Name: Mikronaświetlanie laserowe do badania rekrutacji DNA w fazie S (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Poznaj dynamikę rekrutacji białek naprawy DNA w fazie S za pomocą mikronaświetlania laserowego i fluorescencyjnie znakowanego PCNA. Ta metoda umożliwia obserwację kinetiki naprawy w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują M. Pagano za jego nieustanne wsparcie, a także D. Simoneschi, A. Marzio i G. Tang za krytyczną recenzję manuskryptu. B. Miwatani-Minter dziękuje R. Miwatani i B. Minterowi za ich nieustające wsparcie. G. Rona dziękuje K. Ronane Jurasz i G. Rona za ich nieustające wsparcie.

<ol><li>Aleksandrov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics+in+complex+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics in complex DNA lesions.</a> Molecular Cell. 69 (6), 1046-1061 (2018).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H., Podhorecka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+synchronization+by+inhibitors+of+DNA+replication+induces+replication+stress+and+DNA+damage+response%3A+Analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: Analysis by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Herce, H. D., Rajan, M., Lattig-Tunnemann, G., Fillies, M., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell+permeable+DNA+replication+and+repair+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">A novel cell permeable DNA replication and repair marker.</a> Nucleus. 5 (6), 590-600 (2014).</li>
<li>Keijzers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+exonuclease+1+%28EXO1%29+regulatory+functions+in+dna+replication+with+putative+roles+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in dna replication with putative roles in cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), (2018).</li>
<li>Cheruiyot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29-binding+promotes+Exo1+damage+recruitment+and+suppresses+its+nuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose)-binding promotes Exo1 damage recruitment and suppresses its nuclease activities.</a> DNA Repair (Amsterdam). 35, 106-115 (2015).</li>
<li>Zhang, F., Shi, J., Chen, S. H., Bian, C., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+domain+of+EXO1+recognizes+poly%28ADP-ribose%29+in+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The PIN domain of EXO1 recognizes poly(ADP-ribose) in DNA damage response.</a> Nucleic Acids Research. 43 (22), 10782-10794 (2015).</li>
<li>Rona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+recruitment+of+the+FBXL10-RNF68-RNF2+ubiquitin+ligase+to+sites+of+DNA+damage+controls+H2A.Z+loading%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent recruitment of the FBXL10-RNF68-RNF2 ubiquitin ligase to sites of DNA damage controls H2A.Z loading.</a> elife. 7, (2018).</li>
<li>Young, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIMELESS+forms+a+complex+with+PARP1+distinct+from+its+complex+with+TIPIN+and+plays+a+role+in+the+dna+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TIMELESS forms a complex with PARP1 distinct from its complex with TIPIN and plays a role in the dna damage response.</a> Cell Reports. 13 (3), 451-459 (2015).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+to+study+in+vivo+cellular+responses+to+simple+and+complex+dna+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation to study in vivo cellular responses to simple and complex dna damage.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56213(2018).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensin+I+recruitment+to+base+damage-enriched+DNA+lesions+is+modulated+by+PARP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Condensin I recruitment to base damage-enriched DNA lesions is modulated by PARP1.</a> PLoS One. 6 (8), 23548(2011).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+site-specific+induction+of+oxidative+DNA+damage+reveals+differences+in+recruitment+of+repair+proteins+to+heterochromatin+and+euchromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Novel method for site-specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2330-2345 (2014).</li>
<li>Zerjatke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cell+cycle+analysis+based+on+an+endogenous+all-in-one+reporter+for+cell+tracking+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative cell cycle analysis based on an endogenous all-in-one reporter for cell tracking and classification.</a> Cell Reports. 19 (9), 1953-1966 (2017).</li>
<li>Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+infection+of+cultured+cells+induces+oxidative+stress+and+attenuates+cellular+base+excision+repair+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity.</a> Mutation Research. 845, 403054(2019).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+pneumoniae+infection+induces+reactive+oxygen+species+and+DNA+damage+in+A549+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma pneumoniae infection induces reactive oxygen species and DNA damage in A549 human lung carcinoma cells.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4405-4413 (2008).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amsterdam). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Muster, B., Rapp, A., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+DNA+damage+induction+and+DNA+repair+pathway+activation+by+continuous+wave+visible+light+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of DNA damage induction and DNA repair pathway activation by continuous wave visible light laser micro-irradiation.</a> AIMS Genetics. 4 (1), 47-68 (2017).</li>
<li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+human+NTH1%2C+a+homolog+of+Escherichia+coli+endonuclease+III.+Direct+identification+of+Lys-212+as+the+active+nucleophilic+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of human NTH1, a homolog of Escherichia coli endonuclease III. Direct identification of Lys-212 as the active nucleophilic residue.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (34), 21585-21593 (1998).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 94 (14), 7429-7434 (1997).</li>
<li>Reid, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+dynamics+of+the+nonhomologous+end-joining+machinery+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (20), 2575-2584 (2015).</li>
<li>Taccioli, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku80%3A+product+of+the+XRCC5+gene+and+its+role+in+DNA+repair+and+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ku80: product of the XRCC5 gene and its role in DNA repair and V(D)J recombination.</a> Science. 265 (5177), 1442-1445 (1994).</li>
<li>Marsin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+XRCC1+in+the+coordination+and+stimulation+of+oxidative+DNA+damage+repair+initiated+by+the+DNA+glycosylase+hOGG1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of XRCC1 in the coordination and stimulation of oxidative DNA damage repair initiated by the DNA glycosylase hOGG1.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44068-44074 (2003).</li>
<li>Thompson, L. H., Brookman, K. W., Jones, N. J., Allen, S. A., Carrano, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+human+XRCC1+gene%2C+which+corrects+defective+DNA+strand+break+repair+and+sister+chromatid+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the human XRCC1 gene, which corrects defective DNA strand break repair and sister chromatid exchange.</a> Molecular and Cell Biology. 10 (12), 6160-6171 (1990).</li>
<li>Scharer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+excision+repair+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide excision repair in eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 5 (10), 012609(2013).</li>
