Name: Generowanie 3D organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę generowania trójwymiarowych organoidów płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych hiPSC. Ten protokół umożliwia modelowanie rozwoju i chorób ludzkiego płuca in vitro z komórkami nabłonkowymi i mezenchymalnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

Ten protokół badania został zatwierdzony przez Institutional Review Board of UCSD's Human Research Protections Program (181180).
1. Ostateczna indukcja endodermy z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Dzień 1 - 3)
<ol>
	<li>Pożywka matrycowa z membraną podstawną o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR) (BM) wolno rozmrażać na lodzie 30 minut przed użyciem. W zimnej mieszaninie DMEM/F12 rozcieńczyć podłoże GFR BM w stosunku 1:1 tak, aby stanowiło 50% tego podłoża. Umieść końcówki pipet P1000 w zamrażarce, aby schłodziły się przed użyciem.</li>
	<li>Pokryj każde zagłębienie 12-dołkowej płytki 500 μl 50% podłoża o macierzy podstawnej GFR przygotowanego w lodowato zimnym DMEM/F12. Po pokryciu żądanej liczby dołków usuń nadmiar mieszaniny pożywki i/lub pęcherzyków z dołków i umieść płytkę na lodzie lub lodówce w temperaturze 4 °C na 20 minut, aby stężała. Następnie przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C na noc, aby zżelowała i wyschła.</li>
	<li>Gdy hiPSC osiągną 70-90% konfluencji, dodaj 10 μM inhibitora kinazy związanej z Rho (ROCK) Y-27632 na godzinę przed dysocjacją. Odessać pożywkę i przemyć raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Oddzielić hiPSC, dodając pożywkę do oddzielania komórek (0,5 ml / dołek 12-dołkowej płytki) i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Wyjąć płytki z inkubatora i dodać 0,5 ml/12 dołków pożywki do pasażowania komórek macierzystych (Tabela 1) do studzienek; delikatnie rozcierać komórki za pomocą końcówki P1000, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Przenieść zdysocjowane komórki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml; Wirować przez 5 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml pożywki mTeSR Plus uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK (Y-27632). Wykonaj zliczanie komórek. Dodać 2,0 x 105 hiPSC w 1 ml mTeSR uzupełnionego inhibitorem ROCK Y-27632 na studzienkę 12-dołkowej płytki pokrytej medium z membraną podstawną GFR. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. 
	UWAGA: Liczba wysiewu komórek musi być zoptymalizowana dla każdej linii komórek. 24 godziny po poszyciu studzienki powinny być zlewane w 50%-70%.</li>
	<li>W dniu 1 odessać mTeSR Plus i dodać pożywkę indukcyjną Definitive Endoderm (DE) (Tabela 1) uzupełnioną 100 ng/ml ludzkiej aktywiny A i 5 μM inhibitora GSK3β/aktywatora Wnt CHIR99021, 
	UWAGA: Pożywki DE z inhibitorem GSK3β/aktywatorem Wnt CHIR99021 należy usunąć w ciągu 20-24 godzin od indukcji DE w dniu 1 w celu pomyślnego różnicowania.</li>
	<li>W dniu 2 i 3 zmień pożywkę na indukcyjną DE uzupełnioną tylko 100 ng / ml aktywiny A. 
	UWAGA: Różnicowanie DE nie powinno przekraczać łącznie 72 godzin, w przeciwnym razie skuteczność zmniejszy się. W 4 dniu, jeśli zaobserwuje się obumieranie dużych komórek, skróć całkowity czas ekspozycji na media DE o 6-12 godzin.</li>
	<li>Aby przeanalizować wydajność DE, potwierdź więcej niż 90% ekspresję CXCR4 i/lub cKit za pomocą cytometrii przepływowej lub analizy immunofluorescencyjnej FOXA2 i/lub SOX17 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2a).</li>
</ol>
2. Indukcja endodermy przedniego jelita przedniego (AFE) (Dzień 4 - 6)
<ol>
	<li>W 4 dniu zmień pożywkę na pożywkę wolną od surowicy (SFBM) (Tabela 1) uzupełnioną 10 μM SB431542 i 2 μM Dorsomorphina do indukcji AFE. Zmieniaj media AFE codziennie przez 3 dni (dzień 4, dzień 5 i dzień 6).</li>
	<li>Aby przeanalizować skuteczność AFE, potwierdź solidną ekspresję SOX2, TBX1 i FOXA2 za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2b).</li>
</ol>
3. Różnicowanie komórek progenitorowych płuc (LPC) (Dzień 7 - 16)
<ol>
