Generowanie 3D organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc

Protokół ten wykorzystuje indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste do różnicowania ich w komórki płuc w celu modelowania ludzkiej choroby płuc i rozwoju w naczyniu. Protokół ten jest istotny, ponieważ trudno jest uzyskać i hodować pierwotną ludzką tkankę płucną. Główną zaletą różnicowania komórek płuc od pluripotencjalnych komórek macierzystych jest stały dopływ określonych komórek płuc do badania rozwoju i chorób płuc u ludzi.

Komórki te mogą być utrzymywane w hodowli komórkowej przez długi czas, mogą być kriokonserwowane do przyszłych zastosowań i mogą być manipulowane genetycznie w celu badania mutacji genów. Procedurę zademonstruje Rachel McVicar, doktorantka z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy powoli rozmrozić pożywkę o obniżonej zdolności wzrostu lub GFR na lodzie i rozcieńczyć ją w równej objętości zimnego DMEM F12.

Umieść końcówki P1000 w zamrażarce, aby schłodziły się przed użyciem. Następnie pokryj każdą studzienkę 12-dołkowej płytki 500 mikrolitrami podłoża o macierzy membrany podstawnej 50% GFR i usuń nadmiar mieszaniny pożywki i pęcherzyków z dołków. Umieść płytki dołków na mokrym lodzie lub w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zastygły na 20 minut, a następnie przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc.

Gdy wysokie PSE osiągną 70% konfluencji, dodaj 10 mikromolowych inhibitorów ROCK Y27632 do ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych i odczekaj godzinę przed dysocjacją. Odessać pożywkę i raz umyć komórki PVS. Oddziel IPSC, dodając 500 mikrolitrów pożywki do oddzielania komórek na studzienkę i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.

Po inkubacji dodać 500 mikrolitrów pożywki do pasażowania komórek macierzystych na dołek. Delikatnie pipetuj komórki za pomocą końcówki P1000, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie przenieś zdysocjowane komórki do 15-mililitrowej probówki i wiruj przez pięć minut przy 300 razy G. Po odwirowaniu odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy jednym mililitrem pożywki mTeSR Plus uzupełnionej 10-mikromolowym inhibitorem ROCK.

Po policzeniu komórek dodać dwa razy 10 do piątego IPSC do każdego dołka 12-dołkowej płytki pokrytej pożywką GFR i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia należy odessać mTeSR Plus przed dodaniem ostatecznej pożywki indukcyjnej endodermy lub DE. W drugim i trzecim dniu zmień media indukcyjne DE.

W czwartym dniu należy rozpocząć indukcję AFE, zastępując pożywkę indukcyjną DE pożywką podstawową bez surowicy. Zmieniaj pożywkę AFE codziennie przez trzy dni przed analizą skuteczności AFE pod koniec szóstego dnia. Siódmego dnia rozmrozić podłoże z matrycą błony podstawnej GFR na lodzie do późniejszego wykorzystania.

Jednocześnie należy przystąpić do różnicowania komórek progenitorowych płuc poprzez zasysanie pożywki AFE i mycie studzienek PVS. Dodaj jeden mililitr roztworu do oddzielania komórek do studzienki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji dodać jeden mililitr pożywki hartowniczej do studzienek zawierających roztwór do odrywania komórek.

Utrzymuj komórki jako agregaty, delikatnie pipetując w górę i w dół. Upewnij się, że wszystkie komórki są usunięte, ale do przeniesienia ich do 15-mililitrowej stożkowej probówki do wirowania w temperaturze 300 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad ogniwa w pożywce indukcyjnej LPC.

Policz komórki i dodaj 2,5 razy 10 do piątych komórek do 100 mikrolitrów zimnej pożywki z macierzy błony podstawnej GFR i dobrze wymieszaj. Umieścić kroplę w studzienku na 12-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki LPC na studzienkę, upewniając się, że kropla pożywki jest całkowicie zanurzona i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W ósmym dniu zmień pożywkę LPC, aby usunąć inhibitor ROCK Y27632. Zmieniaj nośniki co drugi dzień i analizuj wydajność LPC na koniec 16 dnia. W dniu 17 umyj studzienki i dodaj 500 mikrolitrów dwóch mikrogramów na mililitr dypazy.