<li>Oeck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+protein+migration+and+localization+after+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of protein migration and localization after laser micro-irradiation.</a> Science Reports. 9 (1), 3148(2019).</li>
<li>Mistrik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+and+stripes%3A+A+novel+quantitative+photo-manipulation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique.</a> Science Reports. 6, 19567(2016).</li>
<li>Durand, R. E., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity%2C+mutagenicity+and+dna+damage+by+hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity, mutagenicity and dna damage by hoechst 33342.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (2), 111-116 (1982).</li>
<li>Tobey, R. A., Oishi, N., Crissman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization%3A+reversible+induction+of+G2+synchrony+in+cultured+rodent+and+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization: reversible induction of G2 synchrony in cultured rodent and human diploid fibroblasts.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 87 (13), 5104-5108 (1990).</li>
<li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+phosphorylation%3A+Its+role+in+DNA+damage+response+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">H2AX phosphorylation: Its role in DNA damage response and cancer therapy.</a> Journal of Nucleic Acids. 2010, (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że publikacja prezentowanej pracy była sponsorowana przez firmę Nikon Corporation. Autorzy oświadczają, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Krytyczne kroki i potencjalne rozwiązywanie problemów/modyfikacje protokołu Właściwe naczynie do hodowli tkankowej do mikronapromieniania ma kluczowe znaczenie dla sukcesu. Większość systemów obrazowania o wysokiej rozdzielczości jest zoptymalizowana pod kątem grubości szkła nakrywkowego 0,17 mm. Używanie komór obrazowania o większej lub mniejszej grubości lub wykonanych z polimerów z tworzywa sztucznego (niezoptymalizowanych pod kątem obrazowania 405 nm) może znacznie obniżyć jakość obrazu. Używając szklanych powierzchni, upewnij się, że są one poddane hodowli tkankowej w celu zwiększenia przyczepności komórek. Jeśli nie zostaną poddane obróbce kultur tkankowych, komory te będą musiały zostać pokryte, na przykład, poli-D-lizyną przed wysiewem komórek. Podczas powlekania komórek w komorze nakrywkowej idealna gęstość komórek ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć nieprawidłowości cyklu komórkowego i dodatkowego stresu dla komórek. Właściwa równowaga termiczna elementów mikroskopu przed eksperymentami w celu utrzymania stabilnej temperatury ma kluczowe znaczenie zarówno dla utrzymania ostrości przez cały czas obrazowania poklatkowego, jak i jest niezbędna do zapewnienia jednorodnego DDR w czasie i próbkach.
Bardzo ważne jest, aby komórki były w dobrym stanie przed mikronapromienianiem, aby zmniejszyć ilość danych artefaktów. Jeśli komórki mają nieregularną morfologię po infekcji/selekcji, pozwól komórkom przejść przez wiele pasaży, aż morfologia powróci do normy. Zawsze upewnij się, że użyte linie komórkowe są wolne od zanieczyszczenia mykoplazmą. Wśród wielu niekorzystnych skutków zakażenia mykoplazmą, powoduje ono również uszkodzenie DNA komórek gospodarza i może wpływać na ich szlaki DDR14,15. Najbardziej czułym sposobem wykrywania mykoplazmy w hodowli komórkowej jest PCR (w porównaniu z wykrywaniem za pomocą DAPI lub Hoechst).
Optymalna nadekspresja białka naprawczego będącego przedmiotem zainteresowania powinna być porównywalna z poziomami endogennymi, jednak wystarczająco wysoka, aby można ją było wykryć. Promotor stosowany na wektorach wirusowych, miano wirusa podczas infekcji i długość czasu infekcji można dostosować w celu uzyskania idealnych poziomów ekspresji. Aby uzyskać spójne wyniki, wyizoluj poszczególne klony komórek, aby zapewnić jednorodny poziom ekspresji i normalną morfologię komórek. Zaleca się stosowanie konstruktów wektorowych, które nie wykazują nadekspresji znakowanego PCNA na poziomach wyższych niż endogenne dla prawidłowego cyklu komórkowego i funkcji markera naprawy DNA. Nawet niski poziom nadekspresji PCNA jest wystarczający do rozróżnienia komórek fazy S. Retrowirusowe wektory pBABE są z powodzeniem stosowane w tym celu (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA może być oznaczone dowolnymi monomerycznymi czerwonymi (np. mPlum, mCherry, mRuby itp.) lub monomerycznymi zielonymi białkami fluorescencyjnymi (np. mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald itp.), które można następnie połączyć z alternatywnie oznaczonym punktem POI. Nadekspresja fluorescencyjnie oznaczonego punktu POI ma pewne ograniczenia i kwestie. Znaczniki fluorescencyjne mogą zakłócać normalne funkcjonowanie i lokalizację białek. W związku z tym należy wziąć pod uwagę lokalizację znacznika (zacisk N lub C). Zawsze używaj monomerycznych białek fluorescencyjnych, ponieważ oligomeryzacja wariantów niemonomerycznych może wpływać na funkcję POI.
Ustawienia lasera muszą być określone dla każdego systemu obrazowania, ponieważ wiele elementów ścieżki optycznej będzie miało wpływ na rzeczywistą moc dostarczaną do komórek. Mikronaświetlanie laserowe może powodować kilka rodzajów uszkodzeń DNA w zależności od długości fali wzbudzenia, mocy wyjściowej lasera FRAP oraz tego, czy zastosowano jakiekolwiek czynniki wstępnie uczulające (takie jak bromodeoksyurydyna lub Hoechst). Lasery o długości fali 405 nm mogą powodować oksydacyjne uszkodzenia DNA, pęknięcia jedno- i dwuniciowe16,17. Dzięki zastosowaniu wyższych ustawień mocy lasera zwiększa się ilość DSB. W tym protokole nie zastosowano metod wstępnego uczulenia, ale techniki te są szeroko omówione w literaturze i ponownie podsumowane w poniższej dyskusji. Naszym zdaniem najlepszym sposobem sprawdzenia, czy pożądana zmiana została wygenerowana, jest przeprowadzenie testów na rekrutację znanych genów specyficznych dla szlaku uszkodzenia DNA. Rekrutacja NTHL1 lub OGG1, składników szlaku BER, sugeruje indukcję utlenionych zasad DNA 10,11,17,18,19, podczas gdy FBXL10 lub XRCC5 wskazują na obecność DSB 8,20,21. Rekrutacja XRCC1 może wskazywać zarówno na obecność utlenionych zasad DNA, jak i pęknięć jednoniciowych (SSB)22,23. XPC (tj. RAD4) jest dobrym wskaźnikiem NER, który usuwa masywne addukty DNA generowane przez światło ultrafioletowe (UV)17,24. Ponieważ rekrutacja białek egzogennych może wprowadzać pewne nieprawidłowości, barwienie immunofluorescencyjne endogennych białek lub markerów naprawy DNA (takich jak γH2A. X dla pęknięć dwuniciowych) może potwierdzić obecność specyficznych zmian w DNA. Alternatywnie można również zastosować przeciwciała wywołane przeciwko określonym typom uszkodzeń DNA. Aby dostosować dostarczaną moc lasera, można zmienić zarówno czas przebywania, jak i moc lasera.
Za pomocą modelowania matematycznego można przeprowadzić szczegółową analizę kinetyczną, która może dostarczyć cennych informacji na temat właściwości rekrutacyjnych punktu POI (np. udział wielu domen wiążących DNA, wrażliwość na różne zdarzenia sygnalizacyjne itp.). Zautomatyzowana ocena rekrutacji i śledzenie komórek mogą być połączone w celu stworzenia solidnych przepływów pracy 1,25.