	<li>W dniu 7 rozmrozić podłoże z matrycą membrany podstawnej GFR na lodzie. Odessać pożywkę AFE i dobrze umyć 1x PBS. Dodać 1 ml roztworu do oddzielania komórek i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki hartowniczej (2% FBS w DMEM/F12) do studzienek zawierających roztwór do oddzielania komórek. Utrzymuj komórki jako agregaty, delikatnie pipetując w górę i w dół. Upewnij się, że wszystkie komórki zostały usunięte i przeniesione do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przez 5 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce hartowniczej uzupełnionej 10 ng / ml ludzkiego rekombinowanego białka morfogennego kości-4 (BMP4), 0,1 μM kwasu all-trans retinowego (RA), 3 μM inhibitora GSK3β / aktywatora Wnt CHIR99021 i 10 μM inhibitora skały Y-27632.</li>
	<li>Wykonaj zliczanie komórek. Dodaj 2,5 x 105 komórek do 100 μl zimnego podłoża z matrycą membranową GFR-podstawa, dobrze wymieszaj i umieść kropelkę w dołku na 12-dołkowej płytce. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut, aby umożliwić polimeryzację podłoża. Dodać 1 ml pożywki LPC uzupełnionej 10 μM inhibitora ROCK Y-27632 do studzienki, upewniając się, że kropla pożywki jest całkowicie zanurzona i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>W 8 dniu, 24 godziny po indukcji LPC, zmień pożywkę LPC, aby usunąć inhibitor ROCK Y-27632. Zmieniaj pożywkę LPC co drugi dzień, w sumie przez 9-11 dni. 
	UWAGA: Jeśli podłoże zmieni kolor na żółty w ciągu 24 godzin, należy je zmieniać codziennie.</li>
	<li>Aby przeanalizować wydajność LPC, potwierdź solidną ekspresję wewnątrzkomórkowego czynnika transkrypcyjnego NKX2-1 lub wykonaj cytometrię przepływową dla markerów powierzchniowych CD47hi/CD26low15 lub CPM18 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2c). Ogólnie rzecz biorąc, sferoidy LPC powinny być okrągłe i przezroczyste (<silna klasa="xfig">Rysunek 2c). 
	UWAGA: Nie należy przystępować do różnicowania organoidów płucnych, jeśli skuteczność NKX2-1 jest poniżej 30%.</li>
</ol>
4. 3D indukcja organoidów płuc (Dzień 16 - 22)
<ol>
	<li>W dniu 17 rozmrozić podłoże z matrycą błony podstawnej GFR na lodzie. Zassać pożywkę indukcyjną LPC. Następnie dodać 2 μg/ml dypazy (1 ml) do dołka i ponownie zawiesić mieszaninę pożywki/dypazy za pomocą pipety P1000. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Ponownie rozcierać mieszaninę i inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 15 minut.</li>
	<li>Przenieść dyspazę i komórki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Użyj schłodzonego PBS (2-3 ml) do umycia studzienki i ponownego zaparcia mieszaniny dypazy/komórek. Wirować przez 5 minut przy 400 x g. Ręcznie usunąć supernatant, uważając, aby nie usunąć warstwy osadu/osadu komórkowego. Powtórzyć płukanie schłodzonym PBS i odwirować stożkową probówkę wirówkową przez kolejne 5 minut przy 400 x g.</li>
	<li>Ręcznie usunąć supernatant, a następnie dodać 2 ml roztworu dysocjacyjnego na bazie trypsyny do stożkowej probówki wirówkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 minut.</li>
	<li>Po inkubacji ponownie zawiesić komórki za pomocą końcówki do pipety P1000. Następnie dodać równą objętość pożywki hartowniczej do stożkowej probówki wirówkowej i wirować w dół z prędkością 400 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hartowniczej + 10 μM inhibitora ROCK Y-27632. 
	UWAGA: Skuteczna indukcja organoidów płucnych następuje, gdy komórki są osadzone jako agregaty, a nie pojedyncze komórki, należy odpowiednio dostosować pipetowanie.</li>
	<li>Wykonaj zliczanie komórek. Oblicz objętość potrzebną do uzyskania 5,0-8,0 x 104 komórek na studzienkę. Podwielokrotność komórki LPC agreguje się do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i wirować przez 5 minut przy 400 x g. Usuń nadmiar supernatantu, uważając, aby nie poruszyć osadu komórkowego. Pozostaw tylko 10 μl pozostałej pożywki.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl zimnej pożywki z matrycą błony podstawnej GFR i dodać do wkładek błony do hodowli komórkowych (średnica 6,5 mm, pory 0,4 μm, membrana poliestrowa). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut, aby umożliwić polimeryzację podłoża o macierzy membranowej GFR.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki do indukcji organoidów 3D (Tabela 1) uzupełnionej czynnikiem wzrostu fibroblastów-7 (FGF7) (10 ng/ml), FGF10 (10 ng/ml), inhibitorem GSK3β/aktywatorem Wnt CHIR (3 μM), naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF) (10 ng/ml) i 10 μM inhibitora ROCK Y-27632 do komory podstawno-bocznej wkładki membranowej. Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez 6 dni.</li>
