-mysz 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>Fluorescencyjne przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Koza anty-mysz 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td>Fluorescencyjne przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Koza anty-królik 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Fluorescencyjne wtórne przeciwciało</td></tr><tr><td>Koza anty-królik 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Fluorescencyjne przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Invitrogen Countess II FL Szkiełko wielokrotnego użytku</td><td>Invitrogen</td><td>A25750</td><td>Wymagany automatyczny licznik komórek Odczynnik</td></tr><tr><td>Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td>Fluorescencyjny barwnik przeciwutleniający jądro</td></tr><tr><td>LM-HyCryo-STEM - 2X Pożywka do kriokonserwacji dla komórek macierzystych</td><td>HyClone Laboratories, Inc.</td><td>SR30002</td><td>Przechowywanie komórek mrożonych</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe</td><td>Fisher Chemical Permount</td><td>SP15-100</td><td>Zawór montażowy próbki</td></tr><tr><td>Mr. Frosty pojemnik do zamrażania</td><td>Nalgene</td><td>51000001</td><td>Pojemnik do kontrolowanego zamrażania próbek</td></tr><tr><td>Mycoplasma-ExS Spray</td><td>PromoCell</td><td>PK-CC91-5051</td><td>Dezynfekcja</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td>Antybiotyk. Ekspansja VIC</td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ANTMPT</td><td>Anty-mykoplazma. Izolacja i ekspansja VIC/VEC</td></tr><tr><td>Przeciwciało SM22a</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td>Przeciwciało pierwotne (barwienie dodatnie VIC)</td></tr><tr><td>Nożyczki o standardowym wzorze</td><td>Narzędzia do nauki</td> o wysokiej jakości <td>14001-14</td><td>Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC</td></tr><tr><td>Sterylny wacik bawełniany</td><td>Puritan</td><td>25806 10WC</td><td>Izolacja VEC</td></tr><tr><td>Kaseta na tkanki ludzkie Swingsette</td><td>Simport Scientific</td><td>M515-2</td><td>Pojemnik do zatapiania tkanek</td></tr><tr><td>Kleszcze Taylora (17 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11016-17</td><td>Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>Roztwór do zliczania komórek</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>Rozdzielanie VIC/VECs</td></tr><tr><td>Zestaw von Kossa</td><td>Polysciences</td><td>246331</td><td>Barwienie skrawków parafinowych tkanek do zwapnienia</td></tr><tr><td>przeciwciało czynnika von Willebranda</td><td>Abcam</td><td>ab68545</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (barwienie dodatnie VEC)</td></tr> <tr><td>Ksyleny</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3S-4</td><td>Próbki tkanek deparrafinowających</td></tr> <tr><td>i przeciwciało alfa SMA</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (barwienie VIC dodatnie)</td></tr></tbody></table>

izolacja ludzkich pierwotnych komórek zastawki do modelowania chorób in vitro

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Zwapnienie zastawki aortalnej (CAVD) występuje u prawie jednej trzeciej starszej populacji. Pogrubienie, usztywnienie i zwapnienie zastawki aortalnej powoduje zwężenie zastawki aortalnej i przyczynia się do niewydolności serca i udaru mózgu. Patogeneza choroby jest wieloczynnikowa, a stresy, takie jak zapalenie, przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej, przepływ turbulentny oraz naprężenia mechaniczne i naprężenia, przyczyniają się do osteogennego różnicowania komórek śródbłonka zastawki i śródmiąższu zastawki. Jednak dokładne czynniki inicjujące, które napędzają osteogenną przemianę zdrowej komórki w komórkę zwapniejącą, nie są w pełni zdefiniowane. Co więcej, jedyną obecnie terapią zwężenia zastawki aortalnej wywołanego CAVD jest wymiana zastawki aortalnej, w której usuwa się natywną zastawkę (chirurgiczna wymiana zastawki aortalnej, SAVR) lub wprowadza się całkowicie składaną zastawkę zastępczą za pomocą cewnika (przezcewnikowa wymiana zastawki aortalnej, TAVR). Te zabiegi chirurgiczne wiążą się z wysokimi kosztami i poważnym ryzykiem; W związku z tym konieczne jest zidentyfikowanie nowych celów terapeutycznych do odkrywania leków. W tym celu w niniejszym badaniu opracowano przepływ pracy, w którym chirurgicznie usunięte tkanki od pacjentów i tkanki zwłok dawcy są wykorzystywane do tworzenia specyficznych dla pacjenta pierwotnych linii komórek zastawek do modelowania chorób in vitro. Protokół ten wprowadza wykorzystanie rozwiązania do przechowywania w chłodni, powszechnie stosowanego w przeszczepach narządów, w celu zmniejszenia uszkodzeń spowodowanych często długim czasem pobierania między wycięciem tkanki a przetwarzaniem laboratoryjnym, z korzyścią dla znacznie stabilizującej komórki wycinanej tkanki. Wyniki niniejszego badania pokazują, że izolowane komórki zastawki zachowują swoją zdolność proliferacyjną oraz fenotypy śródbłonka i śródmiąższu w hodowli przez ponad kilka dni po usunięciu zastawki od dawcy. Wykorzystanie tych materiałów pozwala na pobranie komórek kontrolnych i CAVD, z których tworzone są zarówno linie komórkowe kontrolne, jak i chorobowe.