Zalety i ograniczenia wstępnego uczulania DNA Wstępne uwrażliwienie DNA przed mikronapromieniowaniem jest powszechnie stosowanym narzędziem do rekrutacji białek naprawy DNA16,17. Uwrażliwienie DNA przed mikronapromieniowaniem sprawia, że jest ono bardziej podatne na DSB. Dwie najczęstsze metody wstępnego uczulania DNA to wstępne traktowanie komórek bromodeoksyurydyną (BrdU) lub barwnikiem Hoechsta. W przypadku systemów, które nie są zdolne do mikronaświetlania przy dużych mocach lasera, metody te mogą być konieczne do indukowania uszkodzeń DNA, takich jak DSB. Dodatkowo, w przypadku braku detektora światła przechodzącego lub sygnału fluorescencyjnego podkreślającego jądro komórkowe (na przykład podczas badania rekrutacji nieoznakowanych endogennych białek naprawy DNA), Hoechst działa zarówno jako narzędzie uczulające, jak i fluorescencyjne barwienie jądrowe. Jednak wstępne uczulenie DNA może wprowadzić poważne komplikacje. BrdU (stosowany w końcowym stężeniu 10 μM) musi być dodawany do komórek w ciągu 24 godzin (lub czasu odpowiadającego pełnemu cyklowi komórkowemu w użytej linii komórkowej), aby prawidłowo włączyć się do DNA i może powodować zakłócenia cyklu komórkowego26. Hoechst 33342 (stosowany w końcowym stężeniu 1 μg/ml) jest cytotoksyczny po długich okresach inkubacji, ale wymaga wystarczającej ilości czasu na nasycenie jądra barwnikiem. Dlatego należy go stosować tylko 15-20 minut przed mikronapromienianiem; W przeciwnym razie dane rekrutacyjne nie będą spójne. Wybarwione w ten sposób komórki nie mogą być trzymane w hodowli dłużej niż kilka godzin27,28. Upewnij się, że nie używasz Hoechst 33358, który nie jest tak przepuszczalny dla komórek jak barwnik Hoechst 33342. Wstępne uczulenie może również wprowadzić niepotrzebną wariancję między eksperymentami i sprawia, że eksperyment jest jeszcze bardziej wrażliwy na różnice w gęstości komórek (ponieważ wpłynie to na ilość wprowadzonego barwnika / komórkę).
Zalety i ograniczenia mikroskopii konfokalnej Szybkość obrazowania w mikroskopii konfokalnej może być ograniczona w porównaniu z mikroskopią szerokokątną. Jednak mikroskop konfokalny wyposażony w skaner rezonansowy może znacznie poprawić szybkość obrazowania (kosztem rozdzielczości), zbliżając się do prędkości mikroskopii z wirującym dyskiem. Trzy cechy sprawiają, że system konfokalny A1R HD25 jest doskonałym wyborem dla prezentowanego tutaj protokołu. Po pierwsze, pole widzenia systemu wynoszące 25 mm umożliwia obrazowanie od 15 do 20 komórek w jednym zeskanowanym polu (w porównaniu z 5-10 komórkami w zwykłych konfiguracjach), ograniczając liczbę akwizycji niezbędnych do uzyskania wystarczającej liczby komórek do analizy statystycznej. Po drugie, moduł FRAP i dwie głowice skanujące umożliwiają obrazowanie i mikronaświetlanie komórek jednocześnie, a nie tylko sekwencyjnie. Wreszcie, elastyczność wynikająca z posiadania zarówno skanerów rezonansowych, jak i galwanograficznych zapewnia możliwość łatwego przełączania między obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości czasowej z wyjątkową prędkością, która minimalizuje wygaszanie fluoroforów, a obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, które wykorzystuje wolniejsze prędkości skanowania do tworzenia obrazów o wyższym stosunku sygnału do szumu. O ile zastosowany system pozwalał na wspomnianą wcześniej elastyczność, upodabniając się do szerzej dostępnych konfiguracji mikroskopów konfokalnych, o tyle w prezentowanych eksperymentach wykorzystano jedynie skaner galwanowy (zarówno do mikronaświetlania, jak i późniejszego obrazowania).
Zalety i ograniczenia mikronapromieniania Chociaż mikropromieniowanie zapewnia niezrównaną rozdzielczość przestrzenną i czasową, nie jest pozbawione ograniczeń. Uszkodzenia DNA spowodowane mikropromieniowaniem laserowym są silnie skupione w określonych częściach jądra w porównaniu z naturalnie występującymi czynnikami uszkadzającymi. W związku z tym odpowiedź chromatyny na mikropromieniowanie może się różnić w porównaniu z jednorodnie rozłożonymi uszkodzeniami. Ponadto mikronapromienianie jest czasochłonne i może być przeprowadzone tylko na kilkudziesięciu komórkach, podczas gdy duże metody biochemiczne oparte na populacji (frakcjonowanie chromatyny, immunoprecypitacja, ChIP) mogą zapewnić zwiększoną odporność poprzez badanie tysięcy komórek jednocześnie. Weryfikacja obserwacji dokonanych za pomocą mikronapromieniania tradycyjnymi technikami biochemicznymi jest skuteczną strategią pozwalającą na uzyskanie wiarygodnych wniosków. Chociaż możliwe jest jednoczesne mikronapromienianie wielu komórek w określonym polu widzenia, system obrazowania będzie potrzebował więcej czasu na wykonanie zadania. W związku z tym pomiar dynamiki białek, które bardzo szybko rekrutują się do zmian w DNA, ogranicza liczbę możliwych ROI dla mikronapromieniania stosowanego jednocześnie. W systemie obrazowania używanym w tym protokole mikronaświetlanie pojedynczego ROI o długości 1024 pikseli trwa 1032 ms przy użyciu czasu przebywania 1000 μs i 3088 ms przy użyciu czasu przebywania 3000 μs. Użycie wielu linii ROI znacznie wydłuży czas potrzebny na zakończenie mikronaświetlania (np. zwrot z inwestycji o długości 7 x 1024 pikseli zajmuje 14402 ms przy użyciu czasu przebywania 1000 μs i 21598 ms przy użyciu czasu przebywania 3000 μs). Ten czas jest stracony na akwizycję obrazu i należy go wziąć pod uwagę. Podczas obrazowania szybkich zdarzeń rekrutacyjnych należy stosować jak najkrótszy zwrot z inwestycji i mikronaświetlać tylko jedną komórkę na raz.
Zalety i ograniczenia w stosunku do metod synchronizacji W przypadku badań specyficznych dla cyklu komórkowego istniejące metody obejmują albo synchronizację komórek w określonych fazach cyklu komórkowego, albo wykorzystanie reporterów fluorescencyjnych w celu zidentyfikowania określonej fazy cyklu komórkowego komórki. Jednak każda z tych metod wiąże się z własnymi wyzwaniami i ograniczeniami.
System FUCCI3 (opierający się na białku fluorescencyjnym oznaczonym skróconymi formami CDT1 i Gemininy) jest szczególnie przydatnym narzędziem do badań cyklu komórkowego, ale ma ograniczenia, jeśli chodzi o różnicowanie faz S i G2 cyklu komórkowego. Poziomy bliźniąt są już wysokie od połowy fazy S i utrzymują się na wysokim poziomie aż do fazy M, co utrudnia rozdzielenie tych faz. Zastosowanie systemu FUCCI oznacza również, że do obrazowania punktu POI nie można wykorzystać dwóch kanałów optycznych mikroskopu.
Nienowotworowe linie komórkowe mogą być zsynchronizowane z G0 poprzez usunięcie czynników wzrostu znajdujących się w surowicy (głód surowicy), powodując niewielkie lub żadne uszkodzenie DNA komórek. Jednak większość linii komórek nowotworowych będzie częściowo kontynuować postęp w cyklu komórkowym, nawet bez odpowiedniej ilości surowicy w ich pożywce. Dodatkowo komórki częściowo zaczynają tracić synchronizację pod koniec G1, wczesna faza S. Oprócz głodu surowicy istnieje wiele chemicznych metod osiągania synchronizacji cyklu komórkowego. Bloki hydroksymocznika, afidikoliny i tymidyny są metodami zatrzymywania replikacji DNA w celu synchronizacji komórek we wczesnej fazie S. Chociaż metody te są tanie i proste, wprowadzają stres replikacyjny, który powoduje uszkodzenie DNA. Wykazano, że te inhibitory replikacji DNA indukują fosforylację H2A. X, dobrze znany marker DSB 2,29. Metoda użycia znakowanego PCNA jako markera dla komórek fazy S zmniejsza potencjał artefaktów spowodowanych synchronizacją chemiczną i może być stosowana do szerokiego zakresu linii komórkowych w porównaniu z głodem surowicy.
Konkluzja Uszkodzenie DNA jest siłą napędową chorób genetycznych, w których zmiany mutagenne mogą prowadzić do złośliwej transformacji komórek. Celowanie w maszynerię syntezy DNA jest podstawową strategią terapeutyczną w leczeniu chorób hiperproliferacyjnych, takich jak rak. Aby leczyć te choroby w bardziej ukierunkowany sposób, musimy lepiej zrozumieć białka, które naprawiają uszkodzenia DNA. Opisany tutaj protokół pomaga w badaniach opartych na mikronapromieniowaniu w fazie S, minimalizując wyzwania związane z tradycyjnymi metodami synchronizacji w celu zmniejszenia możliwych artefaktów i zwiększenia odtwarzalności eksperymentów.