</ol>
5. 3D Rozgałęzienia organoidów płuc (Dzień 23 - 28)
<ol>
	<li>W 23 dniu zmień podłoże na rozgałęzione 3D (Tabela 1) uzupełnione FGF7 (10 ng / ml), FGF10 (10 ng / ml), inhibitor GSK3β / aktywator Wnt CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng / ml) i czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) / placental growth factor (PlGF) (10 ng / ml). Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez 6 dni. 
	UWAGA: W 6 dniu różnicowania rozgałęzień 3D powinno być wiele rozgałęzionych organoidów (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).</li>
</ol>
6. 3D dojrzewanie organoidów płuc (Dzień 29 - 34)
<ol>
	<li>W 29 dniu zmień pożywkę do dojrzewania 3D (Tabela 1), która jest taka sama jak pożywka rozgałęziająca 3D, ale z dodatkiem deksametazonu (50 nM), cAMP (100 μM) i 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX), inhibitora fosfodiesterazy określanego również jako izobutyloksantyna (100 μM). Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez 6 dni. 
	UWAGA: W ciągu 24 godzin po dojrzewaniu 3D rozgałęzione organoidy powinny się rozszerzyć i zmienić w przezroczyste kule.</li>
</ol>
7. 3D Immunocytochemia organoidów płuc
<ol>
	<li>W celu analizy 3D organoidów całych płuc, należy utrwalić podłoże macierzy błony podstawnej GFR we wkładkach membranowych za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Zanurzyć w wosku parafinowym i zamontować na szkiełkach zgodnie ze standardowymi opublikowanymi protokołami.</li>
	<li>Wykonaj pobieranie antygenu przed barwieniem. Markery dróg oddechowych obejmują KRT5, MUC5AC i SCGB3A2. Markery pęcherzyków płucnych obejmują SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 i HOPX (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
</ol>
8. Usuwanie całych organoidów płucnych z podłoża macierzy błony podstawnej GFR w celu przejścia, FACS lub kriokonserwacji
<ol>
	<li>Aby oddzielić organoidy od podłoża macierzy błony podstawnej GFR, należy usunąć pożywkę z komory podstawowej i dodać 2 μg/ml dyspazy (1 ml) do komory wierzchołkowej.</li>
	<li>Delikatnie rozcierać mieszaninę pożywki/dypazy za pomocą pipety P1000 i umieszczać w inkubatorze na 15 minut. Delikatnie rozcierać mieszaninę ponownie i inkubować przez kolejne 15 minut.</li>
	<li>Dodać 1 ml schłodzonego PBS (4 °C) i przenieść organoidy z podłożem matrycowym do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować z prędkością 400 x g przez 5 min. Usunąć szwadron ostrożnie, aby nie naruszyć osadu komórkowego.</li>
	<li>Przemyć jeszcze raz 1 ml schłodzonego PBS i wirować w tempie 400 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć supernatant, aby nie naruszyć mieszaniny pożywki i komórek.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu do odrywania komórek do stożkowej probówki wirówkowej, delikatnie rozetrzyć ponownie zawiesić mieszaninę podłoża z matrycą membranową GFR-Basement/komórki. Umieścić w inkubatorze na 12 minut w przypadku pasażowania komórek jako agregatów lub w celu kriokonserwacji) lub 20 minut w przypadku zawiesiny pojedynczej komórki.</li>
	<li>Dodać równą objętość środka hartowniczego i wirować w temperaturze 400 x g przez 5 minut. Zawiesić w medium hartowniczym + 10 μM inhibitora ROCK Y-27632. 
	UWAGA: Na tym etapie w probówce nie powinny być widoczne żadne resztki podłoża z membrany podstawnej. Jeśli pozostał pozostały resztki podłoża, powtórz kroki 8.5 i 8.6.</li>
	<li>Wykonaj zliczanie komórek. Oblicz objętość potrzebną do dalszych zastosowań.</li>
</ol>