Powyższy protokół opisuje kroki niezbędne do obróbki tkanek zastawek ludzkich oraz izolacji i tworzenia żywotnych linii komórkowych z tych tkanek. Płatki zastawki aorty są poddawane obróbce w celu zatopienia w parafinie, zamrażane gwałtownie do długoterminowego przechowywania w celu analizy biochemicznej lub genetycznej oraz trawione w celu izolacji VEC i VIC (Rysunek 1). Choć materiały chirurgiczne prawdopodobnie będą posiadały kliniczną diagnozę stenozy aortalnej i mogą wykazywać duże guzk...

Ten protokół opisuje zbieranie ludzkich zastawek aortalnych pobranych podczas zabiegów chirurgicznej wymiany zastawki aortalnej lub z tkanki zwłok, a następnie izolację, rozszerzanie i charakterystykę specyficznych dla pacjenta komórek śródbłonka i śródmiąższu pierwotnej zastawki. Uwzględniono ważne szczegóły dotyczące procesów potrzebnych do zapewnienia żywotności komórek i swoistości fenotypu.

Izolacja ludzkich pierwotnych komórek zastawki do modelowania chorób in vitro

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...

Izolacja ludzkiego śródbłonka zastawki pierwotnej i komórki śródmiąższowej ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmu leżącego u podstaw patogenezy zwapnienia zastawki aortalnej. Kiedy zastawka jest wycinana z tkanki natywnej, żywotność komórek spada. Zidentyfikowaliśmy więc metodę, która przedłuża żywotność komórek.Po otrzymaniu pobranych próbek tkanki zastawki należy usunąć korzeń aorty i zanurzyć tkankę w 50-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej sterylny roztwór do płukania. Po 10 minutach inkubacji w wiaderku na lodowisku na bujaku, spryskaj rurki 70% etanolem. W sterylnym kapturze do hodowli tkankowej przenieść tkankę na szalkę Petriego i wyciąć dwie ulotki zastawki.Umieść jedną ulotkę w fiolce kriogenicznej i zamroź tkankę w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby utrwalić tkankę do barwienia zawartością wapnia, przetnij drugą ulotkę na pół od guzka do zawiasu i umieść oba kawałki tkanki w kasecie zanurzonej w 4% paraformaldehydzie. Następnie umieść cały zestaw na bujaku w temperaturze pokojowej na co najmniej dwie, ale nie dłużej niż cztery godziny.Aby wyizolować komórki śródmiąższowe zastawki, przenieś ulotkę do nowej stoż

isolation-of-human-primary-valve-cells-for-in-vitro-disease-modeling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli czystych populacji komórek śródbłonka zastawek serca (VEC). Komórki VEC można izolować z obu stron cuspisu lub płatka zastawki, a bezpośrednio po tym procesie możliwe jest łatwe wyizolowanie znajdujących się pod nimi komórek śródmiąższowych (VIC).