Kilka ścieżek naprawy DNA wyewoluowało, aby zwalczać różne rodzaje uszkodzeń DNA, które mogą powstać w komórkach, z których wszystkie są wysoce regulowane zarówno w przestrzeni, jak i w czasie. Jednym z najbardziej wrażliwych okresów cyklu komórkowego jest faza S, w której zachodzi synteza DNA. Chociaż proliferacja ma fundamentalne znaczenie dla życia, stanowi również poważne wyzwanie. Komórki muszą zapewnić wierną replikację swojego genomu, aby uniknąć przekazania mutacji przyszłym pokoleniom. W związku z tym proliferacja stanowi terapeutyczny punkt interwencji, który został wykorzystany do opracowania podejść terapeutycznych w dziedzinie onkologii.
Wszystkie główne techniki używane do badania rekrutacji białek w uszkodzeniach DNA mają swoje mocne i słabe strony. Mikropromieniowanie ma lepszą rozdzielczość przestrzenną i czasową1 niż większość alternatywnych metod, takich jak immunofluorescencyjne obrazowanie ognisk wywołanych promieniowaniem jonizującym (IRIF), immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) lub frakcjonowanie biochemiczne. Jednak mikronapromienianie potwierdza solidność wyżej wymienionych technik, które mogą pobierać próbki z dużej liczby komórek w tym samym czasie.
Aby zbadać naprawę DNA w fazie S, trzeba być w stanie rozróżnić komórki fazy S w asynchronicznej populacji hodowli komórek. Istnieje wiele dobrze znanych metod, aby temu zaradzić, obejmujących synchronizację komórek lub wizualizację różnych faz cyklu komórkowego. Oba podejścia wiążą się jednak z poważnymi wyzwaniami i możliwymi artefaktami. Metody synchronizacji chemicznej szeroko stosowane do wzbogacania komórek we wczesnej fazie S (np. Podwójny blok tymidyny, afidikolina i leczenie hydroksymocznikiem) osiągają synchronizację poprzez indukcję stresu replikacyjnego i ostatecznie uszkodzenie samego DNA. Ogranicza to użycie tych metod do badania procesów naprawy DNA w fazie S2. Synchronizacja poprzez głód i uwalnianie surowicy ma zastosowanie tylko do ograniczonej liczby linii komórkowych, w dużej mierze wykluczając linie komórek rakowych, które w mniejszym stopniu polegają na czynnikach wzrostu dla progresji cyklu komórkowego w porównaniu z nieprzekształconymi liniami komórkowymi. System FUCCI (Fluorescence Ubiquitin Cell Cycle Indicator) jest szczególnie przydatnym narzędziem do badania cyklu komórkowego, ale ma zasadnicze ograniczenie podczas różnicowania faz cyklu komórkowego S i G23.
Tutaj pokazano, że użycie fluorescencyjnie znakowanego PCNA jako nieinwazyjnego markera dla fazy S ogranicza wady metod chemicznej synchronizacji cyklu komórkowego, pozwalając jednocześnie na większą specyficzność i elastyczność niż system FUCCI. Jako pojedynczy marker, PCNA może nie tylko wyróżnić komórki fazy S w populacji asynchronicznej, ale może również pokazać dokładny postęp komórek w fazie S (tj. wczesnej, środkowej lub późnej fazie S)4. Niski poziom ekspresji egzogennego, znakowanego PCNA zapewnia minimalną ingerencję zarówno w progresję cyklu komórkowego, jak i procesy naprawy DNA. Co ważne, PCNA służy również jako wewnętrzna kontrola dla prawidłowej indukcji uszkodzeń DNA, ponieważ bierze udział w naprawie kilku uszkodzeń DNA i jest rekrutowany do lokalnie indukowanych miejsc uszkodzenia DNA1,4.
Eksperymenty przedstawione tutaj pokazują, jak zmierzyć dynamikę rekrutacji EXO1b w fazie S i jak wpływa na to dobrze znany inhibitor PARP, olaparyb. Aktywność nukleazy EXO1b jest istotna dla szerokiego zakresu szlaków naprawy DNA, w tym naprawy niedopasowania (MMR), naprawy przez wycinanie nukleotydów (NER) i naprawy pęknięć dwuniciowych (DSB). W fazie S EXO1b odgrywa główną rolę w rekombinacji homologicznej (HR) poprzez tworzenie nawisów 3' ssDNA podczas resekcji DNA5. EXO1b jest dalej zaangażowany w replikację DNA, odgrywając rolę w aktywacji punktów kontrolnych w celu ponownego uruchomienia zablokowanych widełek DNA, a także w usuwaniu starterów i dojrzewaniu fragmentów Okazaki na opóźnionej nici podczas przemieszczenia nici w replikacji5. Rekrutacja EXO1b do uszkodzonych miejsc DNA jest regulowana przez bezpośrednią interakcję z poli (ADP-rybozą) (PAR)6,7. Ze względu na liczne implikacje EXO1b specyficzne dla cyklu komórkowego, jest to doskonały wybór do badań rekrutacyjnych specyficznych dla fazy S z wykorzystaniem PCNA.