<ol><li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+development+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li>
<li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li>
<li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+and+exogenous+stem%2Fprogenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36(2016).</li>
<li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+crosstalk+in+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li>
<li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li>
<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li>
<li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li>
<li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li>
<li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li>
<li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+10+%28FGF10%29+and+branching+morphogenesis+in+the+embryonic+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung.</a> Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).</li>
<li>Bellusci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Sonic+hedgehog+%28Shh%29+in+mouse+embryonic+lung+growth+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis.</a> Development. 124 (1), 53-63 (1997).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li>
<li>Hawkins, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+NKX2-1-expressing+human+lung+progenitors+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).</li>
<li>McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51(2018).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
<li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal%2C+spatial%2C+and+phenotypical+changes+of+PDGFR%CE%B1+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li>
<li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+on+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li>
<li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li>
<li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%2C+Inflammation+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li>
<li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450(2019).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTII-280%2C+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li>
<li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2%2B+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li>
<li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293(2020).</li>
<li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li>
<li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells%3A+universal+donor+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Skuteczne różnicowanie 3D organoidów całych płuc (WLO) opiera się na wieloetapowym, 6-tygodniowym protokole z dbałością o szczegóły, w tym czas ekspozycji na czynniki wzrostu i małe cząsteczki, gęstość komórkową po pasażowaniu oraz jakość hiPSC. Informacje na temat rozwiązywania problemów znajdują się w Tabeli 2. hiPSC powinny być w około 70%-80% zlewne, z mniej niż 5% spontanicznym różnicowaniem przed dysocjacją. Protokół ten wymaga nośnika "mTeSR plus"; jednak zwykła pożywka "mTeSR" została również uży...