Odpipetować mieszaninę do dyspazy pipetą P1000 i inkubować przez 15 minut, następnie pipetować mieszaninę i inkubować przez kolejne 15 minut. Po inkubacji dodać jeden mililitr pożywki hartowniczej do studzienek zawierających dyspazę i przenieść komórki do stożkowych probówek. Odwirować i ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze schłodzonego PVS, a następnie powtórzyć wirowanie.

Następnie ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pożywki oddzielającej komórki. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 minut, następnie dodać równą objętość pożywki hartowniczej i ponownie odwirować. Zawiesić osad w jednym mililitrze środka hartowniczego i 10 mikromolowym inhibitorze ROCK Y27632.

Wykonaj liczenie komórek, aby obliczyć objętość potrzebną do uzyskania osiem razy 10 do czwartej komórki na studzienkę. Następnie podziel wymaganą objętość komórek LPC na 1,5 mililitra mikroprobówek wirówkowych i wiruj przez pięć minut przy 300 razy G. Usuń nadmiar supernatantu bez mieszania osadu komórkowego, pozostawiając 10 mikrolitrów pozostałej pożywki. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach zimnego podłoża z matrycą błony podstawnej GFR i przenieść komórki do wkładek błony do hodowli komórkowych.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Po inkubacji dodać jeden mililitr pożywki indukcyjnej 3D organoidowej do komory podstawno-bocznej wkładki i zastępować ją świeżą pożywką co drugi dzień przez sześć dni. W 23 dniu zmień podłoże na podłoże rozgałęziające 3D, a następnie zmieniaj podłoże co drugi dzień przez sześć dni.

W 29 dniu zmień pożywkę na pożywkę do dojrzewania 3D i kontynuuj wymianę pożywki co drugi dzień przez następne sześć dni. W czwartym dniu indukcji DE przyłączone komórki wykazują zwartą morfologię bruku. Stwierdzono ekspresję ostatecznych markerów endodermy CXCR4 i SOX17 nałożonych na jądra, potwierdzając różnicowanie endodermy.

Indukcja przedniego odcinka jelita grubego została potwierdzona w siódmym dniu, przy czym morfologia wykazała bardziej ściśle zbite komórki, a markery FOXA2 i SOX2 pokryte jądrami. Generowanie 3D komórek progenitorowych płuc zostało potwierdzone za pomocą sferoid 3D i endogennej ekspresji GFP NKX2-1 w reporterowej linii komórkowej. Po trzech tygodniach różnicowania w organoidy całych płuc, markery płucne analizowano za pomocą immunocytochemii.

W organoidach zaobserwowano markery rozgałęzionej morfogenezy SOX2 i SOX9 nałożone na jądra. Markery proksymalne płuc P63 i KRT5, oba markery komórek podstawnych, zostały pomyślnie wykryte wraz z SCGB3A2, który jest markerem komórek klubowych. Dystalne markery płuc indukowały markery Pro SPC i SPB dla komórek pęcherzyków płucnych typu II.

I markery HOPX komórek pęcherzyków płucnych typu I. Dodatkowo NKX2-1 i ZO1 ulegały ekspresji nałożonej na jądra. Markery mezenchymowych komórek płuc PGFR Alpha, marker fibroblastów, ulegający koekspresji z SOX9, reprezentowały mezenchymę dystalną.

Ulegała również ekspresji wimentyny, która była rozprowadzana po całym płucu. Po tej procedurze organoidy płuc można wyposażyć w indukowane pluripotencjalne komórki śródbłonka i komórki odpornościowe pochodzące z komórek macierzystych. Rozwój i choroba płuc następuje poprzez sygnalizację między populacjami komórek nabłonkowych i mezenchymalnych, ale także z komórek śródbłonka i makrofagów.

System modelowania tkanki płucnej 3D ma kliniczne znaczenie dla badania chorób człowieka i terapii.