<table><tbody><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434-500G</td><td>Do gaszenia formaldehydu</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne królika anty-EXO1 Proteintech</td><td></td><td>16253-1-AP</td><td>przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Anty-fosfo-histon H2A. X (Ser139) Przeciwciało, klon JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td>przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td>BSA do blokowania</td></tr><tr><td>BrdU (5-Bromo-2'-deoksyurydyny)</td><td>Środek wstępnie uczulający</td> <td>Merck</td><td>19-160</td></tr><tr><td>Citifluor&trade; Roztwór montażowy AFR3</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>17973-10</td><td>roztwór PBS zapobiegający blaknięciu do obrazowania</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>barwienie kwasem nukleinowym</td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569010</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych dla komórek</td></tr><tr><td>HEK293T DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr> <tr>do kontroli i rozpuszczania pojazdów<td>EGFP-FBXL10</td><td>Addgene</td><td>#126542</td><td>wektor ekspresji wirusa dla EGFP-FBXL10</td></tr><tr><td>EXO1b-AcGFP&nbsp; (w pRetroQ)</td><td>niestandardowe klonowanie</td><td>na</td><td>cDNA EXO1b zostało sklonowane w miejscach NheI, BamHI wektora pRetroQ-AcGFP1-N1.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Suplement</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>Wolne od czerwieni fenolowej do mikroskopii</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td> przeciwciało <td>wtórne</td></tr><tr><td>HEK293T komórkach</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td>Linia komórkowa do pakowania wirusów</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td>Środek buforujący uzupełniający pożywkę do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td> środek <td>wstępnie uczulający</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A (zmodyfikowany) Medium</td><td>Life Technologies</td><td>16600-108</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych dla komórek U-2 OS</td></tr><tr><td>mCherry-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55117</td><td>niewirusowy konstrukt PCNA odpowiedni do markera cyklu komórkowego</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55994</td><td>niewirusowy konstrukt PCNA odpowiedni do markera cyklu komórkowego</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA (w pBABE)</td><td>niestandardowe klonowanie</td><td>na</td><td>cDNA mPlum-PCNA zostało sklonowane z Addgene #55994 w miejscach BamHI, SalI pBABE (puro)</td></tr> <tr><td>Konfokalna głowica skanująca i kontroler Nikon A1R-HD25</td><td>System</td><td>obrazowania konfokalnego Nikon na system obrazowania konfokalnego</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka laserowa Nikon LUN4</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>system wzbudzenia</td></tr><tr><td>Nikon LUN-F 50 mW 405 nm Jednostka laserowa FRAP</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>FRAP Nikon</td></tr><tr><td>Oprogramowanie kontrolera konfokalnego NIS Elements Nikon</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do sterowania konfokalnego</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon Ti2-E</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>podstawie odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Modułowy system oświetlenia Nikon Ti2-LAPP</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>system oświetlenia</td></tr><tr><td>NTHL1-mCherry (w pRetroQ)</td><td>niestandardowe klonowanie</td><td>na</td><td>NTHL1 cDNA zostało sklonowane w miejscach NheI, SalI wektora pRetroQ-mCherry-N1.</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe komorowe Nunc Lab-Tek II (4 dołki)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382PK</td><td>Mikroskopia żywych komórek Komora do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Olaparib</td><td>Selleck Chemicals</td> Inhibitor <td>PARP</td><td>S1060</td></tr><tr><td>Opti-MEM o obniżonej surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Podłoże rozcieńczające do transfekcji</td></tr><tr><td>przejściowej Wodny roztwór paraformaldehydu (32%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-494</td><td>Utrwalacz</td></tr><tr><td>pBABE (higro)</td><td>Addgene</td><td>#1765</td><td>retrowirusowy wektor ekspresyjny (dla niskich poziomów ekspresji)</td></tr><tr><td>pBABE (neo)</td><td>Addgene</td><td>#1767</td><td>retrowirusowy wektor ekspresyjny (dla niskich poziomów ekspresji)</td></tr><tr><td>pBABE (puro)</td><td>Addgene</td><td>#1764</td><td>retrowirusowy wektor ekspresyjny (dla niskich poziomów ekspresji)</td></tr><tr><td>pBABE (zeo)</td><td>Addgene</td><td>#1766</td><td>retrowirusowy wektor ekspresyjny (dla niskich poziomów ekspresji)</td></tr><tr><td>Przeciwciało PCNA (PC10)</td><td>Przeciwciało pierwotne</td> <td>Santa Cruz</td><td>sc-56</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>Suplement podłoża</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td>Zwiększ skuteczność infekcji wirusowej</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-C1</td><td>Takara</td><td>632506</td><td>retrowirusowy wektor ekspresyjny</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-N1</td><td>Takara</td><td>632505</td><td>retrowirusowy wektor ekspresyjny</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-C1</td><td>Takara</td><td>632567</td><td>retrowirusowy wektor ekspresyjny</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-N1</td><td>Takara</td><td>632568</td><td>retrowirusowy wektor ekspresyjny</td></tr><tr><td>pUMVC</td><td>Addgene</td><td>#8449</td><td>Wektor opakowania wirusowego</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td>Suplement do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>Triton X-100 roztwór wodny (10%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td>Rozcieńczony w PBS do buforu przepuszczalności komórek</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>Rozcieńczony w PBS w celu rozszczepienia komórek</td></tr><tr><td>U-2 OS Cells</td><td>ATCC&</td><td>nbsp; HTB-96</td><td>Optymalna linia komórkowa do eksperymentów mikroskopowych</td></tr><tr><td>Uniwersalny zestaw do wykrywania mykoplazmy</td><td>Zestaw do wykrywania mykoplazmy na bazie</td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td> PCR</tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>Wektor otoczki białka wirusowego</td></tr></tbody></table>