Płuco jest skomplikowanym, niejednorodnym, dynamicznym organem, który rozwija się w sześciu różnych etapach - dojrzewanie embrionalne, pseudogruczołowe, kanałowe, workowate, pęcherzykowe i mikronaczyniowe1,2. Dwie ostatnie fazy występują przed i po urodzeniu w rozwoju człowieka, podczas gdy pierwsze cztery etapy występują wyłącznie podczas rozwoju płodu, chyba że nastąpi przedwczesny poród3. Faza embrionalna rozpoczyna się w endodermalnym listku zarodkowym i kończy się pączkowaniem tchawicy i zawiązków płuc. Rozwój płuc następuje częściowo poprzez sygnalizację między komórkami nabłonkowymi i mezenchymalnymi4. Interakcje te powodują rozgałęzianie się płuc, proliferację, determinację losu komórek i różnicowanie komórkowe rozwijającego się płuca. Płuca są podzielone na strefy przewodzące (tchawica do końcowych oskrzelików) i strefy oddechowe (oskrzeliki oddechowe do pęcherzyków płucnych). Każda strefa zawiera unikalne typy komórek nabłonkowych; w tym komórki podstawne, wydzielnicze, rzęskowe, szczotkowe, neuroendokrynne i jonocytowe w przewodzących drogach oddechowych 5, a następnie komórki pęcherzykowe typu I i II w nabłonku oddechowym<klasa sup = "xref">6. Nadal wiele nie wiadomo na temat rozwoju i reakcji na uszkodzenia różnych typów komórek. Modele organoidów płuc pochodzące z iPSC umożliwiają badanie mechanizmów kierujących rozwojem płuc człowieka, wpływu mutacji genetycznych na czynność płuc oraz odpowiedzi zarówno nabłonka, jak i mezenchymy na czynniki zakaźne bez konieczności pierwotnej ludzkiej tkanki płucnej.
Markery odpowiadające różnym etapom różnicowania embrionalnego obejmują CXCR4, cKit, FOXA2 i SOX17 dla definitywnej endodermy (DE)7, FOXA2, TBX1 i SOX2 dla endodermy przedniego jelita (AFE)8, oraz NKX2-1 dla wczesnych komórek progenitorowych płuc9. W rozwoju płuc embrionalnych jelito przednie dzieli się na grzbietowy przełyk i brzuszną tchawicę. Pączki prawego i lewego płuca pojawiają się jako dwa niezależne wyloty wokół pączka tchawicy10. Podczas rozgałęzionej morfogenezy mezenchyma otaczająca nabłonek wytwarza elastyczną tkankę, mięśnie gładkie, chrząstki i naczynia krwionośne11. Interakcja między nabłonkiem a mezenchymą jest niezbędna do prawidłowego rozwoju płuc. Obejmuje to wydzielanie FGF1012 przez mezenchymę i SHH13 wytwarzane przez nabłonek.
Tutaj opisujemy protokół ukierunkowanego różnicowania hiPSC na trójwymiarowe (3D) organoidy całych płuc (WLO). Chociaż istnieją podobne podejścia, które obejmują izolację komórek progenitorowych płuc poprzez sortowanie na etapie LPC, aby uzyskać podobne do pęcherzyków płucnych14,15 (dystalne) organoidy lub organoidy dróg oddechowych16 (proksymalne) organoidy lub generują sferoidy brzuszno-przednie jelita przedniego, aby ludzkie organoidy płucne wyrażały markery komórek pęcherzykowych i mezenchymalnych oraz organoidy progenitorowe końcówek pąków17, mocną stroną tej metody jest włączenie zarówno typów komórek nabłonka płuc, jak i mezenchymów w celu modelowania i koordynowania morfogenezy, dojrzewania i ekspansji rozgałęzień płuc in vitro.
Ten protokół wykorzystuje małe cząsteczki i czynniki wzrostu do kierowania różnicowaniem pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez ostateczną endodermę, endodermę przedniego jelita i komórki progenitorowe płuc. Komórki te są następnie indukowane do organoidów 3D całych płuc poprzez ważne etapy rozwoju, w tym rozgałęzianie i dojrzewanie. Podsumowanie protokołu różnicowania jest pokazane na <silna klasa="xfig">Rysunek 1a z reprezentatywnymi obrazami różnicowania endodermalnego i organoidowego w jasnym polu pokazanymi na <silna klasa="xfig">Rysunek 1b. Rysunek 1c,d pokazuje szczegóły ekspresji genów w różnicowaniu endodermalnym, jak również ekspresję genów zarówno w proksymalnej, jak i dystalnej populacji komórek nabłonka płuc po zakończeniu różnicowania.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 płytki dołkowe</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe, 0,4um, półprzezroczyste</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 bez kwasu retinowego</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) frakcja V, roztwór 7,5%</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Rozpaza</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologie</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>szynki" s F12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Zmodyfikowany Dulbecco" s Medium (IMDM) + Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Wymiana surowicy nokautującej (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglycerol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus Kit (10/opakowanie)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pen/paciorkowiec</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (inhibitor skał</td>)<td>R& Systemy D</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>Czynniki wzrostu/Małe cząsteczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Kwas all-trans retinowy (RA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>R& D Systems</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D Systems</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-izotylo-1-metyloksantyna)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>R& D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>VEGF/PIGF</td><td>R& D Systems</td><td>297-VP/CF</td><td></td></tr><<tr><td>silne>Przeciwciała pierwotne</td><td></td><td></td><td>Szybkość rozcieńczenia</td></tr><tr><td>CXCR4-PE</td><td>R& D Systems</td><td>FAB170P</td><td>1:200 (F)</td></tr><tr><td>HOPX</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-398703</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>HTII-280</td><td>Terrace Biotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>0.145833333</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab52635</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>0.25</td></tr><tr><td>NKX2-1-APC</td><td>LS-BIO</td><td>LS-C264437</td><td>1:1000 (F)</td></tr><tr><td>proSPC</td><td>Abcam</td><td>ab40871</td><td>0.215277778</td></tr><tr><td>SCGB3A2</td><td>Abcam</td><td>ab181853</td><td>0.25</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-014</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SOX9</td><td>R& D Systems</td><td>AF3075</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SPB (dojrzały)</td><td>7 Hills</td><td>48604</td><td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td></tr><tr><td>SPC (dojrzałe)</td><td>LS Bio</td><td>LS-B9161</td><td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td></tr></tbody></table>