Izolacja komórek śródbłonka zastawek

Niniejszy artykuł przedstawia metodę izolacji i hodowli zarodków przepiórki lub kury na etapie HH14.- komórki endokardialne zastawki oraz mezenchymalne komórki poduszeczki zastawkowej w stadium HH25.

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek progenitorowych zastawek ptasich

W tym filmie pokazujemy izolację komórek śródmiąższowych zastawki aortalnej z serca dorosłej myszy za pomocą dwuetapowej procedury kolagenazy i ich późniejszą hodowlę w małej ilości pożywki wzrostowej.

Izolacja komórek śródmiąższowych zastawki myszy: enzymatyczna metoda izolowania i hodowli VIC z mysiej zastawki aortalnej

Zdolność do izolowania komórek śródbłonka zastawki serca (VEC) jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów rozwoju, utrzymania i choroby zastawki.  W tym miejscu opisujemy izolację VEC od embrionalnych i dorosłych myszy Tie2-GFP za pomocą FACS, co pozwoli na badania określające udział VEC w procesach rozwojowych i chorobowych.

Izolacja komórek śródbłonka mysiej zastawki

Tutaj prezentujemy model przepływu ex vivo, w którym mysie zastawki mogą być hodowane, co pozwala na badanie biologii zastawki.

Hodowla zastawek serca myszy w miniaturowym systemie hodowli tkankowej

Ten protokół opisuje izolację, hodowlę i zwapnienie komórek śródmiąższowych zastawki pochodzących od szczurów, wysoce fizjologiczny model in vitro zwapnienia zastawki aortalnej (CAVD). Wykorzystanie tego szczurzego modelu ułatwia badania nad CAVD w badaniu mechanizmów komórkowych i molekularnych, które leżą u podstaw tego złożonego procesu patologicznego.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych komórek śródmiąższowych zastawki szczura: nowy model do badania zwapnienia zastawki aortalnej

W tym badaniu opisujemy proces izolacji limfocytów T ze świeżych próbek zwapniałych zastawek aortalnych oraz etapy analityczne klonowania limfocytów T w celu scharakteryzowania adaptacyjnych podzbiorów leukocytów za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Badanie zwapnienia zastawki aortalnej poprzez izolację i hodowlę limfocytów T przy użyciu komórek zasilających z napromieniowanej Buffy Coat

Ten artykuł opisuje izolację komórek mysiej zastawki aortalnej za pomocą dwuetapowej procedury kolagenazy. Izolowane komórki zastawki myszy są ważne dla wykonywania różnych testów, takich jak test zwapnienia in vitro, oraz dla badania szlaków molekularnych prowadzących do mineralizacji zastawki aortalnej.

Izolacja komórek zastawki śródmiąższowej myszy w celu zbadania zwapnienia zastawki aortalnej in vitro

Ten artykuł opisuje metodę opartą na hodowli eksplantatów do izolacji i hodowli pierwotnych, specyficznych dla pacjenta ludzkich komórek mięśni gładkich aorty i fibroblastów skóry. Ponadto przedstawiono nowatorską metodę pomiaru skurczu komórek i późniejszej analizy, która może być wykorzystana do badania specyficznych dla pacjenta różnic w tych komórkach.

Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Pierwotne hepatocyty stanowią cenne narzędzie do oceny funkcji biochemicznych, molekularnych i metabolicznych w fizjologicznie istotnym systemie eksperymentalnym. Opisujemy niezawodny protokół perfuzji wątroby szczura in situ, który pozwala na konsekwentne uzyskiwanie żywotnych hepatocytów w ilości do 1,0 × 108 komórek na preparat, przy żywotności komórek w zakresie 88 ~ 96%.

Izolacja i hodowla pierwotna komórek wątroby szczura

Naucz się izolować ludzkie pierwotne komórki zastawki aortalnej do modelowania chorób in vitro. Ta metoda zapewnia około 40% żywotności komórek do 61 godzin po ekstrakcji, wspierając badania nad patogenezą zwapnienia zastawki aortalnej.

Izolacja ludzkich pierwotnych komórek zastawki do modelowania chorób in vitro

Przeglądaj więcej filmów