mikronaświetlanie laserowe do badania rekrutacji dna w fazie s

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

Naprawa uszkodzeń DNA utrzymuje integralność genetyczną komórek w wysoce reaktywnym środowisku. Komórki mogą akumulować różnego rodzaju uszkodzenia DNA spowodowane zarówno endogennymi, jak i egzogennymi źródłami, takimi jak aktywność metaboliczna lub promieniowanie UV. Bez naprawy DNA kod genetyczny komórki zostaje naruszony, podważając struktury i funkcje białek i potencjalnie powodując choroby. 
Zrozumienie czasoprzestrzennej dynamiki różnych szlaków naprawy DNA w różnych fazach cyklu komórkowego jest kluczowe w dziedzinie naprawy uszkodzeń DNA. Obecne techniki mikroskopii fluorescencyjnej dostarczają doskonałych narzędzi do pomiaru kinetyki rekrutacji różnych białek naprawczych po indukcji uszkodzenia DNA. Synteza DNA podczas fazy S cyklu komórkowego jest szczególnym punktem w losie komórki dotyczącym naprawy DNA. Zapewnia unikalne okno do badania całego genomu pod kątem błędów. Jednocześnie błędy syntezy DNA stanowią również zagrożenie dla integralności DNA, które nie występuje w komórkach niedzielących się. Dlatego procesy naprawy DNA różnią się znacznie w fazie S w porównaniu z innymi fazami cyklu komórkowego, a różnice te są słabo poznane. 
Poniższy protokół opisuje przygotowanie linii komórkowych i pomiar dynamiki białek naprawczych DNA w fazie S w lokalnie indukowanych miejscach uszkodzenia DNA, przy użyciu laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w linię laserową 405 nm. Oznaczone PCNA (z mPlum) jest używane jako marker cyklu komórkowego w połączeniu z białkiem naprawczym znakowanym AcGFP (tj. EXO1b) do pomiaru rekrutacji uszkodzeń DNA w fazie S.