generowanie 3d organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Rozwój i choroby płuc u ludzi były trudne do zbadania ze względu na brak biologicznie istotnych systemów modelowych in vitro. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) mogą być różnicowane stopniowo w wielokomórkowe organoidy płuc 3D, zbudowane zarówno z populacji komórek nabłonkowych, jak i mezenchymalnych. Podsumowujemy embrionalne sygnały rozwojowe, wprowadzając czasowo różne czynniki wzrostu i małe cząsteczki, aby skutecznie wygenerować ostateczną endodermę, endodermę przedniego jelita przedniego, a następnie komórki progenitorowe płuc. Komórki te są następnie osadzane w pożywce macierzy błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu (GFR), co pozwala im spontanicznie przekształcić się w organoidy płuc 3D w odpowiedzi na zewnętrzne czynniki wzrostu. Te całe organoidy płuc (WLO) przechodzą wczesne etapy rozwoju płuc, w tym rozgałęzioną morfogenezę i dojrzewanie po ekspozycji na deksametazon, cykliczny AMP i izobutyloksantynę. WLO posiadają komórki nabłonka dróg oddechowych wyrażające markery KRT5 (podstawny), SCGB3A2 (maczuga) i MUC5AC (kielichowy), a także komórki nabłonka pęcherzyków płucnych wykazujące ekspresję HOPX (pęcherzyk płucny typu I) i SP-C (pęcherzyk płucny typu II). Obecne są również komórki mezenchymalne, w tym aktyna mięśni gładkich (SMA) i receptor płytkowego czynnika wzrostu A (PDGFRα). O WLO pochodzących z iPSC można utrzymywać w warunkach hodowli 3D przez wiele miesięcy i sortować w celu uzyskania markerów powierzchniowych w celu oczyszczenia określonej populacji komórek. Włókna WLO pochodzące z iPSC mogą być również wykorzystywane do badania rozwoju płuc człowieka, w tym sygnalizacji między nabłonkiem płuc a mezenchymą, do modelowania mutacji genetycznych dotyczących funkcji i rozwoju ludzkich komórek płuc oraz do określania cytotoksyczności czynników zakaźnych.

24 godziny po wysianiu (dzień 1.), iPSC powinny osiągnąć konfluencję na poziomie 50%–90%. W dniu 2. konfluencja DE powinna wynosić 90%–95%. Podczas indukcji DE w 4. dniu często obserwuje się znaczną śmierć komórek, jednak komórki przytwierdzone zachowują zwartą morfologię typu „brukowej nawierzchni” (cobblestone morphology)Rycina 2b). Przerwać różnicowanie, jeśli większość komórek przylegających odłączy się, i rozważyć skrócenie czasu ekspozycji na pożywkę DE z aktywiną A o 6–12 h. Podczas i...

Artykuł opisuje stopniowe różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do trójwymiarowych organoidów całego płuca zawierających zarówno proksymalne, jak i dystalne komórki nabłonkowe płuc wraz z mezenchymą.

Generowanie 3D organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Protokół ten wykorzystuje indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste do różnicowania ich w komórki płuc w celu modelowania ludzkiej choroby płuc i rozwoju w naczyniu. Protokół ten jest istotny, ponieważ trudno jest uzyskać i hodować pierwotną ludzką tkankę płucną. Główną zaletą różnicowania komórek płuc od pluripotencjalnych komórek macierzystych jest stały dopływ określonych komórek płuc do badania rozwoju i chorób płuc u ludzi.Komórki te mogą być utrzymywane w hodowli komórkowej przez długi czas, mogą być kriokonserwowane do przyszłych zastosowań i mogą być manipulowane genetycznie w celu badania mutacji genów. Procedurę zademonstruje Rachel McVicar, doktorantka z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy powoli rozmrozić pożywkę o obniżonej zdolności wzrostu lub GFR na lodzie i rozcieńczyć ją w równej objętości zimnego DMEM F12.Umieść końcówki P1000 w zamrażarce, aby schłodziły się przed użyciem. Następnie pokryj każdą studzienkę 12-dołkowej płytki 500 mikrolitrami podłoża o macierzy membrany podstawnej 50% GFR i usuń nadmiar mieszaniny pożywki i pęcherzyków z dołków. Umieść płytki dołków na mokrym lodzie lub w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zastygły na 20 minut, a następnie przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc.Gdy wysokie PSE osiągną 70% konfluencji, dodaj 10 mikromolowych inhibitorów ROCK Y27632 do ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych i odczekaj godzinę przed dysocjacją. Odessać pożywkę i raz umyć komórki PVS. Oddziel IPSC, dodając 500 mikrolitrów pożywki do oddzielania komórek na studzienkę i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.Po inkubacji dodać 500 mikrolitrów pożywki do pasażowania komórek macierzystych na dołek. Delikatnie pipetuj komórki za pomocą końcówki P1000, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie przenieś zdysocjowane komórki do 15-mililitrowej probówki i wiruj przez pięć minut przy 300 razy G. Po odwirowaniu odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy jednym mililitrem pożywki mTeSR Plus uzupełnionej 10-mikromolowym inhibitorem ROCK.Po policzeniu komórek dodać dwa razy 10 do piątego IPSC do każdego dołka 12-dołkowej płytki pokrytej pożywką GFR i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia należy odessać mTeSR Plus przed dodaniem ostatecznej pożywki indukcyjnej endodermy lub DE. W drugim i trzecim dniu zmień media indukcyjne DE.W czwartym dniu należy rozpocząć indukcję AFE, zastępując pożywkę indukcyjną DE pożywką podstawową bez surowicy. Zmieniaj pożywkę AFE codziennie przez trzy dni przed analizą skuteczności AFE pod koniec szóstego dnia. Siódmego dnia rozmrozić podłoże z matrycą błony podstawnej GFR na lodzie do późniejszego wykorzystania.Jednocześnie należy przystąpić do różnicowania komórek progenitorowych płuc poprzez zasysanie pożywki AFE i mycie studzienek PVS. Dodaj jeden mililitr roztworu do oddzielania komórek do studzienki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji dodać jeden mililitr pożywki hartowniczej do studzienek zawierających roztwór do odrywania komórek.Utrzymuj komórki jako agregaty, delikatnie pipetując w górę i w dół. Upewnij się, że wszystkie komórki są usunięte, ale do przeniesienia ich do 15-mililitrowej stożkowej probówki do wirowania w temperaturze 300 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad ogniwa w pożywce indukcyjnej LPC.Policz komórki i dodaj 2,5 razy 10 do piątych komórek do 100 mikrolitrów zimnej pożywki z macierzy błony podstawnej GFR i dobrze wymieszaj. Umieścić kroplę w studzienku na 12-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki LPC na studzienkę, upewniając się, że kropla pożywki jest całkowicie zanurzona i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.W ósmym dniu zmień pożywkę LPC, aby usunąć inhibitor ROCK Y27632. Zmieniaj nośniki co drugi dzień i analizuj wydajność LPC na koniec 16 dnia. W dniu 17 umyj studzienki i dodaj 500 mikrolitrów dwóch mikrogramów na mililitr dypazy.Odpipetować mieszaninę do dyspazy pipetą P1000 i inkubować przez 15 minut, następnie pipetować mieszaninę i inkubować przez kolejne 15 minut. Po inkubacji dodać jeden mililitr pożywki hartowniczej do studzienek zawierających dyspazę i przenieść komórki do stożkowych probówek. Odwirować i ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze schłodzonego PVS, a następnie powtórzyć wirowanie.Następnie ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pożywki oddzielającej komórki. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 minut, następnie dodać równą objętość pożywki hartowniczej i ponownie odwirować. Zawiesić osad w jednym mililitrze środka hartowniczego i 10 mikromolowym inhibitorze ROCK Y27632.Wykonaj liczenie komórek, aby obliczyć objętość potrzebną do uzyskania osiem razy 10 do czwartej komórki na studzienkę. Następnie podziel wymaganą objętość komórek LPC na 1,5 mililitra mikroprobówek wirówkowych i wiruj przez pięć minut przy 300 razy G. Usuń nadmiar supernatantu bez mieszania osadu komórkowego, pozostawiając 10 mikrolitrów pozostałej pożywki. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach zimnego podłoża z matrycą błony podstawnej GFR i przenieść komórki do wkładek błony do hodowli komórkowych.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Po inkubacji dodać jeden mililitr pożywki indukcyjnej 3D organoidowej do komory podstawno-bocznej wkładki i zastępować ją świeżą pożywką co drugi dzień przez sześć dni. W 23 dniu zmień podłoże na podłoże rozgałęziające 3D, a następnie zmieniaj podłoże co drugi dzień przez sześć dni.W 29 dniu zmień pożywkę na pożywkę do dojrzewania 3D i kontynuuj wymianę pożywki co drugi dzień przez następne sześć dni. W czwartym dniu indukcji DE przyłączone komórki wykazują zwartą morfologię bruku. Stwierdzono ekspresję ostatecznych markerów endodermy CXCR4 i SOX17 nałożonych na jądra, potwierdzając różnicowanie endodermy.Indukcja przedniego odcinka jelita grubego została potwierdzona w siódmym dniu, przy czym morfologia wykazała bardziej ściśle zbite komórki, a markery FOXA2 i SOX2 pokryte jądrami. Generowanie 3D komórek progenitorowych płuc zostało potwierdzone za pomocą sferoid 3D i endogennej ekspresji GFP NKX2-1 w reporterowej linii komórkowej. Po trzech tygodniach różnicowania w organoidy całych płuc, markery płucne analizowano za pomocą immunocytochemii.W organoidach zaobserwowano markery rozgałęzionej morfogenezy SOX2 i SOX9 nałożone na jądra. Markery proksymalne płuc P63 i KRT5, oba markery komórek podstawnych, zostały pomyślnie wykryte wraz z SCGB3A2, który jest markerem komórek klubowych. Dystalne markery płuc indukowały markery Pro SPC i SPB dla komórek pęcherzyków płucnych typu II.I markery HOPX komórek pęcherzyków płucnych typu I. Dodatkowo NKX2-1 i ZO1 ulegały ekspresji nałożonej na jądra. Markery mezenchymowych komórek płuc PGFR Alpha, marker fibroblastów, ulegający koekspresji z SOX9, reprezentowały mezenchymę dystalną.Ulegała również ekspresji wimentyny, która była rozprowadzana po całym płucu. Po tej procedurze organoidy płuc można wyposażyć w indukowane pluripotencjalne komórki śródbłonka i komórki odpornościowe pochodzące z komórek macierzystych. Rozwój i choroba płuc następuje poprzez sygnalizację między populacjami komórek nabłonkowych i mezenchymalnych, ale także z komórek śródbłonka i makrofagów.System modelowania tkanki płucnej 3D ma kliniczne znaczenie dla badania chorób człowieka i terapii.