Komórki reagują na każdy rodzaj uszkodzenia DNA w specyficzny sposób, który zależy również od fazy cyklu komórkowego, w której się znajdują. Na przykład po mikroirradiacji pęknięcia dwuniciowe (DSB) będą naprawiane albo poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), albo przez HR, w zależności od fazy cyklu komórkowego. Nukleazy działające najintensywniej podczas faz S i G2 cyklu komórkowego tworzą nawisy DNA, które są kluczowe dla prawidłowego przebiegu HR. Aby umożliwić ocenę komórek w fazie S, jako jednobarwny marker cyklu komórkowego wykorzystano PCNA. Rysunek 1A przedstawia profil lokalizacji mPlum-PCNA podczas przebiegu cyklu komórkowego. PCNA wykazuje całkowicie jednorodny rozkład w jądrze w fazach G1 i G2 (będąc jednocześnie w większości wykluczonym z jąderek). W fazie S PCNA lokalizuje się w miejscach replikacji DNA, co można zaobserwować jako jasne punkty w jądrze. W komórkach we wczesnej fazie S punkty te są stosunkowo małe i równomiernie rozłożone w całym jądrze komórkowym. Wraz z przejściem w środkową fazę S punkty stają się rozmyte i lokalizują się bardziej w kierunku obwodu jądra oraz jąderek. W późnej fazie S liczba punktów zmniejsza się, ale stają się one coraz większe, ponieważ PCNA koncentruje się w późnych miejscach replikacji (Rysunek 1B). Co ważne, egzogenna ekspresja PCNA z wektora pBABE była niższa niż poziomy endogenne, ale wystarczająca do detekcji mikroskopowej, co minimalizuje potencjalne artefakty w przebiegu cyklu komórkowego i DDR. Rysunek 1C pokazuje zakres nadekspresji PCNA w porównaniu z poziomami endogennymi. Należy zauważyć, że prążek odpowiadający mPlum-PCNA migruje wolniej ze względu na jego większy rozmiar.
Naszym celem było wprowadzenie DSB podczas mikroirradiacji w celu zbadania zależnej od PARP1/2 rekrutacji EXO1b do tych uszkodzeń w fazie S. Rysunek 2A pokazuje, że niskie dawki energii (czas ekspozycji 1000 µs) nie indukują rekrutacji EGFP-FBXL10, białka reagującego na DSB (składnika kompleksu FRUCC 8), podczas gdy były one wystarczające do indukcji rekrutacji NTHL1-mCherry, białka szlaku naprawy przez wycinanie zasad (BER), rekrutowanego do miejsc oksydacyjnych uszkodzeń DNA10,11,12. Przy czasie ekspozycji 3000 µs rekrutowane są zarówno EGFP-FBXL10, jak i NTHL1-mCherry, co świadczy o tym, że moc lasera generuje zarówno uszkodzenia oksydacyjne, jak i DSB. Potwierdzeniem tych wyników jest Rysunek 2B, przedstawiający barwienie immunofluorescencyjne przeciwko γH2A.X (marker DSB), które jest wyraźnie bardziej widoczne przy zastosowaniu wyższych dawek energii. PCNA służy zarówno jako marker cyklu komórkowego, jak i marker skutecznej mikroirradiacji, ponieważ ulega on odpowiedniej rekrutacji przy obu ustawieniach czasu ekspozycji lasera. Co istotne, do tej funkcji reporterowej można wykorzystać zarówno egzogenne, jak i endogenne PCNA znakowane białkiem fluorescencyjnym, ponieważ zachowują się one podobnie (Rysunek 3). Endogennie znakowane PCNA uzyskano poprzez wstawienie mRuby w ramce z pierwszym eksonem do jednego allelu locus PCNA13 (linia komórkowa była uprzejmym darem od Jörga Mansfelda).
Rysunek 4A oraz Rysunek 4C przedstawiają rekrutację EXO1b znakowanego AcGFP w komórkach w fazie S. Maksymalny poziom akumulacji EXO1b w miejscach mikroirradiacji zostaje osiągnięty po około 1 minucie, a następnie białko powoli zaczyna odłączać się od uszkodzeń DNA. Wzbogacenie w miejscach mikroirradiacji jest oznaczone na wykresie jako wartość &gt; 1 względnej jednostki fluorescencji. W obecności olaparibu akumulacja EXO1b w pasie laserowym w 1. minucie jest znacząco mniejsza w porównaniu z kontrolą nośnikiem. Wyniki te są zgodne z literaturą6,7. Rysunek 4B prezentuje reprezentatywne obszary do kwantyfikacji (obszary A, B i C), zgodnie z opisem w punkcie 6 protokołu. Rysunek 4D pokazuje porównywalne poziomy ekspresji endogennego EXO1b oraz egzogennego EXO1b-AcGFP w komórkach wykorzystanych do mikroirradiacji.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna cyklu komórkowego; synteza DNA w fazie S; obraz mikroskopowy; analiza białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wzorzec lokalizacji PCNA. (A) Obrazy przedstawiają wzorzec lokalizacji stabilnie zintegrowanego egzogennego PCNA w trakcie cyklu komórkowego w komórkach U-2 OS. (B) Obrazy przedstawiają wzorce ognisk PCNA w różnych etapach fazy S (wczesnej, środkowej i późnej) w komórkach U-2 OS. (C) Western blot wykazujący endogenne i egzogenne poziomy PCNA w komórkach U-2 OS wykorzystanych do obrazowania. Pasek skali reprezentuje 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, EGFP-FBXL10 i NTHL1-mCherry, badanie czasu ekspozycji, fazy komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Indukcja DSB poprzez zoptymalizowaną moc wyjściową lasera. (A) Ustawienia lasera mogą zostać zoptymalizowane w celu indukcji różnych form uszkodzeń DNA. Do identyfikacji odpowiednio DSB oraz miejsc uszkodzeń oksydacyjnych wykorzystano komórki U-2 OS stabilnie eksponujące zarówno EGFP-FBXL10, jak i NTHL1-mCherry. Mikroirradiację linią lasera 405 nm przeprowadzono na asynchronicznych komórkach U-2 OS z czasem ekspozycji wynoszącym 1000 µs lub 3000 µs. Pasek skali reprezentuje 20 µm. (B) Barwienie immunofluorescencyjne przeciwko γH2A.X wykonano na ludzkich komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki (hTERT RPE-1) posiadających endogenne PCNA z tagiem mRuby. Komórki utrwalono i przetworzono 5 minut po mikroirradiacji z czasem ekspozycji wynoszącym 1000 µs lub 3000 µs. Pasek skali reprezentuje 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; mRuby-PCNA, mPlum-PCNA; cykl komórkowy, faza G1/G2, faza S, czas ekspozycji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Porównawka rekrutacji endogennego mRuby-PCNA i egzogennego mPlum-PCNA do miejsc mikro-napromieniowania przy czasie ekspozycji lasera 1000 µs lub 3000 µs. Zarówno endogenne, jak i egzogenne znakowane białka PCNA tworzą ogniska replikacyjne podczas fazy S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna EXO1b i PCNA, DMSO vs. olaparib, analiza względnej fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Rekrutacja EXO1b zależna od PARP1/2 w fazie S. Komórki U-2 OS stabilnie eksponujące EXO1b-AcGFP i mPlum-PCNA poddano mikroirradiancji linią lasera FRAP 405 nm przy czasie przebywania 3000 µs. (A) Reprezentatywne obrazy mikroirradianowanych komórek w określonych punktach czasowych po wstępnym traktowaniu kontrolą nośnikiem (DMSO) lub olaparibem (1 µM). Pasek skali reprezentuje 20 µm. (B) Reprezentatywne obrazy zdefiniowanych obszarów A, B i C dla analizy rekrutacji. Pasek skali reprezentuje 20 µm. (C) Dynamikę rekrutacji w miejscach uszkodzeń DNA zarejestrowano za pomocą obrazowania żywych komórek. Względne średnie wartości fluorescencji oraz obrazy pozyskiwano co 5 s przez 12 min. Dla każdego warunku oceniono ≥30 komórek. Średnie względne wartości fluorescencji (ciągłe czarne linie) i błąd standardowy (zakres przedstawiony przez zacieniowany obszar) wykreślono w funkcji czasu. Linia przerywana pokazuje wartości rekrutacji w 1 min po mikroirradiancji. Różnicę między traktowaniem DMSO (n=32) a olaparibem (n=31) obliczono za pomocą testu Mann-Whitneya. Gwiazdka oznacza p&lt;0.0001. (D) Western blot porównuje poziomy ekspresji endogennego EXO1b i egzogennego EXO1b-AcGFP w komórkach użytych do mikroirradiancji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje nieinwazyjną metodę efektywnej identyfikacji komórek fazy S do dalszych badań mikroskopowych, takich jak pomiar rekrutacji białka naprawczego DNA za pomocą mikronapromieniowania laserowego.

Mikronaświetlanie laserowe do badania rekrutacji DNA w fazie S

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

Protokół ten pomaga zrozumieć przestrzenną i czasową rekrutację białek naprawiających uszkodzenia DNA, biorąc pod uwagę fazę cyklu komórkowego. Do dyskryminacji cyklu komórkowego używamy znakowanego białkiem fluorescencyjnym PCNA jako markera fazy S, który omija artefakty wprowadzone przez inne metody synchronizacji cyklu komórkowego. To w połączeniu z mikronapromieniowaniem laserowym daje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną kinetyki białek naprawiających uszkodzenia DNA.Sukces w rutynowym stosowaniu naszego protokołu opiera się na podstawowej wiedzy na temat obrazowania konfokalnego. Na 24 godziny przed mikronapromienianiem należy umieścić w sumie osiem na 10 do czwartej komórki w 500 mikrolitrach na jeden mililitr pożywki na czterodołkowym szkle nakrywkowym. Na godzinę przed mikronapromienianiem należy wymienić zwykłą pożywkę wzrostową na pożywkę obrazową zawierającą olaparyb lub kontrolę nośnika, taką jak DMSO.Co najmniej cztery godziny przed obrazowaniem włącz komorę środowiskową i elementy mikroskopu. Włącz ogrzewanie, dopływ dwutlenku węgla i regulator wilgotności. Zainicjuj źródła światła wraz z liniami laserowymi co najmniej godzinę przed przeniesieniem komórek do mikroskopu.Naoliwić obiektyw mikroskopu i umieścić szkło nakrywkowe z komorą pod mikroskopem. Aby wybrać komórki fazy S w populacji asynchronicznej, spójrz przez oko w poszukiwaniu unikalnego wzorca lokalizacji PCNA oznaczonego mPlum w fazie S i wybierz pole widzenia, które ma wystarczającą liczbę komórek fazy S do mikronapromieniowania. Ustaw obszar zainteresowania dla mikronapromieniowania za pomocą powiązanego oprogramowania do wstawiania linii binarnych.Aby ustawić żądaną liczbę linii i odstępów, kliknij binarny, a następnie wybierz wstaw linię, okrąg i elipsę, aby narysować żądaną liczbę linii, a następnie przekształć te linie binarne w ROI stymulacji, klikając ROI, przenieś plik binarny do ROI, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy dowolny ROI i wybierz użyj jako stymulacji ROI S1. Umieść te linie w polu widzenia tak, aby przechodziły przez jądro komórek. Przed mikronapromienianiem, aby zidentyfikować ogniska PCNA do późniejszej analizy, należy wykonać obraz pola widzenia o wyższej rozdzielczości, ustawiając niezbędne parametry w oknach kompaktowego graficznego interfejsu użytkownika A1 LFOV i obszaru skanowania A1 LFOV, a następnie naciskając przycisk przechwytywania. Aby skonfigurować mikronapromienianie, otwórz zakładkę Stymulacja ND, a następnie uzyskaj dostęp do okna harmonogramu, aby uzyskać serię obrazów przed stymulacją, a następnie serię obrazów po stymulacji za pomocą skanerów Galvano.Skonfiguruj trzy fazy w oknie harmonogramu. W kolumnie Akwizycja i stymulacja wybierz odpowiednio akwizycję, stymulację i akwizycję dla trzech faz. W fazie stymulacji ustaw S1 jako ROI.W oknie Galvano XY ustaw 100% moc wyjściową lasera dla linii laserowej 405 nanometrów i ustaw czas przebywania dla mikronapromieniowania. Aby skonfigurować obrazowanie poklatkowe dla żądanego okna czasowego i interwałów, użyj harmonogramu czasu Kompaktowy graficzny interfejs użytkownika A1 LFOV i okna obszaru skanowania A1 LFOV. Zoptymalizuj ustawienia procentowej mocy lasera, wzmocnienia i przesunięcia, aby zmniejszyć wybielanie zdjęć podczas obrazowania w kompaktowym oknie graficznego interfejsu użytkownika A1 LFOV.W zależności od kinetyki białka, wydłuż lub skróć odstęp między obrazami lub czas trwania całkowitego timelapse, ustawiając żądany interwał i czas trwania dla trzeciego wiersza akwizycji fazy w oknie harmonogramu czasu. Naciśnij przycisk uruchom, aby wykonać mikronaświetlanie i następujące po nim obrazowanie poklatkowe. Pod koniec obrazowania poklatkowego zapisz ROI stymulacji jako osobne obrazy, które będą przydatne do identyfikacji współrzędnych mikropromieniowania w dowolnym oprogramowaniu używanym do analizy.PCNA ma całkowicie jednorodny rozkład w jądrze w fazach G1 i G2. W fazie S PCNA lokalizuje się w miejscach replikacji DNA, które można uwidocznić jako jasne punkty w jądrze. We wczesnych komórkach fazy S plamki są stosunkowo małe i równomiernie rozmieszczone w jądrze komórki.Podczas przechodzenia do środkowej fazy S plamki stają się rozmyte i lokalizują się bardziej w kierunku obwodu jądra i jąderek. W późnej fazie S plamki zmniejszają swoją liczbę, ale stają się coraz większe, ponieważ PCNA koncentruje się w późnych miejscach replikacji. Niskie dawki energii, takie jak 1000 mikrosekund czasu przebywania, nie indukują rekrutacji EGFP-FBXL10, dwuniciowego reagującego na przerwanie, ale są wystarczające do indukowania rekrutacji NTHL1-mCherry, białka szlaku naprawy wycinania zasady, które jest rekrutowane do miejsc oksydacyjnego uszkodzenia DNA.Przy czasie przebywania wynoszącym 3 000 mikrosekund rekrutowane są zarówno EGFP-FBXL10, jak i NTHL1-mCherry, demonstrując moc lasera, która generuje zarówno zmiany oksydacyjne, jak i pęknięcia dwuniciowe. EXO1b osiąga maksymalny poziom miejsc akumulacji i mikronapromieniowania około jednej minuty, a następnie powoli zaczyna odłączać się od zmian DNA. W obecności olaparybu akumulacja EXO1b na pasku lasera w ciągu jednej minuty jest znacznie mniejsza w porównaniu z kontrolą nośnika.Bardzo ważne jest, aby mikroskop miał wystarczająco dużo czasu na rozgrzanie się oraz aby hodowla i warunki były optymalne dla każdego eksperymentu, aby zapewnić spójne wyniki. Ponadto ważne jest, aby zoptymalizować ustawienia lasera za pomocą różnych reporterów uszkodzeń DNA, aby przetestować określone zmiany DNA. Po mikronapromienianiu należy rozważyć walidację wyników za pomocą klasycznych metod biochemicznych, takich jak frakcjonowanie, immunoprecypitacja lub ChIP.Podejścia te próbkują większą populację komórek, zapewniając w ten sposób siłę statystyczną.

laser-micro-irradiation-to-study-dna-recruitment-during-s-phase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Celem tego protokołu jest opisanie, jak używać mikronapromieniowania laserowego do wywoływania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym stosunkowo prostych pęknięć nici i złożonych uszkodzeń, do badania sygnalizacji uszkodzeń DNA i montażu czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia in vivo.

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Testowanie wrażliwości wizualnej u jaszczurek przy operant paradygmat klimatyzacji, która zatrudnia odtwarzania wideo losowych punktów, kinematograms i generowanych komputerowo bezkręgowców.

Badania wizualne Wrażliwość na prędkość i kierunek ruchu w Jaszczurki

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

Opisano szczegółowy protokół obrazowania w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksów naprawy DNA w komórkach Bacillus subtilis.

Obrazowanie naprawy niedopasowań oraz odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia DNA w Bacillus subtilis

Ostre uszkodzenie nerek (AKI) u ludzi jest częstym problemem klinicznym spowodowanym uszkodzeniem komórek nabłonkowych tworzących nefrony nerkowe, a AKI wiąże się z wysoką śmiertelnością na poziomie 50-70%1. Po zniszczeniu komórek nabłonkowych nefrony mają ograniczoną zdolność do regeneracji, choć mechanizmy i ograniczenia sterujące tym zjawiskiem pozostają słabo poznane. W niniejszym artykule wideo opisujemy naszą technikę celowanej ablacji laserowej komórek nefronu nerki w nerce zarodka ryby...

Ablacja laserowa pronefry ryby danio w celu badania regeneracji nabłonka nerkowego

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Poznaj dynamikę rekrutacji białek naprawy DNA w fazie S za pomocą mikronaświetlania laserowego i fluorescencyjnie znakowanego PCNA. Ta metoda umożliwia obserwację kinetiki naprawy w żywych komórkach.

Mikronaświetlanie laserowe do badania rekrutacji DNA w fazie S

Przeglądaj więcej filmów