generation-3d-whole-lung-organoids-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten protokół skutecznie kieruje endodermę pochodzącą z embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje trójwymiarowe, zdecelularizowane rusztowania płuc do kierowania specyfikacją linii płuc w zdefiniowanych, wolnych od surowicy warunkach hodowli.

Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania wypełnionych agarozą precyzyjnie wyciętych ludzkich wycinków płuc z wyciętej tkanki pacjenta, które są odpowiednie do generowania 3D kultur tkanki płucnej do modelowania ludzkich chorób płuc w badaniach biologicznych i biomedycznych.

Generowanie ludzkich kultur 3D tkanki płuc (3D-LTC) do modelowania chorób

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Tutaj opisujemy protokół do efektywnego tworzenia istotnych dla rozwoju organoidów ludzkiego serca (hHO) przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez samoorganizację. Protokół opiera się na sekwencyjnej aktywacji sygnałów rozwojowych i wytwarza wysoce złożone, funkcjonalnie istotne tkanki ludzkiego serca.

Generowanie samoorganizujących się organoidów ludzkiego serca pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Protokół przedstawia metodę pozyskiwania ludzkich organoidów płucnych z pierwotnych tkanek płuc, rozszerzania organoidów płuc i wywoływania różnicowania proksymalnego w celu wygenerowania organoidów dróg oddechowych 3D i 2D, które wiernie kopiują nabłonek ludzkich dróg oddechowych.

Ustalanie ludzkich organoidów płuc i różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych

Ten protokół opisuje kluczowe kroki do wygenerowania i scharakteryzowania mysich organoidów 3D ustno-przełykowych, które reprezentują normalne, przednowotworowe i płaskonabłonkowe zmiany rakowokomórkowe wywołane przez chemiczną kancerogenezę.

Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D

Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z synowicytów podobnych do fibroblastów pochodzących od pacjenta, przy użyciu systemu lentiwirusowego bez komórek zasilających.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu synowiocytów podobnych do fibroblastów wyizolowanych ze stawów pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Poznaj metodę generowania trójwymiarowych organoidów płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych hiPSC. Ten protokół umożliwia modelowanie rozwoju i chorób ludzkiego płuca in vitro z komórkami nabłonkowymi i mezenchymalnymi.

Generowanie 3D organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie 3D organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc

Przeglądaj więcej filmów